TÍTULO: SÍNTESE E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE TRIPANOCIDA DA SUBSTÂNCIA (-)-6,6’-DINITROHINOQUININA
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: BIOMEDICINA SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE DE FRANCA INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): SUZIENE CAROLINE DA SILVA AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): VIVIANE RODRIGUES ESPERANDIM ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): ANA CAROLINA BOVO BOLELA CÂNDIDO, DANIELE DA SILVA FERREIRA, MÁRCIO LUÍS ANDRADE E SILVA, MARIA GABRIELA MARÇAL, MARIANA CINTRA PAGOTTI, THAÍS COELHO LIMA
RESUMO
A doença de Chagas é considerada como uma doença tropical, que vem se tornando um desafio para os pesquisadores. Estudos na literatura destacam a importância de substâncias de origem vegetal atuando sobre o Trypanosoma. cruzi. Este trabalho teve como objetivo a avaliação da atividade tripanocida em formas tripomastigotas e amastigotas in vitro e avaliação citotóxica utilizando o Benzonidazol para comparações da amostra (-)-6,6’-dinitrohinoquinina.
A substância (-)6,6’-dinitrohinoquinina, apresentou os seguintes resultados: nos ensaios de atividade tripanocida in vitro com valor de IC50 de 19,83 µM e valores de porcentagem de lise em torno de 78,4% e 69,4% nas concentrações de 200 e 100 µM, respectivamente. Na avaliação da atividade tripanocida em amastigotas in vitro a (-) 6,6'-dinitrohinoquinina apresentou o valor de IC50 de 145,6 µM e valores de porcentagem de lise em 55,6% e 45,4% nas concentrações de 200 e 100 µM respectivamente. E na avaliação de citotoxicidade a substância (-)-6,6’-dinitrohinoquinina demonstrou-se ser desprovida de efeito citotóxico.
1. INTRODUÇÃO
Reconhecida pela Organização Mundial da Saúde (OMS), a doença de Chagas, está entre as 17 doenças tropicais negligenciadas do mundo, sobretudo na América Latina, onde se estima que existam 28 milhões de pessoas sob o risco de contrair a infecção, entre 7 a 8 milhões de indivíduos infectados (OMS 2014).
No Brasil, avalia-se em torno de dois a três milhões de infectados, dos quais aproximadamente 60% estariam vivendo em áreas urbanas (SIQUEIRA et al., 2007). Assim, a infecção chagásica no Brasil é ainda preocupante (WHO, 2003).
A doença de Chagas, tem por agente causal o Trypanosoma cruzi (OLIVEIRA et al., 2008) e sua transmissão natural ocorre pela picada do inseto vetor, que introduz no organismo as formas tripomastigotas metacíclicas (STUART et al., 2008).
Se não houver tratamento a doença de chagas pode evoluir para uma fase crônica assintomática.(FABBRO et al, 2013).
As drogas atualmente disponíveis para o tratamento da doença de chagas são o Benzonidazol e o Nifurtimox, que apresentam reações adversas ao medicamento (VIOTTI et al, 2006). Devido alto custo, baixa eficiência e eficácia apenas em uma das fases da doença, torna-se necessário a busca por novos fármacos (ALVIANO et al, 2012).
O uso de plantas medicinais está despertando atenção aos pesquisadores. Algumas plantas medicinais tem demonstrado bastante eficácia contra o
Trypanosoma cruzi na doença de chagas (MESCHINICK; DOBSON, 2001).
Dentre essas plantas medicinais que devem ser exploradas, estão as que pertencem ao gênero Piper (JUNQUEIRA et al, 2007), pertencente à família Piperaceae. Tem sido extraída desta planta a (-)-cubebina (SIMÕES et al., 1999), esta tem se mostrado biologicamente ativa.
A (-)-hinoquinina, obtida atráves da (-)-cubebina, lignana dibenzilbutirolactônica, exibe significativa atividade tripanocida em in vivo ou in vitro, demostrando atividade tripanocida (DE SOUZA et al., 2005)
A 6,6’-dinitrohinoquinina usada em nosso estudo, é obtida a partir da (-)-hinoquinina, exibe atividade esquistossomicida (Patente INPI), porém poucos estudos foram realizados referentes à atividade tripanocida.
2. OBJETIVO
O presente trabalho teve por objetivo avaliar a atividade tripanocida in vitro do composto (-)-6,6’-dinitrohinoquinina nas formas tripomastigotas e amastigotas e avaliar a atividade citotóxica deste composto.
3. METODOLOGIA Substância analisada
Foi avaliado a substância 6,6’-dinitrohinoquinina, derivada da (-)-hinoquinina, sintetizada através do Laboratório de Pesquisa em Produtos Naturas da Universidade de Franca – UNIFRAN.
Avaliação da atividade tripanocida in vitro
O ensaio foi realizado utilizando sangue de camundongos albinos infectados com as formas tripomastigotas, onde foram encubadas com a amostra (-)-6,6’-dinitrohinoquinina, em placa de 96 poços a 4°C por 24 horas. A atividade foi verificada quantitativamente de acordo com a técnica por contagem em Câmara de Neubauer comparando com o controle e sendo expressa pelo cálculo de IC50, que representa a dose mínima da droga capaz de eliminar 50% dos parasitos.
Avaliação da atividade tripanocida sobre as formas amastigotas
Avaliação da atividade tripanocida sob formas amastigotas foram realizados em cultura de células, contendo as formas tripomastigotas que foi removido das culturas celulares sendo centrifugado para que as tripomastigotas permaneçam no sobrenadante e as células no sedimento. É feita a coloração pelo método de Giemsa para verificar quantitativamente as células infectadas para determinar a porcentagem de redução parasitária. Como controle positivo foi utilizado o benzonidazol e controle negativo 0,5% de DMSO.
Avaliação da atividade citotóxica
Foram utilizados fibroblastos da linhagem LLCMK2 foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado.A cultura foi incubada em garrafinhas a 37 ºC e 5% de CO2, em estufa umidificada, para obtenção das células para ensaios. Para avaliar a citotoxicidade sobre a linhagem LLCMK2 foi empregado o método da solução de
Turk, onde são coradas as células viáveis. Em comparação com o controle, foi determinada pelo cálculo da concentração citotóxica para 50% das células (IC50). Realizou-se à leitura da placa em leitor de ELISA, através da técnica colorimétrica pelo MTT.
4. DESENVOLVIMENTO
Avaliação da atividade tripanocida em formas tripomastigotas com sangue infectado Utilizou-se sangue de camundongos albinos infectados, obtido por punção cardíaca no pico parasitêmico (7° dia da infecção). O sangue infectado foi diluído com solução fisiológica de forma de se obter uma concentração final de sangue com 106 formas tripomastigotas/mL.
A amostra (-)-6,6’-dinitrohinoquinina foi diluída em DMSO e alíquota desta solução estoque foi adicionada ao sangue infectado na placa de microtitulação (96 poços), totalizando um volume de 200 µL.
Para a realização do ensaio tripanocida, a amostra foi avaliada em triplicata nas concentrações de 200, 100, 50, 25 e 12.5 µM. Como controles foram utilizados: (1) Controle positivo: 25% de DMSO; (2) Controle negativo: 0,5% de DMSO.
A microplaca foi incubada a 4C por 24 horas, após este período, a atividade foi verificada quantitativamente, através da contagem das formas tripomastigotas, de acordo com a técnica por contagem em câmara de Neubauer, e determinação da porcentagem de lise parasitária, através da comparação com o grupo de controle sem tratamento.
Avaliação da atividade tripanocida sobre as formas amastigotas
Os ensaios sobre as formas amastigotas foram realizados em cultura de células LLCMK2, sendo cultivadas em meio RPMI 1640, suplementado com 2mM de L-glutamina, 10mM de NaHCO3, 100U/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina e 5% de soro bovino fetal inativado. O meio contendo as células foi aliquotado em microplacas de 24 poços, sendo esse sistema incubado por 24 horas a 37oC em ambiente a 5% de CO2, com umidade de 95%. O meio de cultura contendo as formas tripomastigotas foi removido das culturas celulares e submetido a uma centrifugação a 760 rpm, durante 8 minutos, a 12°C, para que desta forma as tripomastigotas permaneçam no sobrenadante e as células no sedimento. Serão
adicionadas à microplaca, 1x106 formas tripomastigotas e incubadas durante 48 horas. Uma solução estoque foi preparada pela dissolução das substâncias em 100% de dimetilsulfóxido (DMSO), e alíquota desta solução estoque foi adicionada ao meio infectado, de forma a se obter concentrações finais de 200, 100, 50, 25, 12.5. (µM).
Após esse período, a amostra em análise foi adicionada permanecendo incubada por 48 horas e em seguida será realizado o processo de coloração pelo método de Giemsa. A determinação da atividade foi verificada quantitativamente, através da contagem de células infectadas e determinação da porcentagem de redução parasitária, através da comparação com o controle.
Em paralelo foi realizado o controle negativo (DMSO 0,5%) e controle positivo (Benzonidazol). O ensaio foi realizado em triplicata.
Avaliação da atividade citotóxica
Fibroblastos da linhagem LLCMK2 foram cultivadas em meio RPMI 1640, suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado (100 ml de soro) + 5 ml de antibiótico, em garrafas de cultura a 37ºC em ambiente a 5% de CO2, com umidade de 95%. No dia do experimento, a garrafinha foi riscada com a ponteira (pipeta de 5 ml) enxaguando a superfície, transferindo o meio com as células para um tubo fálcon estéril. Em seguida, o mesmo deve ser centrifugado sob as condições de: 1500 rpm a 4ºC durante 15 minutos. Após a centrifugação, o tubo foi invertido para retirada do sobrenadante e foram acrescentados 1mL de RPMI completo. Da solução de células foram retirados 10 µL e acrescentados 990 µL de solução de TURK. O corante desta solução é capaz de corar as células viáveis, ou seja, as células que devem ser contadas. Desta nova solução, foram retirados 10 µL para a realização da contagem em câmara de Neubauer. Os valores encontrados foram somados e divididos por 4, com a finalidade de se obter um valor médio. Após o acerto do número de células para 106, retirou-se desta solução um volume de 100 µL, que então foi adicionado nos poços da microplaca.
Para a realização do ensaio de citotoxicidade, as amostras foram avaliadas nas concentrações de 400, 200, 100, 50, 25, 12.5 e 6.25 µM. Como controles foram utilizados: (1) Controle positivo: 25% de DMSO; (2) Controle negativo: 100 µL de meio com células + 0,5% de DMSO; (3) Controle negativo: 100 µL de meio com células + 100 µL de RPMI completo.
Após esse procedimento, a placa foi incubada na estufa de CO2 por um período de 24 horas. No término desse período, procedeu-se à leitura da placa em leitor de ELISA, através da técnica colorimétrica pelo MTT.
4. RESULTADOS
Atividade tripaocida em tripomastigotas
A substância (-)-6,6’-dinitrohinoquinina no ensaio tripanocida para formas tripomastigotas teve o valor de IC50 de 19,53 M o que aponta um resultado promissor pois quanto menor o valor de IC50 em formas de tripomastigotas, melhor a atividade tripanocida, pois significa que precisaríamos apenas de uma quantidade mínima da amostra para lisar 50% dos parasitas. Tabela 1.
Tabela 1. Resultados da avaliação da atividade tripanocida in vitro Substâncias % de lise±D.P./concentração (µM)
200 100 50 25 12,5 IC50
(µM) 1 78,4±1,2 69,4±3,1 65,2±1,2 52,7±2,4 43,0±1,2 19,83
1. (-)-6,6’-dinitrohinoquinina
Controle negativo: DMSO 0,5%; Controle positivo: DMSO 25%.
Atividade tripanocida em amastigotas
No ensaio tripanocida para formas amastigotas o valor de IC50 foi de 145,6 µM considerado desta forma um valor muito acima do observado para o Benzonidazol (53,2 µM), medicamento utilizado para o tratamento da doença de Chagas, que de acordo com Filho e Augusto(38), apresenta efeitos colaterais como a dermatite e a polineuropatia.Tabela 2.
Tabela 2. Resultados da avaliação da atividade tripanocida em amastigotas in vitro Substâncias % de lise±D.P./concentração (µM)
1 55,6±2,4 45,4±9,1 34,5±5,5 23,1±6,1 26,8±0 145,6 1. (-)-6,6’-dinitrohinoquinina
Controle negativo: DMSO 0,5%; Controle positivo: DMSO 25%.
Avaliação da atividade citotóxica
Na avaliação citotóxica podemos observar que a substância (-)-6,6’-dinitrohinoquinina é desprovida de efeito citotóxico, uma vez que a porcentagem de células viáveis chega a 99% nas maiores concentrações empregadas, ou seja, nas concentrações de 200 e 400 M e o seu valor de IC50 de 583,3 M. Em paralelo utilizamos para comparação o Benzonidazol, que apresentou porcentagens inferiores de células viáveis em comparação às porcentagens demonstradas pela substância (-)-6,6’-dinitrohinoquinina, tendo uma IC50 de 46,1 µM. Para o ensaio de citotoxicidade utilizamos um parâmetro de quanto mais elevado o valor de IC50, mais segurança temos para a utilização da amostra, pois esta não estaria lisando as células, mas apenas os parasitas. Tabela 3
Tabela 3. Resultados da avaliação da atividade citotóxica in vitro
Substâncias % células viáveis±D.P./concentração (µM)
6,25 12,5 25 50 100 200 400 IC50
(µM) Dinitrohinoquinina 99,7±0,7 99,1±0,9 98,6±1,1 98,6±0,1 90,9±6,8 81,0±2,5 72,8±1,4 583,3
Benzonidazol 71,3±0,4 67,6±0,3 67,4±1,2 65,8±0,3 61,8±2,2 56,1±1,1 37,2±0,3 246,1 Controle negativo: DMSO 0,5%; Controle positivo: DMSO 25%.
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
De acordo com os resultados apresentados neste trabalho, podemos concluir que a amostra (-)-6,6’ -dinitrohinoquinina apresentou atividade tripanocida promissora em base dos resultados nas concentrações avaliadas. Além disso, essa amostra apresentou atividade citotóxica nas concentrações testadas em valores
aceitáveis. Em mais de 100 anos da descoberta da doença de Chagas em muito tem se avançado a ciência a fim de promover melhores formas de prevenção, diagnóstico e tratamento da doença de Chagas, porém há muito por fazer.
Apesar deste resultado obtido tenha sido promissor, torna-se necessário o aprofundamento dos estudos e ensaios experimentais para com a amostra aqui utilizada, a fim de se obter uma maior eficácia sobre o avanço deste estudo, podendo assim incentivar pela busca de novos fármacos através de produtos naturais contra a doença de Chagas.
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