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COMPOSIÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE INSETICIDA DO ÓLEO ESSENCIAL DE HYPTIS SUAVEOLENS.
Cláudio Costa dos Santos1, Ives Antônio L.Q. Silva2
Resumo: O óleo essencial das folhas da Hyptis suaveolens, coletadas em Mossoró-RN, foi extraído por meio de hidrodestilação na UFERSA. Foram realizadas analises da quantificação e composição química por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa e por detecção de ionização de chama. Foram identificados 94,59% dos componentes totais do óleo, com o 1,8-cineol e o Germarcreno B como componentes majoritários. O teste de atividade realizado foi da ação do óleo essencial da Hyptis suaveolens contra o inseto Callosobruchus maculatus (F.) no feijão de corda. Os testes mostraram resultados promissores mostrando a presença de atividade inseticida no óleo nos volumes estudados.
Palavras-chaves: Hyptis suaveolens, Óleos essenciais, GC-MS, GC-FID, Atividade inseticida.
1. INTRODUÇÃO
A International Organization for Standardization (ISO) define óleos essenciais como produtos obtidos de partes de plantas por meio de destilação por arraste de vapor d’água, como também por prensagem do pericarpo de frutos cítricos[1]. Flores, folhas, cascas, rizomas e frutos são matérias-primas para sua produção, a exemplo dos óleos essenciais de rosas, eucalipto, canela, gengibre e laranja, respectivamente. Possuem grande aplicação na perfumaria, cosmética, alimentos e como coadjuvantes em medicamentos. São empregados principalmente como aromas, fragrâncias, fixadores de fragrâncias, em composições farmacêuticas e orais e comercializados na sua forma bruta ou beneficiada, fornecendo substâncias purificadas como o limoneno, citral, citronelal, eugenol, mentol e safrol[2].
Analisando por uma visão química, óleos essências são óleos naturais, com odor, liberado pelas glândulas de plantas aromáticas, obtido por processo físico e estrutura química formada por carbono, hidrogênio e oxigênio, dando origem a complexa mistura de substâncias, da qual três substâncias geralmente caracterizam a planta em questão. Essas substâncias apresentam estruturas diversas como ácidos carboxílicos, alcoóis, aldeídos, cetonas, ésteres, fenóis e hidrocarbonetos dentre outras, cada qual com sua característica aromática e ação bioquímica[15].
O Brasil tem lugar de destaque nesta produção, ao lado da Índia, China e Indonésia, que são considerados os 4 grandes produtores mundiais. A posição do Brasil deve-se aos óleos essenciais de cítricos, que são subprodutos da indústria de sucos. No passado, o país teve destaque como exportador de óleo essencial de pau-rosa, sassafrás e menta[2].
Dessa forma, esse estudo tem como objetivo, através da análise de modelos cromatográficos e da atividade biológica, averiguar as propriedades e composição do óleo essencial de Hyptis suaveolens. Utilizou-se as técnicas da cromatografia gasosa com espectro de massa (GC-MS) e a cromatografia gasosa com detector por ionização de chama (FID), para identificar e quantificar os componentes do óleo. Os testes realizados foram o de atividade pesticida e repelente contra o inseto Callosobruchus maculatus (F.).
2. DESENVOLVIMENTO 2.1. A Hyptis suaveolens
A Hyptis suaveolens, é conhecida como bamburral ou alfazema-brava na região do cerrado. Tem como principal sinonímia a denominação de Mesosphaerum suaveolens (L.) Kuntze. Ela é uma planta anual, ereta, bastante aromática, ramificada, subarbustiva, de caule quadrangulado e pubescente, de 50-190 cm de altura, nativa do continente americano, mas também é encontrada em regiões africanas como Nigéria e Benin [4]. Suas folhas são opostas, membranáceas, glandular –pubescentes de 4 a 8 cm de comprimento e bastantes aromáticas.
Flores pequenas, sésseis, protegidas por brácteas filiformes, de cor azul-rosada, reunidas em pequenos grupos nas axilas foliares do ápice dos ramos. Ela se propaga através de sementes[5]. Algumas dessas características podem ser observadas na Figura 01.
Figura 01: Planta Hyptis suaveolens no Centro de Cuidado ao Idoso, local onde a amostra foi coletada. (Autoria Própria).
O bamburral é tipicamente encontrado em áreas de pastagens, beira de estrada, terrenos baldios e culturas anuais e perenes. É mais frequente em zonas de cerrado onde forma densas infestações de populações homogêneas e prefere solos frescos e drenados. Floresce de janeiro a abril[2]. Os exemplares estudados foram obtidos na cidade de Mossoró-RN (5°09'35.9"S 37°21'38.5"W) e foram coletadas no mês de junho, por volta das 11 horas. O bamburral cresceu naturalmente na região sem a interferência externa.
A Hyptis suaveolens é empregada na medicina caseira em algumas regiões. A infusão de suas flores é usada para aliviar cólicas menstruais, problemas digestivos e também para tratamento da gota. As flores são também indicadas contra gripe febres e para problemas respiratórios em geral. Ambas flores e folhas são empregadas na forma de cigarro para o tratamento de cefaleias e como odontológicas[2]. Estudos também apontam propriedades repelentes[5], antimicrobiana[7][8] e larvicida[9].
2.2. Os Processos Cromatográficos
A Intenational Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) define a cromatografia como um processo de separação física no qual os componentes que separados se dividem em duas fases, uma é fixa (a fase estacionária), está fase é composta de um camada microscópica de líquido ou polímero sobre um sólido inerte dentro da coluna, ela irá contribuir com a seletividade da análise, enquanto a outra move-se em uma determinada direção (a fase móvel) ,esta fase é um gás que não deverá reagir com o analito, os mais utilizados são hidrogênio, nitrogênio e oxigênio[10]. O objetivo dela é identificar os componentes de uma determinada amostra através de detectores de massa ou por espectroscopia ultravioletas e propriedades como solubilidade tamanho e massa.
Os vários tipos de processos cromatográficos são nomeados de acordo com o estado físico da fase móvel como na cromatografia gasosa (GC) e a cromatografia líquida (LC), onde a fase estacionária encontra-se na fase gasosa e líquida respectivamente. Uma subclassificação também pode ser feita considerando o estado físico da fase estacionária, caso a fase estacionária seja sólida a técnica é chamada de cromatografia de gás-sólido (CSG) e caso seja líquida, cromatografia de gás-líquido (GLC) [11]. A Figura 02 mostra as partes básicas de um cromatógrafo gasoso.
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O detector de espectro de massa é empregado principalmente na análise de compostos orgânicos, por fornecer uma variedade de informações diferentes sobre a amostra, dentre elas: a massa molecular de um composto, informações estruturais, verificação da pureza de substâncias e análise isotópica. Este mecanismo de detecção é baseado em três etapas fundamentais: a ionização/fragmentação das moléculas separadas na coluna cromatográfica, em diferentes relações massa/carga (m/z); separação dos fragmentos iônicos gerados e detecção dos fragmentos segundo sua relação massa/carga (m/z). Os 3 principais componentes deste detector são: a fonte de ionização, o analisador de massa e a multiplicadora de elétrons, este último é o dispositivo que monitora os fragmentos iônicos separados pelo separador de massa[13].
O funcionamento básico de um cromatógrafo com espectro de massa pode ser observado na Figura 03. As moléculas de analito após saírem da coluna serão ionizadas na fonte de ionização, para que possam ser atraídas ou repelidas pelo campo magnético ou elétrico utilizado na detecção. A fonte de ionização é aquecida e opera no vácuo de modo a facilitar a vaporização das amostras e posteriormente ioniza-las. As principais técnicas de ionização são a ionização por impacto de elétrons e a ionização química[11].
Na ionização por impacto de elétrons, o analito em fase gasosa é bombardeado por uma grande quantidade de energia. Os analitos absorverão esta energia gerando vários processos, o mais simples dele é a ionização do analito pela remoção de um elétron (M+). A fragmentação rápida do analito pode conduzir a não detecção de algum dos íons perdendo-se assim dados importantes da espectrometria de massa. A ionização química foi desenvolvida para tentar contornar esse problema, aumentando assim produção de íons moleculares e reduzindo as fragmentações relacionadas a ionização por elétrons. Nesta técnica as moléculas do analito são introduzidas juntas com um gás reagente. A mistura de gases será bombardeada com elétrons, mas diferente da ionização anterior o gás reagente, por estar em excesso, receberá a maior parte dos íons formando íons pseudomoleculares do analito. Por necessitar de pouca energia para a realização deste processo, a fragmentação não é observada[12].
Figura 03: Esquema simplificado de um processo de análise por espectro de massa[13].
No analisador de massa as espécies iônicas de massa atômica diferente serão separadas para produzir o espectro de massa. Essa separação se dá com base na razão massa-carga das espécies iônicas. O espectro de massa é um gráfico do número de íons produzidos versus a razão massa-carga[14]. Os analisadores de massa mais comuns são o quadrupolo e a armadilha de íons, a Figura 04 ilustra esses analisadores. O quadrupolo consiste de 4 bastões que estão carregados com uma corrente não-contínua e com sinais alternados. Além disso uma frequência de rádio é aplicada aos quatro bastões, dependendo da combinação da frequência e dos sinais das correntes, diferentes íons atravessarão os bastões até chegarem ao detector.
(a) (b) Figura 04: Analisador de massa quadrupolo (a) e armadilha de íons (b) [11].
A armadilha de íons (ion-trap) é um quadrupolo tridimensional que captura todos os íons introduzidos em seu interior e os mantém armazenados até determinada radiofrequência seja aplicada, fazendo assim com que íons com certa razão massa/carga fiquem instáveis e assim sejam liberados deste analisador[12]. O detector irá analisar e processar os íons vindos do analisador de massa gerando um perfil caracteristico para a composto, de maneira que o detector associará o espectro de massa ao pico cromatográfico desta molécula[11].
2.2.2. Cromatografia Gasosa Com Detector Por Ionização De Chama
O Detector por ionização de chama (FID) baseia-se na mudança na corrente de ionização devido ao aumento da densidade de íons que fluem entre o cátodo (a chama do detector) e o ânodo (o coletor de elétrons) depois de a amostra ser analisada ser colocada na chama[13]. O efluente da coluna é queimado em uma pequena chama de oxigênio e hidrogênio, produzindo íons durante o processo, estes serão recolhidos por um eletrodo negativo e será produzido um sinal elétrico. Quando não há amostra sendo queimada, deverá haver pouca ionização devido ao hidrogênio e impurezas do ar que possam ter adentrado o sistema. Devido a isso o FID é detector de propriedades específicas com uma alta sensibilidade para as mesmas[11].
A Figura 05 ilustra o detector por ionização de chama. O efluente da coluna é misturado com hidrogênio e direcionado para chama que está envolvida por um alto fluxo de ar para auxiliar a combustão. Um dispositivo de ignição está acoplado ao sistema para iniciar remotamente a chama. O coletor de eletrodos é polarizado em torno de +300V em relação a chama e o fluxo de elétrons coletados é amplificado por um circuito de alta impedância.
O detector deve estar aquecido a no mínimo 125Cº para prevenir a condensação da água, resultante do processo de combustão, e de amostras com alta ponto de ebulição. É comum que os FIDs funcionem a 250Cº ou em temperaturas mais elevadas[11].
Figura 05: Esquema de um detector por ionização de chama[13][11].
O FID responde a todos os compostos orgânicos que queimam na chama de oxigênio e hidrogênio. O sinal gerado é aproximadamente proporcional ao conteúdo de carbono do composto. Isso deve-se ao fato de todos átomos de carbono serem convertidos em metano durante o processo de combustão do FID. Na presença de heteroátomos como oxigênio e nitrogênio, esse fator de proporcionalidade irá diminuir. Nestes casos podemos
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secagem utilizando nitrogênio.
Figura 06: Ilustração do sistema de hidrodestilação utilizado (Autor: Renan Cavalcante).
2.4. Testes de Atividade
Os testes contra o inseto Callosobruchus maculatus (F.) foram conduzidos no Complexo de Laboratórios De Biotecnologia E Ecologia, pelo Professor Dr. Carlos Eduardo Alvares Soares e Mônica Ellen Soares, a aluna que o acompanha.
O procedimento consistiu em colocar um pedaço de filtro de café, com o volume de óleo que estava sendo testada dentro de um pote. Após isso foram colocados dez feijões de corda devidamente selecionados e um casal de insetos coletados de forma aleatória de um insetário, como pode ser observado na Figura 07, então analisou-se o comportamento dos insetos durante certo tempo a exposição do óleo. Os volumes testados foram 10, 20 e 30 microlitros, o procedimento foi realizado em duplicata com um dos tratamentos servindo de controle para o experimento.
Figura 07: Teste de atividade inseticida do óleo essencial Hyptis suaveolens (Autora: Larícia Nogueira).
2.5. Resultados e Discussões
A Hyptis Suaveolens estudada foi identificada pelo botânico Dr. Leandro de Oliveira Furtado de Souza. O óleo volátil foi extraído por meio de hidrodestilação das folhas da H. suaveolens no laboratório de processos químicos da UFERSA. As análises cromatográficas acopladas aos detectores de ionização em chamas (GC-FID) e massa (GC-MS) do produto extraído foram realizadas no laboratório de Produtos Naturais da Embrapa Agroindústria Tropical sob a supervisão do Dr. Kirley Marques Canuto. As identificações dos constituintes foram efetuadas através de pesquisa em espectroteca e comparação com os dados da literatura [17].As analises foram realizadas em um equipamento GC–MS Agilent 7890B-GC/5977A-MS equipado com uma coluna capilar
de sílica fundida apolar VF-5MS (30 m × 0,25 mm DI, 0,25 μm de espessura do filme) utilizando uma razão de injeção (split ratio) de 1:30 e hélio a 1,5 mL min-1 como gás de arraste. A temperatura do injetor e do detector foram ajustadas a 250 °C. A temperatura do forno foi aumentada de 70 a 180 °C com variação de 4 °C min-1 e depois para 250 °C a 10 °C min-1. Os espectros de massa foram registrados na faixa de razão massa/carga (m/z) entre 30 e 450. As análises de GC-FID foram realizadas em um cromatógrafo Shimadzu GC-2010 Plus nas mesmas condições cromatográficas supracitadas, exceto para o gás de arraste que foi o hidrogênio.
Os óleos essenciais obtidos das folhas de Hyptis suaveolens foram denominados OEHSF. O cromatograma do OEHSF mostrado na Figura 08, apresentou 2 picos majoritários, o pico com tempo de retenção, em minutos, 5,52 refere-se ao 1,8-cineol apresentando um teor de 22,31% e o pico de 18,76 foi identificado como o Germarcreno B com um teor de 20,98%. Seus cromatogramas podem ser observados nas Figuras 09 e 10. Foi possível identificar a maioria dos constituintes presentes no OEHSF.
Figura 08: Cromatograma do GC-MS do OEHSF
Figura 09: Cromatograma do 1,8-cienol na GC-MS a partir OEHSF.
Figura 10: Cromatograma do Germacreno B na GC-MS a partir OEHSF. Pico 21
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Figura 11: Cromatograma do GC-FID do OEHSF Tabela 01: Componentes Químicos Identificados no OEHSF
Componente KI Área relativa GCMS Área relativa GCFID
α-pineno 939 0,71 0,64
β-pineno 979 3,40 3,19
1,8-cineol 1031 22,31 22,18
γ-terpineno 1059 1,58 1.57
α-cubebeno 1351 0,52 -
α-copaeno 1376 1,84 1,53
β-bourboneno 1388 3,39 2,98
β-cedreno 1420 1,86 1,53
β-copaeno 1432 0,20 -
β-gurjeneno 1433 0,18 -
Prezizaeno 1446 5,11 4,54
<cis->Cadina-1(6),4-dieno 1463 1,12 0,61
<trans->Cadina-1(6),4-dieno 1475 2,71 1,79
γ-muuroleno 1479 0,71 0,28
Macrocarpeno 1499 2,02 1,64
Isodauceno 1500 0,48 0,25
γ-cadineno 1513 1,62 0,65
δ-cadineno 1523 1,01 -
Zonareno 1529 8,07 13,15
α-cadineno 1538 1,42 1,42
Germacreno B 1561 20,98 19,31
Maaliol 1567 1,83 1,26
Espatulenol 1578 6,82 6,25
Guaiol 1600 1,83 2,49
Intermedeol 1666 0,46 0,37
Rimueno 1896 0,37 -
Isopimara-9(11),15-dieno 1905 0,25 0,20
Cembreno 1938 1,58 1,26
Abietano 2087 0,21 -
Total 94,59 89,09
Fonte: Elaborado pelos autores, 2018.
Os estudos de óleos essenciais encontrados na literatura relatam a composição química volátil, de folhas e parte aérea de H. suaveolens, e mostram composições características do habitat em que se encontram, como observados para os quimiotipos, denominados segundo a composição majoritária: β-cariofileno (41%, Malásia);
1,8-cineol e sabineno (38,71 e 19,91%, EUA); (35,3 e 15,05%, Índia); (35,9 e 12,0%, Aruba), 1,8-cineol e β- pineno (37 e 18,7%, Amazônia Brasileira), e 1,8-cineol (30,88%, Nordeste Brasileiro)[18]. A composição química identificada neste trabalho para o óleo obtido do material coletado em Mossoró se assemelha ao óleo essencial obtido de espécimens do Nordeste com 1,8-cineol como majoritário, apesar do Germacreno B aparecer como um dos constituintes principais e este não ser mencionado em nenhum dos quimiotipos mencionados nestes estudos.
No teste de atividade, durante o período inicial de uma hora de observação, houve mortes de 1 dos insetos nos potes de volume de 20 e 30 microlitros, os outros insetos apresentavam estado de letargia. No período de 24hrs todos os insetos haviam sido mortos. Após 30 dias foi confirmado que não houve o depósito de ovos dos insetos nos feijões, mostrando um potencial de inseticida em volumes mais elevados e larvicida no óleo, em concentrações mais brandas o óleo pode ter um alto potencial como repelente. Esses resultados encontram-se na tabela 02
Tabela 02: Resultado do teste de atividade inseticida do OEHSF Tempo
Volume (μL)
Mortalidade
1 Hora 1 Dia 1 Mês
10 0 2 0
20 1 2 0
30 1 2 0
Fonte: Elaborado pelos autores, 2018.
3. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os produtos majoritários, por comporem cerca 45% do óleo, são facilmente isolados. Os compostos encontrados têm propriedades medicinais[19] no caso do 1,8-cineol e antimicrobianas e inseticidas[20] no caso do Germacreno B, mostrando assim bastante potencial para o estudo desse óleo o fato de ser uma planta que não exige condições muito restritas de cultivo também contribui para isso. A fragrância do óleo abre brechas para aplicação cosméticas do mesmo.
O potencial do óleo essencial da H. suaveolens e o fato de ser uma planta que não exige condições muito restritivas de cultivo, justifica a continuidade da pesquisa. Para projetos futuros, planeja-se estudar a variação da composição volátil do óleo durante o dia (circadiano) e acordo com o período do ano (sazonal), além de realizar outros testes de atividade e verificar em quais concentrações a atividade pesticida apresentaria os melhores resultados em um número maior de inseto.
A fragrância do óleo abre brechas para aplicação em cosméticos do mesmo.
4. AGRADECIMENTOS
O presente trabalho foi auxiliado pela Embrapa Agroindústria Tropical, que realizou as análises cromatográficas; pelo professor Dr. Carlos Eduardo Alvares Soares, que realizou os testes de atividade inseticida; pelo professor Dr. Leandro de Oliveira Furtado de Souza, que identificou a espécie vegetal; pelo discente Gabriel Freitas, que contribui com a localização da planta na cidade de Mossoró. Agradecemos a essencial contribuição de todos para a produção deste artigo.
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