Universidade Federal do Rio de Janeiro
Genilton Alves da Silva
MELANOIDINAS DE CAFÉ E PÃES: IMPORTÂNCIA NA DIETA
BRASILEIRA E ESTUDO DE BIOACESSIBILIDADE DOS SEUS
COMPOSTOS FENÓLICOS
RIO DE JANEIRO
2019
2
Genilton Alves da Silva
MELANOIDINAS DE CAFÉ E PÃES: IMPORTÂNCIA NA DIETA
BRASILEIRA E ESTUDO DE BIOACESSIBILIDADE DOS SEUS
COMPOSTOS FENÓLICOS
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciência de Alimentos, Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciência de Alimentos.
Orientador: Prof. Dr. Daniel Perrone
Rio de Janeiro 2019
4
Genilton Alves da Silva
MELANOIDINAS DE CAFÉ E PÃES: IMPORTÂNCIA NA DIETA
BRASILEIRA E ESTUDO DE BIOACESSIBILIDADE DOS SEUS
COMPOSTOS FENÓLICOS
Prof. Dr. Daniel Perrone
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciência de Alimentos, Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciência de Alimentos.
Aprovada por:
_____________________________________________ Presidente: Prof. Dr. Daniel Perrone Moreira, IQ/UFRJ
_____________________________________________ Maria Beatriz de Abreu Glória, FF/UFMG
_____________________________________________
Mariana Costa Monteiro, INJC/UFRJ
_____________________________________________ Leandro Araujo Lobo , IMPG/UFRJ
_____________________________________________
5 DEDICATÓRIA
Aos meus pais, por todo amor,
cuidado e dedicação.
6 AGRADECIMENTOS
Primeiro de tudo, gostaria de agradecer a Deus por me guiar, iluminar e me dar tranquilidade para seguir em frente com os meus objetivos e não desanimar com as dificuldades.
Agradeço aos meus pais, que sempre com muito sacrifício, puderam me fornecer uma educação de qualidade, me mostraram o quanto era importante estudar, mesmo não tendo eles a mesma oportunidade no passado.
Agradeço a minha irmã pelo apoio irrestrito nas minhas decisões e por me proporcionar as maiores alegrias da minha vida, os meus sobrinhos. Gabriel apareceu no final do meu mestrado e Nicolas no final do doutorado balanceando os diversos sentimentos que ocorrem nessas fases.
Ao Daniel Perrone, meu orientador e mestre. Obrigado pela orientação, competência, profissionalismo e dedicação tão importantes. Tantas vezes que nos reunimos e, embora em algumas eu chegasse desestimulado, bastavam alguns minutos de conversa e umas poucas palavras de incentivo e lá estava eu, com o mesmo ânimo do primeiro dia. Resumi-lo a meu orientador é muito pouco e tenho certeza de que ele sente a importância que teve e tem para mim, não só na condução do trabalho, mas também como conselheiro.
Аоs meus amigos do LBNA, pelas alegrias, tristezas е dores compartilhas. Desde 2013, fortalecemos um laço cada vez mais forte. Aline, Vanessa (Jane), Laís, Emília, Ellen, Fabrício, Nívea, Kim, Nathália Ferrari, Iris, Suellen, Ana Beatriz, André, Andressa.
Agradeço aos funcionários da Embrapa, em especial a professora Lourdes Cabral e aos técnicos Fernando e Filé. Obrigado por me ajudarem nos processos de ultrafiltração e secagem dos meus preciosos materiais.
Agradeço ao Laboratório de Biologia de Anaeróbios do Instituto de Microbiologia Paulo de Góes da UFRJ, em especial ao professor Leandro Lobo que me ofereceu toda a infraestrutura para que eu pudesse realizar os processos de fermentação.
Agradeço à professora Mariana por disponibilizar a infraestrutura do CCS para realizar diversas etapas do meu doutorado, além de contribuir de tanto para o atual trabalho quanto para os trabalhos futuros.
A todos aqueles que de alguma forma estiveram е estão próximos de mim, fazendo esta vida valer cada vez mais а pena.
7 Por fim, agradeço aos órgãos governamentais CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento científico e Tecnológico), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) e FAPERJ (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro) pela bolsa de estudos e auxílio financeiro que possibilitou a dedicação integral ao programa de pós-graduação e a operacionalização do estudo
8 RESUMO
Silva, Genilton Alves da. Melanoidinas de café e pães: importância na dieta brasileira e estudo da bioacessibilidade dos seus compostos fenólicos. Rio de Janeiro, 2019. Tese (Doutorado em Ciência de Alimentos). Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Melanoidinas são macromoléculas que contribuem para a formação de cor, aroma e a textura presentes em alimentos termicamente processados, além de apresentarem diversas atividades biológicas. Tais benefícios estão associados, em parte, aos compostos fenólicos nela incorporados. No presente estudo, foi estimada a ingestão diária de melanoidinas e dos compostos fenólicos ligados a essas macromoléculas de alimentos termicamente processados consumidos regularmente na dieta brasileira, assim como a sua contribuição para a capacidade antioxidante dietética. A partir desses resultados, determinou-se a bioacessibilidade dos compostos fenólicos ligados às melanoidinas utilizando o modelo de digestão simulada in vitro e fermentação ex vivo dos principais grupos de melanoidinas: café (melanossacarídeos) e pão (melanoproteínas). Foi estimado que até 10,7 g de melanoidinas são consumidos diariamente pela população brasileira, sendo a cerveja o principal contribuinte (44%), seguida pelos produtos a base de cereais (36%) e pelo café (17%). Os brasileiros ingerem até 26,0 mg de compostos fenólicos ligados a melanoidinas por dia, principalmente provenientes de café (75%) e cerveja (13%). Além disso, as melanoidinas contribuem com até 21% da capacidade antioxidante da dieta brasileira. Em relação à bioacessibilidade, foi avaliada, pela primeira vez, a bioacessibilidade dos compostos fenólicos livres e ligados às melanoidinas. Os valores encontrados para os compostos fenólicos livres foram maiores quando comparados aos compostos fenólicos ligados, variando de 22% (café) e 31% (pão) a 82% (café) e 91% (pão), respectivamente. Em relação a fermentação colônica, os compostos fenólicos, tanto os livres quanto os ligados foram extensivamente metabolizados a compostos fenólicos mais simples pela microbiota colônica, levando a valores de até 63% de bioacessibilidade, no caso dos compostos fenólicos solúveis do pão. Esses resultados sugerem que os potenciais efeitos benéficos associados aos compostos fenólicos ligados às melanoidinas podem estar ligados tanto as suas formas intactas quanto aos seus metabólitos.
9 ABSTRACT
Silva, Genilton Alves da. Coffee and bread melanoidins: importance in the Brazilian diet and study of bioaccessibility of phenolic compounds. Rio de Janeiro, 2019. Tese (Doutorado em Ciência de Alimentos). Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Melanoidins are macromolecules that contribute to the formation of color, aroma and texture of thermally processed foods, besides presenting various biological activities. Such benefits are associated in part with the phenolic compounds incorporated in their skeletons. In the present study, we aimed to estimate the daily intake of melanoidins, and phenolic compounds linked to these macromolecules of thermally processed foods regularly consumed in the Brazilian diet, as well as their contribution to dietary antioxidant capacity. From these results, we investigated the bioaccessibility of melanoidin-bound phenolic compounds through in vitro simulated digestion model and
ex vivo gut fermentation of the main melanoidin groups: coffee (melanosaccharides) and
bread (melanoproteins). It was investigated up to 10.7 g of melanoidins are consumed daily by the Brazilian population, with beer being the main contributor (44%), followed by cereal products (36%) and coffee (17%). Brazilians ingest up to 26.0 mg of melanoid-bound phenolic compounds per day, mainly from coffee (75%) and beer (13%). In addition, melanoidins contribute up to 21% of the antioxidant capacity of the Brazilian diet. The bioaccessibility of free and melanoidin-bound phenolic compounds was evaluated for the first time. The contents of free phenolic compounds were higher than bound, ranging from 22% (coffee) and 31% (bread) to 82% (coffee) and 91% (bread), respectively. Regarding colonic fermentation, both free and bound phenolic compounds were extensively metabolized to simpler phenolic compounds by gut microbiota, leading to values of up to 63% bioaccessibility in the case of bread soluble phenolic compounds. These results suggest that the potential beneficial effects associated to melanoidins-bound phenolic compounds may be linked to both their intact forms and their metabolites.
10 PUBLICAÇÕES RESULTANTES DESTA TESE
Artigo em periódico
Alves, G., Limoeiro, R., Xavier, P., Perrone, D. Contribution of melanoidins from heat-processed foods to the phenolic compound intake and antioxidant capacity of the Brazilian diet. Journal of Food Science and Technology
Resumos publicados em anais de conferências científicas:
G. Alves, P. Santos, D. Perrone. Melanoidins, melanoidin-bound phenolics and antioxidant capacity of coffee and bread: estimation of dietary intake in the Brazilian diet. 7th International Conference on Polyphenols and Health. Tours, França, 2015.
Alves, Genilton, Perrone, Daniel. Coffee free phenolics are more bioaccessible than melanoidin-bound phenolics upon in vitro simulated digestion and ex vivo colonic fermentation. The International Conference on Polyphenols and Health. Quebec, Canadá, 2017.
Raphael Limoeiro, Genilton Alves, Daniel Perrone. Compostos fenólicos ligados às melanoidinas contribuem para uma elevada ingestão de compostos bioativos na dieta Brasileira. Menção Honrosa na 8ª Semana de Integração Acadêmica. Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2017.
11 LISTA DE FIGURAS
Capítulo 1
Figura 1. Esquema da Reação de Maillard proposto por Hodge (1953)... 24
Figura 2. (A) Condensação de açúcar-amina para formar N glicosamida substituída. (B) Rearranjo de Amadori que conduz ao composto de Amadori, N-substituída 1-amino-1-desoxi-2-cetose... 25
Figura 3. Principais classes e subclasses dos compostos fenólicos... 37
Figura 4. Estrutura básica dos ácidos hidroxicinâmico... 38
Figura 5. Estrutura básica dos ácidos hidroxibenzóicos... 39
Figura 6. Estrutura química básica dos flavonoides... 39
Figura 7. Ácidos clorogênicos e compostos relacionados de acordo com as suas características químicas: compostos básicos, monoésteres de ácido quínico com ácidos hidroxicinâmicos (exemplo para os isômeros de posição 5) e diésteres do ácido quínico e ácidos hidróxicinâmicos... 42
Figura 8. Imagem esquemática do sistema digestivo humano... 47
Figura 9. Especificidade da região do trato gastrintestinal humano... 49
Capítulo 2 Figura 1. Conteúdo de melanoidinas em amostras selecionadas de alimentos processados termicamente presentes na dieta brasileira, divididas em dois grupos, de acordo com a sua solubilidade: melanosacarídeos (g/100 mL) (A) e melanoproteínas (g/100 g) (B)... 60
Figura 2. Capacidade antioxidante mensurada pelos ensaios de FRAP (A) e TEAC (B) dos melanossacarídeos dos alimentos brasileiros termicamente processados. Barras representam média ± desvio padrão (n = 3) das marcas #1 (■), #2 (■) e #3 (■)... 69
Figure 3. Capacidade antioxidante mensurada pelos ensaios de FRAP (A) e TEAC (B) das melaproteínas dos alimentos brasileiros termicamente processados. Barras representam média ± desvio padrão (n = 3) das marcas #1 (■), #2 (■) e #3 (■)... 70
12 Capítulo 3
Figura 1. Diagrama esquemático (A) e aparato experimental de bancada (B) do sistema de ultrafiltração de módulo submerso... 79 Figura 2. Esquema das etapas gastrointestinais in vitro e da etapa colônica ex
vivo das frações do café. Todas as etapas foram realizadas em triplicata e de
forma independente... 82 Figura 3. Balão com nitrogênio realizando troca de atmosfera (simulação de anaerobiose)... 83 Figura 4. (A) Câmara de anaerobiose; (B) Controle positivo (meio rico em nutrientes adicionado de fezes e com adição do fluido digerido); (C) Controle negativo (meio rico em nutrientes, adicionado de fezes e sem adição de fluido digerido)... 86 Figura 5. Volume do permeado (mL) (A, C) e teores (mg/L) de ácidos clorogênicos (CGA) (B, D) obtidos após o processo de ultrafiltração/diafiltração da bebida de café ao longo dos dias das duas etapas... 88 Figura 6. Formação de gel na superfície da membrana, após o processo de ultrafiltração do café... 89 Figura 7. Bioacessibilidade total (%) de CGA (A) e das suas classes (B) observadas ao longo da digestão gastrointestinal in vitro e da fermentação colônica ex vivo do material permeado do café... 95 Figura 8. Teores totais (µg/g) do CGA, das suas classes (A) e dos compostos fenólicos (B) observadas ao longo da digestão gastrointestinal in vitro do material permeado do café... 96 Figura 9. Teores totais (µg/g) do CGA, das suas classes (A) e dos compostos fenólicos (B) observadas ao longo da fermentação colônica ex vivo do material permeado do café... 101 Figura 10. Teores totais (µg/g) dos compostos fenólicos, classe dos ácidos hidroxicinâmico e da classe dos ácidos hidroxibenzóicos nas etapas gástrica e gastrointestinal in vitro do material retido do café... 103 Figura 11. Bioacessibilidade dos compostos fenólicos do material retido do café nas etapas gástrica e gastrointestinal e da fermentação colônica... 104
13 Figura 12. Teores dos compostos fenólicos totais e de suas classes (µg/g) (A)
e curvas dos ácidos protocatecuito e gálico (B) após a fermentação colônica ex
vivo do material retido do café... 109
Capítulo 4
Figura 1. Teores totais dos compostos fenólicos (µg/g) observadas ao longo da digestão simulada in vitro do material permeado do pão... 120 Figura 2. Bioacessibilidade (%) dos compostos fenólicos observadas ao longo da digestão gastrointestinal in vitro e da fermentação colônica ex vivo do material permeado do pão... 121 Figura 3. Teores dos compostos fenólicos (µg/g) observadas ao longo da fermentação colônica ex vivo do material permeado do pão... 125 Figura 4. Teores totais dos compostos fenólicos (µg/g) observadas ao longo da digestão simulada in vitro do material retido do pão... 128 Figura 5. Bioacessibilidade (%) dos compostos fenólicos observadas ao longo da digestão gastrointestinal in vitro e da fermentação colônica ex vivo do material retido do pão... 129 Figura 6. Teores dos compostos fenólicos (µg/g) observadas ao longo da fermentação colônica ex vivo do material retido do pão... 132
14 LISTA DE TABELAS
Capítulo 1
Tabela 1. Classes de compostos aromáticos derivados da Reação de Maillard e relacionados ao sabor e aroma de alimentos processados termicamente... 28 Tabela 2. Principais alimentos termicamente processados em que as melanoidinas se encontram presentes... 30 Tabela 3. Principais atividades biológicas relacionadas às melanoidinas... 34 Tabela 4. Grupos de substituição dos principais ácidos hidroxicinâmico na estrutura apresentada na figura 4... 38 Tabela 5. Grupos de substituição dos principais ácidos hidroxibenzóicos na estrutura apresentada na figura 5... 39 Tabela 6. Algumas fontes alimentares de compostos fenólicos... 40
Capítulo 2
Tabela 1. Preparação das amostras e isolamento das melanoidinas dos alimentos termicamente processados... 55 Tabela 2. Conteúdo (µg/100 mg) dos compostos fenólicos ligados na estrutura dos melanossacarídeos dos alimentos termicamente processados... 64 Tabela 3. Conteúdo (µg/100 mg) dos compostos fenólicos ligados na estrutura das melanoproteínas dos alimentos termicamente processados... 67 Tabela 4. Consumo mínimo e máximo de melanoidinas e sua consequente ingestão de compostos fenólicos e capacidade antioxidante na dieta da população brasileira... 73
Capítulo 3
Tabela 1. Programação do gradiente de concentração da fase móvel utilizada na análise de compostos fenólicos livres... 80 Tabela 2. Constituintes dos fluidos sintéticos do modelo de bioacessibilidade 84 Tabela 3. Teores dos ácidos clorogênicos (µg/g) no material permeado do café... 91
15 Tabela 4. Teores dos compostos fenólicos ligados covalentemente (µg/g) ao
material retido do café... 92 Tabela 5. Teores dos compostos fenólicos (µg/g) e seus metabólicos após a digestão gastrointestinal in vitro do material permeado do café ... 94 Tabela 6. Teores dos compostos fenólicos (µg/g) e seus metabólicos após a fermentação colônica ex vivo do material permeado do café ... 100 Tabela 7. Teores dos compostos fenólicos (µg/g) e seus metabólicos após a digestão gastrointestinal in vitro do material retido do café ... 103 Tabela 8. Teores dos compostos fenólicos (µg/g) que permaneceram ligados ao material retido do café após as etapas gástrica e gastrointestinal in vitro do material retido do café ... 107 Tabela 9. Teores dos compostos fenólicos e dos seus metabólicos (µg/g) após a fermentação colônica ex vivo do material retido do café ... 108
Capítulo 4
Tabela 1. Formulação para elaboração do pão integral... 115 Tabela 2. Teores (µg/g) dos compostos fenólicos identificados no material retido e permeado do pão integral... 118 Tabela 3. Teores dos compostos fenólicos (µg/g) após a digestão gastrointestinal
in vitro do material permeado do pão integral... 120
Tabela 4. Teores dos compostos fenólicos (µg/g) após a fermentação colônica ex
vivo do material permeado do pão integral... 125
Tabela 5. Teores dos compostos fenólicos (µg/g) após a digestão gastrointestinal
in vitro do material permeado do pão integral... 127
Tabela 6. Teores dos compostos fenólicos (µg/g) após a fermentação colônica ex vivo do material retido do pão integral... 132
16 LISTA DE ABREVIAÇÕES
ABTS 2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt ANOVA Análise de variância
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência DAD Detector de Arranjo de Diodos
DF Diafiltração
EDTA Etilenodiamino tetra-acético FDA Food and Drug Administration FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power HMF 5-hidroximetilfurfural
LDH Lactato desidrogenase ND Não detectável
POFcon Pesquisa de Orçamentos Familiares de consumo pessoal
POFacq Pesquisa de Orçamentos Familiares de aquisição domiciliar per capita de alimentos
RM Reação de Maillard
TEAC Trolox Equivalent Antioxidant Capacity TPTZ 2,4,6-Tris(2-pyridyl)-S-triazine
TROLOX 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid UF Ultrafiltração
17 SUMÁRIO
Capítulo 1 - Revisão da literatura
1.Reação de Maillard... 24
1.1. Visão geral da Reação de Maillard... 24
1.2. Reação de Maillard nos alimentos... 27
1.3. Melanoidinas... 29
1.3.1. Propriedades biológicas das melanoidinas... 32
2. Compostos fenólicos... 37
3. Bioacessibilidade e metabolismo dos compostos fenólicos... 42
3.1 Bioacessibilidade dos compostos fenólicos... 43
3.2 Biodisponibilidade dos compostos fenólicos... 45
3.3. Técnicas para avaliação da bioacessibilidade in vitro... 46
3.3.1. Digestão humana... 47
3.3.2 Métodos de digestão simulada in vivo... 48
Capítulo 2 - Contribuição das melanoidinas de alimentos termicamente processados na ingestão de compostos fenólicos e na capacidade antioxidante da dieta brasileira. 1. Introdução... 52
2. Materiais e métodos... 53
2.1. Amostragem... 53
2.2. Preparo das amostras e isolamento dos melanossacarídeos... 54
2.3. Preparo das amostras e isolamento das melanoproteínas... 56
2.4 Análises dos compostos fenólicos ligados às estruturas das melanoidinas 56 2.5. Capacidade antioxidante... 57
2.6. Banco de dados para o cálculo da estimativa de consumo pela população Brasileira... 58
2.7 Análise estatística... 58
Introdução... 20
18
3. Resultados e discussão... 59
3.1. Conteúdo de melanoidinas nos alimentos termicamente processados... 59
3.2. Compostos fenólicos ligados às estruturas das melanoidinas... 62
3.3 Capacidade antioxidante das melanoidinas... 68
3.4 Contribuição das melanoidinas de alimentos processados termicamente à ingestão de compostos fenólicos e à capacidade antioxidante da dieta... 71
4. Conclusão... 75
Capítulo 3 - Bioacessibilidade dos compostos fenólicos livres e ligados as estruturas das melanoidinas do café 1. Introdução... 77
2. Materiais e métodos... 78
2.1. Preparo da amostra e isolamento das frações de alto e baixo peso molecular do café... 78
2.2. Análise dos compostos fenólicos das frações do café... 79
2.3. Digestão simulada das frações isoladas do café... 81
2.3.1 Etapa oral... 82
2.3.2 Etapa gástrica... 82
2.3.3 Etapa intestinal... 85
2.3.4. Fermentação colônica ex vivo (etapa colônica)... 85
2.4. Análise dos compostos fenólicos e seus metabólitos... 87
2.5. Cálculo da bioacessibilidade... 87
2.6. Análises estatísticas... 87
3. Resultados e discussão... 88
3.1 Isolamento das frações de alto e baixo peso molecular de café... 88
3.2. Perfil dos compostos fenólicos das frações isoladas do café... 90
3.2.1 Perfil dos compostos fenólicos do material permeado... 90
3.2.2. Perfil dos compostos fenólicos do material retido... 91
3.3. Digestão simulada in vitro das frações isoladas do café... 93
3.3.1 Digestão simulada in vitro do material permeado do café... 93
3.3.2 Digestão simulada in vitro do material retido do café... 107
19 Capítulo 4 - Bioacessibilidade dos compostos fenólicos livres e ligados as estruturas das melanoidinas do pão
1. Introdução... 113
2. Materiais e métodos... 115
2.1. Preparo da amostra... 115
2.2. Extração e isolamento das melanoidinas do pão... 116
2.3. Análise dos compostos fenólicos das frações do pão... 117
2.4. Digestão simulada das frações isoladas do pão... 117
2.5. Análises estatísticas... 117
3. Resultados e discussão... 117
3.1 Perfil dos compostos fenólicos das frações isoladas do pão integral... 117
3.2 Digestão simulada in vitro das frações isoladas do pão integral... 120
3.2.1 Digestão simulada in vitro do material permeado do pão integral.... 120
3.2.2 Digestão simulada in vitro do material retido do pão integral... 127
4. Conclusão... 134
Conclusão geral da tese... 135
Perspectivas futuras... 136
20 INTRODUÇÃO
Melanoidinas são moléculas que contribuem para a formação de cor, aroma e a textura dos alimentos termicamente processados, como café e produtos de panificação. Estima-se que as populações ocidentais consomem até 12,2 g de melanoidinas por dia considerando-se todas as fontes dietéticas. Essas moléculas são caracterizadas por apresentar alto peso molecular, conter nitrogênio na sua estrutura, possuir, geralmente, coloração marrom e por serem produtos finais da Reação de Maillard.
No passado, as melanoidinas era atribuída como uma das causas da diminuição do valor nutricional dos alimentos, em função da redução no teor de lisina, aminoácido essencial frequentemente limitante em dietas. Contudo, há cada vez mais evidências na literatura que sugerem que as melanoidinas não são um material inerte ou que agregam valores nutricionais negativos ao alimento. Estudos sugerem que essas macromoléculas podem exercer alguma ação biológica, tais como antioxidante, antimicrobiana e prebiótica. Muitas dessas atividades vêm sendo relacionadas à presença de compostos fenólicos ligados à estrutura das melanoidinas.
Nesse contexto, a presente tese objetivou estimar o consumo diário das melanoidinas pela população brasileira, assim como dos compostos fenólicos nelas incorporados. Além disso, a partir de alimentos que contribuem de maneira significativa para o consumo de melanoidinas e de compostos fenólicos incorporados (café e pão) e que, ao mesmo tempo representam diferentes classes dessas moléculas (melanosacarídeos e melanoproteínas), avaliou-se a bioacessibilidade dos compostos fenólicos incorporados, objetivando-se estimar sua bioacessibilidade e metabolismo ao longo da digestão dos seres humanos. Para atender a esses objetivos, essa tese foi dividida em quatro capítulos. Inicialmente, no primeiro capítulo foi realizada uma revisão da literatura a fim de introduzir os temas a serem discutidos dos capítulos da tese.
O segundo capítulo foi dedicado à determinação do teor de melanoidinas e dos compostos fenólicos incorporados às suas estruturas nos alimentos termicamente processados consumidos regulamente pela população brasileira. Também foi determinada a capacidade antioxidante dessas moléculas. A partir desses dados, avaliou-se o impacto do consumo desses alimentos na capacidade antioxidante dietética e na ingestão de compostos fenólicos na dieta geral da população.
21 O terceiro capítulo foi dedicado ao estudo da bioacessibilidade dos compostos fenólicos incorporados nas melanoidinas do café, principal representante dos melanossacarídeos. Avaliou-se o comportamento das diferentes formas dos compostos fenólicos (solúvel e insolúvel) frente às diferentes condições encontradas no sistema gastrointestinal, incluindo o metabolismo colônico.
Já o quarto capítulo foi dedicado ao estudo da bioacessibilidade dos compostos fenólicos presente nas melanoidinas de pão, principal representante das melanoproteínas, principalmente no que se refere à sua ingestão dietética diária. De maneira análoga ao segundo capítulo, avaliou-se o comportamento das diferentes formas dos compostos fenólicos frente às diferentes condições encontradas no sistema gastrointestinal.
Por fim, uma seção final é dedicada as considerações finais e as perspectivas futuras desse trabalho.
22 OBJETIVOS DA TESE
1. Geral
O objetivo geral desse estudo foi estimar a ingestão de compostos fenólicos incorporados em melanoidinas de alimentos termicamente processados e investigar a bioacessibilidade dos compostos ligados às melanoidinas do café e do pão.
2. Específicos
Capítulo 1. Realizar uma revisão sistemática da literatura dos temas a serem discutidos
na tese.
Capítulo 2. Determinar o conteúdo de melanoidinas, dos seus compostos fenólicos
ligados e da sua capacidade antioxidante presentes em alimentos termicamente processados consumidos regularmente na dieta brasileira. Em seguida, com base nos dados de consumo alimentar, estimar a ingestão diária de melanoidinas pela população brasileira e sua contribuição para a ingestão de compostos fenólicos e para a capacidade antioxidante da dieta.
Capítulo 3. Investigar a bioacessibilidade dos compostos fenólicos livres e ligados às
melanoidinas do café por meio de ensaios de digestão simulada in vitro e fermentação colônica ex vivo.
Capítulo 4. Investigar a bioacessibilidade dos compostos fenólicos livres e ligados às
melanoidinas do pão por meio de ensaios de digestão simulada in vitro e fermentação colônica ex vivo.
23
Capítulo 1
24 1. Reação de Maillard
1.1.Visão geral da Reação de Maillard
O nome dado à reação é uma homenagem ao químico francês Louis Camille Maillard (1878-1936). Em meados de 1912, através do estudo de aminoácidos e açúcares submetidos ao aquecimento, Maillard descreveu o que parecia ser um fenômeno muito simples: ao aquecer suavemente os açúcares e aminoácidos na água, uma cor marrom-amarelada era desenvolvida (Hodge, 1953; Tamanna & Mahmood, 2015). No entanto, apenas em 1953, Hodge apresentou o primeiro esquema de reação global, onde foi demonstrado que a química subjacente à Reação de Maillard (RM), também chamada de reação de escurecimento não enzimático, é realmente muito complexa. Esse fenômeno engloba não um caminho de reação, mas toda uma rede de várias reações que ocorrem simultaneamente que se subdivide em três estágios: inicial, intermediário e final (Hodge, 1953; Tamanna & Mahmood, 2015) (Figura 1).
Figura 1. Esquema da Reação de Maillard proposto por Hodge (1953). Reação A: condensação
de açúcar-amina; Reação B: Rearranjo de Amadori; Reação C: Desidratação do Açúcar; Reação D: Fragmentação de Açúcar; Reação E: Degradação de aminoácidos (degradação de Strecker); Reação F: Condensação de Aldol; Reação G: Condensação de aldeído-amina e formação de compostos nitrogenados
25 No estágio inicial, ocorre a ligação covalente de açúcares redutores como glicose e frutose, com a extremidade N-terminal de aminoácidos ou grupo ε amino de proteínas e ácidos nucleicos, que produz uma base de Schiff e uma glicosilamina reversível, instável, incolor e sem sabor e aroma (Figura 2A) (Peng, Ma, Chen, & Wang, 2011).
Na etapa intermediária, observa-se o Rearranjo de Amadori. O rearranjo, em geral, não é reversível e ocorre espontaneamente, mesmo a 25 ºC. O rearranjo para a forma cíclica é imediato, mais estável devido a formação da ligação hemiacetal entre os carbonos 1 e 5. Ocorre, então, a entrada e saída de um próton, inicialmente formando o cátion da base de Schiff (capaz de doar prótons) e a sua isomerização, resultando em 1-amino-1-desoxicetose N-substituída. A forma ceto (cetoseamina), mais estável, é denominada composto de Amadori (Figura 2B) (Peng et al., 2011).
Figura 2. (A) Condensação de açúcar-amina para formar N glicosamida substituída. (B)
Rearranjo de Amadori que conduz ao composto de Amadori, N-substituída 1-amino-1-desoxi-2-cetose. Adaptado de Peng et al. (2011).
Os compostos de Amadori sofrem muitas reações, tais como reações de enolização, desidratação, migrações de carbonila, descarboxilações, auto-oxidações que levam a uma variedade de produtos e de novas reações. A reação de desidratação, por exemplo, pode ocorrer de duas maneiras: em meio ácido, a reação segue a via 1,2-enominol, que irá gerar 5-hidroximetilfurfural (HMF) ou furfural e em meio neutro ou alcalino, a reação segue a via 2,3-enodiol. A formação de furfural é frequentemente usada como um meio relativamente simples para se avaliar a deterioração dos alimentos durante
26 o armazenamento (Finot, 2005). Já o HMF é usado como um indicador da extensão da Reação de Maillard que ocorre em sistemas alimentares processados (Dolores Del Castillo, Villamiel, Olano, & Corzo, 2000; Ramírez-Jiménez, Guerra-Hernández, & García-Villanova, 2000) Apesar do seu potencial de mutagenicidade (Janzowski, Glaab, Samimi, Schlatter, & Eisenbrand, 2000), a síntese do HMF não se encontra na principal via das melanoidinas (Tosun & Ustun, 2003).
Conforme a RM segue, diversos compostos de baixo peso molecular, como aldeídos, cetonas, furanos, pirróis, indóis, quinolinas e α-dicarbonilas são formados por uma série de reações paralelas, tais como desidratação, ciclização e oxidação. Uma reação importante que ocorre na etapa intermediária é a de degradação de aminoácidos (degradação de Strecker). A reação envolve oxidação de α-aminoácidos ao seu aldeído correspondente liberando compostos secundários, tais como, dióxido de carbono e a amônia. Apesar do caminho da degradação de Strecker não ser a principal reação de geração de cor, essa via é responsável pela origem dos off-flavours geralmente associados com a RM (Finot, 2005; Morales & Boekel, 1999). Nesta etapa ocorre também o desenvolvimento de fluorescência. A medida da fluorescência é um indicador do dano térmico em alimentos processados (Delgado-Andrade, Seiquer, & Navarro, 2007).
Por fim, a última etapa é caracterizada pela polimerização dos compostos de baixo peso molecular que formam durante a RM e reagem juntos para formar polímeros heterogêneos. Essas moléculas de alto peso molecular e que possuem coloração marrom são chamados melanoidinas e são extremamente difíceis de separar e caracterizar a partir de qualquer mistura de reação, ou seja, tanto em sistemas modelos quanto em alimentos.
Além dos diversos componentes que podem participar da reação e com isso produzir diferentes compostos, a RM é influenciada por diversos fatores (Matmaroh, Benjakul, & Tanaka, 2006). O fator mais importante que interfere na velocidade da reação é o parâmetro temperatura-tempo (Carabasa-Giribet & Ibarz-Ribas, 2000). Por exemplo, aquecimento com uma temperatura suave e por longo tempo pode produzir um produto mais desejável em termos de cor e sabor, do que um processo curto e de alta temperatura. A atividade da água (a reação é favorecida entre 0,5 e 0,8) e o pH também alteram vias de RM, e pode influenciar fortemente a perfil do produto, fato que pode ser útil nos alimentos (Monti, Bailey, & Ames, 1998; Sherwin & Labuza, 2003). Algumas substâncias, como metais, oxigênio atmosférico (Hayase, Usui, & Watanabe, 2006) e inibidores da Reação de Maillard, como sulfito (Iyengar & McEvily, 1992) podem
27 resultar em diferentes reações e com isso em uma mistura diversificada de produtos intermediários.
Além desses fatores, a composição do alimento também influência na ocorrência da RM. O tipo de açúcar redutor interfere na velocidade de reação com os grupamentos amina, sendo a xilose, o açúcar redutor mais reativo, seguida de arabinose, glicose, maltose e frutose, indicando que as pentoses são mais reativas do que as hexoses. Ainda, os açúcares redutores diferem na via de escurecimento, sendo as cetoses as mais reativas para a formação de produtos de Heyns, enquanto as aldoses o são para a formação de produtos de Amadori (Gerrard, 2002). Além dos açúcares, os tipos de aminoácidos também interferem na velocidade de reação. A lisina é a mais reativa quando comparada aos outros aminoácidos, devido à presença de grupamentos α e ε-amino em sua estrutura. Na sequência, os aminoácidos básicos e não polares (arginina, fenilalanina, leucina, isoleucina e valina) são os mais reativos, seguidos dos aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico) (Kwak & Lim, 2004).
1.2.Reação de Maillard nos alimentos
A RM ocorre em quase todos os alimentos, especialmente alimentos que contenham altos níveis de carboidratos e proteínas e que sofreram algum tipo de processamento térmico. A reação afeta muitas das propriedades sensoriais dos alimentos durante o armazenamento e processamento. Isso inclui: mudanças no cor, particularmente escurecimento e, em menor grau, fluorescência; produção de compostos de aroma e sabor; produção de compostos bioativos, benéficos e tóxicos; perda de qualidade nutricional, principalmente de proteínas; e mudanças na textura (Morales, Somoza, & Fogliano, 2012; Rufián-Henares & Morales, 2007).
A RM é comumente associada a formação de cor, sendo nomeada de reação de escurecimento ou reação de escurecimento não enzimático, esse último é para distinguir das reações de escurecimento causadas pela polifenol oxidase e outras enzimas (Friedman, 1996). Muitas vezes, esse escurecimento é parte integrante do processamento de alimentos de interesse e é uma das qualidades a que o consumidor responde na sua aceitação, como ao forneamento de produtos de panificação, torrefação de café e grãos de cacau e o cozimento de carne, por exemplo (Morales, Somoza, & Fogliano, 2012; Mesías & Delgado-Andrade, 2017).
28 Além da cor frequentemente desejável dos alimentos que deriva dos produtos da RM, muitos compostos de aroma e sabor podem ser encontrados entre a rede complexa de moléculas geradas. A reação desempenha um papel importante na formação dos sabores distintos de muitos alimentos e bebidas submetidos ao processamento térmico. Quase invariavelmente, centenas de compostos foram isolados de cada alimento estudado e a Tabela 1 apresenta as principais classes de compostos de baixo peso molecular que são gerados na fase intermediária da RM e que são associados ao flavor e sabor dos alimentos.
Tabela 1. Classes de compostos aromáticos derivados da Reação de Maillard e relacionados ao sabor e aroma de alimentos processados termicamente.
Classe Sabor/aroma Alimentos
Pirazinas Cozido, assado, torrado,
cereais cozidos Alimentos cozidos em geral
Alquilpirazinas Nozes, torrado Café
Alquilpiridinas Amargo, adstringente, queimado
Café, produtos de panificação e malte
Acilpiridinas Tipo Cracker Cereais
Pirróis Tipo Cereal Cereais e café
Furanos, furanonas,
piranonas Doce, queimado, pungente Alimentos cozidos em geral
Oxazóis Nozes, doce Cacau, café e carnes
Adaptado de Van Boekel (2006)
Os produtos da RM também podem influenciar na qualidade nutricional dos alimentos durante o processamento, levando à perda de aminoácidos, especialmente lisina. Como a lisina é frequentemente nutriente limitante de uma dieta, sua perda irreversível durante a RM pode ter um efeito prejudicial sobre o conjunto valor nutricional de um alimento (Echavarría, Pagán, & Ibarz, 2012; Hayase et al., 2006; Rivero et al., 2005).
Além disso, alguns compostos são produzidos durante a reação, como o metilglioxal e a acrilamida, que são nocivos devido à toxicidade, efeito mutagênico e carcinogênico (Nagao, Fujita, Wakabayashi, Nukaya, 2014; Stadler et al., 2002). Rufian-Henares et al. (2006) sugerem que o consumo de acrilamida deveria se limitar em torno de 45 mg/kg de peso do indivíduo. Os efeitos deletérios desses compostos podem ser
29 diminuídos ou prevenidos pela formação de produtos da RM, de natureza antioxidante, como as melanoidinas
1.3.Melanoidinas
Atualmente, entende-se por melanoidinas o grupo de compostos heterogêneos, nitrogenados, de alto peso molecular, na maior parte dos casos, e que são comumente identificados nos comprimentos de onda cujos valores variam entre 360 nm e 420 nm (Wang et al., 2011). A estrutura química e as vias de formação das melanoidinas são extremamente complexas e permanecem desconhecida (Bruhns, Kanzler, Degenhardt, Koch, & Kroh, 2019).
Na RM, apenas a massa molecular de várias moléculas foi identificada e algumas propostas para os mecanismos de polimerização de melanoidinas foram descritas. A primeira afirma que o esqueleto das melanoidinas seria constituído, principalmente, a partir de produtos da degradação do açúcar, polimerizados através da condensação de aldopentoses (Kato e Tsuchida, 1981). Tressl, Wondrak, Garbe, Krüger, & Rewicki (1998) propuseram um complexo estrutural macromolecular consistindo de unidades de repetição de furanos e pirróis, ligados por meio de reações de policondensação. Hofmann, 1998 identificou cromóforos de baixo peso molecular e postulou que a geração de melanoidinas ocorreria por uma reação de reticulação entre estas substâncias de baixo peso molecular e biopolímeros de elevado peso molecular, tais como proteínas. Outros estudos também indicam a possível formação das melanoidinas a partir da incorporação de outros compostos da matriz alimentar à sua estrutura, além dos carboidratos e aminoácidos como, por exemplo, os compostos fenólicos (Alves & Perrone, 2015; Bekedam, Schols, Van Boekel, & Smit, 2008; Perrone, Farah, & Donangelo, 2012; Quiroz-Reyes & Fogliano, 2018). Além desses alimentos, a RM também é importante em outros alimentos (Tabela 2)
30 Tabela 2. Principais alimentos termicamente processados em que as melanoidinas se encontram presentes.
Alimento Referências
Café
Bekedam, De Laat, Schols, Van Boekel, & Smit, 2007; Bekedam, Roos, Schols, Van Boekel, & Smit, 2008; Moreira, Nunes, Domingues, & Coimbra, 2012; Moreira
et al., 2017; Nunes & Coimbra, 2010
Cacau Hofmann, Bors, & Stettmaier, 1999; Quiroz-Reyes & Fogliano, 2018; Summa et al., 2008
Pão
Alves & Perrone, 2015; Borrelli et al., 2003; Borrelli & Fogliano, 2005; Helou, Jacolot, Niquet-Léridon, Gadonna-Widehem, & Tessier, 2016; Lindenmeier, Faist,
& Hofmann, 2002; Pastoriza & Rufián-Henares, 2014
Muffins González-Mateo, González-SanJosé, & Muñiz, 2009
Cereal matinal Pastoriza & Rufián-Henares, 2014
Malte
Carciochi, Dimitrov, & Galván D´Alessandro, 2016; Faist, Lindenmeier, Geisler, & Erbersdobler and
Hofmann, 2002
Mel Brudzynski & Miotto, 2011
Leite Calligaris, Manzocco, Anese, & Nicoli, 2004
Cerveja preta Kuntcheva & Obretenov, 1996; Morales, Fernandez-Fraguas, & Jiménez-Pérez, 2005; Rivero et al., 2005
Vinho Ortega-Heras & González-Sanjosé, 2009; Rufián-Henares & Morales, 2008
Vinagre balsâmico Falcone & Giudici, 2008; Verzelloni, Tagliazucchi, & Conte, 2010
31 A incorporação de compostos fenólicos nas estruturas das melanoidinas dos alimentos já foi descrita para diversos alimentos, principalmente para pães (Alves & Perrone, 2015) e para o café (Moreira et al., 2017; Perrone, Farah & Donangelo, 2012). O conteúdo de compostos fenólicos ligados nessas melanoidinas variou de 1,5 mg / 100 g em pão (Alves & Perrone, 2015) a 370 mg / 100 g em café (Perrone, Farah & Donangelo, 2012). Delgado-Andrade et al. (2005) relataram que compostos fenólicos presentes no café se ligam de forma não covalente (ligação iônica) à estrutura das melanoidinas contribuindo assim, em parte, para o aumento da atividade antioxidante. Em um outro trabalho do mesmo grupo (Delgado-Andrade et al., 2005) concluiu-se que mais de 50% da atividade antioxidante das melanoidinas de café é devido aos compostos de baixo peso molecular que ligados de forma não-covalente à estrutura das melanoidinas.
No estudo realizado por Perrone et al. (2012), os autores observaram que os compostos fenólicos são incorporados nos estágios iniciais da torrefação do café, sendo parcialmente oxidados e degradados em etapas posteriores. Além disso, esse estudo verificou que, apesar de menos de 1% do teor de ácidos clorogênicos originalmente presente nos grãos de café verde terem sido incorporados nas melanoidinas durante a torrefação, o teor de compostos fenólicos ligados às melanoidinas aumentou durante esse processo, atingindo 29% do total de compostos fenólicos presentes na bebida preparada com grãos de torra escura.
Outro estudo do nosso grupo de trabalho avaliou-se, pela primeira vez, a incorporação de compostos fenólicos nas melanoidinas do pão. O enriquecimento do pão de trigo branco com farinha de goiaba aumentou a incorporação de compostos fenólicos em até 2,4 vezes. A maioria dos compostos fenólicos apresentaram uma maior incorporação do que liberação durante o forneamento, levando a aumentos de 3,3 a 13,3 vezes nos fenólicos totais ligados à melanoidinas (Alves & Perrone, 2015).
O isolamento e as dificuldades em atribuir propriedades individuais às melanoidinas são causados por sua diversidade, complexidade, problemas com purificação e identificação e baixa solubilidade em água e solventes orgânicos (Bruhns et al., 2019). Devido as diferentes características relativas à sua solubilidade, as melanoidinas podem ser divididas em duas classes, melanossacarídeos (esqueletos compostos principalmente de polissacarídeos) e melanoproteínas (esqueletos compostos principalmente de proteínas), dependendo da composição da matriz alimentar em que são formadas.
32 Os melanossacarídeos derivam da reação de aminoácidos e polissacarídeos, geralmente são carregados negativamente e, portanto, bastante solúveis em água (Pastoriza & Rufián-Henares, 2014). É o caso das melanoidinas do café, cerveja e cacau. As melanoidinas formadas durante a torrefação do café compõem uma grande parte da bebida, podendo atingir até 25% da matéria seca (Borrelli et al., 2002). A formação das melanoidinas do café durante a torrefação tem sido relacionada a diversos componentes presentes nos grãos verde: sacarose (após inversão), polissacarídeos (galactomananas e arabinogalactanas), aminoácidos, proteínas (proteínas da parede celular e de estoque) e ácidos clorogênicos (Nunes & Coimbra, 2007). Todos esses componentes precursores podem aumentar a complexidade e a heterogeneicidade das melanoidinas do café.
Por outro lado, as melanoproteínas derivam da reticulação de proteínas e açúcares em alimentos ricos em proteínas, como pães e cereais matinais, e consistem em uma rede de moléculas de peso molecular extremamente alto, amplamente insolúveis (Helou et al., 2016; Lindenmeier, Faist, & Hofmann, 2002).
O isolamento das melanoidinas pode ser realizado com base no seu peso molecular sendo as principais técnicas a diálise, cromatografia de permeação em gel e ultrafiltração (Fogliano & Morales, 2011). A principal diferença entre os métodos se dá pelo rendimento alcançado. Segundo Hofmann (2001), compostos de baixo peso molecular podem reagir durante a diálise, originando estruturas de peso molecular mais elevado e com isso o teor final de melanoidinas é aumentado. A aplicação de cromatografia de permeação em gel (por exemplo, Shephadex G-25) poderia subestimar os níveis de melanoidinas devido à baixa quantidade de amostra analisada (Hofmann, 2001). Já a técnica de ultrafiltração tem como vantagens ser um método simples, com alto rendimento/taxa da amostra processada e baixa contaminação (Rufián-Henares & Morales, 2007).
1.3.1. Propriedades biológicas das melanoidinas
No passado, atribuía-se as melanoidinas atividade antinutricional devido, principalmente, à inativação ou destruição de aminoácidos ou proteínas, digestibilidade reduzida de nitrogênio e absorção prejudicada das melanoidinas no intestino após a inativação das enzimas (Martins, Jongen, & Boekel, 2008; Silván, van de Lagemaat, Olano, & del Castillo, 2006; Tamanna & Mahmood, 2015). Foi demonstrado in vitro e in
33 alimentar, incluindo a tripsina (Ibarz, Garvín, Garza, & Pagán, 2009; Öste, Dahlqvist, Sjöström, Norén, & Miller, 1986).
Com o passar dos tempos, aumentaram os estudos sobre as melanoidinas e sua importância não se deu apenas por suas características organolépticas aos alimentos, mas também aos diversos efeitos benéficos a saúde a ela atribuídas. Dentre os efeitos estão as suas atividades antioxidantes, antimicrobianas, inflamatórias, atividade anti-hipertensiva e prebiótica, entre outros (Echavarría, Pagán, & Ibarz, 2012; Morales, Somoza, & Fogliano, 2012; Moreira, Nunes, Domingues, & Coimbra, 2012). A Tabela 3 apresenta as principais atividades biológicas associadas as melanoidinas.
34 Tabela 3. Principais atividades biológicas relacionadas às melanoidinas.
Atividades biológicas Origem das
melanoidinas Referências
Antioxidante Café Delgado-Andrade & Morales, 2005; Delgado-Andrade, Rufián-Henares, &
Morales, 2005; Jiménez-Zamora, Pastoriza, & Rufián-Henares, 2015; Martinez-Saez et al., 2014; Moreira et al., 2012b; E. Verzelloni, Tagliazucchi, Del Rio, Calani, & Conte, 2011; Goya,
Delgado-Andrade, Rufián-Henares, Bravo, & Morales, 2007; Zhang, Zhang, Troise, & Fogliano, 2019;
Morales & Babbel, 2002
Produtos de panificação Alves & Perrone, 2015; Martín et al., 2009
Mel, cerveja, molho de soja, vinagre balsâmico
e malte
Brudzynski & Miotto, 2011; Carvalho, Øgendal, Andersen, & Guido, 2016; Rivero et al., 2005; Wang et al., 2007;
Xu, Tao, & Ao, 2007
Sistemas modelo Echavarría, Pagan, & Ibarz, 2013; Rufián-Henares & Morales, 2007;
Valls-Bellés et al., 2004
Antimicrobiana Café, cerveja, biscoito, vinho doce
Jiménez-Zamora et al., 2015; Monente et al., 2015; Moreira et al., 2012; Rufián-Henares & Morales, 2008; Rufián-Henares & De La Cueva, 2009;
Ames, Wynne, Hofmann, Plos, & Gibson, 1999; Trang et al., 2009
Sistemas modelo Rufián-Henares & Morales, 2007
Anti-inflamatória Café, pão Helou et al., 2015; Moreira et al., 2012
Anticarcinogênica Café, batata, molho de soja
De Marco, Fischer, & Henle, 2011; Langner et al., 2013; Marko et al., 2002; Marko et al., 2003; Moreira et
al., 2012
Antihipertensiva Café Moreira et al., 2012
Sistemas modelo Rufián-Henares & Morales, 2007
Prebiótica Café, pão Borrelli & Fogliano, 2005; Jiménez-Zamora et al., 2015
35 As melanoidinas podem atuar como antioxidantes e essa capacidade tem sido amplamente estudada com o uso de modelo sintético melanoidinas, bem como obtidas de alimentos como café e pão. O principal mecanismo de ação está na eliminação de radicais livres (radicais hidroxila, superóxido e peroxila) de cátions metálicos, especialmente ferro (Morales & Babbel, 2002; Rufián-Henares & Morales, 2007; Valls-Bellés et al., 2004). Apesar da estrutura das melanoidinas serem desconhecidas, o que dificulta a indicação de qual fração, peso molecular alto ou baixo, é responsável por esta atividade, Morales e Babbel (2002) indicaram maior atividade anti-radical de produtos de baixo peso molecular, como os ácidos ferúlico e cafeico, frente as melanoidinas. Esses achados estão de acordo com os dados obtidos por Delgado-Andrade, Rufián-Henares, & Morales, 2005 que concluíram que mais de 50% da atividade antioxidante das melanoidinas de café é devido aos compostos de baixo peso molecular que ligados de forma não-covalente à estrutura das melanoidinas. Rufián-Henares & Morales (2007) observaram que a simulação da digestão gastrointestinal promoveu a liberação de compostos de baixo peso molecular ligados à estrutura das melanoidinas de café. Tais compostos de baixo peso apresentaram uma maior atividade antioxidante em comparação aos compostos ligados ionicamente às melanoidinas. Outro estudo demonstrou que após 24 h de fermentação in
vitro das frações de café de alto peso molecular com microrganismos do intestino,
aproximadamente 25% da atividade antioxidante inicial ainda estava presente (Reichardt, Gniechwitz, Steinhart, Bunzel, & Blaut, 2009).
Além disso, as melanoidinas exercem algum efeito protetor nas células. Valls-Bellés et al (2004) relataram atividade preventiva de produtos de alto peso molecular de um sistema glicina-glicose contra citotoxicidade induzida por adriamicina em hepatócitos de ratos in vitro. Adriamicina, um antibiótico com atividade antitumoral, muitas vezes causa uma variedade de efeitos colaterais devido ao seu mecanismo de ação. Este gera uma grande quantidade de espécies reativas de oxigênio, que destroem as células cancerígenas, mas também as células normais. A adição de melanoidinas ao meio de cultura diminuiu a toxicidade induzida pela adriamicina, que foi medida, por exemplo, pela liberação de LDH ou dano de proteína. Além disso, as melanoidinas isoladas dos alimentos demonstraram proteger células in vitro contra o desafio oxidativo. Melanoidinas de biscoitos (Martín et al., 2009) e do café (Goya et al., 2007), digeridas simulando condições digestivas gástricas e pancreáticas, podem proteger as células HepG2 de hepatoma humano em cultura contra o estresse oxidativo.
36 As melanoidinas também podem inibir o crescimento de bactérias patogênicas, como Helicobacter pylori (Trang et al., 2009), Escherichia coli, Bacillus cereus,
Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium (Rufián-Henares & De La Cueva, 2009) e, simultaneamente, seu efeito
benéfico sobre lactobacilos e bifidobactérias também foi comprovado (Ames et al., 1999; Borrelli & Fogliano, 2005; Mesías & Delgado-Andrade, 2017). As melanoidinas do pão mostraram uma inibição da enterobactérias no trato gastrointestinal humano em ensaios
in vitro, associados a uma atividade anti-inflamatória (Helou et al., 2015).
As melanoidinas podem funcionar diretamente nos alimentos como agentes antimicrobianos, prologando, assim seu prazo de validade. Este efeito pode ser mediado tanto por ações bacteriostáticos e bactericida (Rurián-Henares & Morales, 2008).
A capacidade de modular a atividade de diferentes sistemas enzimáticos faz com que as melanoidinas também possam exercer influência, por exemplo, na inibição da enzima de conversão da angiotensina-I mostrada nas melanoidinas do café que está associada a uma atividade anti-hipertensiva (Rufián-Henares & Morales, 2007). Enquanto isso, a inibição de metaloproteases da matriz confere à melanoidinas sua propriedade anticarcinogênica (De Marco et al., 2011). Nesse sentido, diversos estudos relatam a capacidade das melanoidinas e dos produtos da RM de suprimir o crescimento de células cancerígenas in vitro. Os produtos da RM diminuíram a proliferação celular, provavelmente devido à inibição da cascata de proteína quinase ativada por mitogênio (Marko et al., 2002; Marko et al., 2003). Outro estudo realizado por Kamei et al. (1997) demonstrou a inibição do crescimento de células cancerígenas do cólon e do estômago in
vitro, incubados com melanoidinas obtidas a partir de missô e molho de soja.
A microbiota intestinal desempenha um papel crucial na manutenção da homeostase de um organismo, mantendo, portanto, o equilíbrio adequado entre microrganismos benéficos e os prejudiciais. Estudos de Rufián-Henares & Morales, (2006, 2008) observaram o potencial bacteriostático das melanoidinas produzidas a partir de sistemas modelos, bem como as isoladas dos alimentos, no qual produtos de baixo peso molecular ligados as melanoidinas, ou seja, compostos fenólicos, são responsáveis por essa atividade inibidora do crescimento de bactérias em relação às melanoidinas sintetizadas. Borrelli & Fogliano (2005) relataram que as melanoidinas presentes na crosta do pão podem ser metabolizadas/fermentadas pela microbiota do intestino grosso humano aumentando o crescimento das bifidobactérias, apresentando potencial de atuação prebiótica semelhante à das fibras dietéticas.
37 2. Compostos fenólicos
Os compostos bioativos são substâncias químicas que se encontram em pequenas quantidades nas plantas e certos alimentos. Estes apresentam diversas formas, tanto no que se refere à sua estrutura química, quanto ao seu aspecto funcional, de acordo com o grupo em que se encontram (Kris-Etherton et al., 2002). Dentre estes, os compostos fenólicos representam uma das suas principais classes, não apenas do ponto de vista de variedade, mas também dos avanços científicos relacionados à bioatividade (Murkovic, 2003).
Os compostos fenólicos são originados do metabolismo secundário das plantas, sendo essenciais para o seu crescimento, reprodução e pigmentação. Formam-se em condições de estresse como, infecções, ferimentos, radiação ultravioleta, dentre outros (Naczk & Shahidi, 2006). São substâncias que possuem pelo menos um anel aromático no qual ao menos um hidrogênio é substituído por um grupamento hidroxila, e são sintetizados a partir da fenilalanina e da tirosina através da via do ácido chiquímico (Krämer et al., 2003).
Os fenólicos podem ser classificados em diferentes grupos funcionais de acordo com o número de anéis aromáticos presentes na molécula e com os elementos estruturais aos quais estes anéis estão ligados. Como se pode perceber na Figura 3, as classes são bastante diversificadas, ademais, os compostos fenólicos podem ainda ser encontrados ligados a vários carboidratos, ácidos orgânicos e a outros fenólicos (Manach, Rémésy, Scalbert, Jiménez, & Morand, 2004).
38 Os ácidos fenólicos se caracterizam, de maneira geral, como fenóis que possuem um grupo ácido carboxílico funcional. Estes ácidos podem ser divididos em dois grupos distintos: os ácidos hidroxicinâmicos (Figura 4) e os hidroxibenzóicos (Figura 5), os quais apresentam um esqueleto básico, porém o número e as posições dos grupos hidroxila no anel aromático estabelecem a diferença e a variedade entre os compostos (Stalikas, 2007). As suas formas ligadas são derivadas glicosiladas ou ésteres dos ácidos quínico, shiquimico e tartárico.
O principal representante dos ácidos hidroxicinâmicos é o ácido cafeico. Ocorre em alimentos principalmente na forma de ésteres com ácido quinico, denominado de ácido clorogênicos (ácido 5-cafeoilquínico). É encontrado em diversas frutas e café, em elevada concentração. Já no grupo dos hidroxibenzóicos, derivados do ácido benzoico por substituição de três hidrogênios ligados ao anel aromático por hidroxilas, o ácido gálico é o principal representante.
Figura 4. Estrutura básica dos ácidos hidroxicinâmicos (Stalikas, 2007).
Tabela 4. Grupos de substituição dos principais ácidos hidroxicinâmico na estrutura apresentada na figura 4
Nome R1 R2 R3 R4
Ácido cinâmico H H H H
Ácido m-cumárico H OH H H
Ácido p-cumárico H H OH H
Ácido ferúlico H OCH3 OH H
Ácido sináptico H OCH3 OH OCH3
Ácido cafeico H OH OH H
39 Figura 5. Estrutura básica dos ácidos hidroxibenzóicos (Stalikas, 2007).
Tabela 5. Grupos de substituição dos principais ácidos hidroxibenzóicos na estrutura apresentada na figura 5.
Nome R1 R2 R3 R4
Ácido benzóico H H H H
Ácido p-hidroxibenzóico H H OH H
Ácido vanílico H OCH3 OH H
Ácido gálico H OH OH OH
Ácido protocatecuito H OH OH H
Ácido siríngico H OCH3 OH OCH3
Ácido salicílico OH H H H
Fonte: Adaptado de Stalikas (2007).
O grupo dos flavonoides apresenta uma estrutura básica que consiste em dois anéis aromáticos A e B, ligados por uma ponte de três carbonos, geralmente na forma de anel aromático (Figura 6). Variações na substituição do anel C resultam nas subclasses de flavonoides. As substituições nos anéis A e B derivam os diferentes compostos em cada classe. As subclasses de flavonoides são os flavonóis, as flavonas, as isoflavonas, as flavanonas, as antocianidinas e os flavanóis (Balasundram, Sundram, & Samman, 2006; Manach et al., 2004).
40 A distribuição de compostos fenólicos nos tecidos das plantas tanto nos níveis celulares quanto sub-celulares não é uniforme. Os compostos fenólicos insolúveis são encontrados na parede celular, enquanto que compostos fenólicos solúveis estão presentes dentro dos vacúolos de células de plantas (Acosta-Estrada, Gutiérrez-Uribe, & Serna-Saldívar, 2014). Os compostos fenólicos da parede celular, ligados a diversos componentes celulares, contribuem para a resistência mecânica das paredes das células, bem como desempenhando um papel regulador do crescimento das plantas e morfogênese, na célula, em resposta ao stress, e agentes patogênicos (Manach et al., 2004).
Apesar de os compostos fenólicos estarem presentes em praticamente todos os alimentos de origem vegetal (Tabela 6), a sua ingestão dietética varia de acordo com o tipo de dieta e a quantidade ingerida desses alimentos. A variabilidade das quantidades encontradas nos vegetais é influenciada diretamente por fatores genéticos e condições de cultivo. Por exemplo, os principais compostos fenólicos de cereais e legumes são os flavonoides, ácidos fenólicos e taninos, enquanto os do vinho incluem os ácidos fenólicos, antocianinas, taninos e flavonoides (Del Rio et al., 2013). Estes compostos exercem funções específicas no corpo que podem promover boa saúde, além disso, tem efeito benéfico, a médio e longo prazo, na prevenção de doenças cardiovasculares, alguns tipos de câncer e mudanças hormonais (Bravo, 2009; Manach et al., 2004; Murkovic, 2003).
Tabela 6: Algumas fontes alimentares de compostos fenólicos
Compostos fenólicos Fontes alimentares
Ácidos fenólicos
Ácidos hidroxicinâmicos Café, cenoura, cereais, pêra, cerejas, frutas cítricas, sementes oleaginosas, pêssegos, ameixas, espinafre,
tomate e berinjela Ácidos hidroxibenzóicos Cereais e oleaginosas
Flavonoides
Antocianinas Amoras, cerejas, uvas e morangos.
Flavonas Frutas cítricas, aipo, salsa e espinafre. Flavonóis Maçãs, feijão, amoras, alface, cebola, azeitona,
pimentão, tomates e trigo
Flavanonas Frutas cítricas
Flavanóis Maçãs, uvas, cebola e alface
Isoflavonas Soja
Xantonas Manga
Taninos
Condensados Maçãs, uvas, pêssegos e pêra
Hidrolisáveis Romã e framboesa
41 Os ácidos fenólicos e flavonoides estão presentes nos cereais nas formas livres e conjugadas. A maior concentração de ácidos fenólicos e flavonoides está na camada de aleurona dos grãos de cereais, mas esses compostos também são encontrados em embriões e revestimento de sementes de grãos (Debeaujon, Léon-Kloosterziel, & Koornneef, 2000). O ácido ferúlico é o ácido fenólico livre predominante nas sementes dos diferentes tipos de cereais (Irakli, Samanidou, Biliaderis, & Papadoyannis, 2012; Szawara-Nowak, Bączek, & Zieliński, 2016; Xiong et al., 2013)
Irakli, Samanidou, Biliaderis, & Papadoyannis (2012) relataram que os ácidos fenólicos como os ácidos cumárico, ferúlico, gálico, hidroxibenzóico, vanílico, siringico e sinápico são encontrados em ambas formas, livre e conjugada, no trigo durum, farinha de trigo refinada, cevada, aveia, centeio, arroz e milho. Nos cereais, os ácidos fenólicos livres constituem uma pequena porção do teor total de compostos fenólicos enquanto os ácidos fenólicos ligados são os mais predominantes. Neste caso, foi observado que o total de ácidos fenólicos conjugados constitui de 88% (centeio) a 99,5% (milho) do total de ácidos fenólicos.
Os ácidos clorogênicos (CGA) são os principais compostos fenólicos presentes em grãos de café (Perrone, Farah, & Donangelo, 2012). Essa classe de compostos é dividida em diferentes subclasses formadas pela esterificação de uma molécula do (–) ácido quínico, com uma a quatro moléculas de ácidos trans-hidroxicinâmicos (Figura 7) (Clifford, 2000). Os ésteres são preferencialmente formados com a hidroxila do carbono 5 do ácido quínico, mas também com aquelas dos carbonos 3 e 4 e, menos comumente, com a hidroxila do carbono 1. O ácido caféico (CA) é o ácido hidróxicinâmico mais comum no café, seguido dos ácidos ferúlico (FA) e p-cumárico (p-CoA) (Moreira et al., 2015).
Os principais grupos de CGA encontrados nos grãos de café verde são apresentados na Figura 7, de acordo com sua identidade química, número e posição de resíduos acila. Esses grupos de compostos incluem: ácidos cafeoilquínicos (CQA), com 3 isômeros (3-, 4- e 5-CQA); ácidos dicafeoilquinícos (diCQA), com 3 isômeros (3,4-diCQA; 3,5-(3,4-diCQA; 4,5-diCQA); ácidos feruloilquinicos (FQA), com 3 isômeros (3-, 4- e 5-FQA) e ácidos p- cumaroilquínicos ( p CoQA), com 3 isómeros (3-, 4- e 5- p CoQA) (Farah & Donangelo, 2006).
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Figura 7. Ácidos clorogênicos e compostos relacionados de acordo com as suas características
químicas: compostos básicos, monoésteres de ácido quínico com ácidos hidroxicinâmicos (exemplo para os isômeros de posição 5) e diésteres do ácido quínico e ácidos hidróxicinâmicos (Farah & Donangelo, 2006).
Além da relevância para a fisiologia das plantas, os CGA participam da formação da cor, do sabor e do aroma do café durante a torrefação (Farah, 2012; Trugo & Macrae, 1984). Em decorrência da sua termolabilidade, os CGA podem ser degradados quase na sua totalidade. Durante a torrefação do café, os CGA podem sofrer isomerização, epimerização, lactonização (formação de 1,5-γ-lactonas através da perda de uma molécula de água e formação de uma ligação éster intramolecular) e degradação em componentes de baixo peso molecular (Clifford, 2000; Moreira et al., 2012a; Perrone et al., 2012; Trugo & Macrae, 1984). Os CGA também participam na formação dos polímeros de coloração marrom do café, conhecidos como melanoidinas (Bekedam, et al., 2008; Moreira et al., 2015, 2012b; Nunes & Coimbra, 2007).
3. Bioacessibilidade e metabolismo dos compostos fenólicos
Atualmente, muitos estudos têm sido dedicados à estimativa do teor nutricional de produtos alimentares, baseados na quantidade de nutriente que sai da matriz durante a digestão gastrointestinal e fica disponível para sua absorção pelo organismo (Fernández-García, Carvajal-Lérida, & Pérez-Gálvez, 2009). Isso porque nem todo o conteúdo total de um nutriente será eficientemente absorvido e liberado para o organismo durante a
