Weissella cibaria e sua ação probiótica no trato intestinal de surubins híbridos

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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE AQUICULTURA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQUICULTURA. Weissella cibaria e sua ação probiótica no trato intestinal de surubins híbridos. Dissertação apresentada como requisito a obtenção do título de mestre em Aquicultura, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de Santa Catarina. Orientador: José Luiz Pedreira Mourino. Gabriel Fernandes Alves Jesus. Florianópolis 2014.

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(3) Weissella cibaria e sua ação probiótica no trato intestinal de surubins híbridos Por GABRIEL FERNANDES ALVES JESUS Esta dissertação foi julgada adequada para a obtenção do título de MESTRE EM AQUICULTURA e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Aqüicultura.. _____________________________________ Prof. Alex Pires de Oliveira Nuñer, Dr. Coordenador do Programa. Banca Examinadora: __________________________________________ Dr. José Luiz Pedreira Mourino – Orientador __________________________________________ Dra. Cleide Rosana Werneck Vieira __________________________________________ Dra. Débora Machado Fracalossi __________________________________________ Dr. Evoy Zaniboni Filho.

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(5) “... isso é só o fim...”. Marcelo Nova.

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(7) AGRADECIMENTOS À minha família, meus pais e meu irmão, por todo apoio, investimento, educação e carinho ao longo desses anos, À minha namorada e amada Sthefanie Caroline Medeiros, por toda paciência, apoio, carinho, alegrias e momentos perfeitos. Ao sempre presente orientador e amigo Prof. José Luiz P. Mouriño, por todo o apoio, ensinamentos, bagunças, confiança, esforços, conselhos e ajudas ao longo desses 6 anos de amizade e convívio. Ao coorientador e amigo de braçadas e travessias, Prof. Mauricio Laterça Martins, por todos os momentos ao longo do curso. Ao Prof. Felipe do Nascimento Vieira por toda a amizade, brincadeiras, conselhos, ensinamentos e puxões de orelha ao longo dessa formação. Aos amigos Bruno Correa da Silva e Adolfo Jatoba pela amizade, ensinamentos, paciência, brincadeiras e confiança desde os primeiros dias de LCM. Ao Prof. Walter Quadros Seiffert, por todo o apoio, a confiança, amizade e conselhos. Aos amigos do setor de microbiologia, Gabriella P, Gabriela S., Norha, Mariana, Jessica, Karine, Scheila, Esmeralda, Juliana, Marysol, Josy, Marcela, Marco, Marcola, pelos inúmeros momentos de risadas, de trabalho em grupo, e experimentos. Aos amigos Marcello e Efrayn por todo apoio, confiança, conselhos, roubadas, parcerias, bagunças, e pelos, sempre, bons momentos. Aos amigos de graduação e principalmente Robert Santos, Lucas W. Miranda e Japaaaa, por todos os momentos que tornam a vida acadêmica uma das melhores, e com certeza a amizade continuará ao longo da vida. A empresa Mar e terra, por todo suporte técnico e financeiro concedido; Ao LAMAR e principalmente aos Profs. Zenilda Laurita Bouzon e Éder Carlos Schimdt, pela parceria e por todo o suporte, estrutura e apoio para realização das análises de microscopia. Ao LCME por todo o suporte e apoio dos técnicos para realização das análises de microscopia eletrônica. Ao LAPAD pela parceria dos técnicos e alunos, além do fornecimento da ração para o experimento. Ao NEPAQ pela estrutura e apoio para realização do experimento. Ao LCM por ter sido minha “casa” ao longo desses anos. Aos funcionários e amigos do LCM, em especial David, Ilson, Carlos, “o gaudério” Carlos Biólogo, Rafael biólogo, Seu Xico e Dimas, por toda a convivência e trabalho duro nesses anos de LCM..

(8) Enfim a todos que de alguma forma contribuíram para que eu chegasse aqui..

(9) RESUMO O presente trabalho objetivou avaliar os efeitos da suplementação da bactéria probiótica Weissella cibaria no trato intestinal e na saúde de surubins híbridos (Pseudoplatystoma corruscans ♂ e P. reticulatum♀). Os 96 peixes foram distribuídos em 12 tanques circulares de 100 L, em sistema de recirculação de água. Os peixes foram alimentados com 3% da biomassa total durante 45 dias, sendo os peixes do tratamento alimentados com ração comercial suplementada com probiótico, e os peixes do grupo controle com ração comercial sem suplementação. O número de eritrócitos totais, trombócitos e linfócitos se apresentaram maiores nos peixes alimentados com a suplementação probiótica (p<0,05). A porcentagem de fagocitose, o título aglutinante e a concentração total de imunoglobulinas foram maiores nos peixes alimentados com a suplementação probiótica (p<0,05). Através de técnicas de microscopia de luz e eletrônica, foi possível verificar a alteração na microbiota autóctone dos peixes, além do incremento, daqueles que receberam suplementação probiótica, no comprimento e largura das vilosidades intestinais, do número de células caliceformes por vilo, além do perímetro dessas vilosidades. A bactéria W. cibaria foi capaz de colonizar e alterar a microbiota intestinal, assim como sua ultraestrura, além de modular os parâmetros hemato-imunológicos. Palavras-chave: Trato intestinal, Pseudoplatystoma, bactéria ácidolática, ração, colonização, probiótico..

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(11) ABSTRACT This study aimed to evaluate the effects of supplementation of probiotic bacteria in the intestinal tract Weissella cibaria and health hybrid surubins (Pseudoplatystoma corruscans ♂ e P. reticulatum♀ ). The 96 fish were distributed into 12 circular tanks of 100 L in water recirculation system. The fish were fed 3% of the total biomass for 45 days, the fish treatment fed commercial feed supplemented with probiotics, and fish from the control group with commercial feed without supplementation. The total number of erythrocytes, thrombocytes and lymphocytes presented higher in fish fed the probiotic supplementation (p<0.05). The percentage of phagocytosis, the agglutination title and the total concentration of immunoglobulins were higher in the fish fed the probiotic supplementation (p <0.05). Through techniques of light and electron microscopy, we observed the change in the indigenous microbiota of fish, plus the increment, by supplemented animals with probiotics, the length and width of the villi, the number goblet cells per villus, beyond perimeter of these villis. It was possible to verify the ability of the bacteria to colonize and W. cibaria alter the intestinal microbiota, as well as its ultrastructure, and modulate the hemato-immunological parameters. Key words: Gut alterations, health status, probiotic, Pseudoplatystoma, ration..

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(13) LISTA DE FIGURAS Figura 1: Esquema de seleção de bactérias probióticas (Adaptado de Ray et al. (2012). ................................................................................... 26 Figura 2: Complexo responsável por inativar ou ativar a transcrição de genes alvo, como exemplo a produção de toxinas. Adaptado de Defoirdt et al. (2004) ............................................................................. 45 Figura 3: Alterações na ultraestrutura intestinal de surubins híbridos alimentados ou não com suplementação probiótica, durante 45 dias. Em (A,B,C) Grupo controle em Microscopia de Luz (ML), Microscopia eletrônica de varredura (MEV) e Microscopia eletrônica de transmissão (MET) respectivamente; (D,E,F) Grupo probiótico em ML, MEV, MET, respectivamente. cc células caliceforme, li linfócitos infiltrados, l lúmen, m mucosa, be borda em escova, b bacilos, bc bacilococcos, e enterócitos, mv microvilosidades, cd células de defesa......................... ........................................................... 71 Figura 4: Alterações na microbiota intestinal de surubins híbridos alimentados (Probiótico) ou não (Controle) com suplementação probiótica, durante 45 dias, utilizando microscopia eletrônica de varredura (MEV). Verifica-se (aumento 1.500 x) bactérias com morfologia de bacilos no Controle e bactérias do gênero bacilococos no tratamento probiótico. Nota-se também uma maior concentração de bactérias no tratamento probiótico quando comparado ao Controle..... ............................................................................................ 72.

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(15) LISTA DE TABELAS Tabela 1: Parâmetros hematológicos de surubins híbridos (Pseudoplatystoma corruscans x P. reticulatum) alimentados durante 45 dias com ração comercial suplementada com probiótico ou sem suplementação (Controle)...................................................................... 69 Tabela 2: Título aglutinante e atividade antimicrobiana do plasma de surubins híbridos (Pseudoplatystoma corruscans x P. reticulatum) alimentados durante 45 dias com ração comercial suplementada com probiótico ou sem suplementação. ........................................................ 69 Tabela 3: Comprimento e largura das vilosidades, do número de vilos e de células caliceformes, e do perímetro e área, de surubins híbridos alimentados ou não com suplementação probiótica durante 45 dias. .................................................................................................. 70.

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(17) SUMÁRIO CAPÍTULO 1 ................................................................................ 19 Revisão: Probióticos na aquicultura ................................................. 19 1.. Introdução .............................................................................. 21. 2.. Critérios de Seleção de microorganismo probióticos para aquicultura ............................................................................. 24. 3.. Testes in vitro ......................................................................... 27 3.1.. Isolamento das cepas ............................................................. 27. 3.2.. Espécies de microorganismos utilizados como probióticos .. 28. 3.3.. Antagonismo entre cepas probióticas .................................... 28. 3.4.. Formação de esporos ............................................................. 30. 3.5.. Crescimento em diferentes concentrações de pH e resistência à sais biliares ....................................................... 30. 3.6.. Resistência a diferentes temperaturas.................................... 31. 4.. Testes in vivo ......................................................................... 31. 5.. Modo de ação ......................................................................... 33. 6.. 7.. 5.1.. Colonização da microbiota intestinal .................................... 33. 5.2.. Inibição competitiva .............................................................. 34. 5.3.. Fonte de nutrientes e enzimas digestivas .............................. 34. 5.4.. Produção de compostos inibitórios........................................ 38. Imunomodulação .................................................................... 40 6.1.. Efeito nas células imunológicas da mucosa intestinal ........... 40. 6.2.. Interação com células imunes ............................................... 41. 6.3.. Interferência do quorum sensing ........................................... 44. Biorremediação de água e solo ................................................. 46. JUSTIFICATIVA .......................................................................... 48 OBJETIVOS.................................................................................. 49 HIPÓTESE .................................................................................... 49.

(18) CAPÍTULO 2 .................................................................................50 Weissella cibaria e sua ação probiótica no trato intestinal de surubins híbridos ..................................................................................50 1.. Introdução...............................................................................52. 2.. Material e Métodos ..................................................................53. 3.. 2.1.. Material biológico e manutenção .......................................... 53. 2.2.. Preparo do inóculo de probiótico e dietas experimentais ...... 54. 2.3.. Delineamento experimental .................................................. 54. 2.4.. Análises hemato-imunológicas ............................................. 55. 2.5.. Histologia .............................................................................. 57. 2.6.. Microscopia eletrônica de transmissão (MET) ..................... 57. 2.7.. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ........................ 58. 2.8.. Ganho de peso e sobrevivência ............................................. 58. 2.9.. Análises estatísticas .............................................................. 58. Resultados ..............................................................................58 3.1.. Parâmetros hematológicos .................................................... 58. 3.2.. Parâmetros imunológicos ...................................................... 58. 3.3.. Colonização do trato intestinal .............................................. 59. 3.4.. Histomorfometria intestinal .................................................. 59. 3.5.. Ganho em peso e sobrevivência ............................................ 60. 4.. Discussão................................................................................60. 5.. Conclusão ...............................................................................62. 6.. Agradecimentos ......................................................................62. 7.. Referências .............................................................................62. 8.. Referências da introdução geral ................................................73.

(19) CAPÍTULO 1. Revisão: Probióticos na aquicultura.

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(21) 21. 1. Introdução A Aquicultura mundial se destaca como umas das principais atividades na produção de alimentos. A produção aquícola mundial alcançou o valor recorde em 2010, em 60 milhões de toneladas (excluindo plantas aquáticas e produtos não alimentares), com um valor estimado total de $ 119.000.000.000. Em 2010, a produção mundial de peixes cultivados foi de 59,9 milhões de toneladas, um aumento de 7,5%, quando comparado com 55,7 milhões de toneladas em 2009 (FAO, 2012). Neste cenário, destaca-se a piscicultura continental que apresentou em 2011 uma produção de 35.596.862 t, 33,7% superior do que em 2007 onde produziu 26.621.449 t (Fao, 2013). No Brasil a piscicultura continental apresentou em 2011, cerca de 541.151 t de pescado, 160% superior a produção de 2007. A produção aquícola mundial está em constante expansão. Entre os peixes mais cultivados no país em águas continentais, a tilápia e as carpas são as de maior importância, juntas somaram 63,4% da produção nacional de pescado em 2010, seguidas dos peixes redondos nativos tambaqui (Colossoma macropomum), pacu (Piaractus mesopotamicus), pirapitinga (Piaractus brachypomus) e seus híbridos, os quais representaram juntos 24,6% da produção (Brasil, 2010). À medida que se pretende aumentar a produção seja em pequena ou larga escala, um quesito importante a ser observado é biossegurança. Grandes mortalidades de peixes são observadas quando há a intensificação da produção. A ocorrência de enfermidades tem como principal fator o desequilíbrio do triângulo epidemiológica patógenohospedeiro-meio ambiente, que consequentemente diminui a capacidade imunológica dos animais, além de deteriorar a qualidade da água do cultivo, favorecendo assim o desenvolvimento de doenças (Lizama et al., 2007). Durante estes surtos, diversos agentes químicos podem ser utilizados como tratamentos profiláticos e remediadores às enfermidades, tais como ácido acético, amônia quaternária, cal, cloreto de sódio, formol, iodo, metrifonato, sulfato de cobre, verde malaquita, ácido oxolínico, sulfamerazina, sulfato de magnésio e especialmente os antibióticos. Estes últimos, diversas vezes, são utilizados indiscriminadamente e de maneira errônea (Eler e Millani, 2007). O uso inadequado destes agentes normalmente ocorre quando não se conhece o agente causador do surto de enfermidade e/ou mortalidade, obrigando produtores a utilizar antibióticos com grande espectro de.

(22) 22. atuação. Os agentes podem ser tanto bactérias Gram-positivas, quanto as Gram-negativas, além de alguns protozoários. Medidas inadequadas podem provocar a seleção e a resistência dos patógenos (Klaenhammer e Kullen, 1999), além de serem uma fonte de poluição ambiental (Boyd e Massaut, 1999) e prejudicarem a comercialização e saúde humana (Sapkota et al., 2008). Aliando este problema aos resíduos deixados na carne dos animais, diversos países baniram o uso de antibióticos em cultivos. A União Europeia proibiu, a partir de janeiro de 2006, o uso de antibióticos na produção animal (Luckstadts, 2006). No Brasil, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA, 2013) já proibiu o uso de diversos antibióticos; clorafenicol e nitrofuranos (IN nº 09, 27/06/2003), quilononas e sufonamidas (IN nº 26, 9/07/2009), espiramicina e eritromicina (IN nº 14, 17/05/2012); como aditivo alimentar na produção animal. Dessa forma, cada vez mais a profilaxia se torna um item essencial nas pisciculturas e boas práticas sanitárias devem ser incorporadas pelos produtores para possibilitar o equilíbrio do cultivo. Dentre as práticas sanitárias alternativas, destaca-se a utilização de aditivos alimentares, como os probióticos, que auxiliam no aumento da capacidade imunológica dos peixes. Probiótico é uma palavra derivada do grego que significa a favor da vida, porém desde de 1965 o uso de seu termo vem sendo continuamente revisto. A definição mais aceita em estudos animais aquáticos é que probióticos são microorganimos vivos que quando ministrados, colonizam o trato intestinal, regularizando a flora, competindo com agentes patogênicos e estimulando o sistema imunológico (Gatesoupe, 1999). Atualmente no mercado encontramos diferentes fórmulas comerciais de probióticos testadas e utilizadas em peixes. Porém observa-se que probióticos isolados de outros animais ou em espécies de peixes que não sejam o alvo, podem apresentar resultados controversos, sendo necessário o isolamento e desenvolvimento de probióticos espécie-específicos, ou seja, probióticos autóctones (Mourino, 2010). O sucesso da utilização dos probióticos se dá pelo seu potencial de competição e colonização do intestino, assim a influência de fatores bióticos e abióticos sobre o microambiente do trato grastrointestinal resulta na alteração de crescimento dos microorganismos (Gatesoupe, 1999b). Diferentes microorganismos são usados como probiótico em piscicultura: bactérias ácido-láticas como Lactobacillus sp., bactérias esporuladas como Bacillus sp., bactérias gram negativas como Pseudomonas sp., Vibrio sp. e Aeromonas sp. e leveduras. Contudo,.

(23) 23. bactérias como Pseudomonas sp. e Vibrios sp. podem ser potencialmente patogênicas para alguns peixes. Adicionalmente, bactérias do Gênero Bacillus são utilizadas em formulações comerciais já que além de produzirem compostos inibitórios durante a esporulação podem ser facilmente incorporadas nas dietas por possuirem maior resistência devido aos esporos. Contudo, algumas cepas podem se tornar patogênicas, causando mortalidades no cultivo (George et al., 2005). Portanto, é necessário realizar a caracterização fenotípica e, se possível, molecular a fim de se determinar a existência de patogenicidade do microorganismos para a espécie cultivada. A utilização de bactérias ácido-láticas apresenta efeito positivo registrado em diversas espécies, como robalos, Centropomus spp. (Barbosa et al., 2011), tilápias, Oreochromis spp, (Jatoba et al., 2011) e camarões, Litopenaeus vannamei, (Vieira et al., 2007), devido à sua capacidade de colonizar o trato digestório, alterando a dominância natural da microbiota intestinal e promovendo melhoria no sistema imune dos animais (Carnevali et al., 2006; Jatoba et al., 2008; Vieira et al., 2008). Estes resultados estão relacionados com a alta especificidade entre o microorganismo probiótico e o hospedeiro, pois todas as cepas utilizadas nestes trabalhos foram isoladas dos próprios animais em estudo. Por outro lado, estudos demonstram que a utilização de bactérias alóctones também podem apresentar bons resultados e um papel positivo no bem estar dos peixes (Ridha e Azad, 2012; Standen et al., 2013), porém há um consenso de que cepas de bactérias ácido-láticas autóctones possuem maior chance de colonizar o intestino e trazer benefício à saúde do hospedeiro (Sun et al., 2013). A utilização de cepas alóctones apresentam uma série de desvantagens como a inserção de microorganismos exógenos ao ambiente de cultivo, o desconhecimento dos possíveis efeitos no trato intestinal e sua interação com os demais microorganismos no ambiente, além da capacidade dessas cepas sobreviverem ou se manterem em condições viáveis e em concentrações ótimas no trato intestinal dos animais (Nayak, 2010b), Em peixes (trutas, Oncorhynchus mykiss, e tilápias do Nilo) as bactérias ácido-láticas já demonstraram a capacidade de melhorar o crescimento, o sistema imunológico e a sobrevivência após desafios experimentais (Nikoskelainen et al., 2003; Panigrahi et al., 2007; Aly, Mohamed, et al., 2008; Merrifield et al., 2013)..

(24) 24. 2. Critérios de Seleção de microorganismo probióticos para aquicultura Ao longo dos anos várias estratégias para modular a composição da microbiota intestinal a fim de se obter melhores taxas de crescimento, digestão, imunidade, e resistência a doenças foram estudadas nos mais diversos ramos da produção animal (Mare et al., 2006; Aly, Mohamed, et al., 2008; Abd El-Rhman et al., 2009). Os microorganismos usados como probióticos na aquicultura devem exercer boa atividade microbiana e sererm seguros, não apenas para o animal cultivado e o meio em que vivem, mas também para os humanos. Porém, para ser considerado um probiótico o microorganismo precisa, de maneira geral, colonizar o trato intestinal possuindo característica de organismo probionte e ter efeito benéfico para o hospedeiro, seja ele em resistência a doenças, em crescimento, ou em qualquer outro fator desejado (Gatesoupe, 1999). Outras características também devem ser observadas para a seleção mais detalhada do microorganismo como, por exemplo: deve ser inócuo, deve resistir ao tempo de armazenamento e transporte, resistir às enzimas do trato digestório e a bile, não possuir genes de resistência a antibióticos e possuir propriedades antimutagênicas e anticancerígenas (Coppola, 2004; Munoz-Atienza et al., 2013). Muitos dos probióticos empregados na aquicultura são desenvolvidos para uso humano ou para o uso na produção de animais terrestres. No entanto, a adapataçao do uso desses probióticos em meio aquático é mais complexo quando comparado ao ambiente terrestre, podendo esse ser o motivo de muitas vezes não atingir os efeitos esperados. Dessa forma, o isolamento, caracterização e comercialização de bactérias probióticas autóctones, adaptadas ao meio, precisam ser estudadas (Azad e Ai-Marzouk, 2008). Assim, se torna conveniente seguir alguns critérios de seleção para garantir a chegada íntegra de bactérias probióticas no trato intestinal dos animais, e o consequente aumento da efetividade do probiótico na saúde do peixe cultivado. Após o isolamento, pode ser avaliada a diversidade de critérios de seleção para pressupor a eficiência do microorganismo probiótico. A seleção primária mais comum utilizada são os testes de antagonismo in vitro frente a um conjunto de cepas patogênicas, pois a produção de compostos inibitórios constitui um fator importante para a seleção. Além disso, o probiótico deve ter a capacidade de colonizar o intestino, e para isto, o microorganismo precisa resistir ao trânsito gastrointestinal. Portanto, é importante que a cepa probiótica seja submetida a testes em diferentes concentrações de pH, de sais biliares e proteases (Balcazar et.

(25) 25. al., 2008), a fim de garantir que o microorganismo sobreviva e colonize o trato intestinal, evitando a colonização de patógenos. Da mesma forma, são recomendados testes em diferentes temperaturas e salinidades (para peixes marinhos e estuarinos) com o intuito de obter as condições ótimas de crescimento e maior produção de compostos inibitórios (ácidos orgânicos, peróxido de hidrogênio, bacteriocinas) (Ringo e Gatesoupe, 1998). Fjellheim et al. (2010) usaram dois critérios de seleção primária para escolher um conjunto de 500 bactérias candidatas a probióticas de larvas de bacalhau do Atlântico Gadus morhua. As bactérias dominantes da flora intestinal foram isoladas utilizando como critério a atividade antagônica contra Vibrio anguillarum, patogênica para esta espécie. Com base em critérios como domínio e capacidade fermentativa, o número total de bactérias foi reduzido a 55 cepas, submetidas a análises in vitro, verificando-se crescimento e aderência ao muco, produção de enzimas extracelulares e resistência à bile, assim reduzidas a sete bactérias potencialmente probióticas para o bacalhau. Testes adicionais também podem ser realizados como, por exemplo, testes de inibição entre duas ou mais cepas probióticas. Isto para verificar se existe antagonismo entre as cepas, em caso de utilizálas em conjunto a fim de se verificar a existência de um efeito sinérgico entre elas. Por último, testes in vivo devem ser realizados para verificar a colonização do probiótico no intestino e posteriormente avaliar os benefícios do seu uso no hospedeiro, analisando índices hematoimunológicos, índices zootécnicos e a resistência do peixe frente a infecções experimentais com patógenos..

(26) 26. Figura 1: Esquema de seleção de bactérias probióticas (Adaptado de Ray et al., (2012). A suplementação com probióticos pode ser realizada diretamente na água (Li et al., 2006), na dieta artificial (Vieira et al., 2007; Jatoba et al., 2008) ou no alimento vivo (Arndt e Wagner, 2007). As concentrações dos microorganismos probióticos podem variar, sendo recomendável concentrações maiores de 105 unidades formadoras de colônia (UFC) g-1(Lang et al. 1997). Jatoba et al. (2008) e Vieira et al. (2007) testaram concentrações de 1 x 108 UFC g-1 de bactérias láticas suplementadas na ração e obtiveram bons resultados em tilápia-do-Nilo e camarão marinho, respectivamente, conseguindo alterar a microbiota.

(27) 27. intestinal e obter efeito probiótico. Contudo, estas concentrações de bactérias não conseguem se manter estáveis no trato intestinal do animal sem um fornecimento constante do probiótico, onde as concentrações de bactérias probióticas no intestino tendem a diminuir, como verificado por Vieira et al. (2008), onde a ação do probiótico (Lactobacillus plantarum) no camarão foi apenas de 4 dias. Portanto, a metodologia proposta para seleção de microorganismos probióticos para a aquicultura deve incluir: 1) isolamento a partir do animal a ser estudado, 2) testes de seleção in vitro, 3) testes in vivo e 4) avaliação dos efeitos no animal. 3. Testes in vitro 3.1. Isolamento das cepas Embora as bactérias com este potencial sejam isoladas de várias fontes, na grande maioria das vezes, elas são extraídas do trato gastrointestinal dos hospedeiros nos quais atuarão. Este é um critério relevante para a seleção de linhagens de cepas probióticas, pois se espera que tenham melhor desempenho em ambiente semelhante àquele do qual ela foi isolada (Morelli, 2000). A origem gastrointestinal das bactérias probióticas é constatada em diversos trabalhos (Bjornsdottir et al., 2010; De Souza et al., 2010). Vale ressaltar a existência de cepas probióticas que não atuam diretamento no hospedeiro, como as biocontroladoras e biorremediadoras, que atuam no ambiente de cultivo. Ambas são microorganismos vivos, porém as biocontroladoras são antagônicas à patógenos e não colonizam o trato gastrointestinal (GI), diminuem a carga de bactérias patogênicas somente na água do ambiente de cultivo. Já as cepas biorremediadoras, melhoram a qualidade da água ou auxiliam na decomposição da matéria orgânica do cultivo, porém sem ter relação com bactérias patogênicas (Gatesoupe, 1999). Dessa forma, uma cepa pode apresentar mais de uma ação, atender a critérios simultaneamente. Por exemplo, uma bactéria bioremediadora pode decompor a matéria orgânica do ambiente e produzir compostos que diminuam a carga de bactérias patogênicas na água. É de extrema importância definir precocemente qual será o efeito probiótico que se espera obter nos animais, para que a seleção do microorganismo seja realizada baseada no caráter desejado. Por exemplo, para uma seleção que visa à melhora do sistema imune do hospedeiro, deve-se isolar microorganismos capazes de produzir compostos antimicrobianos, estimular a formação de imunoglobulinas;.

(28) 28. para uma seleção que visa o aumento da capacidade digestória, deve-se selecionar cepas que produzam mais enzimas e ácidos orgânicos; dessa forma a seleção será direcionada e eficiente, diminuindo custos e mão de obra (Mourino, 2010). 3.2. Espécies de microorganismos utilizados como probióticos Como fontes de bactérias com potencial probiótico, podem ser utilizadas bactérias dominantes no trato gastrointestinal de animais saudáveis. Mas há também possíveis patógenos com potencial probiótico que já foram utilizados com este propósito: as vibrionáceas e Pseudomonas sp. (Gatesoupe, 1999) são um exemplo. O fator que torna uma cepa, patogênica ou probiótica, é uma pequena variação genética entre elas ou mesmo o despertar de sua virulência. Para facilitar o estudo sobre os tipos de cepas probióticas, os microorganismos utilizados serão divididos em dois grupos: as bactérias Gram-negativas e as Gram-positivas. Dentre as Gram negativas, que já tiveram seu efeito probiótico comprovado, estão os gêneros: Pseudomonas sp., Aeromonas sp (A. hydrophila., A. sobria), Vibrio sp. (V. fluvialis), dentre outros (Nayak, 2010). No segundo grupo de microorganismos, os Grampositivos, estão a maioria dos probióticos utilizados em aquicultura, destacam-se os gêneros: Lactobacillus, Lactococcus, Bacillus, Enterococcus, Carnobacterium, Micrococcus, Streptococcus, Vagococcus, Aerococcus, Pediococcus e Leuconostoc. Atualmente, muitas tentativas vêm sendo realizadas com o objetivo de induzir dominância artificial destas bactérias no trato intestinal de peixes (Gatesoupe, 1999). Entre os gêneros citados, devemos destacar as bactérias ácidoláticas e os bacilos (B. subtilis, B. licheniformes, B. circulans) devido a sua capacidade de produção de compostos antimicrobianos, estimulação do sistema imune, além de secretarem enzimas digestivas, favorecendo uma maior digestão e absorção de nutrientes (Ringo e Gatesoupe, 1998; Ninawe e Selvin, 2009; Nayak, 2010; Ringo et al., 2010). 3.3. Antagonismo entre cepas probióticas Probióticos podem ser administrados na forma monoespécie ou multiespécies. Para alcançar resultados ótimos utilizando diferentes gêneros e espécies, deve-se dar ênfase ao antagonismo entre as cepas, pois uma bactéria não deve inibir a outra. Assim, evita-se a seleção de.

(29) 29. cepas resistentes a compostos produzidos por uma única cepa bacteriana. Avella et al. (2010) testaram os efeitos de uma mistura de três gêneros de Bacillus, no crescimento e sobrevivência em larvicultura e engorda de Dourada, Sparus aurata, 45 e 75 dias após a larvicultura, constatando um aumento significativo no peso e comprimento das larvas e juvenis. Segundo Nayak (2010), os estudos mais recentes têm confirmado os efeitos benéficos, tanto da forma monoespécie como da multiespécie (mistura) de cepas probióticas, em condições in vitro e in vivo. Repetidas vezes, a indução do sistema imune inato em peixes, tem sido registrada com probióticos multiespécies. Aly, Ahmed, et al. (2008) demonstraram, por testes in vitro, que Bacillus subtilis e Lactobacillus acidophilus usados conjuntamente aumentaram o efeito probiótico no animal, inibindo o crescimento de A. hydrophila e melhorando os índices de sobrevivência, de ganho de peso, valores do hematócrito, ensaio de teste do nitroazul de tetrazólio (NBT), e atividade da lisozima sérica, além de registrarem alta atividade bactericida do soro. Apesar dos compostos antibacterianos produzidos pelas candidatas probióticas e de suas propriedades inibitórias in vitro, outros critérios como: resistência ou não a antibióticos, sua natureza não hemolítica e seu potencial não patogênico precisam ser levados em consideração na seleção de uma cepa para esta finalidade (MunozAtienza et al., 2013). Nos últimos estudos percebeu-se que estas bactérias ácido-láticas tinham potencial para transferir resistências a antibióticos (Ammor et al., 2007). Atualmente é descrita em praticamente todas as espécies bacterianas a existência de resistência a antibióticos possibilitando à bactéria vantagem de sobrevivência na presença de um determinado antibiótico (Hayes e Wolf, 1990). Da mesma forma, Patel et al. (2010) isolaram uma cepa de bactéria a partir de resíduos do leite. A cepa selecionada demonstrou susceptibilidade aos antibióticos, reduzindo a possibilidade de doar genes que determinam resistência às bactérias indesejadas, se administrados sob a forma de probiótico. Nayak e Mukherjee (2011) isolaram e selecionaram bactérias do trato gastrointestinal de três espécies de carpa indiana: Labeo rohita, Catla catla e Cirrhinus mrigala para a seleção de um probiótico adequado, encontrando bactérias do gênero Aeromonas, Micrococcus, Corynebacterium, Plesiomonas, Bacillus e Pseudomonas que demonstraram atividades antibacteriana contra patógenos. Dentre eles, o.

(30) 30. B. subtilis resistiu a grandes variações de temperature, pH, concentrações salinas e demonstrou ser não patogênico, não resistente à antibióticos e não hemolítico. O estudo de Munoz-Atienza et al. (2013), investigou a atividade antimicrobiana de 99 bactérias lácticas, isoladas de animais aquáticos utilizados como alimento humano, contra patógenos de peixes e a sua susceptibilidade à antibióticos, revelando atividade antimicrobiana ampla contra os principais patógenos de peixes Gram-positivos e Gramnegativos, além da resistência à antibióticos em Weissella sp., Pediococcus sp., Lactobacillus sp. e Enterococcus sp. Alguns probióticos comerciais já atentam para o uso de cepas probióticas não resistentes a antibióticos, porém muitos não possuem comprovação científica. 3.4. Formação de esporos Tanto as cepas esporuladas como as não esporuladas, podem ser utilizadas como probióticos (Nayak, 2010). Contudo a vantagem de bactérias esporuladas é sua resistência a amplas faixas de temperatura e pH, características não atribuídas à outros probióticos. Isto se torna vantajoso na fabricação de rações suplementadas com tais microorganismos. Dentre as formas esporuladas, B. subtilis e B. licheniformes são as cepas probióticas mais comuns utilizadas em aquicultura. A maior vantagem na utilização deste grupo de bactérias como probióticos está relacionada com a facilidade de ser produzida em massa e incorporada em produtos comerciais, pois possuem a capacidade de esporulação, facilitando sua inclusão em dietas e produtos comerciais (Ochoa-Solano e Olmos-Soto, 2006). Os benefícios a longo prazo do uso de bactérias formadoras de esporos como probióticos é o fato de além de possuírem estabilidade ao calor, também podem sobreviver ao trânsito através da barreira do estômago, propriedades essas que não podem ser assegurados com probióticos fornecidos na forma vegetativa. No entanto, a maioria dos probióticos disponíveis atualmente são bactérias que não são formadores de esporos, ou seja, são fornecidas como células vegetativas (geralmente preparadas liofilizadas), apresentando bons efeitos probiótico (Huang et al., 2008). 3.5. Crescimento em diferentes concentrações de pH e resistência à sais biliares Burbank et al. (2012), isolaram 318 bactérias do trato intestinal de trutas e, usaram além de outros testes, o de resistência à sais biliares.

(31) 31. como indicador para a seleção de 24 cepas candidatas à probiótico. Neste mesmo contexto, Cai et al. (1998) utilizaram diversos critérios de seleção, dentre eles o de resistência a 10% de sais biliares, para selecionar uma cepa com potencial probiótico dos 199 microorganismos isolados do trato GI do peixe linguado (Paralichthys orbignyanus). A baixa resistência de bactérias probióticas, frequentemente constatada em ensaio de resistência a sais biliares, é consequência das condições extremas utilizadas in vitro para simular o ambiente gástrico, sendo muitas vezes usados valores de pH inferiores e tempo de exposição superiores aos encontrados in vivo. Por outro lado, outros experimentos têm demonstrado que linhagens de bactérias ácido-láticas geralmente são tolerantes às condições ácidas em estudos in vitro (De Angelis et al., 2006; Lin et al., 2007). 3.6. Resistência a diferentes temperaturas Dentre os testes realizados in vitro durante a seleção de uma bactéria candidata a probiótica está a curva de crescimento ideal em diferentes temperaturas (Vijayan et al., 2006). Dessa forma, busca-se a faixa na qual a bactéria sobrevive e a temperatura ideal onde atuará no máximo de sua eficiência. Poffo e Da Silva (2011) caracterizaram fisiologicamente algumas bactérias ácido-láticas com potencial probiótico, isolado de sardinhas, Sardinella brasiliensis, a fim de definir a temperatura ideal para o seu crescimento. 4. Testes in vivo Na seleção de cepas com potencial probiótico é comum procederse aos testes in vitro para avaliar a viabilidade dos micro-organimos como probióticos e, a partir daí, realizar os testes in vivo. Quando são realizados testes in vivo, é comum identificar a microbiota endógena, nativa do trato gastrointestinal do hospedeiro, e compará-la com a microbiota que se estabeleceu no trato após a administração de uma dieta enriquecida com probiótico. Isto leva à constatação da alteração e da colonização de tais cepas no trato do hospedeiro. Divya et al. (2012) conduziram um estudo para avaliar o estabelecimento de Bacillus coagulans, Bacillus mesentericus, e Bifidobacterium infantis no intestino de pós-larvas do peixe ornamental Puntius conchonius, alimentadas com copépodos enriquecidos com tais microorganismos, demonstrando uma colonização significativa no.

(32) 32. intestino dos peixes, bem como efeitos significativos na diminuição de patógenos do intestino. Outros fatores também devem ser levados em consideração quando procede-se aos testes in vivo de cepas probióticas, como o modo de suplementação, a concentração oferecida e o período de oferta. Estimar a dose ou a concentração ideal de probiótico é necessário não só para a proliferação adequada das bactérias no intestino, mas também para obter os efeitos benéficos causados pelas mesmas, incluindo sua atividade imunoestimulante. Vários estudos têm demonstrado que as respostas imunes dos peixes variam em função da concentração de probióticos. Normalmente a dose ideal é definida por meio de regressão baseando-se na melhora do crescimento e da proteção do hospedeiro. Brunt et al. (2007) administraram em truta arco-íris, Bacillus sp isoladas do trato gastrointestinal de tilápias, definindo a dose ideal de 2 x 10 8 cél/g e constatando redução nos índices de mortalidade causada por bactérias patogênicas. Em aquicultura costuma-se usar doses que variam de 106 à 1010 CFU/g ração (Nayak, 2010b). Song et al. (2006) registraram aumento da atividade da lisozima no soro sanguíneo e na pele de M. miiuy nas doses 107 e 109 CFU/ de C. butyricum/g ração, respectivamente. Doses altas também podem causar mortalidade nos hospedeiros, como registrado por (Nikoskelainen et al., 2001). Portanto, é necessário se estabelecer a dose ideal para cada cepa probiótica em cada hospedeiro. O período de administração do probiótico também é um fator importante. Na maioria dos peixes, entre 1 à 10 semanas de tratamento, percebe-se um ganho de peso, e a melhora dos parâmetros imunes e resistência à doenças (Nayak, 2010). O tempo de fornecimento varia conforme o tipo de cepa e com o parâmetro imune em questão que se deseja modular. Analisando um mesmo parâmetro, constata-se diferenças nas respostas imunológicas, causadas pelo período de oferta. Incremento da atividade de “burst” respiratório foi detectado em peixes alimentados durante 60 dias com suplementação probiótica (DiazRosales et al., 2009). Porém, em ensaio anterior, foi verificado efeito antagônico quando o probiótico foi ofertado por um período mais curto, de 4 semanas. Além disso, nem sempre maiores períodos de oferta do probiótico garantirão melhores efeitos estimulantes no animal. Enquanto alguns pesquisadores acreditam que um regime de alimentação longo não é necessário, o regime mais curto de alimentação pode causar diminuição acentuada na resposta imune nos peixes (Panigrahi et al., 2005). Esse tipo de declínio pode acontecer devido à.

(33) 33. dificuldade das bactérias de probióticos para se estabelecerem e se multiplicar no intestino. Embora se saiba que o modo de administração dos probióticos mais eficaz seja pela alimentação, devido a maiores índices de colonização do trato GI, esta não é sua única forma de uso. Probióticos também são utilizados diretamente na água de cultivo, causando efeitos benéficos ao ambiente e ao hospedeiro (Zhou et al., 2010) ou podem ser incorporadas em rotíferos e artêmias em larviculturas de peixes (Picchietti et al., 2007; Picchietti et al., 2009a). 5. Modo de ação Benefícios ligados à administração de probióticos são: exclusão competitiva de bactérias patogênicas (Vine et al., 2004), fonte de nutrientes e enzimas digestivas (Mehrabi et al., 2012), modulação do sistema imunológico (Panigrahi et al., 2004), produção de compostos antimicrobianos como bacteriocinas e ácidos orgânicos (Balcazar, Vendrell, et al., 2007; Mandiki et al., 2011). 5.1. Colonização da microbiota intestinal Segundo Furlan (2004), as bactérias no trato gastrointestinal podem ser encontradas associadas ao epitélio ou livres na luz intestinal. As livres devem-se multiplicar rapidamente a fim de compensar a eliminação pelo movimento peristáltico intestinal, ou mesmo aglutinarem-se às demais bactérias aderidas na mucosa intestinal. Existe ainda um prolongamento polissacarídeo do enterócito em direção à luz intestinal denominado glicocálix ou fímbria. O processo de aderência das bactérias é feito por meio de polissacarídeos, moléculas de açúcares ramificados, que se estendem da parede externa da bactéria formando uma estrutura (glicocálix), que envolve a célula ou mesmo uma colônia de bactérias. Essa estrutura apresenta outras funções importantes, como a manutenção da camada aquosa próxima a mucosa intestinal, em pH neutro, que permite a ação de enzimas de membrana. Dessa forma, o mecanismo regulador da colonização das bactérias no epitélio intestinal parece estar baseado na dependência da aderência do glicocálix de uma bactéria com o glicocálix do enterócito. Essa ligação entre glicocálix, estudos apontam em muitos casos, pode ser mediada por uma lectina, que se liga especificamente a um polissacarídeo. Vale a pena ressaltar, também, que estudos verificaram que os microorganismos quando em meio de cultura não produzem o glicocalix, aparentemente utilizando as reservas para multiplicação, e não aderência, a qual não é necessária nestas circunstâncias..

(34) 34. 5.2. Inibição competitiva O antagonismo é um fenômeno comum na natureza, onde interações bacterianas desempenham papel importante no equilíbrio da microbiota intestinal entre as bactérias benéficas e as potencialmente patogênicas. A quebra desse equilíbrio é resultante de más práticas de manejo, ração de baixa qualidade, qualidade de água precária, além de estresse e fatores ambientais, podem estimular a proliferação de bactérias patogênicas no hospedeiro (Ringo e Gatesoupe, 1998). A colonização do trato gastrointestinal dos animais por probióticos se torna possível após o surgimento e antes da instalação definitiva de uma microbiota endógena competitiva. Após essa instalação, somente a adição de doses elevadas de probiótico provocará a alteração na microbiota natural presente e sua posterior manutenção (Nikoskelainen et al., 2003; Vieira et al., 2008; Mourino et al., 2012). Dessa forma, probióticos comerciais muitas vezes são relativamente ineficazes, por não serem específicos da espécie de peixe trabalhada são incapazes de sobreviver ou permanecerem viáveis em uma concentração ideal e efetiva no intestino, uma vez que a flora intestinal endógena dos animais já se encontra formada (Ghosh et al., 2007) A colonização é caracterizada pela adesão das bactérias à superfície da mucosa, ou por associação ao muco ou por aderência as células epiteliais. A adesão aos sítios e colonização da mucosa são mecanismos de defesa contra patógenos através da competição por ligações locais e nutrientes (Westerdahl et al., 1991; Korkea-Aho et al., 2011). O processo se inicia com a entrada da bactéria por meio de partículas de alimentos ou água, seguindo até o trato digestivo onde podem ser mantidas como parte residente da microflora. Outras são destruídas por processos digestivos ou eliminadas nas fezes. No trato, o crescimento bacteriano pode ser inibido por um conjunto de compostos antimicrobianos produzidos pelo hospedeiro, como: proteases, bacteriocinas (principalmente bactérias ácido lácticas), lisozimas, peróxido de hidrogênio, além de diminuir o pH pela produção de ácidos orgânicos (Gram et al., 1999; Gatesoupe, 2008; Ferguson et al., 2010; Korkea-Aho et al., 2011; Boutin et al., 2012; Del'duca et al., 2013). 5.3. Fonte de nutrientes e enzimas digestivas De acordo com Ray et al. (2012), a digestão dos alimentos depende de três fatores principais: (i) a ingestão de alimentos e a medida em que o alimento é susceptível aos efeitos de enzimas digestivas, (ii) a atividade das enzimas e o tempo que o alimento está exposta à ação das.

(35) 35. enzimas digestivas. Cada um desses fatores é afetado por uma série de fatores secundários como, por exemplo, pela contribuição da microbiota do intestino dos peixes. Devido à complexidade e a ecologia variável do trato digestivo de diferentes espécies de peixes, a presença do estômago, dos cecos pilóricos e o comprimento do intestino é difícil avaliar a contribuição exata da microbiota gastrointestinal. A microflora probiótica é capaz de aumentar a digestibilidade com a produção de enzimas digestivas, produção de vitaminas do complexo B (ácido fólico), redução do pH do trato através da produção de ácidos graxos de cadeia curta, regulação dos movimentos peristálticos, absorção de minerais como o cálcio e síntese de colesterol (Vine et al., 2006; Dimitroglou et al., 2011; Parfenov e Bondarenko, 2012; Cornélio et al., 2013). A hidrólise enzimática bacteriana pode aumentar a biodisponibilidade de proteínas e de gordura e aumentar a liberação de aminoácidos livres. Além de ácido lático, ácidos graxos de cadeia curta, como propiônico e butírico, também são produzidos pelas bactérias láticas. Quando absorvidos, esses ácidos graxos contribuem para o pool de energia disponível do hospedeiro e podem proteger contra mudanças patológicas na mucosa do cólon. Além disso, uma concentração mais elevada de ácidos graxos de cadeia curta auxilia na manutenção de um pH apropriado no lúmen do cólon, crucial para a expressão de muitas enzimas bacterianas sobre compostos estranhos e sobre o metabolismo de carcinógenos no intestino (Kopp-Hoolihan, 2001). Adicionalmente, o butirato, além de fornecer energia para as células epiteliais, proteção contra enterites, aumenta a proliferação e diferenciação destas células, aumentando a altura das vilosidades intestinais e o consequente aumento da absorção de nutrientes (Galfi e Bokori, 1990). Estudos demonstram que a microbiota intestinal é influenciada pela composição da dieta. Pedrotti et al. (2013) descreveram que para peixes onívoros (tilápias e jundiás) alimentados com diferentes fontes de carboidratos na dieta, houve alteração na microbiota intestinal, influenciando níveis de bactérias amilolíticas, celulolíticas, lipolíticas, proteolíticas e bactérias totais cultiváveis nos tratos dos peixes amostrados. Os primeiros estudos com produção de enzimas de bactérias intestinais de peixes são datados da década de 70 (Hamid et al., 1979). A seguir é apresentada uma tabela com dados recentes de produção de enzimas por bactérias isoladas do trato intestinal de peixes relacionadas à nutrição de peixes..

(36) Carpas Labeo bata Labeo rohita. Bacillus licheniformis; B. subtilis. Bacillus cereus; B. circulans; B. pumilus. Piaractus mesopotamicus. Bacillus subtilis, B. velesensis. Citrobacter sp.;Enterobacter sp.;Bacillus coagulans , Bacillus cereus, Bacillus sp.. Cyprinus carpio. Aeromonas sp.. *Quadro continua na página seguinte.. Protease. Carpas. Labeo bata. Bacillus licheniformis; Bacillus subtilis. Citrobactersp.;Enterobactersp.;Bacillus coagulans, Bacillus cereus , Bacillus sp. Citrobacter freundii. Gadus morhua. Brochothrix sp. e Brochothrix thermosphacta. Celulase. Salmo salar. Bacillus thuringiensis, B. cereus, Bacillus sp, Bacillus subtilis e Acinetobacter sp.. Amilase. Fonte de isolamento. Microorganismo. Enzima produzida. Quadro 1: Microorganismos produtores de enzimas isolados do trato intestinal de peixes.. 36. Ghosh et al., 2002. Mondal et al., 2010). Ray et al., 2010. Peixoto et al., 2011. Jiang et al., 2011. Ray et al., 2012. Mondal et al., 2010. Askarian et al., 2012. Askarian et al., 2012. Referência. 36.

(37) Quitinase. Fitase. Lipase. Bacillus subtilis; B. atrophaeus Marinobacter lutaoensis, Ferrimonas balearica, Pseudoalteromonas piscicida, Enterovibrio norvegicus, Grimontia hollisae, Photobacterium damselae spp. damselae, P. leiognathi, P. lipolyticum, P. phosphoreum, P. rosenbergii, Vibrio campbelli, V. chagasii, V. fischeri, V. fortis, V. gallicus, V. harveyi, V. natrigenes, V. nigripulchritudo, V. ordalii, V. parahaemolyticus, V. pomeroyi, V. ponticus, V. proteolyticus.. Agrobacterium; Pseudomonas; Brevibacterium; Microbacterium; Staphylococcus Vibriospp.,Acinetobacterspp. Enterobacteriaceae, Pseodomonasspp. Bacillus licheniformis Teleosteos Peixes da japonesa costa. Khan et al., 2011 Itoi et al., 2006. Roy et al., 2009. Gatesoupe, 1997. Dicentrarchus labrax. Peixes teleosteos. Ringo et al., 1995. Salvelinus alpinus. 37. 37.

(38) 38. O estudo dos probióticos aponta para vários mecanismos de ação conjunta da adição de bactérias probióticas e os efeitos benéficos de sua utilização em seu hospedeiro e entre estes efeitos é comum a melhora do desempenho relacionado à nutrição do animal, seja pela produção suplementar de enzimas e vitaminas, pelo aumento do crescimento, pelo aumento da eficiência alimentar ou mesmo na prevenção de desordens nutricionais incluindo a pré-digestão de fatores anti-nutricionais presentes em alguns ingredientes (Thompson et al., 1999; Verschuere et al., 2000). Após a passagem pelo estômago, na colonização ou mesmo durante a passagem pelo trato intestinal, as bactérias usam diversas fontes de açúcares (carboidratos) para seu crescimento e chegam a produzir uma gama de enzimas digestivas durante este processo, o que auxilia na digestão do alimento (El-Haroun et al., 2006). Efeitos significativos na melhora do crescimento e digestibilidade, também foram observados por De Rodriganez et al. (2009), quando ofereceram dieta enriquecida com duas cepas probióticas da família Alteromonadaceae, para juvenis de Linguado, Senegalese sole. A ação de microorganismos durante a fabricação de produtos contendo culturas ou no trato digestivo influencia favoravelmente a quantidade, a biodisponibilidade e a digestibilidade de alguns nutrientes da dieta. A fermentação de produtos lácteos por bactérias láticas pode aumentar a concentração de determinados nutrientes, como vitaminas do complexo B. As bactérias láticas caracterizam-se pela liberação de diversas enzimas no lúmen intestinal. Essas enzimas exercem efeitos sinérgicos sobre a digestão, aliviando sintomas de deficiência na absorção de nutrientes (Kopp-Hoolihan, 2001). 5.4. Produção de compostos inibitórios Diversos trabalhos na literatura confrontam bactérias probióticas com microorganismos patogênicos, a fim de verificar o potencial de inibição das bactérias probióticas frente as patogênicas. Burbank et al. (2012) isolaram e testaram, in vitro, bactérias do trato gastrointestinal de trutas quanto à sua capacidade para inibir o crescimento de Flavobacterium psychrophilum, o agente causador da doença de água fria, descobrindo assim, algumas cepas com o potencial de reduzir ou controlar tal doença. De maneira semelhante Brunt et al., (2007) isolaram cepas probióticas de truta arco-íris e carpa (Ciprinus sp.) que demonstraram bons resultados na redução da mortalidade.

(39) 39. quando os hospedeiros foram infectados com Bacillus sp. e A. sobria, respectivamente. A eficácia probiótica de uma bactéria de origem humana, Lactobacillus rhamnosus também foi constatada na inibição do crescimento de bactérias patogênicas de peixes e rãs (Pirarat et al., 2009). As bactérias ácido-láticas são capazes de secretar peptídeos antimicrobianos e são utilizadas na conservação de alimentos, assim como promotor de saúde em humanos e animais. Bacteriocinas produzidas por bactérias ácido-láticas são classificados em três grupos principais, sendo os lantibióticos o grupo mais documentado e explorado industrialmente. Lantibióticos (Classe I), não-lantibióticos, pequenos peptídeos termoestáveis (Classe II), e grande proteína lábil ao calor (Classe III) (O'sullivan et al., 2002). Estudos indicam que estas substâncias probióticas antibacterianas exercem seus efeitos inibitórios de patógenos, sozinhas ou sinergicamente. Os componentes lantibióticos, produzidos por bactérias Gram positivas, como Lactococcus lactis, são pequenos peptídeos antimicrobianos. Estes peptídeos foram encontrados ativos em concentrações de nanomolares para inibir patógenos, atingindo os componentes lipídicos da parede celular bacteriana (Vanderpool et al., 2008). Cepas de Lactobacillus produzem amplo grupo de bacteriocinas com sequências divergentes. Estes peptídeos apresentam um espectro relativamente estreito de atividade e na sua maior parte, são tóxicos para bactérias Gram-positivas, como Lactococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Listeria e micobactérias. O principal mecanismo de ação é por meio da formação de poros na membrana citoplasmática de bactérias sensíveis, podendo também interferir nas atividades essenciais de enzimas em espécies mais sensíveis (Vanderpool et al., 2008). Ainda no conceito de produção de compostos antimicrobianos pelas bactérias probióticas, Vazquez et al. (2005) selecionaram microorganismos, confrontando bactérias ácido-láticas com bactérias patogênicas de Scophthalmus maximus e constataram que os responsáveis pelos efeitos inibitórios das bactérias patogênicas não eram as bacteriocinas das bactérias ácido-láticas, e sim, os ácidos acético e lático produzidos pelas mesmas. Bactérias ácido-láticas isoladas de rãtouro (Rana catesbeiana) de cultivo, também inibiram o crescimento de uma cepa patogênica pela produção de ácidos orgânicos (Pasteris et al., 2009). Na dieta, os ácidos orgânicos funcionam como agentes de conservação, reduzindo o pH do alimento, inibindo o crescimento.

(40) 40. microbiano e diminuindo a absorção de organismos patogênicos. No trato intestinal dos animais, os ácidos orgânicos inibem o crescimento de bactérias, principalmente as Gram-negativas. Os ácidos na sua forma não ionizada entram pela parede das bactérias e realizam a liberação de prótons no citoplasma, onde estas consomem uma grande quantidade de ATP para exportar os prótons do interior da célula para fora, tentando manter o equilíbrio do pH intracelular. Esse gasto de ATP resulta em uma depleção de energia celular e posteriormente a morte (Luckstadts, 2008). 6. Imunomodulação Ao encontro da imunomodulação, as cepas de bactérias ácidoláticas e/ou probióticas protegem os peixes de possíveis infecções por bactérias patogênicas, pois diminuem a mortalidade significativamente após infecções experimentais relatadas por Balcazar et al. (2007) e comprovadas por Balcazar et al. (2010). O efeito do uso de probiótico na defesa de peixes contra microorganismos patogênicos analisando diferentes respostas imunológicas tais como: interações com células do intestino; efeitos em células hematológicas relacionadas com defesa inata e aumento na concentração de compostos sanguíneos de respostas imunes inatas e adaptativas, será abordado a seguir. 6.1. Efeito nas células imunológicas da mucosa intestinal A proteção contra patógenos dos probióticos causada pela competição pela adesão da parede do intestino é bem estudada em peixes e comprovada anteriormente por alguns autores (Rombout et al., 2011) O aumento da concentração de linfócitos T no intestino de larvas de robalo (Dicentrarchus labrax) alimentadas com bactéria probiótica foi relatado recentemente por Picchietti et al. (2009), comprovando o que já era esperado, que os linfócitos estão presentes em abundância no muco da parede intestinal de peixes. Em teleósteos, o nível de organização do sistema linfóide associado ao intestino é inferior ao de mamíferos, porém é mais difundido, contendo uma grande quantidade de células linfóides, macrófagos, eosinófilos e neutrófilos granulares. Por outro lado, ainda não existe consenso sobre a presença de células dendríticas em peixes. Dentre essas células destacam-se os macrófagos encontrados em carpas, os quais possuem grande capacidade ligante. Essas células podem carregar antígenos do lúmen para posterior degradação na.

(41) 41. superfície do intestino. Os granulócitos (neutrófilos, eosinófilos e basófilos) em geral possuem capacidade de produzir e liberar triptase, peptídeos antimicrobianos como lisozima, piscidina, entre outros; os quais são altamente relacionados com respostas inflamatórias no intestino. 6.2. Interação com células imunes As concentrações de células sanguíneas em geral, assim como os parâmetros hematológicos sofrem alterações positivas em peixes alimentados com cepas de bactérias probióticas. Essas alterações podem ser tanto em quantidade como qualidade. Por exemplo, o valor do hematócrito (quantidade de células vermelhas em circulação) aumenta significativamente em tilápias-do-nilo alimentadas com uma mistura de probiótico (Bacillus subtilis e Lactobacillus acidophilus), como comprovado pelo estudo de Aly et al. (2008). Os leucócitos são células de defesa dos peixes que desempenham um papel importante durante uma infecção. Acredita-se que essas células comportam-se da mesma maneira que em outros vertebrados, no qual os probióticos interagem com as células do sistema imune através de células especializadas do epitélio do intestino, induzindo assim a sua multiplicação. Essa ativação e multiplicação de leucócitos totais foram observadas em tilápias alimentadas com L. plantarum (Jatoba et al., 2011); em trutas alimentadas com Bacillus e E. faecium (Merrifield, Dimitroglou, Bradley, 2010) e em juvenis de robalo (Centropomus parallelus) alimentados com L. plantarum (Barbosa et al., 2011). Nos trabalhos citados anteriormente de Jatoba et al. (2011) e Barbosa et al. (2011) também foi relatado um aumento na concentração de linfócitos em peixes alimentados com cepas probióticas. A abundância de linfócitos no sangue pode ser considerada um indicador de saúde de peixes, uma vez que essas células desempenham uma ação importante no sistema inato e adaptativo na defesa de peixes teleósteos. Outros trabalhos também relatam o aumento de linfócitos sanguíneos em robalo (Picchietti et al., 2009b), em tilápias (Aly, Ahmed, et al., 2008) e em trutas arco-íris Newaj-Fyzul et al. (2007), após alimentações com dietas contendo probióticos. Os linfócitos-B constituem a defesa inata dos peixes enquanto os linfócitos-T são responsáveis por respostas mediadas por outras células, ou seja, precisam de um estímulo prévio (Magnadottir, 2010). Porém poucos estudos demonstram a relação de aumento ou redução dessas células em relação à alimentação de peixes com bactérias probióticas presentes na dieta (Rombout et al., 2011)..

(42) 42. As imunoglobulinas são produzidas e secretadas pelos linfócitosB como anticorpos e desempenham um papel imunológico importante em peixes teleósteos (Choi e Kim, 2011). O nível de imunoglobulina em trutas arco-íris aumentou significativamente após alimentação com probiótico após apenas uma semana (Nikoskelainen et al., 2003). Esse resultado foi confirmado por Panagrahi et al. (2005), onde suplementações de bactérias acido-láticas na dieta, tanto na forma viva como na forma morta, induziu aumento na concentração de imunoglobulina no plasma de trutas arco-íris. Esse aumento na concentração de imunoglobulinas totais no sangue dos peixes ocorreu também em tilápias-do-nilo alimentadas com Bacillus sp. e Lactobacillus sp. (Ridha e Azad, 2012); em surubins híbridos, Pseudoplatystoma sp., alimentados com dietas contendo Weissella cibaria (Mouriño et al., 2012); e em bagres africanos, Clarias gariepinus, após alimentação de dietas suplementadas com Lactobacillus acidophilus. Assim como descrito acima, Panigrahi et al. (2009) também relataram aumento da atividade fagocítica em peixes após alimentação com cepas probióticas. Este aumento de atividade fagocítica da parte anterior do rim pode ser visto em trutas arco-íris, alimentadas com diferentes cepas probióticas (Lactococcus lactis ssp, Leuconostoc mesenteroides, and Lactobacillus sakei) (Balcazar et al., 2007). Porém, deve-se tomar cuidado com a forma de administração dos mesmos, pois trabalhos comprovam que a forma de administração das cepas na dieta probióticas influencia ou não na melhor atividade de fagocitose (Panigrahi et al., 2005). As células fagocitárias, tais como os neutrófilos e macrófagos, desempenham papel importante na defesa antibacteriana, pois combatem bactérias pela produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), entre elas os ânions superóxidos (O 2-); peróxido de hidrogênio (H2O2) e radicais livres hidroxilas (OH-) durante a atividade respiratória (Ellis, 1999). A produção de ânions superóxidos foi observada por Panigrahi et al. (2005) em trutas arco-íris alimentadas com probióticos e outros estudos demonstram que a administração de probióticos Lactobacillus rhamnosus em dietas de peixes estimulam a atividade respiratória (Nikoskelainen et al., 2003). Os estudos de potencial de atividade respiratória utilizam metodologias específicas (Puangkaew et al., 2004) as quais induzem essa atividade, não querendo dizer que os peixes estavam com essa concentração de atividade respiratória alta continuamente. Todavia,.