Óleos essenciais de Lippia sidoides (alecrim-pimenta) e Mentha piperita (hortelã-pimenta) no controle de parasitos Monogenea e na hematologia de Oreochomis niloticus

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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE AQUICULTURA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQUICULTURA. Óleos essenciais de Lippia sidoides (alecrim-pimenta) e Mentha piperita (hortelã-pimenta) no controle de parasitos Monogenea e na hematologia de Oreochromis niloticus. Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Aquicultura da Universidade Federal de Santa Catarina para obtenção do Grau de Mestre em Aquicultura. Orientador: Maurício Laterça Martins. Gabriela Sayuri de Oliveira Hashimoto. Florianópolis 2015.

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(3) Óleos essenciais de Lippia sidoides (alecrim-pimenta) e Mentha piperita (hortelã-pimenta) no controle de parasitos Monogenea e na hematologia de Oreochromis niloticus Por GABRIELA SAYURI DE OLIVEIRA HASHIMOTO Esta dissertação foi julgada adequada para a obtenção do título de MESTRE EM AQUICULTURA e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Aqüicultura.. _____________________________________ Prof. Alex Pires de Oliveira Nuñer, Dr. Coordenador do Programa. Banca Examinadora: __________________________________________ Dr. Mauricio Laterça Martins – Orientador __________________________________________ Dra. Débora Machado Fracalossi __________________________________________ Dr. Marcos Caivano Pedroso de Albuquerque __________________________________________ Dra. Natalia da Costa Marchiori.

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(5) “Imagine uma nova história para sua vida e acredite nela.” Paulo Coelho.

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(7) AGRADECIMENTOS Agradeço ao meu pai Cláudio, minha mãe Margarida, meus irmãos Cláudia e Paulo por todo o suporte e apoio nesses anos, vocês foram fundamentais para a conclusão desta etapa da minha vida. Ao meu orientador Maurício Laterça Martins, com quem tive a honra de trabalhar e aprender. Desde a graduação me orientando e ensinando da melhor maneira e sempre com um sorriso no rosto. Queridos amigos do laboratório, sem vocês nada disso seria possível. Gabi, Nati, Carol, Jerko, Jully, Geovana, Lucas, Dudu, Karen, Katina, Jéssica, Gabri, Maria, Fausto, Maitê, Monyele, Scheila, Michele, muito obrigada pela parceria sempre, vocês são incríveis! Um agradecimento especial a três pessoas fundamentais na minha formação. Natália Marchiori, muito obrigada pela sua amizade, por toda a sua dedicação e atenção comigo, você vai morar sempre no meu coração. Gabriela Tomas Jerônimo, uma amiga inexplicável, companheira e sempre presente de alguma forma. E, Karen Roberta Tancredo, minha parceira inseparável do laboratório, quem me ensinou os primeiros passos e sempre esteve ao meu lado. Muito obrigada. Amo vocês! A todos os membros do núcleo NEPAQ, pela convivência, almoços e confraternizações juntos. Aos meus amigos de graduação, que devido aos caminhos que a vida nos levou, perdemos contato, mas são muito especiais. Bia,Vi, Scheila, Jeison, Gabi, Ágata, Raquel, Vanessa, Dudu, Bail, João, nos vemos por aí! À Universidade Federal de Santa Catarina e todos meus professores da graduação e mestrado pelo conhecimento que transmitiram. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo fornecimento da bolsa de estudo. À Dra. Edsandra Campos Chagas e Dr. Francisco Célio Maia Chaves (EMBRAPA Amazônia Ocidental) pela parceria com o Laboratório AQUOS (Macroprograma 2) e extração dos óleos. E a todos que contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho..

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(9) RESUMO Parasitos de peixes estão entre um dos principais obstáculos para o sucesso da produção aquícola. O uso de produtos químicos nos tratamentos pode ser danoso para o peixe, para o ambiente e consumidores. Com o objetivo de controlar o parasitismo por Monogenea em tilápia do Nilo, este trabalho analisou a eficácia dos óleos essenciais das plantas Lippia sidoides (alecrim-pimenta) e Mentha x piperita (hortelã-pimenta), sobre os índices parasitológicos e parâmetros hematológicos. Um total de 320 peixes juvenis foram distribuídos em 16 tanques de 100 L, 20 peixes por tanque, divididos em quatro tratamentos em quadruplicatas: peixes expostos a banhos de L. sidoides à concentração de 20 mg.L-1; peixes expostos a banhos de M. piperita à concentração de 40 mg.L-1; peixes controle apenas com banhos de água e peixes controle com banhos de água + DMSO (dimetilsulfóxido). Foram realizados três banhos de 10 min com intervalo de 24 h para cada tratamento. Após o terceiro banho realizouse a coleta para análise parasitológica e hematológica. Foi realizada análise unifatorial (ANOVA) sobre os parâmetros hematológicos e calculada a eficácia, frente ao parasitismo, dos óleos essenciais. A prevalência do parasito teve redução de aproximadamente 70% nos grupos tratados. A eficácia obtida no tratamento com L. sidoides comparada com controle água e água + DMSO foi de 1,96% e 14,16%, respectivamente e no tratamento com M. piperita comparada com os controles foi de 33,33% e 41,63%, respectivamente. Os números totais de eritrócitos e de trombócitos foram menores nos peixes tratados com L. sidoides. A taxa de glicose e o número de neutrófilos foram significativamente maior nos peixes tratados com L. sidoides. Devido a alta eficácia e ao resultado positivo sobre os parâmetros hematológicos analisados, recomenda-se o uso do óleo essencial de M. piperita na concentração de 40 mg.L-1, o qual mostrou positiva atividade antihelmíntica. Palavras-chave: Aquicultura; tilápia; antiparasitário; banhos terapêuticos; sangue..

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(11) ABSTRACT Fish parasites are among the main obstacles to the success of aquaculture production. The use of chemicals to treat fish parasites infestation may be dangerous for fish, environment and consumers. With the aim to control the number of parasitic Monogenea in Nile tilapia, this study analyzed the efficacy of plant Lippia sidoides (pepper rosemary) and Mentha x piperita (peppermint) essential oils on the parasitological indices and hematological parameters. A total of 320 juvenile fish were distributed in 16 tanks of 100 L capacity, 20 fish per tank, divided in four treatments in quadruplicates: fish exposed to 20 mg.L-1 L. sidoides bath; fish exposed to 40 mg.L-1 M. piperita bath; fish exposed only to water bath and fish exposed to water + DMSO (dimethyl sulfoxide) bath. Three baths for 10 min were realized with intervals of 24 h for each treatment. After the third bath, the parasitological and hematological analyzes were performed. It was calculated the one way ANOVA against the hematological parameters and the efficacy, against the parasitism, of the oils. Parasite prevalence showed a reduction of 70% in essential oils treated fish. The efficacy obtained in L. sidoides treated fish, when compared to control water and water + DMSO was 1.96% and 14.16%, respectively, in M. piperita treated fish was 33.33% and 41.63%, respectively. Total numbers of erythrocytes and thrombocytes were lower in L. sidoides treated fish. Glucose concentration and the number of neutrophils were significantly higher in L. sidoides treated. Due to efficacy and positive hematological results, we suggest the use of 40 mg.L-1 M. piperita bathes for anthelmintic activity. Key words: Aquaculture; tilapia; anti-parasitic; therapeutic bath; blood..

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(13) LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO 1 Figura 1: Composição química dos óleos essenciais utilizados neste estudo. A - Lippia sidoides e B - Mentha piperita............................. ... 41 Figura 2: Tempo de anestesia de O. niloticus submetidas ao teste de toxicidade com óleos essenciais de L. sidoides e M. piperita................ 42 Figura 3: Eficácia de óleos essenciais de Lippia sidoides (20 mg.L-1) e Mentha piperita (40 mg.L-1) comparados aos controles água e água + DMSO administrados na forma de banhos terapêuticos em tilápia do Nilo............................................. ...................................................... 44.

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(15) LISTA DE TABELAS CAPÍTULO I Tabela 1: Valores médios de prevalência (%), intensidade e abundância (±desvio padrão) de Monogenea, entre os peixes tratados com L. sidoides (20 mg.L-1), M. piperita (40 mg.L-1), Água e água + DMSO......................................... .......................................................... 43 Tabela 2: Média (± desvio padrão) dos parâmetros hematológicos de tilápia-do-Nilo, quando submetidas a banhos terapêuticos com óleo essencial de L. sidoides (20 mg.L-1), M. piperita (40 mg.L-1), Água e água + DMSO........................................................................................ 46.

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(17) SUMÁRIO INTRODUÇÃO GERAL .................................................................... 19 Tilápia do Nilo .................................................................................. 20 O uso de produtos naturais ............................................................... 21 Lippia sidoides (alecrim-pimenta) .................................................... 22 Mentha x piperita (hortelã-pimenta) ................................................. 24 Hematologia ...................................................................................... 25 Antiparasitários ................................................................................ 26 Monogenea ........................................................................................ 27 JUSTIFICATIVA ................................................................................ 29 OBJETIVO GERAL ........................................................................... 29 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................ 29 Abstract ................................................................................................ 32 Resumo ................................................................................................. 33 INTRODUÇÃO ................................................................................... 34 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................ 35 Extração dos óleos essenciais ........................................................... 35 Teste de imobilização “in vitro” ....................................................... 36 Teste de toxicidade ............................................................................ 36 Desenho experimental ....................................................................... 37 Análises parasitológicas e hematológicas ........................................ 37 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................ 38 Agradecimentos ................................................................................... 47 Referências ........................................................................................... 47 CONSIDERAÇÕES FINAIS.............................................................. 52 REFERÊNCIAS DA INTRODUÇÃO GERAL ................................ 53.

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(19) 19. INTRODUÇÃO GERAL O significativo aumento da produção e comercialização de organismos aquáticos no Brasil expresso a cada ano torna a aquicultura vulnerável a crescentes mortalidades. Principalmente devido às doenças infecciosas e parasitárias que constantemente acometem os cultivos (REVERTER et al., 2014). Assim, na medida em que a piscicultura continental assume papel expansivo de modo a atender às demandas do consumidor para produtos pesqueiros, é natural que a mesma se cerque de medidas de segurança e padrão de qualidade. Entre essas medidas, há destaque para o conhecimento das doenças infecciosas, consideradas por muitos como o grande obstáculo ao pleno sucesso da atividade, tanto do ponto de vista econômico, quanto sanitário (LUQUE, 2004). Porém, o que se usa contra estes entraves, além de outras medidas preventivas, são variados produtos químicos, que por meio de pesquisas já se provou a ocorrência de danos prejudicais tanto para o animal quanto para o ambiente (LUQUE, 2004; CHAGAS et al., 2014). Uma alternativa viável é o uso de plantas em formas de óleos essenciais, extratos ou frações na prevenção e no tratamento de enfermidades (CHAGAS et al., 2014; REVERTER et al., 2014). A gestão de doenças infecciosas e parasitárias na piscicultura de peixes de água doce tem focado amplamente na utilização de banhos convencionais com quimioterápicos de alto grau de toxicidade, os quais, por sua vez, podem ser ineficazes, estressantes e nocivos não somente ao peixe, mas também ao meio ambiente, ao profissional que manipula tais drogas e, até mesmo, ao consumidor final (IŞCAN et al., 2002). Dessa forma, a ação de plantas medicinais contra viroses, bacterioses e parasitismo têm sido um caminho investigado (CAMURÇAVASCONCELOS et al., 2007). O grande interesse no estudo de plantas com possível efeito alopático é justificado pela crescente necessidade de desenvolver uma agricultura sustentável, ao mesmo tempo reduzir os danos ambientais e à saúde humana provocada pela introdução de compostos químicos, e encontrar alternativas ao uso de produtos sintéticos (MARCO et al., 2012). Para a obtenção de novos compostos biologicamente ativos, eficazes contra parasitoses, bacterioses e outros patógenos são necessários a avaliação in vitro, in vivo em laboratório e, de preferência, in vivo em campo (CHAGAS et al., 2014). Realizando diferentes modos de ação a garantia de potencialidade do produto ou metodologia utilizada garante bons resultados..

(20) 20. Tilápia do Nilo Mundialmente conhecida, a tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) tem grande papel econômico no mercado de aquícola, pois contribui tanto na renda de pequenos produtores, quantos de grandes empresas, que produzem em alta densidade, utilizam excelente tecnologia e comercializam no mercado internacional em grande escala (FITZSIMMONS et al., 2011). Em 2012, a produção mundial de tilápias e outras ciclídeos superaram 4 milhões de toneladas e renderam mais de 7 bilhões de dólares. A O. niloticus é a quinta maior espécie produzida no mundo, superando a marca de 3 milhões de toneladas e 5 bilhões de dólares no ano de 2012 (FAO, 2012). No Brasil a produção aquícola está em constante crescimento. Segundo o Ministério da Pesca e Aquicultura o país produziu 1,25 milhões de toneladas de peixe, e deste total, 38% é proveniente do cultivo (MPA, 2014). A produção comercial da tilápia apresenta significativo aumento em todo o mundo, seu cultivo é o que mais cresce, sendo a segunda mais cultivada no mundo e a primeira no Brasil (VICENTE et al., 2014). Este ciclídeo originário da bacia do rio Nilo, no Leste da África, encontra-se amplamente distribuída nas regiões tropicais e subtropicais, espécie de água doce com hábito alimentar onívoro (CARVALHO, 2006). Devido às características favoráveis de cultivo, entre elas a resistência ao manejo, crescimento acelerado, boa eficiência alimentar, suportar baixos teores de oxigênio dissolvido e ampla variação de temperatura (BOSCOLO et al., 2002; ZIMMERMANN e FITZSIMMONS, 2004), a tilápia vem sendo cultivada em grande quantidade em altas densidades de estocagem, favorecendo o surgimento de enfermidades causando grande empecilho nas produções. No Brasil, a rápida difusão de novas tecnologias de instalações e as novidades geradas pela pesquisas realizadas, contribuiram significativamente para os bons resultados da piscicultura nos últimos anos (LEITE, 2007). Contudo, dois lados devem caminhar juntos, a medida que a intensificação do cultivo e produção ocorre, a implantação de programas de prevenção e controle de enfermidades são essenciais para maximizar a atividade. Neste contexto, por ser uma espécie amplamente cultivada e possuir grande representação no mercado internacional, pesquisas relacionadas à enfermidades que acometem a espécie, assim como alternativas de tratamento e prevenção são fundamentais para o incremento da produção..

(21) 21. O uso de produtos naturais Medicamentos com utilização específica de compostos bioativos oriundos de vegetais, capazes de aliviar ou curar enfermidades, empregando-se exclusivamente os derivados (extrato, tintura, óleo, cera, exsudato, suco e outros), são denominados de medicamentos fitoterápicos. Podem ser manipulados ou industrializados e, conforme a legislação brasileira pode ainda ser destinada ao uso humano ou veterinário. Para uso humano são regulamentados pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e para uso veterinário, pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) (ANVISA, 2013). Os extratos de plantas geralmente contêm mais de um composto com atividade antimicrobiana, sendo utilizados também na indústria alimentícia (KOTZEKIDOU et al., 2007). De acordo com Burt (2004), óleos essenciais de plantas e seus derivados são amplamente aplicados em diversos setores, sendo também de grande utilidade no controle de patógenos. O mercado mundial de produtos naturais, incluindo produtos à base de matérias-primas de plantas, foi estimado em uma taxa de crescimento entre 5 e 15% (HARIKRISHNAN et al., 2011). Os óleos essenciais extraídos das plantas são parte do seu metabolismo secundário; no entanto, constituem um dos mais importantes grupos de matéria prima para a indústria alimentícia, farmacêutica, perfumaria e outros. São misturas complexas de substâncias voláteis e lipofílicas, com baixo peso molecular, geralmente odorífera e líquida (MORAIS, 2009) possuindo ampla variação nas propriedades químicas (GOMES et al., 2011). Na aquicultura, estas substâncias utilizadas tanto no tratamento quanto na prevenção de doenças, vêm ganhando espaço por apresentarem diversas vantagens no cultivo tais como: diminuição do impacto ambiental por serem produtos biodegradáveis, diminuição dos resíduos químicos nos animais, potencialmente menos tóxicos por serem menos concentrados, possui diversos modos de ação e sua utilização resulta em menor probabilidade de causar resistência, além de serem menos onerosos na criação (COIMBRA et al., 2006; SOARES e TAVARES-DIAS, 2013). Inúmeros tratamentos aplicados na piscicultura, diversas vezes se tornam inviáveis de serem empregados (REINCHENBACHKLINKE, 1982). Nos cultivos, o uso de quimioterápicos pode gerar grande impacto, devido aos resíduos químicos na água, assim como a ocorrência de bactérias e/ou patógenos resistentes aos tratamentos (FIGUEIREDO e LEAL, 2008). Com isso, o crescente interesse pelos.

(22) 22. estudos de novas formas de tratamento ou controle de doenças é uma realidade (REVERTER et al., 2014). Para mitigar tais problemas, uma forma é direcionar ações para determinadas técnicas de manejo profilático nos cultivos. Segundo Moraes e Martins (2004), o bem-estar dos animais nas pisciculturas compreende um conjunto de medidas ligadas à prevenção e/ou à diminuição do risco de transmissão de doenças infecciosas (virulentas ou bacterianas) e parasitárias das populações de peixes saudáveis. Truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss) alimentadas com extrato de gengibre (Zingiber officinale) apresentaram aumento significativo da atividade extracelular de células fagocíticas no sangue (DUGENCI et al., 2003). Por sua vez, Girme et al. (2006) demonstraram que extratos metabólicos de M. piperita e folhas, caules e raízes da planta camará (Lantana camara) apresentaram considerável atividade anti-helmíntica contra Pheretima posthuma, espécie de anelídeo. Em um estudo preliminar, Divyagnaneswari et al. (2007) indicaram que o uso da planta medicinal indiana Solanum trilobatum, em tilápia mossambica (Oreochromis mossambicus), favoreceu o estado de saúde dos animais, reduzindo a mortalidade. O uso de produtos naturais ganham destaque na sanidade animal, pois podem ser fontes promissoras de substâncias bioativas contra parasitos e microrganismos, podem estimular o apetite, ter atividade anti-estresse e melhorar a maturação (SOARES e TAVARESDIAS, 2013; REVERTER et al., 2014). Lippia sidoides (alecrim-pimenta) O gênero Lippia pertence à família Verbenaceae inclui aproximadamente 200 espécies de plantas, entre elas ervas, arbustos e pequenas árvores (PASCUAL et al., 2001). Lippia sidoides Cham., popularmente conhecida como alecrim-pimenta é um arbusto densamente ramificado com até 2 m de altura, casca frágil, folhas aromáticas e flores pequenas (MATOS e OLIVEIRA, 1998). É nativa do sertão nordestino, encontrada principalmente nos estados do Ceará e Rio Grande do Norte (COSTA et al., 2002), podendo ser encontrado também no norte de Minas Gerais (MORAIS et al., 2012). Como outras espécies do gênero, a L. sidoides é caracterizada como planta aromática de uso medicinal popular, por suas atividades biológicas e terapêuticas, principalmente por apresentar características anti-sépticas e antimicrobianas (COSTA et al., 2002; MATOS e OLIVEIRA, 1998). Extratos e óleos essenciais obtidos de Lippia spp. têm sido amplamente testados cientificamente, devido ao potencial dos princípios.

(23) 23. bioativos (SOARES e TAVARES-DIAS et al., 2013). Segundo diversos estudos, o timol e carvacrol são os principais constituintes químicos do óleo essencial da L. sidoides (MARCO et al., 2012; MATOS e OLIVEIRA, 1998; CAVALCANTI et al., 2010) apresentando propriedades bactericidas e fungicidas respectivamente, possuindo ainda o hidrolato, com atividade molusquicida e larvicida (MATOS e OLIVEIRA, 1998). Devido a estas propriedades L. sidoides é cultivado, em hortos de plantas medicinais e faz parte do elenco de plantas selecionadas pelo Governo do Estado do Ceará, como fitoterápico (COSTA et al., 2002). Assim como em peixes, o controle de parasitos em mamíferos por meio de substância bioativas vem demandando diversos estudos a fim de combater a infestação e proliferação do parasitismo. Por exemplo, Camurça-Vasconcelos et al. (2008) relataram que parasitos nematoides causam significativas perdas econômicas na criação de ovelhas e são controlados com quimioterápicos. Da mesma forma, o controle de parasitos é realizado nos peixes. Entretanto, seu uso pode resultar em resíduos na carne, contaminação do ambiente e um dos grandes entraves, o alto custo destes produtos (HAMMOND et al., 1997). Todavia, os constantes usos destes produtos também causam o desenvolvimento de populações de parasitos resistentes, evidenciando a busca por formas alternativas de tratamento. Dessa forma, a L. sidoides se mostrou eficiente no controle destes nematóides, combatendo cerca de 56,9% segundo Camurça-Vasconcelos et al. (2008). Outro exemplo é o citado por Gomes et al. (2014), os quais constataram que o óleo essencial de alecrim-pimenta tem também atividade acaricida em duas espécies de larvas de carrapato. Já Reis et al. (2011) relataram que o uso deste óleo resultou em inibição da bactéria Listeria monocytogenes, que acomete filés de surubim (Pseudoplatystoma sp.) refrigerados, o que pode causar infecção grave a saúde de indivíduos sensíveis quando ingeridos. Por sua vez, Silva et al. (2013) avaliaram o uso do óleo essencial da planta na atividade anestésica em jundiás (Rhamdia quelen), obtendo resultados satisfatórios. Assim como a L. sidoides, avaliou-se a capacidade anestésica em jundiás do óleo essencial de Lippia alba, espécie da mesma família. Concentrações entre 100 mg/L e 500 mg/L foram eficientes para anestesiar os peixes, assim como para inibir o aumento dos níveis de cortisol no plasma, quando comparados ao controle (CUNHA et al., 2010). Parodi et al. (2012) testaram o efeito anestésico do óleo essencial de L. alba (20 µL.L-1) em pós larvas e.

(24) 24. adultos do camarão branco (Litopenaeus vannamei), confirmando o efeito. Com o intuito da redução do uso de quimioterápicos, a constante pesquisa em produtos não prejudiciais ao meio ambiente e menos agressivos à saúde do homem e do animal são frequentes. Com isso, espécies de Lippia vêm sendo exploradas para uso em diversas áreas como a medicina veterinária, microbiologia, parasitologia, zootecnia e aquicultura, devido ao seu potencial bioativo e facilidade de produção agronômica em escala (SOARES e TAVARES-DIAS, 2013). Mentha x piperita (hortelã-pimenta) O gênero Mentha contém aproximadamente 25 espécies, algumas espécies híbridas e pertence a família Lamiaceae (LOPEZ et al., 2010). A espécie M. piperita é uma espécie híbrida de “spearmint” (Mentha spicata L.) e “watermint” (Mentha aquatica L.) tendo seu crescimento favorável em solos com alta capacidade de retenção de água (McKAY e BLUMBERG, 2006). Folhas de hortelã-pimenta são usadas em todo o mundo, especialmente nos países ocidentais e do oriente médio, nas formas de infusões, tinturas, chás, extratos e óleo essencial (SAMOJLIK et al., 2012). Além de seu uso como compostos naturais, os usos medicinais da Mentha sp., que remontam aos tempos antigos, incluem atividade antiinflamatória, estimulante, analgésica, anestésica e imunomoduladora (IŞCAN et al., 2002). Sua composição química possui também componentes com propriedades antimicrobianas e antioxidante (TSAI et al., 2013). Segundo Gulluce et al. (2007) espécies do gênero Mentha são fontes ricas de compostos químicos, e demais compostos voláteis, o que as confere forte propriedade antimicrobiana. É considerada importante planta que produz óleo essencial contendo mentol e diversos componentes amplamente utilizados nas indústrias farmacêuticas e de produtos naturais (KUMAR e PATRA, 2012). Segundo diversos autores, o mentol é o componente majoritário do óleo extraído, seguido pela mentona (IŞCAN et al., 2002; FREIRE, et al., 2011; SAMOJLIK et al., 2012; TSAI et al., 2013), o que caracteriza as propriedades citadas anteriormente. Pesquisas utilizando a M. piperita, avaliando a atividade antifúngica do óleo essencial da planta coletada no Irã, demonstrou resultados positivos frente a três espécies de fungos (MOGHADDAM et al., 2013) Estes dados corroboram os obtidos por Freire et al. (2011), que também constataram o potencial de inibição do óleo essencial da M. piperita à concentração de 0,2% frente a sete espécies de fungo,.

(25) 25. Aspergillus flavus, Aspergillus glaucus, Aspergillus niger, Colletotrichum gloesporioides, Colletotrichum musae, Fusarium oxysporum e Fusarium semitectum. Segundo Gharib e Silva (2012), o óleo essencial de hortelã-pimenta expressou potencial como antioxidante natural devido aos seus componentes químicos. Na aquicultura, são poucos trabalhos registrados com o uso de M. piperita. Houve redução na mortalidade e aumento da sobrevivência de perca (Lates calcarifer), depois de desafio com Vibrio harveyi. Melhor ganho de peso e conversão alimentar também foram observados, quando percas alimentadas com ração suplementada com extratos da M. piperita (TALPUR, 2014). Assim como para a L. sidoides, devido aos diversos componentes químicos e propriedades antimicrobianas e antifúngicas, estudos com óleos essenciais, extratos e outros compostos da M. piperita devem ser elaborados a fim de testar características positivas da planta. Com intuito de diminuir ou conter o uso de quimioterápicos nos cultivos de peixes, reduzindo assim a poluição e contaminação do ambiente. Hematologia Com a intensificação da produção de peixes, os problemas que acometem as pisciculturas se tornam mais frequentes. Com isso, o monitoramento periódico das condições de higidez dos peixes deve receber especial atenção dos produtores (RANZANI-PAIVA et al., 2014). A hematologia é o estudo dos conhecimentos sobre o sangue e, grande parte das informações, consiste em medidas de valores de parâmetros em condições orgânicas normais ou anormais (RANZANIPAIVA e SILVA-SOUZA, 2014). Os parâmetros sanguíneos podem ser usados como ferramenta no monitoramento da saúde dos peixes e do ambiente. Auxiliando na identificação de estresse que o ambiente e os parasitos podem causar nos animais (TAVARES-DIAS et al., 2009). Para realizar as análises hematológicas a contagem total e diferencial dos componentes sanguíneos é essencial para um diagnóstico completo. Os eritrócitos são as células mais abundantes na circulação dos peixes, sua função consiste no transporte de gases respiratórios, por meio de ligação com a hemoglobina (RANZANI-PAIVA et al., 2014). Os leucócitos são as células responsáveis pela defesa do organismo, utilizam as vias sanguíneas para realizar o monitoramento de possíveis infecções e/ou danos teciduais. Juntamente com os leucócitos, os trombócitos fazem parte de células de defesa do organismo, sendo.

(26) 26. essencial para o diagnóstico de possíveis alterações hematológicas (TAVARES-DIAS et al., 2009). As variáveis relativas ao eritrograma auxiliam na identificação de processos anêmicos, enquanto o leucograma auxilia no diagnóstico de processos infecciosos e outros estados de desequilíbrio homeostático do peixe (TAVARES-DIAS et al., 2009). Com isso, as análises hematológicas em peixes podem ser usadas como uma ferramenta de estudo para verificação da saúde dos peixes. Podendo auxiliar no diagnóstico de doenças ou outros eventuais problemas. Antiparasitários Muitas das doenças que causam prejuízos nas pisciculturas são provocadas por agentes infecciosos, podendo tornar a atividade onerosa e pouco lucrativa para os produtores, devido à mortalidade excessiva durante surtos de infecção e/ou infestação. Entre os principais grupos de parasitos que causam doenças em piscicultura estão os protozoários, mixosporídeos, helmintos e crustáceos, além de fungos, bactérias e vírus que, ao encontrarem condições adequadas, proliferam causando doenças (TAVECHIO et al., 2009). O controle dos parasitos baseia-se praticamente no uso de antiparasitários (AYRES e ALMEIDA, 2002), que são produtos com o intuito de diminuir o nível de parasitos, matando-os ou inibindo seu crescimento (HSU, 1997). Porém na sua grande maioria, são utilizados antiparasitários químicos como formalina, sulfato de cobre, verde malaquita e pesticidas para combater o parasitismo em peixes. Esses produtos, além do efeito tóxico aos tecidos dos peixes, principalmente nas brânquias, no tegumento e no fígado, podem acumular resíduos na musculatura, oferecendo risco potencial ao consumidor, caso não sejam respeitados o tempo de carência pós-tratamento. Além disso, aumentam significativamente o impacto ambiental no entorno da piscicultura onde os resíduos dos tratamentos são descartados (TAVECHIO et al., 2009) e podem provocar redução na concentração de oxigênio dissolvido na água. Com o intuito de reduzir o uso desses produtos, diversas pesquisas têm sido realizadas testando produtos naturais com efeito antiparasitário nos animais. Essas substâncias podem aumentar a resistência dos animais quando expostos a situações estressantes. A aquicultura pode ser beneficiada com o uso dos preventivos quando utilizados de modo profilático e durante determinadas fases de desenvolvimento dos peixes, quando susceptíveis a agentes infecciosos (BOYD et al., 2008). Em muitas espécies, a dieta pode influenciar em.

(27) 27. alguns parâmetros imunológicos, como número de leucócitos e produção de anticorpos, assim como na capacidade do animal de resistir a doenças infecciosas (ALCORN et al., 2002). Segundo Tavechio et al. (2009), a suplementação com vitaminas C e E na dieta podem reduzir o estresse próprio da criação, melhoram o sistema imune e reduzem a ocorrência de diversos grupos de parasitos, apresentando potencial preventivo, e para substituir produtos químicos no controle de diversas doenças parasitárias. Por outro lado, Xiao-Feng et al. (2014) verificaram uma alternativa natural para o tratamento do protozoário causador da doença dos pontos brancos (Ichthyophthirius multifiliis) no "goldfish" (Carassius auratus) no qual consistiu na utilização dos compostos ativos queleritrina e cloroxilonina da planta comumente chamada de “espinhode-ladrão” Toddalia asiatica na forma de banho reduzindo significativamente a carga parasitária. Para os helmintos Monogenea, a literatura mostra que já foram testadas algumas formas de diminuir a incidência parasitária nos peixes. Uma planta que tem apresentado bons resultados é o alho (Allium sativum) que devido às suas propriedades é usada no controle de doenças (CHAGAS et al., 2014). Por sua vez, o óleo essencial do manjericão (Ocimum gratissimum) em tambaquis (Colossoma macropomum) apresentou 93,8 e 100% de eficácia no combate ao parasitismo por Monogenea administrando banhos com 10 e 15 mg/L por 15 minutos, respectivamente (Boijink et al., 2011). Para o pirarucu (Arapaima gigas) foi avaliado o uso do extrato de Piper aduncum popularmente conhecido como flor-de-mel no controle do Monogenea Dawestrema cycloancistrium com eficácia de 80% administrado na forma de banho 80 mL por 24 h (QUEIROZ, 2012). Observa-se que são muitas as fontes em potencial para a produção do efeito antiparasitário a serem estudadas e utilizadas na aquicultura. Dentre as mais variadas substâncias naturais, o alecrimpimenta e a hortelã-pimenta, substâncias estudadas neste trabalho, podem se enquadrar neste contexto. Monogenea O parasitismo ocorre como resultado da interação entre hospedeiro/parasito/ambiente sendo que alguns fatores ou substâncias são responsáveis pela redução da resposta imune do hospedeiro, resultando no desequilíbrio da interação (MORAES e MARTINS, 2004). Fatores como temperatura da água, nível de estresse, qualidade nutricional, idade e imunidade natural, acarretam tal desequilíbrio (XU.

(28) 28. et al., 2001; CAVICHIOLO et al., 2002; BUCHMANN e LINDESTROM, 2002). Em cultivos intensivos, o baixo fluxo de água e alta concentração de matéria orgânica favorece o crescimento e reprodução dos parasitos (MORAES e MARTINS, 2004). Certos parasitos são extremamente específicos em termos de hospedeiros, mas podem ser oportunistas, atingindo indivíduos de outras espécies (MORAES e MARTINS, 2004), podendo causar grandes mortalidades e significativas perdas econômicas. Com isso, faz-se necessário, a implantação de boas práticas de manejo no cultivo. A infestação por ectoparasitos pode causar danos clínicos aos peixes, dependendo do seu grau, variando de lesões na pele (superficiais ou profundas) à quadros típicos de septicemia decorrente de infecções secundárias por patógenos oportunistas. Os Monogenea são helmintos, na sua grande maioria, ectoparasitos de peixes, de ciclo de vida monoxeno e caracterizados pela presença de estruturas de fixação esclerotizadas, parasitando preferencialmente brânquias, narinas, olhos e superfície corporal (TAKEMOTO et al., 2013) podendo ser encontrados no estômago (JERÔNIMO et al., 2011). Esta característica acentua sua patogenicidade provocando lesões nos tecidos e alterando o comportamento dos animais, causando o aumento da produção do muco, hemorragias cutâneas, branquiais, hiperplasia nos filamentos brânquias, anorexia e morte (PAVANELLI et al., 2002). Também, em infecções menos intensas, as pequenas lesões são portas de entrada para infecções secundárias por bactérias ou vírus (MARTINS e ROMERO, 1996). A alta infestação por Monogenea é usualmente indicadora de prejuízo na saúde dos animais e deterioração da qualidade da água devido à alta densidade de estocagem, culminando em altos níveis de amônia ou nitrito e nível baixo de oxigênio, podendo então se reproduzir rapidamente nestas condições (NOGA, 2000). Em cultivos intensivos, o manejo inadequado, a má qualidade da água, grande quantidade de matéria orgânica e outros fatores favorecem a proliferação e rápida reprodução destes parasitos, sendo fator expressivo de mortalidades na piscicultura (MORAES e MARTINS, 2004). Com isso, novos estudos e métodos de prevenção e controle são fundamentais para diminuir a infestação fazendo-se uso de produtos naturais como possível alternativa..

(29) 29. JUSTIFICATIVA Embora haja relativas evidências nos benefícios do uso de determinados antiparasitários na aquicultura, atualmente existem poucos produtos comerciais aprovados para uso seguro na piscicultura brasileira. A estão de parasitos ono enea em pisciculturas t m ocado amplamente na utili a ão de banhos terap uticos ue podem por sua e serem caros ao produtor t icos e estressantes ao pei e. Muitas são as fontes com potencial fitoterápico a serem exploradas para a produção de substâncias com capacidade preventiva e curativa frente às enfermidades na aquicultura. Com o aprofundamento nessa linha de pesquisa, novas diretrizes de boas práticas de manejo na piscicultura devem ser consideradas, principalmente em períodos críticos do cultivo, como transporte, reprodução e larvicultura. Além disso, as investigações do mecanismo de ação de óleos essenciais sobre o sistema imunológico de tilápias e seu efeito sobre parasitos, pode dar início a novos estudos relacionados à terapêutica de peixes, inclusive para tilápias. O presente trabalho busca estudar o uso dos óleos essenciais de Lippia sidoides e Mentha piperita no controle de Monogenea em banhos terapêuticos em tilápia do Nilo e sua influência sobre os parâmetros hematológicos. OBJETIVO GERAL Avaliar o uso de banhos terapêuticos com óleos essenciais de L. sidoides e M. piperita sobre o parasitismo por Monogenea e parâmetros hematológicos de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), fornecendo subsídios para a redução de enfermidades na piscicultura, a partir do uso de substâncias naturais.. OBJETIVOS ESPECÍFICOS . Reali ar teste de imobili a ão “in vitro” com di erentes concentrações dos óleos essenciais de L. sidoides e M. piperita;. . Realizar teste de toxicidade com tilápia do Nilo quando em contato com óleos essenciais de L. sidoides e M. piperita;.

(30) 30. . Estabelecer os índices de prevalência, intensidade média e abundância média de Monogenea;. . Avaliar os parâmetros hematológicos de tilápia exposta à banhos terapêuticos com óleos essenciais de L. sidoides e M. piperita..

(31) 31. CAPÍTULO 1 Óleos essenciais de Lippia sidoides (alecrim-pimenta) e Mentha x piperita (hortelã-pimenta) no controle de parasitos Monogenea e na hematologia de Oreochromis niloticus. Artigo redigido nas normas do periódico Aquaculture Research.

(32) 32. Abstract This study evaluated the use of therapeutic bathes with essential oils of Lippia sidoides (pepper rosemary) and Mentha piperita (peppermint) on the hematological parameters in Nile tilapia parasitized by Monogenea. A total of 320 juvenile fish were distributed in 16 tanks of 100 L capacity, 20 fish per tank, divided in 4 treatments in quadruplicates: fish exposed to 20 mg.L-1 L. sidoides bath; fish exposed to 40 mg.L-1 M. piperita bath; fish exposed only to water bath and fish exposed to water + DMSO (dimethyl sulfoxide) bath. Three bathes for 10 min were realized with intervals of 24 h for each treatment. After the third bath the parasitological and hematological analysis were performed. It was calculated the factorial analysis of variance (ANOVA) and the efficacy of the oils. Parasite prevalence showed a reduction of 70% in essential oils treated fish. The efficacy obtained in L. sidoides treated fish compared to control water and water + DMSO was 1.96% and 14.16%, respectively, and in M. piperita treated fish was 33.33% and 41.63%, respectively. Total numbers of erythrocytes and thrombocytes were lower in L. sidoides treated fish. Glucose concentration and the number of neutrophils were significantly higher in L. sidoides treated ones. Due to efficacy and positive hematological results, we suggest the use of 40 mg.L-1 M. piperita bathes for anthelmintic activity. Key words: tilapia; phytotherapy; anti-parasitic; therapeutic bath; blood..

(33) 33. Resumo Este estudo avaliou a utilização de banhos terapêuticos com óleos essenciais de Lippia sidoides (alecrim-pimenta) e Mentha x piperita (hortelã-pimenta), sobre os parâmetros hematológicos de tilápia do Nilo parasitada por Monogenea. Um total de 320 alevinos foram destribuídos em 16 tanques de 100L, 20 peixes por tanque, divididos em quatro tratamentos em quadruplicatas: peixes expostos à banhos de L. sidoides à concentração de 20 mg.L-1; peixes expostos à banhos de M. piperita à concentração de 40 mg.L-1; peixes controle apenas com banhos de água e peixes controle com banhos de água + DMSO (dimetilsulfóxido). Foram realizados três banhos de 10 minutos com intervalo de 24 h para cada tratamento. Após o terceiro banho realizou-se a coleta para análise parasitológica e hematológica. Foi realizada análise unifatorial (ANOVA) e calculada a eficácia dos óleos essenciais. A prevalência do parasito apresentou redução de 70% nos grupos tratados. A eficácia obtida no tratamento com L. sidoides comparada com Água e Água + DMSO foi de 1,96% e 14,16%, respectivamente e no tratamento com M. piperita foi de 33,33% e 41,63%, respectivamente. Os números totais de eritrócitos e de trombócitos foram menores nos peixes tratados com L. sidoides. A taxa de glicose e número de neutrófilos foi significativamente maior nos peixes tratados com L. sidoides. Devido a eficácia e ao resultado positivo sobre os parâmetros hematológicos analisados, recomenda-se o uso do óleo essencial de M. piperita na concentração de 40 mg. L-1, o qual mostrou eficácia benéfica, apresentando atividade antihelmíntica. Palavras-chave: Oreochromis; tratamento; sangue.. fitoterápicos;. antiparasitário;.

(34) 34. INTRODUÇÃO No Brasil, a rápida difusão de novas tecnologias de instalações e as novidades geradas pelas pesquisas realizadas, contribuiram significativamente para os bons resultados da piscicultura nos últimos anos (Leite 2007). Assim, na medida em que a piscicultura continental assume papel expansivo de modo a atender às demandas do consumidor para produtos pesqueiros, é natural que a mesma se cerque de medidas de segurança e padrão de qualidade. Nos cultivos intensivos o nível de estresse causado nos animais, somado ao fluxo de água, alta concentração de matéria orgânica, temperatura da água e qualidade nutricional favorecem no surgimento e na reprodução de parasitos (Moraes & Martins 2004), com isso promovendo aumento na susceptibilidade a doenças, como por exemplo, Monogenea. A gestão de doenças infecciosas e parasitárias na piscicultura de peixes de água doce tem focado amplamente na utilização de tratamentos convencionais com quimioterápicos de alto grau de toxicidade, os quais, por sua vez, podem ser ineficazes, estressantes e nocivos não somente ao peixe, mas também ao meio ambiente, ao profissional que manipula tais drogas e, até mesmo, ao consumidor final (Işcan Kirimer Kürkcüo lu Baser & Demirci 2002). O interesse em novos meios de tratamento é justificado pela crescente necessidade de desenvolver uma pecuária sustentável, reduzir os danos ambientais e à saúde humana provocada pela introdução desses compostos químicos, e encontrar alternativas ao uso de produtos sintéticos (Marco, Teixeira, Simplício, Oliveira, Costa & Feitosa 2012). Uma alternativa que vem se tornando viável é o uso de produtos naturais, como plantas, nas formas de óleos essenciais, extratos ou frações para a prevenção e tratamento de enfermidades (Chagas, Majolo, Boijink, Chaves, Hashimoto, Figueredo & Martins 2014; Reverter Bontemps, Lecchini, Banaigs & Sasal 2014). Na aquicultura os fitoterápicos ganham espaço por apresentarem diversas vantagens no cultivo tais como: diminuição do impacto ambiental, por serem biodegradáveis; diminuição dos resíduos químicos nos animais; são potencialmente menos tóxicos por serem menos concentrados; possuem diversos modos de ação, resultando em menor probabilidade de causar resistência além de serem menos onerosos na criação (Coimbra, Soares, Garrido, Souza & Ribeiro 2006; Soares & Tavares-Dias 2013). A Lippia sidoides popularmente conhecida como alecrimpimenta é um arbusto densamente ramificado, com casca frágil, folhas.

(35) 35. aromáticas e flores pequenas (Matos & Oliveira 1998). É nativa do sertão nordestino, principalmente nos estados do Ceará e Rio Grande do Norte (Costa, Lemos, Pessoa, Assunção & Braz-Filho 2002) e norte de Minas Gerais (Morais, Oliveira, Bara, Conceição, Rezende, Ferri & Paula 2012). Como outras espécies do gênero, a L. sidoides é caracterizada pelo uso medicinal popular e por suas atividades antisépticas e antimicrobianas (Costa et al. 2002; Matos & Oliveira 1998). Espécies de Lippia sp. vêm sendo exploradas para uso em diversas áreas na medicina veterinária, microbiologia, parasitologia, zootecnia e aquicultura, devido ao seu potencial bioativo e facilidade de produção agronômica em escala (Soares & Tavares-Dias 2013). Outro gênero que também vem sendo explorado é Mentha sp., além de sua fama pelo aroma, é usada na medicina, por possuir em sua composição química componentes com propriedades antimicrobianas e antioxidantes (Tsai, Wu, Lin, Lin, Huang & Yang 2013). Produz óleo essencial contendo mentol e diversos componentes amplamente utilizados nas indústrias farmacêuticas e de produtos naturais (Kumar & Patra 2012). Segundo diversos autores, o mentol é o componente majoritário do leo e traído (Işcan et al. 2002; Freire, Jham, Dhingra, Jardim, Barcelos & Valente 2011; Samojlik Petkovic, Mimica-Dukié & Bozin 2012; Tsai et al. 2013). São muitas as fontes de produtos naturais a serem estudadas e utilizadas na aquicultura, porém ainda são escassos os estudos relativos ao uso de extratos ou óleos essenciais extraídos de plantas administrados na forma de banhos terapêuticos em peixes para combater parasitos. Com isso, o objetivo deste estudo foi avaliar o uso dos óleos essenciais de L. sidoides e M. piperita administrados na forma de banhos terapêuticos no controle de Monogenea parasito de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus). MATERIAL E MÉTODOS Extração dos óleos essenciais Partes aéreas e frutos de plantas adultas de L. sidoides e M. piperita foram coletadas e acondicionadas em sacos plásticos para o encaminhamento ao Laboratório de Plantas Medicinais e Fitoquímica da Embrapa Amazônia Ocidental, Manaus, Brasil. A extração dos óleos foi feita pelo método de hidrodestilação, com o uso do Aparelho Tipo Clevenger. Após este procedimento, os óleos foram armazenados em recipiente âmbar e conservados em freezer a -18ºC..

(36) 36. Teste de imobilização “in vitro” Foram testadas seis concentrações dos óleos de L. sidoides e M. piperita, a fim de obter a concentração mais eficiente, ou seja, que provoque a mortalidade do parasito em relação ao tempo. Foi utilizada uma solução estoque contendo 1 g do óleo e completado com dimetilsulfóxido (DMSO - C2H6OS) até completar 10 mL de solução na proporção 1:10. A partir de arcos branquiais parasitados, foram retirados os filamentos, separados em placas de Petri de 5,5 cm esterilizadas, onde cada conjunto de filamentos parasitados determinou uma concentração e uma repetição de cada óleo. Para as concentrações de 320; 160; 80 e 40 mg.L-1 diluiu-se 80; 40; 20 e 10 µL da solução estoque do óleo de L. sidoides e M. piperita em 25 mL de água, respectivamente e, para 20 mg.L-1 e 10 mg.L-1, dilui-se 10 µL em 50 mL e 100 mL de água, divididas em partes de 8 mL para cada placa. Além disso, realizaram-se dois controles, diluindo 80 µL de DMSO em 25 mL de água, e o segundo somente com água. Para as menores concentrações, observações a cada 15 min foram feitas e registrado o número de parasitos vivos e mortos. Para as concentrações maiores (160 e 320 mg.L-1) as observações eram ininterruptas. Os parasitos Monogenea eram considerados mortos quando constatada a ausência de movimentos ao estímulo com agulha, assim como características típicas de mortalidade como enrugamento do corpo. Teste de toxicidade O teste de toxicidade teve o objetivo de analisar o comportamento e resistência dos peixes quando em contato com os óleos. Para cada concentração utilizou-se três peixes para três litros de água e após a adição do óleo foi observado seu comportamento. Temperatura, pH e oxigênio dissolvido (Multiparâmetro Hanna, USA) foram registrados antes e após a adição do óleo, a fim de verificar influência nestes parâmetros devido à adição dos óleos. Na eventualidade do animal apresentar comportamentos incomuns como, agitação, boquejamento, natação intensa ou tombamento, os peixes eram imediatamente retirados do recipiente, transferidos para recuperação e a concentração e tempo registrados..

(37) 37. Desenho experimental Um total de 320 juvenis de tilápia (Oreochromis niloticus) saudáveis e parasitos, com peso e comprimento médio de 9,76 ± 0,48g e 8,47 ± 0,18cm repectivamente, oriundas de uma mesma desova, procedentes de piscicultura comercial, foram aclimatados por 7 dias e distribuídos de forma aleatória, em 16 unidades experimentais de sistema estático com capacidade para 100 L. Foram realizados quatro tratamentos com quatro repetições cada: Peixes expostos à banhos de L. sidoides à concentração de 20 mg.L-1; Peixes expostos à banhos de M. piperita à concentração de 40 mg.L-1; Peixes controle apenas com banhos de água; Peixes controle com banhos de água + DMSO. Durante o experimento era realizada a renovação diária de 50% da água dos tanques e os peixes alimentados 3 vezes ao dia com ração comercial extrusada para peixes onívoros com 28% de proteína bruta, temperatura, oxigênio dissolvido e pH foram mensurados com Multiparâmetro Hanna, USA e amônia total, nitrito e nitrato com Kit Alfakit®, Florianópolis, Brasil. Para cada tratamento realizaram-se três banhos de 10 min com intervalo de 24 h. A solução terapêutica foi distribuída homogeneamente nas bordas dos tanques: 14 mL da solução estoque para os tratamentos com L. sidoides, para a cada repetição; 28 mL para M. piperita; Água: somente água; e Água + DMSO: água adicionada de 224 mL de DMSO. Após o terceiro banho de cada tratamento foi realizada a coleta de 10 peixes por repetição para análise parasitológica e hematológica. Análises parasitológicas e hematológicas Um total de 40 peixes por tratamento, 10 por repetição foram coletados ao final do terceiro banho, anestesiados com eugenol (75 mg/L) e eutanasiados por comoção cerebral (Comitê de Ética no Uso de Animais CEUA/UFSC PP00869). Foi realizada a coleta das brânquias de 5 espécimes para análise parasitológica imediata e, dos outros 5 animais, as brânquias foram imersas em água 60°C e posteriormente fixadas em álcool 70% para análise parasitológica. A quantificação de Monogenea nas brânquias foi realizada em microscópio estereoscópico (Jerônimo, Laffitte, Speck & Martins 2011) e a identificação dos parasitos segundo Thatcher (2006), Douëllou (1993), Pariselle & Euzet (1995) e Pariselle, Bilong & Euzet (2003)..

(38) 38. A eficácia dos óleos essenciais foi calculada segundo a fórmula: EF = MNPGC - MNPGT x 100/ MNPGC (EF: Eficácia, MNPGC: Média do número de parasitos no grupo controle, MNPGT: Média do número de parasitos no grupo tratado) (Dotta, Brum, Jerônimo, Maraschin & Martins 2015). Os dados de prevalência, intensidade média de infestação e abundância média de parasitos foram calculados segundo Bush, Lafferty, Lotz & Shstak (1997). Para as análises hematológicas, 1,0 ml de sangue foi retirado por punção do vaso caudal com seringas contendo EDTA 10%. Uma alíquota foi destinada para determinação do percentual de hematócrito (Ranzani-Paiva, Pádua, Tavares-Dias & Egami 2013), outra utilizada na confecção de extensões sanguíneas, para posterior coloração por MayGrünwald-Giemsa-Wrigth para contagem diferencial de leucócitos, contagem total de trombócitos e total de leucócitos e 5 µL diluídos em 1 mL de solução diluidora de eritrócitos (Solução Dacie) para contagem total de eritrócitos (Blaxhall & Daisley 1973), realizada em câmara de Neubauer. Os números totais de trombócitos e leucócitos foram obtidos pelo método indireto segundo Ranzani-Paiva et al. (2013). Após a leitura do percentual de hematócrito o capilar foi quebrado pouco acima da faixa dos glóbulos brancos e o plasma transferido para o refratômetro de proteína, para determinação da proteína plasmática total, de acordo com Feldman, Zinckl & Jain (2000). Foi analisado o nível de hemoglobina por espectrofotômetro 545 nm Spectrum Meter® e glicose com kit Accu-Chek®. Análise estatística Os dados foram submetidos à análise unifatorial (ANOVA), utilizando software da Statsoft STATISTICA 7.0. As médias entre os tratamentos foram comparadas com nível de significância de p < 0,05. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os parâmetros de qualidade de água de todos os tratamentos mantiveram-se constantes em: temperatura 27,67 ± 0,99 ºC, oxigênio dissolvido 6,83 ± 0,92 mg L-1, pH 5,86 ± 0,65, amônia total 3,00 ± 1,01 mg L-1, nitrito 0,04 ± 0,01 mg L-1 e nitrato 0,70 ± 0,22 mg L-1. Segundo Zaniboni Filho (2004), a tilápia suporta ampla variação nos parâmetros de qualidade da água, como variações entre 26 – 32ºC e pH entre 7 e 8, embora possam suportar variações entre 5 e 11. Dessa forma, a.

(39) 39. qualidade da água foi mantida dentro dos valores aceitáveis para a tilápias. Os animais coletados após os banhos terapêuticos não apresentaram sinais clínicos ou qualquer alteração na superfície corporal decorrente do contato com os óleos essenciais. Além disso, não foram registradas mortalidades após 72 h do terceiro banho realizado. Neste estudo, L. sidoides apresentou composição química semelhantes aos encontrados por Cavalcanti, Niculau, Blank, Câmara, Araújo & Alves (2010), os quais apresentaram o constituinte timol como majoritário (80,8%). Diferentemente, Botelho, Nogueira, Bastos, Fonseca, Lemos, Matos, Montenegro, Heukelbach, Rao & Brito (2007) e Silva, Silva, Garlet, Cunha, Mallmann, Baldisserotto, Longhi, Pereira & Heinzmann (2013) observaram 56,7% e 68,40% de timol, respectivamente. O óleo essencial de M. piperita demonstrou composição química semelhante aos encontrados por Tsai et al. (2013) e Freire et al. (2011) no qual o constituinte majoritário é representado pelo mentol com 28,19% e 54,2%, respectivamente (Figura 1). Essas diferenças nas composições químicas encontrada nos óleos essenciais das plantas estudadas pode ser justificada pelos parâmetros na colheita da planta. Temperatura, horário, local, clima, tamanho da planta e outros fatores influenciam na diferença dos compostos químicos (Reverter et al. 2014). Referente ao teste de imobilização, as concentrações de 160 mg.L-1 e 320 mg.L-1 para L. sidoides e M. piperita, respectivamente, foram as mais eficazes na mortalidade dos parasitos, com tempo médio de 1 min e 58 s, e 8 min e 11 s, respectivamente. Parasitos expostos à água apresentaram tempo médio para mortalidade de 4 h e 21 min e para os expostos à Água + DMSO foi de 2 h e 51 min. Os resultados deste teste mostraram-se eficientes, assim como encontrado por Militz, Southgate, Carton & Hutson (2014), os quais avaliaram o extrato de alho contra Neobenedenia sp. (Monogenea) em perca L. calcarifer. O estudo demonstrou que o extrato de alho pode suprimir significativamente o desenvolvimento do embrião, reduzir o sucesso de eclosão e reduzir a longevidade do oncomiracídio do parasito. De acordo com Tu, Ling, Huang, Zhang & Wang (2013), extratos de clorofórmio da planta Santalum album administrados na forma de banhos em "goldfish" (Carassius auratus) na concentração de 40 mg.L-1 resultou em 100% de eficácia contra Dactylogyrus sp. e Gyrodactylus sp. Os animais submetidos ao teste de toxicidade com óleos essenciais de L. sidoides e M. piperita demonstraram forte reação.

(40) 40. anestésica nas maiores concentrações, apresentando estado profundo de anestesia em poucos minutos (Figura 2). Este comportamento também foram relatadas por Cunha, Barros, Garcia, Veeck, Heinzman, Loro, Emanuelli & Baldisserotto (2010), no qual observaram que o óleo essencial da Lippa alba foi eficiente para anestesiar R. quelen, inibindo o aumento do nível de cortisol no sangue, além de não alterar o odor e sabor do peixe, à concentrações de 100 a 500 mg.L -1. Com isso, para os banhos terapêuticos foi definida a dose para L. sidoides e M. piperita de 20 mg.L-1 e 40 mg.L-1, respectivamente. Nestas concentrações os peixes mantiveram seu comportamento normal. Estes resultados são similares aos obtidos por Boijink, Inoue, Chagas & Chaves (2011) que administraram banhos terapêuticos de Ocimum gratissimum em tambaquis (Colossoma macropomum) nas concentrações de 10 mg.L-1 e 15 mg.L-1 por 15 min, não causando danos aparentes à saúde do animal, em que mantiveram seu comportamento normal..

(41) 41. A. B. Figura 1: Composição química dos óleos essenciais utilizados neste estudo. A - Lippia sidoides e B - Mentha piperita..

(42) 42. Figura 2: Tempo médio de anestesia de O. niloticus submetidas ao teste de toxicidade com óleos essenciais de L. sidoides e M. piperita. Foram identificadas quatro espécies de Monogenea nas brânquias das tilápias analisadas, Cichlidogyrus tilapiae Paperna, 1960, Cichlidogyrus thurstonae Ergens, 1981, Cichlidogyrus halli Price e Kirk, 1976 e Scutogyrus longicornis Paperna e Thurston 1969 (Thatcher 2006; Douëllou 1993; Pariselle & Euzet 1995; Pariselle et al. 2003). Estas espécies já foram observadas em outras condições de cultivo de tilápia do Nilo, sendo agentes potenciais de enfermidades (Jerônimo et al. 2011; Martins, Sá, Jerônimo, Tancredo, Gonçalves, Bampi, Speck & Sandin 2014; Dotta et al., 2015). A capacidade antiparasitária observada nos óleos essenciais de L. sidoides e M. piperita está provavelmente atribuída à presença de algum composto químico com propriedades antiparasitárias. Porém, o presente estudo relata pela primeira vez esta capacidade, sendo uma descoberta de grande importância para o tratamento de doenças causadas por Monogenea. No entanto, o modo de ação e o composto químico que causou este resultado são desconhecidos, necessitando de mais estudos. Os peixes tratados com L. sidoides e M. piperita apresentaram carga parasitária significativamente menor quando comparados aos submetidos aos tratamentos com água e água + DMSO, indicando redução de 75% e 72,5% do parasitismo para alecrim-pimenta e hortelãpimenta, respectivamente (Tabela 1)..

(43) 43. Segundo Cruz, Machado-Neto, Fujimoto, Henares & Duó (2008) banhos terapêuticos em pacu (Piaractus mesopotamicus), utilizando 2,9 mg/L por 5 dias do extrato de Nim, Azadirachta indica no controle de Anacanthorus penilabiatus (Monogenea), reduziram 89,2% o parasitismo. O mesmo foi observado por Queiroz (2012) que testou o uso do extrato do pariparoba, Piper aduncum em pirarucu (Arapaima gigas) parasitados por Dawestrema cycloancistrium (Monogenea) administrando banhos com 80 ml/L por 24 h, observando redução de 80% da carga parasitária quando comparado ao controle. O cálculo da eficácia resultou em 1,96% e 14,16% para L. sidoides e 33,33% e 41,63% para M. piperita, quando comparados aos peixes submetidos à água e água + DMSO, respectivamente (Figura 1). Tabela 1: Valores médios de prevalência (%), intensidade e abundância (±desvio padrão) de Monogenea, entre os peixes tratados com L. sidoides (20 mg.L-1), M. piperita (40 mg.L-1), Água e água + DMSO. Lippia sidoides. Mentha piperita. Água. Água + DMSO. Prevalência 25 27,5 57,5 60 (%) Intensidade 2,00±1,24 1,36±0,67 2,04±1,22 2,33±1,65 média Abundância 0,50±1,06ab 0,38±0,70c 1,18±4,70bc 1,40±1,72a média *Letras distintas indicam diferença significativa entre os tratamentos (P<0,05). Estes resultados mostram a vantagem do uso de produtos naturais menos agressivos à produção de peixes, uma vez que os tratamentos já existentes constituem em produtos químicos e são utilizados constantemente nas pisciculturas. Corroborando esta hipótese, Paixão, Santos, Ramos & Fujimoto (2013), observaram resultados satisfatórios no combate ao parasitismo por Monogenea em tetra (Hemigrammus sp.) utilizando a formalina, porém registraram mortalidade e características tóxicas aos animais em maiores concentrações. Segundo Dotta et al. (2015) tilápia do Nilo alimentada com dieta suplementada com 0,5% e 1% de extratos de própolis e Aloe barbadensis apresentaram eficácias de 83% e 85%, respectivamente,.

(44) 44. frente ao parasitismo por Monogenea, demonstrando a potencialidade destes produtos naturais no combate a parasitose. Neste trabalho destaca-se o tratamento com M. piperita, no qual demonstrou melhor eficácia contra o parasitismo (Figura 3).. Figura 3: Eficácia de óleos essenciais de Lippia sidoides (20 mg.L-1) e Mentha piperita (40 mg.L-1) comparados aos controles água e água + DMSO administrados na forma de banhos terapêuticos em tilápia do Nilo. A avaliação dos componentes sanguíneos pode auxiliar na determinação da influência nas condições homeostáticas em peixes. Neste estudo, o percentual de hematócrito apresentou maiores valores (p<0,05) nos animais tratados com L. sidoides quando comparados aos peixes do grupo controle. A contagem total de eritrócitos foi menor nos peixes tratados com L. sidoides (Tabela 2). A contagem total de trombócitos também foi inferior no grupo tratado com L. sidoides. Taxa de glicose e o número de neutrófilos nos animais tratados com L. sidoides foi significativamente maior comparado aos demais tratamentos (Tabela 2). Peixes expostos a diferentes ambientes, em contato com diversos produtos ou ao estresse podem apresentar variações nas características hematológicas. O percentual de hematócrito reflete a proporção do volume total de eritrócitos no sangue em relação à quantidade de leucócitos, trombócitos e plasma sanguíneo. Os eritrócitos têm como função o transporte de oxigênio e gás carbônico.

(45) 45. (Ranzani-Paiva et al. 2013). O maior percentual de hematócrito e menor número de eritrócitos nos animais tratados com L. sidoides sugerem a presença de algum agente estressor responsável por suprimir o número de eritrócitos e/ou a disfunção respiratória. No entanto, o número de eritrócitos nos peixes tratados com L. sidoides, apesar de inferior aos demais tratamentos, está dentro do padrão observado para a espécie (Tavares-Dias, Ishikawa, Martins, Satake, Hisano, Pádua, Jerônimo & Sant’ana 2009). Porém, destaca-se que mesmo dentro do padrão da espécie, o contato com a L. sidoides causou alterações hematológicas nos peixes. Observou-se diminuição significativa no número de trombócitos, os quais participam na coagulação do sangue e também defesa do organismo (Martins, Mouriño, Amaral, Vieira, Dotta, Jatobá, Pedrotti, Jerônimo, Buglione-Neto & Pereira 2008). Com isto, sugere-se que o baixo valor encontrado nos animais tratados com L. sidoides pode ser justificado pela migração destas células para áreas expostas, como brânquias e superfície do corpo, demonstrando o efeito irritativo do óleo. Ainda neste mesmo tratamento, observou-se aumento no número de neutrófilos e no nível de glicose (p<0.05). Os neutrófilos são granulócitos intimamente relacionados a defesa do organismo (Iwana & Nakanishi 1996), e situações de neutrofilia em peixes já foi relatada devido a estresse de manejo (Jerônimo et al. 2011), presença de parasitos (Tavares-Dias, Moraes & Martins 2008) ou infecção (Martins et al., 2008). Por sua vez, os níveis de glicose em peixes teleósteos, podem ser afetados por diversos fatores, sendo a dieta a mais importante, seguida pelo estresse e estado de saúde do peixe (Barton & Iwana 1991). Portanto, a neutrofilia observada em tilápia do Nilo submetidas ao banho com L. sidoides, associada ao alto nível de glicose observado, podem estar relacionados ao possível estresse causado pelo óleo essencial de L. sidoides..

(46) Lippia sidoides. Mentha piperita 26,5 ± 3,66ab 2,79 ± 0,50a 8,62 ± 0,99a 5,4 ± 0,40a 65 ± 15,82b. Água. Água + DMSO. Hematócrito (%) 28,25 ± 3,27a 25,5 ± 3,93b 27,5 ± 3,26ab 6 -1 c b Eritrócitos (x 10 .µl ) 1,85 ± 0,33 2,22 ± 0,70 2,76 ± 1,08a b b Hemoglobina 7,89 ± 0,99 7,25 ± 1,11 7,69 ± 1,09b -1 a a Proteína (g.dL ) 5,45 ± 0,60 5,7 ± 0,54 5,4 ± 0,46a -1 a b Glicose (mg.dL ) 83 ± 34,19 52,5 ± 26,12 51,5 ± 34,37b Leucócitos totais 91,7 ± 37,9a 91,45 ± 30,46a 107,14 ± 46,62a 94,77 ± 53,85a (x 103.µl-1) Trombócitos (x 103.µl-1) 42,12 ± 24,01b 89,47 ± 34,66a 83,30 ± 42,12a 90,19 ± 68,92a 3 -1 a a a Linfócitos (x 10 µl ) 85,58 ± 35,79 83,81 ± 29,66 103,35 ± 45,10 87,95 ± 50,85a 3 -1 a b b Neutrófilos (x 10 µl ) 3,35 ± 4,12 0,75 ± 1,31 0,83 ± 3,07 1,64 ± 3,25b 3 -1 ab a b Monócitos (x 10 µl ) 3,60 ± 2,84 4,78 ± 2,59 2,97 ± 2,14 5,29 ± 5,43a Letras minúsculas indicam diferença significativa entre os tratamentos de L. sidoides, M. piperita, água e água + DMSO, pela análise de unifatorial (ANOVA) (P<0,05).. Parâmetros. Tabela 2: Média (± desvio padrão) dos parâmetros hematológicos de tilápia-do-Nilo, quando submetida a banhos terapêuticos com óleo essencial de L. sidoides (20 mg.L-1), M. piperita (40 mg.L-1), Água e água + DMSO.. 46.