Determinação da viremia e da soroprevalência do vírus da Hepatite E (HEV) em doadores de sangue

Texto

(1)UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃ PRETO. MELINA LELLIS BIANQUINI. Determinação da viremia e da soroprevalência do vírus da Hepatite E (HEV) em doadores de sangue. Ribeirão Preto 2018.

(2) MELINA LELLIS BIANQUINI. Determinação da viremia e da soroprevalência do vírus da Hepatite E (HEV) em doadores de sangue. Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação do Mestrado Profissional em Hemoterapia e Biotecnologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, para a obtenção do título de Mestre em Ciências. Área de Concentração: Hemoterapia Aluna: Melina Lellis Bianquini Orientadora: Prof.ª Dr.ª Simone Kashima Haddad. Ribeirão Preto 2018.

(3) Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.. B577d Bianquini, Melina Lellis Determinação da viremia e da soroprevalência do vírus da Hepatite E (HEV) em doadores de sangue./Melina Lellis Bianquini, 2018. 69 p.: il.; 30 cm Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Hemoterapia. Orientadora: Haddad, Simone Kashima. 1. Hemoterapia. 2. Hepatite E. 3. Doadores de Sangue. 4. Soroprevalência. CDU 616.36-002.

(4) Nome: BIANQUINI, Melina Lellis Título: Determinação da viremia e da soroprevalência do vírus da Hepatite E (HEV) em doadores de sangue.. Dissertação apresentada ao Programa de Pós- graduação de Mestrado Profissional em Hemoterapia e Biotecnologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, para a obtenção do título de Mestre em Ciências.. Aprovado em:. /. /. Banca Examinadora. Prof(a). Dr(a). Instituição:. Julgamento:. Assinatura:. Prof(a). Dr(a). Instituição:. Julgamento:. Assinatura:. Prof(a). Dr(a). Instituição:. Julgamento:. Assinatura:. Prof(a). Dr(a). Instituição:. Julgamento:. Assinatura:.

(5) À minha família, com amor, admiração e gratidão, pela compreensão, carinho e incansável apoio ao longo do período de elaboração deste trabalho. À minha filha Luiza, por ser a força que me move..

(6) AGRADECIMENTOS. A Deus, por tudo e sempre. À Professora Dra. Simone Kashima Haddad, pela atenção e apoio durante o processo de definição e orientação. Obrigada por sua dedicação, paciência e compreensão. Ao Professor Dr. Svetoslav Nanev Slavov pelo grande auxílio no desenvolvimento desse projeto. À Dra. Vanderléia Bárbaro Valente, pelo apoio e amizade e por colocar à disposição a área experimental utilizada neste trabalho. Ao Ministério da Saúde, Coordenação de Sangue e Hemoderivados, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e Hemocentro de Ribeirão Preto, pelo desenvolvimento do Programa de Mestrado Profissional em Hemoterapia. Curso de grande importância para o aperfeiçoamento dos profissionais que atuam nos Hemocentros do Brasil. À Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto, pela oportunidade de realização do curso de mestrado. Às equipes dos laboratórios de Sorologia e Biologia Molecular do Hemocentro de Ribeirão Preto, pelo apoio oferecido durante a elaboração da parte prática desse projeto. Ao meu amigo e companheiro de vida, Gustavo. Obrigada por estar comigo..

(7) “Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades, lembrai-vos de que as grandes coisas do homem foram conquistadas do que parecia impossível.” Charles Chaplin.

(8) RESUMO. BIANQUINI, M. L. Determinação da viremia e da soroprevalência do vírus da Hepatite E (HEV) em doadores de sangue. 2018. 69p. Dissertação de Mestrado Profissional. Área de Concentração - Hemoterapia. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.. Introdução: O HEV é um patógeno viral, transmitido principalmente pela via fecal-oral e responsável por grandes surtos de hepatite em todo o mundo. A hepatite E é considerada a hepatite com transmissão entérica mais frequente no mundo, e um importante problema de saúde pública. Por apresentar uma fase sanguínea assintomática e ser um agente emergente, cuja incidência vem aumentando ao longo da última década, o HEV é também considerado um problema para a hemoterapia, uma vez que põe em risco a segurança transfusional, devido ao risco de sua transmissão por transfusão sanguínea. No Brasil, sua ocorrência e características ainda não são compreendidas e os estudos disponíveis são limitados. Objetivo: Determinar a prevalência do HEV em doadores de sangue do Hemocentro de Ribeirão Preto no ano de 2015. Material e Métodos: Foram selecionados aleatoriamente 1.000 doadores de sangue do Hemocentro de Ribeirão Preto no período de janeiro a dezembro de 2015. Inicialmente, foi realizada a pesquisa de anticorpos da classe IgG do HEV em plasma, utilizando a metodologia de imuno-ensaio enzimático (ELISA). As amostras que se apresentaram reagentes (positivas ou inconclusivas) para IgG HEV, foram submetidas à pesquisa de antígenos virais, também por metodologia ELISA. Paralelamente aos testes sorológicos, foi realizado o teste molecular para a detecção de RNA viral, aplicando a técnica de PCR em tempo real e utilizando primers desenhados para a região mais conservada do vírus (ORF-3). Resultados: Entre as 1.000 amostras testadas, 124 foram positivas para a pesquisa de anticorpos anti-HEV IgG e 5 foram inconclusivas. A soroprevalência encontrada foi de 12,5%. A maior prevalência encontrada foi na faixa etária de 50-59 anos (21,2%, p<0,01), porém com aumento significativo entre os 40 e 69 anos de idade. A menor prevalência encontrada foi no grupo etário de 18 a 29 anos (3,9%). A soroprevalência foi proporcionalmente maior entre os indivíduos do gênero masculino (14,3%, p<0,06) em relação aos indivíduos do sexo feminino (10,4%). Nenhuma das amostras testadas foi positiva para a pesquisa de antígenos HEV e nem para a detecção de RNA viral. Conclusão: A soroprevalência do vírus da hepatite E encontrada entre os doadores de sangue de Ribeirão Preto foi alta (12,5%) e compatível com os dados nacionais de soroprevalência entre doadores. A viremia não pode ser estabelecida, pois não foram encontrados casos de HEV RNA positivos. Palavras-chave: Hepatite E, soroprevalência, doadores de sangue, segurança transfusional..

(9) ABSTRACT. BIANQUINI, M. L. Determination of Viremia and Seroprevalence of Hepatitis E vírus (HEV) in blood donors. 2018. 69p. Dissertation (Master). Area - Hemotherapy. Faculty of Medicine de Ribeirão Preto – University of São Paulo, Ribeirão Preto.. Introduction: HEV is a viral pathogen, transmitted primarily by the fecal-oral route and responsible for large outbreaks of hepatitis worldwide. Hepatitis E is considered the most common transmissible enteric hepatitis in the world, and is currently considered a major public health problem. Because it presents an asymptomatic blood stage and is an emerging agent whose incidence has increased over the last decade, HEV is also considered a problem for hemotherapy, since it jeopardizes transfusion safety due to the risk of its transmission by transfusion. In Brazil its occurrence and characteristics are poorly understood and available studies are limited. Objective: To determine the prevalence of HEV in blood donors at the Hemocentro de Ribeirão Preto in the year 2015. Material and Methods: 1.000 blood donors were randomly selected from the Hemocentro of Ribeirão Preto from January to December 2015. Initially, a HEV IgG antibody was investigated in plasma, using ELISA (enzyme immunoassay). As samples that presented reagents (positive or inconclusive) for HEV IgG, they were submitted to the research of viral antigens, also by ELISA methodology. In parallel to the serological tests, it was carried out for molecular testing to detect viral RNA, applying a real-time PCR technique and using primers designed for a more conserved region of the virus (ORF-3). Results: Among 1,000 tested samples, 124 were positive for anti-HEV IgG antibodies and 5 were inconclusive. One seroprevalence was found to be 12.5%. A higher prevalence was found in the age range of 50-59 years (21.2%, p<0,001), but with a significant increase between 40 and 69 years of age. The lowest prevalence was found for the 18-29 age group (3.9%). Seroprevalence was proportionally higher among males (14.3%, p<0,06) than among female users (10.4%). It was not evaluated for a HEV antigen search or for viral RNA detection. Conclusion: A seroprevalence of hepatitis E virus found among blood donors from Ribeirão Preto and high (12.5%) and compatible with data from seroprevalence among donors. Viremia cannot be established because no cases of positive RNA HEV have been found. Key words: Hepatitis E, seroprevalence, blood donors, transfusion safety..

(10) LISTA DE FIGURAS. Figura 1. Estimativa do risco de transmissão de doenças infecciosas por transfusão nos E.U.A. entre 1970-1999 .......................................................................................................... 18 Figura 2. Fatores envolvidos na emergência e reemergência de doenças infecciosas ........... 19 Figura 3. Árvore filogenética do HEV ................................................................................... 23 Figura 4. História evolutiva e reservatórios do HEV ............................................................. 24 Figura 5. Representação da estrutura do HEV ....................................................................... 25 Figura 6. Genoma do HEV .................................................................................................... 26 Figura 7. Ciclo replicativo do HEV........................................................................................ 27 Figura 8. Distribuição global da hepatite E ........................................................................... 29 Figura 9. Distribuição geográfica dos genótipos do HEV ..................................................... 30 Figura 10. Ciclo de transmissão do HEV ............................................................................... 31 Figura 11. Marcadores sorológicos e moleculares do HEV ................................................... 32 Figura 12. Fluxograma da estratégia experimental para a detecção do HEV em doadores de sangue ...................................................................................................................................... 43 Figura 13. Distribuição dos doadores anti-HEv IgG positivos por gênero ............................ 51 Figura 14. Distribuição dos doadores anti-HEV IgG positivos entre os grupos etários ........ 52 Figura 15. Distribuição dos doadores anti-HEV IgG positivos por gênero e grupos etários ..53 Figura 16. Curva de amplificação do controle positivo na PCR em tempo real in house para detecção do HEV .......................................................................................................................................... 54.

(11) LISTA DE TABELAS. Tabela 1. Testes obrigatórios para triagem laboratorial de doenças infecciosas ................... 17 Tabela 2. Classificação do HEV ............................................................................................ 22 Tabela 3. Avaliação da viremia do HEV entre doadores de sangue em diferentes partes do mundo ...................................................................................................................................... 34 Tabela 4. Soroprevalência de anticorpos anti-HEV entre doadores de sangue em diferentes partes do mundo ...................................................................................................................... 35 Tabela 5. Soroprevalência e viremia do HEV em doadores de sangue no Brasil .................. 36 Tabela 6. Determinação do tamanho amostral ....................................................................... 42 Tabela 7. Descritiva da variável idade na amostragem total .................................................. 49 Tabela 8. Distribuição por gênero e grupos etários da amostragem total .............................. 49 Tabela 9. Descritiva da variável idade ................................................................................... 49 Tabela 10. Distribuição por gênero e grupos etários .............................................................. 50 Tabela 11. Distribuição dos doadores positivos e negativos por gênero ............................... 50 Tabela 12. Distribuição dos doadores positivos e negativos por grupo etário ....................... 51 Tabela 13. Distribuição do gênero dos doadores anti-HEV IgG positivos pelos grupos etários .................................................................................................................................................. 52.

(12) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS. AABB Ac AIDS C.O. CDC c-DNA CEP D.O. DNA dNTP EDTA EID ELISA HAV HBsAg HBV HCV HEV HIV HTLV IgG IgM NAT OMS ORF PCR RDC RNA RT PCR TMB. = Associação americana de banco de sangue (do inglês, American Association of Blood Bank) = Anticorpos = Sindrome da imunodeficiencia humana adquirida = Cut off = Centro para controle e prevenção de doença (do inglês, center for desease control and prevention) = DNA complementar = Comitê de ética em pesquisa = Densidade ótica = Ácido desoxirribonucleico = Desoxirribonucleotídeos trifosfatados = Ácido etilenodiamino tetra-acético (do inglês, ethylenediamine tetraacetic acid) = Doença infecciosa emergente (do inglês, emerging infectious disease) = Ensaio imunuenzimático (do inglês, enzime – linked immuno sorbent assey) = Vírus da Hepatite A (do inglês, Hepatitis A Virus) = Antígeno de superfície do Vírus da Hepatite B = Vírus da Hepatite B (do inglês, Hepatitis B Virus) = Vírus da Hepatite C (do inglês, Hepatitis C Virus) = Vírus da Hepatite E (do inglês, Hepatitis E Virus) = Vírus da Imunodeficiencia Humana (do inglês, Human Immunodeficiency Virus = Vírus T- Linfotrópico Humano (do inglês, Human T-cell Lymphotropic Vírus) = Imunoglobulina G = Imunoglobulina M = Teste de ácido nucleico (do inglês, nucleic acid test) = Organização Mundial da Saúde = Região de leitura aberta (do inglês, open Reading frame) = Reação em cadeia da polimerase (do inglês, polimerase chain reaction) = Resolução da diretoria colegiada = Ácido ribonucleico = Reação de transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase = Tetrametilbenzidina.

(13) SUMÁRIO. RESUMO ABSTRACT LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS. 1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 15 1.1. Triagem de Doenças Infecciosas em Doadores de Sangue .............................................. 16 1.2. Doenças Infecciosas na Hemoterapia ............................................................................... 17 1.3. Hepatite E ......................................................................................................................... 20 1.3.1. Histórico ........................................................................................................................ 20 1.3.2. Classificação e filogenia ............................................................................................... 21 1.3.3. Características virais ..................................................................................................... 24 1.3.4. Patogênese ..................................................................................................................... 27 1.3.5. Epidemiologia ............................................................................................................... 28 1.3.6. Diagnóstico laboratorial ................................................................................................ 31 1.3.7. HEV e transfusão sanguínea ......................................................................................... 33 1.4. Hipótese ............................................................................................................................ 36 1.5. Justificativa do Estudo ..................................................................................................... 36. 2 OBJETIVOS ....................................................................................................................... 38 2.1. Objetivos Gerais ............................................................................................................... 39 2.2. Objetivos Específicos ....................................................................................................... 39. 3 MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................. 40 3.1. Aspectos Éticos ................................................................................................................ 41 3.2. Modelo de Estudo ............................................................................................................ 41 3.3. Casuística ......................................................................................................................... 41 3.4. Amostragem ..................................................................................................................... 41 3.5. Estratégia de Execução .................................................................................................... 42 3.6. Testes Sorológicos ........................................................................................................... 43.

(14) 3.6.1. Detecção de anticorpos anti-HEV ................................................................................. 43 3.6.2. Detecção de antígenos do HEV ..................................................................................... 44 3.7. Teste Molecular ................................................................................................................ 45 3.7.1. Extração do RNA viral .................................................................................................. 45 3.7.2. Transcrição reversa ....................................................................................................... 45 3.7.3. RT PCR em tempo real in house ................................................................................... 46 3.7.3.1 Técnica ........................................................................................................................ 47. 4 RESULTADOS ................................................................................................................... 48. 5 DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 55. 6 CONCLUSÕES .................................................................................................................. 60. 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 62. ANEXOS ................................................................................................................................ 66 Anexo I – Parecer consubstanciado do Comitê de Ética e Pesquisa ....................................... 67 Anexo II – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ...................................................... 68.

(15) ______________________ Introdução.

(16) ______________________________________________________________________________ Introdução | 16. 1. INTRODUÇÃO. 1.1. Triagem de Doenças Infecciosas em Doadores de Sangue. A introdução da triagem para doenças infecciosas em doadores de sangue só teve início na década de 1940, com a implantação do teste para o diagnóstico da sífilis. Somente no início dos anos 1970, iniciou-se a pesquisa do antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg) (STRAMER; DODD, 2013). Do início da implantação da triagem até os dias atuais, pudemos observar uma crescente evolução, que teve como marco central a identificação do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) no final da década de 80. O advento do HIV levou ao aperfeiçoamento dos conjuntos diagnósticos, o que proporcionou o desenvolvimento da triagem laboratorial e contribuiu para o incremento da segurança transfusional (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004). Atualmente, a regulamentação técnica da atividade hemoterápica no Brasil, através da Resolução da Diretoria Colegiada - RDC - 158 de 04 de fevereiro de 2016 (BRASIL, 2016), preconiza que todo doador de sangue deve ser submetido à triagem clínica e laboratorial, visando à redução do risco de transmissão de doenças e a consequente proteção do receptor. A RDC 158 (BRASIL, 2016), determina ainda que, para a triagem de doenças infeciosas em doadores de sangue, é obrigatória a realização de exames laboratoriais de alta sensibilidade a cada doação para a detecção de marcadores sorológicos para as seguintes infecções: doença de Chagas, hepatite B, hepatite C, AIDS, sífilis e HTLV (vírus T-linfotrópicos humanos). Além de testes de ácido nucleico (NAT) para os vírus da hepatite B e C e HIV, conforme pode ser observado na próxima tabela:.

(17) ______________________________________________________________________________ Introdução | 17. Tabela 1 - Testes obrigatórios para triagem laboratorial de doenças infecciosas no Brasil.. Testes Obrigatórios Doença Pesquisada. Marcadores Sorológicos. Hepatite B HBsAg e Anti-HBc Hepatite C Ac ou Ac + Ag do HCV Aids Ac (contra subtipos 1, 2 e O) ou Ac + Ag p24 do HIV Infecção pelo HTLV Ac contra o HTLV I/II Doença de Chagas Ac anti- Trypanosoma cruzi Sífilis Ac anti- treponêmico ou Ac não treponêmico. NAT DNA viral RNA viral RNA viral -. Fonte: Adaptado de Brasil (2016).. Nas regiões endêmicas de malária, ainda devem ser realizados testes para a detecção de plasmódio ou anticorpos plasmodiais. Para a prevenção da transmissão do citomegalovírus (CMV), quando não forem utilizados hemocomponentes desleucocitados, é obrigatória a realização de exames laboratoriais de alta sensibilidade em todas as unidades de sangue ou hemocomponentes destinados aos pacientes nas seguintes situações: transplantados de medula óssea ou órgão; recém-nascidos com peso inferior a 1.200 gramas ao nascimento e transfusão intrauterina (BRASIL, 2016).. 1.2. Doenças Infecciosas Emergentes na Hemoterapia. Devido à realização das triagens clínicas e laboratoriais eficazes dos candidatos à doação, o sangue transfundido atualmente é considero seguro. A segurança alcançada é o reflexo de sucessivos refinamentos e melhorias na forma de como o sangue é coletado, analisado, processado, e transfundido. Entretanto, mesmo diante deste panorama, a segurança transfusional continua vulnerável à presença de infecções emergentes e reemergentes, para as quais os mecanismos de triagem não são eficientes. (DODD, 2012; CHAMBERLAND,. 2002). A realização de novos testes e o surgimento de novas metodologias, ao mesmo tempo em que contribuíram para a segurança transfusional, também permitiram a descoberta de novos agentes (STRAMER; DODD, 2013). Podemos observar, conforme a figura abaixo, uma diminuição gradual do risco de transmissão por transfusão de alguns patógenos, como por exemplo, do HCV e o aumento ao longo das últimas décadas do risco de transmissão pelos patógenos emergentes..

(18) ______________________________________________________________________________ Introdução | 18. Figura 1 - Estimativa do risco de transmissão de doenças infecciosas por transfusão nos E.U.A. entre 1970-1999. Fonte: Adaptado de Chamberland (2002).. As evidências de que o controle total das doenças infecciosas não conseguiu ser alcançado, levaram ao desenvolvimento do conceito de doenças infecciosas emergentes (EID) (STRAMER; DODD, 2013). Atualmente as infecções emergentes são definidas como aquelas cuja incidência em seres humanos tem aumentados nas últimas décadas ou então àquelas que apresentam um potencial de aumento para um futuro próximo (STRAMER, 2014). No entanto, mesmo com definição e terminologia recentes, encontramos referências às infecções emergentes no antigo testamento, na China antiga, na Grécia clássica, em Roma, e em séculos subsequentes. Essas referências nos demonstram a importância e o impacto desses agentes ao longo da história, principalmente quando observamos a emergência desses agentes assumindo características epidêmicas ou panêmicas (MORENS; FOLKERS; FAUCI, 2008). Muitos mecanismos podem levar ao risco de surgimento de uma doença infecciosa emergente, entre eles: i) o aparecimento de uma doença infecciosa nova, na maioria das vezes devido a uma infecção zoonótica cruzando com a espécie humana; ii) a expansão de uma infecção existente para uma área geográfica maior e/ou para uma área onde exista uma maior proporção de uma população suscetível; iii) o colapso das medidas de saúde pública; e iv) por meio de agentes benignos que podem se tornam graves patógenos frente à novos tratamentos médicos (STRAMER, 2014). Portanto, podemos concluir que a emergência de novos.

(19) ______________________________________________________________________________ Introdução | 19. patógenos ocorre devido a uma diversidade de fatores, tais como: genéticos, biológicos e socioeconômicos; ou ainda de uma combinação desses fatores (MORENS; FOLKERS; FAUCI, 2008), conforme listado na Figura 2:. Fatores genéticos, biológicos, econômicos e sociais envolvidos no aparecimento de doenças emergentes e reemergentes:. 1. Comércio internacional 2. Demografia e comportamento humano 3. Suscetibilidade humana à infecção 4. Pobreza e desigualdade social 5. Guerra e fome 6. Falha das políticas de saúde pública 7. Tecnologia e indústria 8. Mudança de ecossistema 9. Prejuízo intencional (bioterrorismo) 10. Falta de empenho político 11. Adaptação e mudança microbiana 12. Desenvolvimento econômico e manejo do solo. Figura 2 - Fatores envolvidos na emergência e reemergência de doenças infecciosas. Fonte: Segundo Morens, Folkers e Fauci (2008).. A primeira infecção emergente com importante efeito na medicina transfusional, foi a infecção pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). As lições aprendidas com essa epidemia nos alertam para a necessidade de estarmos atentos aos agentes emergentes e reemergentes que possam vir a afetar a segurança transfusional (STRAMER; DODD, 2013). Quando relacionamos as doenças emergentes com doação e transfusão de sangue, podemos afirmar que qualquer infecção que tenha uma fase sanguínea assintomática, seja ela curta ou prolongada, apresenta potencial para transmissão por transfusão. Outras características que também são necessárias para a transmissão do agente por transfusão são: a sua sobrevida no sangue/hemocomponente coletado e sua capacidade de causar infecção pela via intravenosa (STRAMER, 2014). A frequência com a qual uma infecção é transmitida aos receptores de sangue depende diretamente do período de tempo no qual ela se mantém assintomática e com que regularidade o sangue é doado durante este período. O estado imune da população receptora.

(20) ______________________________________________________________________________ Introdução | 20. também está diretamente relacionado com a frequência e com gravidade da doença resultante da infecção (KIELY et al., 2017). Atualmente, segundo orientações da American Association of Blood Bank (AABB), temos setenta e quatro agentes infecciosos emergentes que oferecem potencial risco de transmissão por transfusão sanguínea, dentre os quais está incluído o vírus da hepatite E (STRAMER, 2014). Esses agentes devem ser constantemente estudados e monitorados, uma vez que a própria essência das infecções emergentes é que sua evolução e manifestações são intrinsecamente imprevisíveis (STRAMER et al., 2016).. 1.3. Hepatite E. 1.3.1. Histórico Os primeiros casos de hepatite foram inicialmente descritos como uma epidemia ictérica, há mais de 2000 anos, no tempo de Hipócrates. No entanto, foi apenas entre 1965 e 1990, que os vários vírus da hepatite humana, seus sintomas e o seu papel na oncogênese hepática foram determinados, levando à expansão da sua nomenclatura de A a E (SCHMID, 2001). Na década de 1970, dois agentes responsáveis por vários casos de hepatite infecciosa foram descobertos e nomeados como vírus da hepatite A (HAV) e vírus da hepatite B (HBV). O desenvolvimento de testes sorológicos sensíveis para a detecção desses agentes levou à constatação de que uma grande proporção de casos de hepatite infecciosa e hepatite póstransfusional, não estavam relacionados a nenhum dos dois agentes. Esses casos foram rotulados provisoriamente como hepatite não-A e não- B (KHUROO, 2011; SCHMID, 2001). Em 1978, um surto de hepatite viral aguda no Vale de Caxemira, na Índia, lançou a base para a descoberta de um novo agente de hepatite. A suspeita principal recaía sobre algum agente viral de transmissão entérica, porém dos 31 pacientes testados, apenas um tinha anticorpos anti-HVA detectáveis e nenhum deles possuía o antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg). Nesta mesma época, foi realizada uma investigação retrospectiva em soros armazenados de um surto de hepatite ocorrido em 1956 em Nova Deli e nenhuma das amostras analisadas foi reativa para marcadores de hepatite A e hepatite B, corroborando com a tese da existência de um novo agente viral causador de hepatite (PETRIK et al., 2015; AGGARWAL,2011)..

(21) ______________________________________________________________________________ Introdução | 21. Em 1983, um novo surto de hepatite com as mesmas características dos ocorridos em Nova Deli e Caxemira, acometeu soldados soviéticos no Afeganistão. O virologista russo Mikhail Balayan, a fim de tentar comprovar a transmissão entérica do agente, se voluntariou e ingeriu extrato aquoso contaminado com matéria fecal de nove soldados doentes. O voluntário desenvolveu hepatite aguda típica no dia 36 após a ingestão do extrato fecal. Os espécimes de fezes coletados nos dias 28-45 apresentaram partículas esféricas semelhantes a vírus (VLPs) quando observados por microscopia eletrônica imune. O voluntário apresentou soroconversão para o novo vírus, mas não apresentou HBsAg detectável ou reatividade para anticorpos antiHAV. Dois macacos cynomolgus sp inoculados com uma suspensão de fezes do voluntário mostraram excreção de VLPs semelhantes e elevação da enzima hepática, confirmando a existência de um novo vírus causador de hepatite (KAMAR et al., 2014). Uma década após a descoberta do novo vírus, uma parte do seu genoma conseguiu ser isolada a partir da bile de um animal experimentalmente infectado. As sequências genômicas semelhantes também foram isoladas em espécimes clínicas obtidos de várias regiões geográficas. Após o sequenciamento molecular de todo o genoma viral, o novo agente foi denominado vírus da hepatite E (HEV), usando a próxima letra do alfabeto inglês disponível, uma vez que nessa época já se conhecia quatro agentes causadores de hepatites virais: HAV (vírus da hepatite A), HBV (vírus da hepatite B), HCV (vírus da hepatite C) e HDV (vírus da hepatite D) e também pelas características ‘E’ntérica e ‘E’ndêmica do vírus (AGGARWAL, 2011).. 1.3.2. Classificação e filogenia. O HEV foi inicialmente classificado como membro da família Picornaviridae, devido a sua semelhança com o HAV. Uma vez que as suas características morfológicas e a organização do seu genoma foram determinadas, o vírus foi transferido para a família Caliciviridae sob o gênero Hepevirus. Posteriormente, com base na análise molecular, o HEV passou a ser classificado como o único agente do gênero Hepevirus da família Hepeviridae. Recentemente, com base em características filogenéticas e na diversidade de hospedeiros do vírus, a família Hepeviridae a qual pertence o HEV, passou a ser classificada em dois gêneros: Orthohepevirus e Piscihepevirus. São classificados como gênero Orthohepevirus os genótipos isolados de mamíferos e aves e como Piscihepevirus o único genótipo isolado de trutas (KHUROO; KHUROO; KHUROO, 2016). O gênero Orthohepevirus inclui as espécies A, B, C e D. A espécie A possui sete.

(22) ______________________________________________________________________________ Introdução | 22. genótipos identificados até o momento, a espécie B possui três genótipos, a espécie C possui dois e a espécie D apenas um. A espécie A engloba genótipos que infectam humanos (HEV-1 e HEV-2), genótipos com características zoonóticas que infectam humanos e animais (HEV-3 e HEV-4) e genótipos que infectam somente animais (HEV-5, HEV-6 e HEV-7). Na espécie B encontramos três genótipos (HEV-1 aviário, HEV-2 aviário e HEV-3 aviário), todos infectando aves. Na espécie C incluem-se dois genótipos (HEV C-1 e HEV C-2) isolados apenas em roedores. A espécie D contempla apenas um genótipo (HEV-D), isolado de morcegos (KHUROO; KHUROO; KHUROO, 2016). O gênero Piscihepevirus possui apenas a espécie A (HEV-A Piscihepevirus), cujo genótipo foi isolado em trutas (KHUROO; KHUROO; KHUROO, 2016). Na tabela abaixo podemos observar a classificação do vírus, seus genótipos e subgenótipos: Tabela 2 – Classificação do HEV.. Família Hepeviridae Gênero. Espécie. A. Genótipo. Subgenótipo. 1 (A HEV-1). 1a, 1b, 1c, 1d ,1e. 2 (A HEV-2). 2a, 2b. 3 (A HEV-3). 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f, 3g,3h, 3i,3j. 4 (A HEV-4). 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g. A HEV-5 A HEV-6 A HEV-7. Orthohepevirus. HEV-1 aviário B. HEV-2 aviário HEV-3 aviário. C. HEV C-1 HEV C-2. Pscihepevirus. D. HEV-D. A. HEV-A Piscihepevirus. Fonte: Adaptado de Khuroo, Khuroo e Khuroo (2016).. A espécie A- Orthohepevirus engloba os quatro principais genomas do HEV: 1 (A HEV-1), 2 (A HEV-2), 3( A HEV-3) e 4 (A HEV-4). O genótipo 1 inclui cepas de origem asiáticas e africanas, o genótipo 2 inclui uma cepa de origem mexicana e algumas variantes.

(23) ______________________________________________________________________________ Introdução | 23. identificadas a partir de casos endêmicos em países africanos. Os genótipos 3 e 4 incluem cepas isoladas em humanos e suínos, sendo o genótipo 3 provenientes de países industrializados e o genótipo 4 proveniente de países asiáticos (principalmente China, Taiwan e Japão) (KHUROO; KHUROO; KHUROO, 2016; MURALI; KOTWAL; CHAWLA, 2015; ZHU et al., 2014). Na figura abaixo, podemos observar a árvore filogenética do vírus:. Figura 3 – Árvore filogenética do HEV. Fonte: Adaptado de Chandra et al. (2008).. Os genótipos 1 e 2 só foram encontrados em seres humanos e os genótipos 3 e 4 foram recuperados de suínos e de outras espécies animais, bem como de humanos. Os genótipos 1 e 2 podem ser transmitidos experimentalmente a primatas não humanos, mas não a outras espécies. Em contraste, os vírus do genótipo 3 e 4, embora infectem preferencialmente humanos ou suínos, também são transmissíveis a primatas não humanos e a várias outras espécies animais tais como: javalis, cervos, coelhos, camelos, alces e ferrets..

(24) ______________________________________________________________________________ Introdução | 24. Atualmente foram isolados vírus pertencentes ao genótipo 3 em ratos e morcegos, nos indicando a diversidade de reservatórios existentes para o vírus e também ressaltando a característica de circulação dos genótipos entre as diferentes espécies (ABRAVANEL et al., 2016) . A figura abaixo exemplifica a história evolutiva do vírus e a sua diversidade de reservatórios:. Figura 4 – História evolutiva e reservatórios do HEV. Fonte: Adaptado de Khuroo, Khuroo e Khuroo (2016).. 1.3.3. Características virais. O HEV é um pequeno vírus esférico, não envelopado, que mede entre 27e 34 nm de diâmetro. Seu genoma é composto por uma cadeia simples de RNA (ácido ribonucleico) com sentido positivo e aproximadamente 7,2 Kb (CAO; MENG, 2012)..

(25) ______________________________________________________________________________ Introdução | 25. Figura 5 – Representação da estrutura do HEV. Fonte: Adaptado de Chandra (2008).. O RNA viral possui três regiões de leitura, denominadas quadros de leitura aberta (ORF), que se encontram parcialmente sobrepostos (CAO; MENG, 2012). A ORF1 corresponde à maior região do genoma com 1980 nucleotídeos e é também a região mais conservada do vírus (PANDA; VARMA, 2013). A ORF-1 é responsável por codificar a poliproteína não estrutural (nsp) que posteriormente será clivada em várias unidades proteícas funcionais: metiltransferase (MeT), protease cisteína de papaína (PCP), macrodomínio (X), helicina de RNA (HeL) e RNA-polimerase dependente de RNA (RdRp) (CHANDRA et al., 2008). A ORF2 é uma região constituída por 38 nucleotídeos, responsável por codificar a proteína pORF2, que é a proteína estrutural principal do capsídeo viral (PANDA; VARMA, 2013). A ORF3 é a menor região de leitura aberta do RNA viral, constituída por apenas 23 nucleotídeos. É responsável por codificar uma pequena fosfoproteína regulatória (pORF3) que possui funções estruturais e não-estruturais (CAO; MENG, 2012). A próxima figura representa e forma esquematizada o genoma viral:.

(26) ______________________________________________________________________________ Introdução | 26. Figura 6 – Genoma do HEV. Fonte: Segundo Kamar et al. (2014).. O ciclo replicativo do HEV ainda não está completamente elucidado. Acredita-se que o vírus chegue ao hospedeiro através das células epiteliais intestinais, sofra hepatotropismo e se anexe à superfície dos hepatócitos através de proteoglicanos de sulfato de heparina (KHUROO; KHUROO; KHUROO, 2016). Após se aderir à superfície do hepatócito, o vírus se liga a receptores presentes na membrana e entra na célula por endocitose. Uma vez internalizado, no próprio citoplasma da célula, começa a tradução da região ORF-1 do genoma viral em poliproteínas não-estrururais. Ao mesmo tempo, o RNA viral de sentido positivo, é replicado em RNA de sentido negativo com a ajuda da RNA-polimerase dependente de RNA. As poliproteínas traduzidas serão clivadas por proteases celulares em unidades proteicas distintas e o RNA de sentido negativo que foi transcrito, torna-se modelo para novas cadeias de RNA genômico de sentido positivo com 7,2 Kb e para cadeias menores de RNA subgenômico com 2,2 Kb. As cadeias de RNA genômico, formarão o material genético de novos vírus e as cadeias de RNA subgenômico serão traduzidas em proteínas pORF2 e pORF3. A proteína pORF2 irá formar o capsídeo viral e a pORF3 irá otimizar a replicação do vírus. A pORF-3 também tem a função de revestir o vírus recém formado, porém irá se desligar do mesmo quando este sair do hepatócito pelo processo de brotamento (KHUROO; KHUROO; KHUROO, 2016; CHANDRA et al., 2008;)..

(27) ______________________________________________________________________________ Introdução | 27. Figura 7 – Ciclo replicativo do HEV. Fonte: Adaptado de Panda e Varma (2013).. 1.3.4. Patogênese. As manifestações clínicas da infecção pelo HEV abrangem uma grande variedade de sintomas, englobando desde casos autolimitados com curso totalmente assintomático até quadros de hepatite grave, com alto risco de morte (PANDA; VARMA, 2013; AHMED et al., 2015). Na maioria dos pacientes, a infecção aguda se manifesta após um período de incubação de 3 a 6 semanas, e é caracterizada por uma infecção que pode variar de subclínica a grave. Os sintomas mais apresentados são: icterícia, anorexia, náuseas, vômitos e ocasionalmente febre, com duração de 1a 6 semanas. Em aproximadamente 1% dos casos, pode ocorrer o desenvolvimento de quadros graves associados com hepatite fulminante (PANDA; VARMA, 2013; KHUMAR et al., 2013). Os casos de hepatite fulminante são mais comuns entre as gestantes, nas quais observamos também, as maiores taxas de mortalidade (15 a 20%) (CHANDRA et al., 2008). As mortes entre as gestantes infectadas pelo HEV ocorrem devido a problemas.

(28) ______________________________________________________________________________ Introdução | 28. obstétricos, incluindo hemorragia ou eclampsia, ou devido ao desenvolvimento de insuficiência hepática fulminante. Os natimortos são comuns, assim como a transmissão vertical aos lactentes que sobrevivem, porém com altas taxas de morbidade e mortalidade neonatal (RAYIS et al., 2013; KAMAR et al., 2014). Até recentemente, acreditava-se que a hepatite E era uma infecção autolimitada. No entanto, atualmente, alguns casos de infecção persistente pelo vírus vêm sendo descritos (MURALI; KOTWAL; CHAWLA, 2015). A infecção crônica é mais comumente observada em pacientes imunossuprimidos, principalmente nos receptores de transplante de órgãos sólidos (fígado, rim ou pâncreas) e também em portadores do vírus do HIV (FERREIRA et al., 2017). Nos casos crônicos da doença, a detecção do RNA viral consegue ser feita até 15 meses após a infecção aguda (PANDA; VARMA, 2013). Estudos em animais demonstraram que a dose de inóculo viral determina a gravidade da lesão hepática. As doses mais baixas são associadas ao desenvolvimento de infecção subclínica e as doses mais altas a quadros graves da doença (KUMAR et al., 2013). Outras pesquisas sugerem ainda a possibilidade da correlação entre a gravidade da doença e o genótipo isolado, sendo a infecção crônica mais comumente associada à infecção pelos genótipos 3 e 4 (MURRISON; SHERMAN, 2017). 1.3.5. Epidemiologia. A hepatite E é considerada, atualmente, a causa mais comum de hepatite viral aguda no mundo, caracterizando um importante problema de saúde pública (KRAWCZYNSKI, 2013). De acordo com o Centro para o Controle e Prevenção de Doenças (CDC) e a Organização Mundial da Saúde (OMS), 20 milhões de pessoas são infectadas anualmente pelo HEV, ocasionando aproximadamente 57.000 óbitos ao ano (AL-SADEQ; MAJDALAWIEH; NASRALLAH, 2017). A doença é hiperendêmica em muitos países do sul da Ásia (Índia, Bangladesh, Butão, Nepal, Paquistão e Sri Lanka), sudeste da Ásia (Birmânia, Camboja, Indonésia, Tailândia, Vietnã e Laos), Ásia Central (Cazaquistão, Tajiquistão e Uzbequistão), África do Norte (Argélia, Marrocos, Sudão e Tunísia), África Oriental (Quénia, Uganda e Burundi), África Ocidental (Costa do Marfim, Libéria, Nigéria e Mali) e México. É considerada endêmica em muitos países do Oriente Médio (Turquia, Arábia Saudita, Iémen, Líbia, Omã, Bahrein, Irã, Kuwait e Emirados Árabes Unidos), algumas regiões do Sudeste Asiático (Cingapura) e América do Sul (Brasil, Argentina, Equador e Uruguai) e em países europeus.

(29) ______________________________________________________________________________ Introdução | 29. desenvolvidos como França, Alemanha e Reino Unidos (KHUROO; KHUROO; KHUROO, 2016). Na figura abaixo, podemos observar as características epidemiológicas do HEV em todo o mundo:. Figura 8 – Distribuição global da hepatite E. Fonte: Adaptado de Al-Saqued, Majdalawieh e Nasrallah (2017).. A doença hiperendêmica geralmente é provocada pelo genótipo 1, com exceção do México e de alguns países africanos, onde a doença é provocada principalmente pelo genótipo 2. Nas regiões endêmicas, devido à maior circulação de genótipos com características zoonóticas (genótipos 3 e 4), encontramos grande quantidade de casos de hepatite aguda, porém sem característica de surto (KHUROO; KHUROO; KHUROO, 2016). A epidemiologia da hepatite E no Egito é diferente das outras regiões do mundo, sendo a região considerada uma ‘zona de padrões distintos’. O genótipo circulante é o 1, porém com subgenótipos típicos, não encontrados na população asiática (KHUROO; KHUROO; KHUROO, 2016). A próxima figura demonstra a distribuição geográfica mundial dos genótipos do HEV:.

(30) ______________________________________________________________________________ Introdução | 30. Figura 9 – Distribuição geográfica dos genótipos do HEV. Fonte: Adaptado de Mirazo et al. (2014).. Devido à rápida industrialização e melhora nas condições sanitárias em muitas partes do Leste Asiático, a transmissão zoonótica do HEV tem assumido um importante papel, que tem resultado na mudança dos genótipos circulantes: do genótipo 1 para genótipos 3 e 4 (MIRAZO et al., 2014). Nas regiões subdesenvolvidas podem ocorrem grandes surtos de hepatite E, devido principalmente à ingestão de água contaminada. Nessas regiões, a doença geralmente afeta adolescentes e adultos jovens e a mortalidade é maior entre as gestantes.. Nas regiões. industrializadas a transmissão zoonótica desempenha um papel importante, sendo a principal fonte de contaminação a ingestão de carne de porco crua ou pouco cozida, uma vez que o vírus permanece infeccioso em temperaturas de até 60 ° C. Nessas regiões, a doença geralmente afeta adultos mais velhos, sendo a maior taxa de mortalidade entre idosos (MIRAZO et al., 2014). Além da via fecal-oral, o HEV pode apresentar transmissão vertical, ou seja, de mãe para filho, através das rotas intra-uterina e perinatal ou através da amamentação (RAYIS et al., 2013). A transmissão parenteral também já foi confirmada, através da comprovação da transmissão por transfusão sanguínea (SULTAN KHUROO et al., 2004). A próxima figura ilustra o ciclo de transmissão do HEV:.

(31) ______________________________________________________________________________ Introdução | 31. Figura 10 – Ciclo de transmissão do HEV. Fonte: Mirazo et al. (2014). 1.3.6. Diagnóstico laboratorial. O vírus da hepatite E pode ser diagnosticado indiretamente pela detecção de anticorpos anti-HEV séricos ou diretamente pela detecção do genoma viral no sangue ou outros fluidos (KAMAR et al., 2014). A IgM anti-HEV aparece durante o estágio agudo da infecção e é detectável a partir do quarto dia após o início da icterícia e persiste por até 5 meses. No entanto, reações fortemente positivas são raras após 3 meses do início dos sintomas. Os anticorpos IgG antiHEV são detectáveis logo após a aparição da IgM anti-HEV, portanto, o fato de ambas as classes de anticorpos se desenvolverem simultaneamente, torna difícil o diagnóstico sorológico preciso da infecção aguda pelo HEV. Enquanto os anticorpos IgM anti-HEV diminuem rapidamente em alguns meses, a IgG persiste por mais tempo, num período variável de 1 a 14 anos pós-infecção (KRAIN; NELSON; LABRIQUE, 2014; MIRAZO et al., 2014)..

(32) ______________________________________________________________________________ Introdução | 32. Figura 11 - Marcadores sorológicos e moleculares do HEV. Fonte: Segundo Krain, Nelson e Labrique (2014).. A grande variabilidade genética do HEV gera modificações significativas em seus sítios antigênicos. Apesar desta variabilidade, os quatro principais genótipos do vírus compartilham epítopos presentes no capsídeo viral e também alguns peptídeos imunodominantes, permitindo o desenvolvimento de testes sorológicos que conseguem contemplar os quatro genomas que infectam a espécie humana (CAO; MENG, 2012) O RNA viral pode se detectado no início da doença e em até 4 a 6 semanas após a infecção. A detecção de RNA viral em amostras biológicas é o padrão-ouro para a confirmação da hepatite E aguda, uma vez que os testes NAT podem identificar com precisão a infecção ativa e ajudar a confirmar os resultados sorológicos (VOLLMER; KNABBE; DREIER, 2014). Nos últimos anos, vários ensaios NAT foram relatados para a detecção e identificação de RNA do HEV em amostras de soro e fezes, incluindo: transcrição reversa seguida de PCR (RT-PCR), RT-PCR em tempo real e amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa. Estes testes foram projetados para detectar amplamente os quatro genótipos do HEV capazes de infectar humanos (CAO; MENG, 2012)..

(33) ______________________________________________________________________________ Introdução | 33. 1.3.7. HEV e transfusão sanguínea. O HEV é distribuído globalmente em diferentes padrões epidemiológicos com base em fatores socioeconômicos e ecológicos (MIRAZZO et al., 2014). Embora o HEV seja transmitido principalmente através da via fecal-oral, em 2004 foi reconhecido como um agente infeccioso transmitido por transfusão (KHUROO; KAMILI, YATTOO, 2004) . A transmissão através da doação de sangue já foi documentada em todo o mundo com observações anuais crescentes, e é responsável por 2,5% do total das contaminações ocasionadas por transfusão. A transmissão do HEV por via transfusional foi inicialmente registrada na Índia, na região de Caxemira e atualmente já foi documentada em vários países do mundo, incluindo: Japão, Reino Unido, França, Dinamarca e Arábia Saudita (AL-SADEQ; MAJDALAWIE; NASRALLA, 2017) . O risco de transmissão do HEV por transfusão sanguínea está associado a uma série de fatores, dentre os quais: a frequência da viremia em doadores de sangue, a carga viral do doador e o volume final de plasma presente no hemocomponente transfundido (NELSON, 2014). Como o sangue e seus componentes são necessários para o tratamento de pacientes com várias condições clínicas, a transmissão do HEV por transfusão pode ser fatal principalmente se ocorrer em pacientes imunocomprometidos, transplantados e gestantes (AL-SADEQ; MAJDALAWIE; NASRALLA, 2017). A soroprevalência e a viremia do HEV em doadores de sangue se mostram variáveis dependendo da região estudada (SLOT et al., 2013). Conforme podemos observar nas próximas tabelas, a soroprevalência do HEV normalmente é maior em países industrializados e endêmicos e a viremia é mais comum em áreas subdesenvolvidas e hiperendêmicas onde os surtos da doença são mais comuns (AL-SADEQ; MAJDALAWIE; NASRALLA, 2017; GALLIAN et al., 2014)..

(34) ______________________________________________________________________________ Introdução | 34. Tabela 3 – Avaliação da viremia do HEV entre doadores de sangue em diferentes partes do mundo.. País. Amostras testadas. Razão-RNA. Ano. Caxemira. 145. 1: 27. 2004. Irã. 700. 1: 100. 2016. Egito. 760. 1: 375. 2011. China. 10.741. 1: 1.094. 2014. Qatar. 5.854. 1: 1.463. 2017. França. 53.234. 1: 2.218. 2012. Holanda. 45.415. 1: 2.672. 2011. Espanha. 9.998. 1: 3.333. 2013. Alemanha. 18.100. 1: 4.525. 2011. Irlanda. 24.985. 1: 4.997. 2016. Inglaterra. 42.000. 1: 7.000. 2011. Suécia. 95.835. 1: 7.986. 2011. Áustria. 58.915. 1: 8.416. 2015. Escócia. 43.560. 1: 14.520. 2013. Austrália. 14.799. 1: 14.799. 2016. Japão. 620.140. 1: 15.075. 2016. E.U.A.. 51.075. Não Encontrado. 2011. Brasil. 300. Não Encontrado. 2015. Fonte: Adaptado de Al-Sadeq, Majdalawieh e Nasrallah (2017)..

(35) ______________________________________________________________________________ Introdução | 35. Tabela 4 – Soroprevalência de anticorpos anti-HEV entre doadores de sangue em diferentes partes do mundo.. País. No. de amostras testadas. Soroprevalência %. Ano. Itália. 3.013. 49,0. 2011. China. 10.741. 27,42. 2014. Qatar. 5.854. 20,5. 2017. Dinamarca. 504. 19,8. 2015. Arábia Saudita. 900. 18,7. 2009. França. 529. 16,6. 2011. Inglaterra. 500. 16,0. 2008. Sérvia. 200. 15,0. 2010. Noruega. 1.200. 14.0. 2016. Áustria. 1.203. 13,3. 2015. País de Gales. 262. 10,0. 2011. Suécia. 108. 9,3. 2006. Tailândia. 663. 8,7. 1996. Alemanha. 1.019. 6,8. 2013. Portugal. 50. 4,0. 1998. Suiça. 550. 4,9. 2008. Escócia. 1.559. 4,7. 2013. Japão. 12.600. 3,4. 2010. Espanha. 2.305. 2,7. 2011. Holanda. 1.275. 0.4. 2011. Fonte: Fonte: Al-Sadeq, Majdalawieh e Nasrallah (2017).. A grande prevalência de doações virêmicas e a alta proporção de receptores de sangue imunocomprometidos, têm levado os profissionais da saúde a definirem medidas para aumentar a segurança do sangue transfundido em relação ao HEV. A triagem para a hepatite E já é obrigatória na Irlanda (desde 2016), Reino Unido e Holanda (ambos desde 2017). A França, a Alemanha e a Suíça estão em fase de implantação da triagem obrigatória, enquanto a Grécia, Itália, Espanha e Portugal estão em fase de avaliação do processo (IZOPET et al., 2017)..

(36) ______________________________________________________________________________ Introdução | 36. Os dados sobre a viremia e a soroprevalência do HEV entre doadores de sangue no Brasil ainda são escassos. O HEV não é investigado rotineiramente no país, mesmo em casos de elevação inexplicável da enzima hepática ou hepatite aguda infecciosa não determinada e apenas alguns laboratórios realizam testes anti-HEV. A maioria dos estudos disponíveis sobre o vírus são limitados e não podem ser comparados adequadamente devido a quantidade insuficiente de amostras testadas e a diversidade das metodologias utilizadas (PASSOSCASTILHO et al., 2016). A tabela abaixo nos oferece uma visão geral dos estudos sobre o HEV que foram realizados no Brasil: Tabela 5 – Soroprevalência e viremia do HEV em doadores de sangue no Brasil.. Local. Amostras. Anti-HEV. RNA Viral. Ano. Fonte. testadas. IgG %. Londrina. 996. 2,3. Não avaliado. 1999. Bortoliero et al., 2006. Campinas. 165. 3,0. Não avaliado. 2000. Gonçales et al., 2000. Rio de Janeiro. 93. 4,3. Não avaliado. 2000. Trinta et al., 2001. Vale do Itajaí. 300. 10. Não encontrado. 2014. Passos-Castilho et al., 2016. São Paulo. 500. 9,8. Não encontrado. 2014. Passos-Castilho et al., 2017. 1.4. Hipótese. O HEV circula entre os doadores de sangue na região de Ribeirão Preto.. 1.5. Justificativa do Estudo. O HEV é uma doença emergente cuja incidência tem aumentado ao longo das últimas décadas e que apresenta risco de transmissão transfusional. Em pacientes imunossuprimidos, que são susceptíveis ao recebimento de transfusões sanguíneas, pode gerar quadros de hepatite crônica e ser responsável por altas taxas de mortalidade. O genótipo circulante no Brasil é o genótipo 3, envolvido com transmissões zoonóticas. A região de Ribeirão Preto é uma região com grande número de propriedades rurais, nas quais ocorrem a manipulação de porcos, principal reservatório para o genótipo 3. O consumo de carne de suínos também é comum nessa região..

(37) ______________________________________________________________________________ Introdução | 37. Os dados sobre viremia e soroprevalência do vírus no Brasil são escassos, e entre a população de doadores de sangue os estudos são poucos e limitados. Na Região Sudeste do Brasil existem apenas três estudos relacionados com doadores de sangue e no Estado de São Paulo, apenas dois. Na Região Noroeste do Estado de São Paulo, onde está localizado o Hemocentro de Ribeirão Preto, não existem estudos relacionados ao HEV entre a população geral e nem entre doadores de sangue. Assim, devido às características do genótipo circulante, ao risco da sua transmissão por transfusão, à gravidade do quadro clínico desenvolvido em grupos de risco que recebem transfusões e a falta de estudos e conhecimento sobre o vírus entre doadores de sangue no Brasil e especialmente na Região Noroeste do estado de São Paulo, torna-se necessário o desenvolvimento de estratégias que levem a uma melhor compreensão do comportamento do vírus. Este trabalho visa determinar a viremia (através da pesquisa do RNA viral) e a soroprevalência (através da pesquisa de anticorpos anti-HEV IgG) do vírus da hepatite E entre os doadores de sangue do Hemocentro de Ribeirão Preto, localizado na região Sudeste do Brasil, no noroeste do Estado de São Paulo..

(38) _______________________ Objetivos.

(39) _______________________________________________________________________________ Objetivos | 39. 2. OBJETIVOS. 2.1. Objetivos Gerais. Determinar a viremia e a soroprevalência do vírus da hepatite E entre os doadores de sangue do Hemocentro de Ribeirão Preto.. 2.2. Objetivos Específicos •. Avaliar a viremia do HEV entre doadores de sangue através da pesquisa do RNA viral;. •. Determinar a soroprevalência do HEV entre doadores de sangue através da pesquisa de anticorpos anti-HEV de classe IgG;. •. Realizar a pesquisa de antígenos virais por técnica sorológica em todos os doadores com anti-HEV reagente;. •. Padronizar a técnica RT-PCR in house para detecção de RNA viral.. •. Comparar a sensibilidade analítica do teste molecular com o teste sorológico para a detecção de antígenos virais em relação à detecção da infecção aguda;. •. Realizar o sequenciamento viral para a determinação do genótipo circulante nos casos em que a pesquisa de RNA forem positivas..

(40) _______________ Materiais e Métodos.

(41) ______________________________________________________________________ Materiais e Métodos | 41. 3. MATERIAIS E MÉTODOS. 3.1. Aspectos Éticos. Esse projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa envolvendo Seres Humanos (CEP) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP (número do processo 2056/2015, parecer 2302/2016). Foi aplicado o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) a todos os doadores participantes desse estudo. Os documentos encontram-se nos anexos I e II, respectivamente.. 3.2. Modelo de Estudo. Este estudo foi realizado de forma retrospectiva, aplicada e quantitativa. É um estudo cego, dos quais as informações de sexo e idade foram obtidas através de questionamento aos doadores no momento de sua abordagem, porém sem permitir a identificação dos mesmos.. 3.3. Casuística Para este estudo utilizamos 1.000 amostras de plasma obtidas entre os doadores de sangue do hemocentro de Ribeirão Preto, no ano de 2015.. 3.4. Amostragem. Nesse estudo, foram utilizadas 1.000 amostras de plasma obtidas durante o período de janeiro a dezembro de 2015 entre os doadores de sangue do Hemocentro de Ribeirão Preto. Os doadores foram selecionados de forma aleatória, em todos os dias da semana e em todos os meses do ano de 2015. No momento da abordagem do doador foi aplicado o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido e também obtidas informações de sexo e idade através de questionamento direto ao próprio doador. Para cada doador foi realizada a coleta de um tubo contendo anticoagulante EDTA, para a obtenção de plasma. Após a centrifugação, uma alíquota de 1mL de plasma foi acondicionada em microtubo de centrifugação e acondicionadas em freezer a - 80 C até o.

(42) ______________________________________________________________________ Materiais e Métodos | 42. momento da realização dos testes. Para calcular o tamanho amostral baseado em uma estimativa de prevalência de anticorpos anti-HEV IgG de 10%, foi utilizada a seguinte equação:. Onde p é o valor esperado da prevalência, d é o erro absoluto tolerável e α é o nível de significância que foi fixado em 5% (LUIZ; MAGNANINI, 2000). Baseado no erro absoluto de 0,0186 foi determinado o tamanho amostral de 1.000 doadores de sangue, conforme tabela abaixo: Tabela 6 – Determinação do tamanho amostral.. Prevalência (p). 0,10. Erro absoluto (d) 0,05 0,03 0,02 0,0186 0,0153. n* 139 385 865 1000 1537. *n= número de amostras. 3.5. Estratégia de Execução. Inicialmente, as amostras obtidas foram testadas pela metodologia imuno-ensaio enzimático (ELISA - do inglês, enzyme linked immunonosorbent assay) do tipo Indireto, para a detecção de anticorpos anti-HEV de classe IgG. As amostras que apresentaram resultados reagentes (positivo ou inconclusivo) para a presença de anticorpos anti-HEV IgG, foram testadas pela metodologia de ELISA do tipo sanduíche , para a detecção de antígenos virais. Após a realização dos testes sorológicos, as amostras passaram pela testagem molecular. Os testes moleculares para a detecção do RNA viral foram realizados utilizando-se a metodologia de PCR em tempo real in house..

(43) ______________________________________________________________________ Materiais e Métodos | 43. Pesquisa de anticorpos anti-HEV IgG. Reagente. Não Reagente. Pesquisa de Ag viral. Pesquisa de RNA viral. Positiva. Sequenciamento Figura 12 – Fluxograma da estratégia experimental para a detecção do HEV em doadores de sangue.. 3.6. Testes Sorológicos. 3.6.1. Detecção de anticorpos anti-HEV Foi utilizado o conjunto diagnóstico Wantai HEV-IgG ELISA (Wantai – Beijing, China) para detectar a presença de anticorpos da classe IgG nas amostras. A metodologia utilizada foi ELISA do tipo indireto e foram seguidas as recomendações do fabricante. De forma resumida, as microplacas para teste ELISA são constituídas por 96 poços sensibilizados por antígenos específicos do vírus HEV. Em cada microplaca foram testadas 91 amostras diferentes, dois controles negativos, dois controles positivos e um branco da reação. Inicialmente, foram acrescentados o diluente de amostras, os controles e as amostras (50 µL), individualmente nos poços da microplaca, onde os anticorpos específicos se ligam aos antígenos que revestem a superfície dos poços. Os anticorpos inespecíficos, não ligados, foram eliminados durante a etapa de lavagem da microplaca. Em seguida, foi adicionado o conjugado a todos os poços da microplaca. O conjugado.

(44) ______________________________________________________________________ Materiais e Métodos | 44. do kit é constituído por anticorpos anti-imunoglobulina humana (IgG) marcados com peroxidase de rábano. Os anticorpos não ligados do conjugado foram eliminados na segunda etapa de lavagem. Por fim, foi adicionada a solução de substrato de tetrametilbenzidina (TMB). A peroxidase ligada aos anti-anticorpos catalisa o substrato de TMB, produzindo uma reação colorimétrica. A intensidade da coloração foi medida utilizando um espectrofotômetro com comprimento de onda de 450 e 630 nm. O valor de corte da reação (cut off) foi calculado segundo as recomendações do fabricante, e consiste na média dos controles negativos adicionados de 0, 016. O valor da densidade ótica (D.O.) de cada amostra obtida na leitura pelo espectrofotômetro, foi dividido pelo valor do cut off (C.O) e a partir desse valor obtivemos a razão (D.O./C.O) que foi interpretada como reagente/positiva (D.O./C.O. ≥ 1); reagente/inconclusiva (D.O./C.O. = 0.91.1) ou não-reagente (D.O./C.O. <1). Segundo o fabricante, a sensibilidade do teste é de 99,80% e a especificidade de 97,96%.. 3.6.2. Detecção de antígenos do HEV. As amostras reagentes para o teste de anticorpos anti-HEV IgG foram testadas para a presença de antígenos virais pela metodologia de ELISA (Enzyme Linked ImmunonoSorbent Assay) do tipo sanduíche, utilizando-se para tal, o conjunto diagnóstico Wantai HEV- Ag ELISA (Wantai – Beijing, China) segundo as recomendações do fabricante. As microplacas para teste são constituídas por 96 poços cada, sensibilizadas por anticorpos anti-antígenos virais específicos do vírus HEV. Em cada microplaca foram testadas 91 amostras diferentes, dois controles negativos, dois controles positivos e um branco da reação. De forma resumida, inicialmente foram acrescentados o diluente, os controles e as amostras (50 µL) individualmente nos poços da microplaca, onde os antígenos virais se ligaram aos anticorpos virais específicos que revestem a superfície dos poços. As proteínas inespecíficas presentes no soro foram eliminadas durante a etapa de lavagem da microplaca. Em seguida o conjugado foi adicionado a cada poço da microplaca. O conjugado do kit é um reagente composto por anticorpos anti-HEV marcados com peroxidase de rábano. Os anticorpos não ligados do conjugado foram eliminados na segunda etapa de lavagem..

(45) ______________________________________________________________________ Materiais e Métodos | 45. Por fim, foi adicionado a solução de substrato de tetrametilbenzidina (TMB) e peróxido de uréia. A peroxidase ligada aos anticorpos do conjugado consegue catalisar o substrato de TMB e uréia, produzindo uma reação colorimétrica. A intensidade da coloração foi medida utilizando um espectrofotômetro com comprimento de onda de 450 e 630 nm. O valor de corte da reação (cut off) foi calculado segundo as recomendações do fabricante, e consiste na média dos controles negativos adicionados de 0, 016. O valor da densidade ótica (D.O.) de cada amostra, obtida na leitura pelo espectrofotômetro, foi dividido pelo valor do cut off (C.O) e a partir desse valor obtivemos a razão (D.O./C.O) foi interpretada como reagente/positiva (D.O./C.O. ≥ 1); reagente/inconclusiva (D.O./C.O. = 0.91.1) ou não-reagente (D.O./C.O. <1). Segundo o fabricante, a sensibilidade do teste é de 95,1%, e a especificidade de 99,93%. Se comparado com o teste de PCR para a detecção de RNA viral, a concordância esperada é de 65,7% entre as amostras positivas.. 3.7. Teste Molecular. 3.7.1. Extração do RNA viral. O processo de extração de RNA foi realizado seguindo as instruções do fabricante, utilizando-se o kit QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN- Hilden, Alemanha). A técnica baseia-se na especificidade de ligação do RNA viral com as colunas de sílica presentes no kit. De forma resumida, inicialmente foi adicionado 140 µL de plasma às colunas de sílica e o RNA viral, se presente nas amostras, ficou ligado de forma especifica à coluna. Em seguida as colunas foram submetidas a duas etapas de lavagem para que todos os contaminantes e inibidores de PCR fossem completamente removidos. Na etapa final, o RNA viral puro, que ficou isolado na coluna de sílica foi eluído em água.. 3.7.2. Transcrição reversa. O RNA viral extraído foi utilizado para realizar a etapa de transcrição reversa com o kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription Reaction (Thermo Fisher Scientific – Waltham, EUA), seguindo-se estritamente as recomendações do fabricante. A técnica se baseia no esquema de primers randômicos, que asseguram que a síntese.