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Preparação e caracterização de microesferas de copolímeros de ácido lático e glicólico (PLGA) contendo sulfato de quinina

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Academic year: 2021

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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE MICROESFERAS DE COPOLÍMERO DE ÁCIDO LÁTICO E GLICÓLICO (PLGA) CONTENDO SULFATO DE QUININA. LÚCIO FIGUEIRA PIMENTEL. Recife, 2004.

(2) UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE MICROESFERAS DE COPOLÍMERO DE ÁCIDO LÁTICO E GLICÓLICO (PLGA) CONTENDO SULFATO DE QUININA. Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas do Departamento de Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como pré requisito para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas, na área de concentração em Controle e Produção de Medicamentos.. Mestrando: Lúcio Figueira Pimentel Orientadora: Profª. Drª. Nereide Stela Santos Magalhães - UFPE Co-Orientadora: Profª. Drª. Vanessa Carla Furtado Mosqueira -UFOP. Recife, 2004.

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(4) Dedico este trabalho À minha mãe, Yêdda Figueira e meu paidrastro Demóstenes Travessa, pelo exemplo de vida, luta e vitórias conquistadas, pela participação definitiva no meu caráter e personalidade..

(5) i. AGRADECIMENTOS A Deus pela luz com a qual ilumina os caminhos que sigo em minha vida.. A minha orientadora Prof. Drª. Nereide Stela Santos Magalhães, pela oportunidade, confiança, orientações durante a realização deste trabalho, além da possibilidade de participação e colaboração com o Grupo de Sistemas de Liberação Controlada e Vacinas (SLC).. A minha Co-orientadora Prof. Drª. Vanessa Carla Furtado Mosqueira, pelo valioso esforço na orientação, pelo carinho e apoio na realização dos experimentos in vivo, durante o desenvolvimento desta dissertação.. Aos professores do Programa de Pós-Graduacão em Ciências Farmacêuticas da UFPE, pela possilidade de compartilhar seus conhecimentos e experiências durante a realização do Mestrado.. Ao Prof. Dr. José Luiz de Lima Filho, Diretor do Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami, e ao Prof. Dr. Luiz Bezerra de Carvalho Junior, responsável pelo setor de Bioquímica, onde foi realizada a maior parte deste trabalho, pela oportunidade de participar de uma instituição que contribui ativamente para o desenvolviento científico e tecnológico do nosso País.. Aos funcionários do LIKA, em especial, Moises, Otaviano da Costa, Oscar, Ilma e Conceição pela contribuição no suporte técnico, necessário na realizaçãos das pesquisas.. Ao Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto pela obtenção de amostra inicial de sulfato de quinina, para a realização dos estudos preliminares relacionados a este trabalho.. Ao Prof. Samuel do laboratório de Hematologia do Departamento de Ciências Farmacêuticas pela contribuição na realização de microfotografias.. A minha mãe Yedda Figueira e ao meu paidrastro Desmóstenes Travessa, pelos ensinamentos ministrados ao longo da vida, pelo suporte e apoio dispensados, necessários para a concretização de mais uma etapa de minha carreira profissional..

(6) ii Aos meus irmãos Fábio e Patrícia e família, pelas horas de ausência e saudade dos momentos sinceros de amizade e fraternidade bem vividos, imprescidíveis para a realização desta caminhada.. Aos meus amigos próximos e distantes, com os quais conto nos momentos de alegrias e tristezas, para apoio, diversão e companheirismo, em especial a Juliana Lima Meira, pelo carinho, respeito, compreensão e companheirismo.. Aos meus amigos do SLC, pela amizade e colaboração mútuas no desenvolvimento de nossas atividades, o carinho e respeito individual por cada um dos componentes, em especial a Agenor Tavares Jácome Junior, pela ajuda essencial na realização desta dissertação.. Aos meus amigos do Setor de Bioquímica e aos demais colegas dos outros laboratórios do LIKA, em especial, Luciana Duarte, Givanildo Oliveira, Luciana da Mata, Ian Porto, Danielly Brunesca, Diego Albuquerque, pelo incentivo, divisão de espaço, material, apoio e a possibilidade de criação de um ambiente de trabalho propício para o desenvolvimento de nossas capacidades e realizações.. Á Roseane Maria Ribeiro Costa e Jaqueline Rodrigues da Silva, pelas orientações recebidas no início de minhas atividades junto ao SLC, pela amizade sincera e pelo carinho recebido.. Aos colegas do Mestrado, em especial Ivana Barroso, Lívia Barreto, Daniela Lordão, Janaína Versiani, Francisco Mendonça Junior (Chico), Severinho Granjeiro (Ceará), Valderes Almeida, Tereza Raquel Fernandes, Líbia Bentes, Ana Amélia Lira, Risonildo Cordeiro, Pedranne Barbosa, Lisandra Gomes pela amizade, apoio, incentivo e ajuda e no esclarecimento das dúvidas inerentes as dúvidas surgidas durante o desenvolvimento de nossas atividades.. Á Cristina Barros, Elaine Leite e Luciano Pinto, pelo valioso apoio na realização dos testes de atividade antimalária e minha estada na cidade de Ouro Preto.. A todos que direta e indiretamente contribuiriam para a realização desta dissertação de Mestrado, meu sincero agradecimento..

(7) iii. SUMÁRIO Agradecimentos Lista de Figuras Lista de Tabelas Lista de Abreviaturas Lista de Siglas Resumo Abstract 1.. INTRODUÇÃO .................................................................................................. 1. 2.. REVISÃO DA LITERATURA ......................................................................... 4. MALÁRIA ...................................................................................................... 5. 2.1.1.. Epidemiologia ............................................................................................ 6. 2.1.2.. Indústria Farmacêutica e Malária .............................................................. 8. 2.1.3.. Agentes Terapêuticos da Malária .............................................................. 9. QUININA ........................................................................................................ 11. 2.2.1.. Farmacocinética da Quinina ...................................................................... 11. 2.2.2.. Aplicações Terapêuticas ............................................................................ 12. 2.2.3.. Mecanismo de Ação .................................................................................. 13. 2.2.4.. Toxicologia da Quinina ............................................................................. 14. SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA DE FÁRMACOS (SLC) ... 14. 2.3.1.. Mecanismos de Liberação do Fármaco de SLC ........................................ 17. 2.3.2.. Biomateria is para Sistemas de Liberação Controlada ............................... 18. 2.1.. 2.2.. 2.3..

(8) iv. 2.3.3.. Poli(lático-co-glicólico) – PLGA .............................................................. 19. MICROPARTÍCULAS ................................................................................... 21. 2.4.1.. Aplicações Terapêuticas ............................................................................ 21. 2.4.2.. Indústria Farmacêutica e SLC ................................................................... 21. MICROENCAPSULAÇÃO ............................................................................ 23. 2.5.1. Métodos de Preparação de Microesferas ................................................... 23. 2.5.1.1.. Métodos de Separação de Fases de Polímeros .......................................... 24. 2.5.1.2.. Métodos de Spray-Drying .......................................................................... 24. 2.5.1.3.. Métodos Utilizando Supercrítico ................................................... 25. 2.5.1.4.. Jateamento Sob Pressão ............................................................................ 25. 2.5.1.5.. Métodos de Trituração ............................................................................... 25. 2.5.1.6.. Sistema de Recirculação Total (TROMS) ................................................. 25. 2.5.1.7.. Métodos de Evaporação e Extração de Solvente ....................................... 26. 2.5.1.8.. Emulsão Água em Óleo em Água (Emulsão Múltipla) ............................. 27. OBJETIVOS ....................................................................................................... 28. 3.1.. Geral ................................................................................................................ 29. 3.2.. Específicos ....................................................................................................... 29. 4.. ARTIGO I ........................................................................................................... 30. 5.. CONCLUSÕES ................................................................................................... 58. 6.. PERSPECTIVAS ................................................................................................ 60. 7.. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 62. 2.4.. 2.5.. 3..

(9) v ANEXO I Resumos enviados para Congressos. ANEXO II Artigos Escritos.

(10) vi. LISTA DE FIGURAS REVISÃO DA LITERATURA Figura 1.. Ciclo evolutivo de Plasmodium spp. (Miller et al., 2002). Figura 2. Número de casos de Malária e óbitos de todas as formas registradas no Brasil. 6 7. nos anos de 1990 – 2001 (FUNASA, 2003). Figura 3.. a) Estrutura molecular da Quinina. b) Microfotorafia de Cristais de Sulfato de. 11. quinina (aumento 40 ×). Figura 4. Perfil farmacocinético de doses múltiplas ou em sistema de liberação controlada. 15. de fármacos (Brannon-Peppas, 1997). Figura 5.. Estrutura molecular dos ácidos polilático e poliglicólico.. 20. Photomicrographs of quinine sulphate- loaded PLGA microspheres prepared. 47. ARTIGO I Fig. 1.. using multiple emulsion tequinique followed by solvent evaporation method, with 25 mg quinine sulphate and 450 mg PLGA. a) SEM of microsphere (3500 ×); b) SEM of microsphere surface (11000 ×); c) SEM of microsphere prepared with 50 mg quinine sulphate and 450 PLGA (15500 ×), showed some crystals in the surface of microsphere. Fig. 2.. In vitro relese profile of quinine sulphate from PLGA microspheres. Error bars. 48. represent mean ± standard deviation for n=3. Fig. 3.. Antimalarial activity of free and microencapsulated quinine sulphate against Plasmodium berghei-infected mice in a four-day-test. Mice were treated with 20 mg/kg/day-1 of quinine sulphate for four days with microspheres loaded with. 49.

(11) vii quinine sulphate (MS-QS) and quinine sulphate (QS) formulations. Untreated control received saline and unloaded microspheres (MS). Each point represents the mean ± standard deviation for ten mice. Fig. 4.. Body weight (g) of mice infected P. berghei in four-day suppresive test, treated with quinine sulphate microspheres PLGA by subcutaneous injection of 20 mg/kg/day-1 of quinine sulphate. Each point represents the mean ± S.D. for ten mice.. 50.

(12) viii. LISTA DE TABELAS. REVISÃO DA LITERATURA. Tabela 1. Principais fármacos antimaláricos (James, 2002). 10. Tabela 2.. 16. Principais Sistemas nanobiotecnológicos utilizados para o carreamento de fármacos.. Tabela 3. Aplicações terapêuticas de Microesferas.. 22. ARTIGO I Table 1. Formulation of quinine sulfate- loaded PLGA microspheres.. 42. Table 2. Evaluation of the influence of the aqueous phase pH on the quinine sulphate. 43. entrapment efficiency in PLGA microspheres. Table 3. Encapsulation efficiency of quinine sulphate into PLGA microspheres (450 mg. 44. of polymer) Table 4. Encapsulation efficienc y of quinine sulphate into PLGA microspheres (450 mg. 45. of polymer) Table 5. RBC and MST of Swiss mice infected with P. berghei treated with PLGA microspheres loaded with quinine sulphate.. 51.

(13) ix. LISTA DE ABREVIATURAS. BSA. Bovine Serum Albumine (albumina sérica bovina). CDR. Controlled Drug Release System (sistema de liberação controlada de fármacos). CEC. Capillar Eletrochromatography (eletrocromatografia capilar). CLAE. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. EC. Eletroforese Capilar. HPLC. High Perfomance Liquid Chromatography (cromatografia líquida de alta eficiência). HSA. Human Serum Albumine (albumina sérica humana). MS. Microsphere (microesfera). MST. Mean Survive Time (tempo de sobrevida médio). Mw. Mass Weight (peso molecular). PBS. Phosphate buffer saline (tampão fosfato salino). PEG. Polyethylene Glycol (polietilenoglicol). PGA. Ácido Poli- glicólico. PLA. Ácido Poli- lático. PLGA. Copolímero de ácido lático e glicólico. PVA. Poly vinyl alcohol (álcool polivinílico). QS. Quinine sulphate (sulfato de quinina). QS-MS. Quinine sulphate Microspheres (microesferas de sulfato de quinina). RBC. Red Blood Cell (células vermelhas do sangue). SD. Stardard Deviation (desvio padrão). SEM. Scanning Electron Microscopy (microscopia eletrônica de varredura). SFC. Supercritical Fluid Chromatography (Cromatografia de flúido supercrítico). SLC. Sistema de Liberação Controlada.

(14) x. LISTA DE SIGLAS E SÍMBOLOS Siglas FDA. Food and Drug Administration (Agência de Controle de Alimentos e Medicamentos dos Estados Unidos). FUNASA. Fundação Nacional de Saúde. GFATM. Global Fund to Figth AIDS, Tuberculose and Malaria (Fundo Global de combate a AIDS, Tuberculose e Malária). LIKA. Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami. MIM. Multilateral Initiative on Malaria (Iniciativas Multilaterais em Malária). MMV. Medicines for Malaria Venture (Medicamentos para Malária). RBM. “Roll Back Malaria” (Regressão da malária).

(15) xi. RESUMO. O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de novas formulações microencapsuladas de sulfato de quinina, para utilização na terapia antimalárica. A caracterização físico-química destas micropartículas, a avaliação da cinética de liberação in vitro, um estudo preliminar de estabilidade e a avaliação da atividade antimalárica in vivo foram realizados. Microesferas de copolímero de ácido lático e glicólico associada ao antimalárico sulfato de quinina (QS-MS) foram obtidas pelo método de emulsão múltipla, seguido de evaporação do solvente. A morfologia das microesferas foi avaliada por microscopia óptica e eletrônica de varredura. A formulação otimizada foi utilizada para a determinação do perfil cinético de liberação pela técnica de dissolução das microesferas em um meio tampão fosfato 7,4. Doseamentos por CLAE foram realizados para determinar o sulfato de quinina. O estudo preliminar de estabilidade foi realizado pela medida da perda de sulfato de quinina das microesferas ao longo do tempo, quando estocadas a 25ºC. A atividade antimalárica in vivo foi avaliada em fêmeas de camundongos Swiss, infectados com Plasmodium berghei no teste de supressão em 4 dias. Os animais foram tratados com sulfato de quinina livre e sulfato de quinina microencapsulado nas microesferas. Um grupo de animais não tratados e um grupo de animais tratados com microesferas placebo foram utilizados como controle. As microesferas de PLGA contendo sulfato de quinina apresentaram formato esférico, com superfície lisa, homogeneas e tamanho de partícula com diâmetro médio de 3,53 ± 1,53 µm. A eficiências de encapsulação foi de 50,34 ± 0,62%. As microesferas liofilizadas mostraram-se estáveis por 230 dias quando armazenadas a 25ºC. O perfil cinético da liberação in vitro de sulfato de quinina microencapsulado exibiu um comportamento bimodal. Uma rápida liberação inicial de 40% foi observada na primeira hora, seguido de uma liberação gradual atingindo um máximo de 73% em 144 horas. Microesferas de sulfato de quinina administradas pela via subcutânea em camundongos não foram capazes de reduzir a infecção por P. berghei na dose de 20 mg/kg/dia, por 4 dias. Entretanto, uma dose de 120 mg/kg/dia foi utilizada e os primeiros resultados demonstram que esta dose pode ser utilizada para determinar a atividade antimalárica da formulação. Uma formulação parenteral de sulfato de quinina microencapsulada pode ser utilizada como uma estratégia para a obtenção de um sistema de liberação controlada do fármaco para o tratamento da malária..

(16) xii. ABSTRACT. The aim of this work is the development of new microencapsulated formulations of quinine sulphate intended for the antimalarial therapy. The physicochemical characterization of these microparticles, their in vitro kinetic release, preliminary stability study, and their in vivo antimalarial activity were evaluated. The poly- lactide-co-glycolide microspheres associated with quinine sulphate (QS-MS) were obtained through a multiple emulsion, followed by solvent evaporation method. The morphology of the microspheres were evaluated by optical and scanning electron microscopy. . The optimized formulation was used to determine the release kinetic profile of quinine from the optimized formulation was determined by the dissolution technique with phosphate buffer 7.4 medium. A High Performance Liquid Chromatography (HPLC) assay was used to determine the quinine sulphate content. A preliminary stability studies was performed by following the lost of quinine sulphate content in the microspheres at 25ºC. The in vivo antimalarial activity was evaluated in female Swiss mice infected with Plasmodium berghei by the four-day suppressive test. The animals were treated with free and quinine-sulphate- loaded microspheres. The untreated animal group and a group treated with unloaded microspheres were used as a control. The quinine-sulphate-loaded microspheres showed spherical shaped particles with a smooth surface, homogeneity, and particle size with a mean diameter of 3.53 ± 1.53 µm. The encapsulation efficiency was 50.34 ± 0.62%. Lyophilized microspheres presented stability over 230 days, when stored at 25ºC. The in vitro release profile of quinine-sulphate- loaded microspheres exhibited a bimodal behavior. A burst effect of 42% was observed in the first hour, followed by a gradual drug release, achieving a release of 72% after 144 hours. Microspheres of quinine sulphate administered by subcutaneous route in mice were not able to reduce the infection of P. berghei at dose of 20 mg/kg/day for four days. However, a dose of 120 mg/kg/day was used in the same test and the first achievements shown that such a dose can used to investigate the antimalarial activity of formulation. A parenteral formulation of quinine sulphate- loaded microspheres is therefore offered as a strategy to achieve a controlled delivering for the malaria treatment..

(17) INTRODUÇÃO.

(18) Pimentel, L. F.. Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático..... 2. 1. INTRODUÇÃO. A Malária é uma doença parasitária de grande impacto no mundo, sendo considerada um dos maiores problemas de Saúde Pública, com 300 a 500 milhões de casos clínicos por ano no mundo e com mais de um milhão de mortes. A malária é causada por protozoários do gênero Plasmodium e transmitida pela picada de mosquitos vetores em humanos, onde quatro espécies são responsáveis pela infecção, P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale (OMS, 1999; Krettli et al., 2001; Gomes et al., 2001). Assim a malária é um problema de saúde constante, devendo-se incentivar a pesquisa contínua de novos fármacos com atividade antimalárica, técnicas de melhoria da ação terapêutica das drogas já existentes, novos esquemas de tratamento, controle do vetor e desenvolvimento de vacina. Além da garantia de uma farmacoterapia adequada, evita-se assim o aumento da resistência aos inseticidas e fármacos já existentes. O sulfato de quinina é o fármaco de escolha para a grande maioria de casos de malária falciparum resistente a cloroquina, porém a quinina possui baixa margem de segurança terapêutica e seu emprego como antimalárico geralmente está associado à elevada incidência de efeitos tóxicos, o que limita o seu uso na terapêutica. Quando a quinina é administrada repetidamente em doses terapêuticas plenas, pode ocorrer um grupo de sintomas típicos relacionados à dose, denominada Chinchonismo (James e Leslie, 1996; Vieira e Mídio, 2000). Promissores agentes terapêuticos com características restritivas que limitam seu uso podem ter um melhor aproveitamento, se técnicas apropriadas de microencapsulação forem desenvolvidas para sobrepor estes inconvenientes intrínsecos. Estas técnicas são normalmente utilizadas para aumentar a estabilidade de materiais, reduzir os efeitos tóxicos ou aumentar a liberação do agente para diferentes aplicações em vários campos da produção (Benoit et al., 1996; Santos e Castanho, 2002; Dunne et al., 2003)..

(19) Pimentel, L. F.. Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático..... 3. Sistemas de Liberação Controlada (SLC), podem ser definidos como aqueles nos quais o agente ativo é liberado independentemente de fatores externos e com uma cinética bem estabelecida (Baker, 1987). Entre as vantagens que os SLC podem oferecer, podemos citar o aumento da eficácia terapêutica, liberação progressiva e controlada do fármaco, manutenção de níveis do fármaco com faixas desejáveis e diminuição significativa da toxicidade (Brannon-Peppas, 1997; Durán e Azevedo, 2002). O. desenvolvimento. de. formas. farmacêuticas. de. liberação. controladas. por. microencapsulamento de sulfato de quinina, poderá permitir um melhor controle da cinética de liberação do fármaco, resultando em níveis plasmáticos terapêuticos com baixas flutuações da concentração do ativo e menor efeito tóxico, podendo consistir num passo importante para o desenvolvimento de uma nova terapêutica antimalárica. Esta Dissertação de Mestrado é constituída de uma revisão da literatura com tópicos sobre a malária, sulfato de quinina, sistemas de liberação controlada e processos de obtenção de micropartículas. Possui o artigo “IN VIVO ANTIMALARIAL ACTIVITY OF QUININE SULPHATE-LOADED PLGA MICROSPHERES” escrito com base nos resultados obtidos no trabalho científico realizado. O artigo intitulado “NANOTECNOLOGIA APLICADA AO CONTROLE E COMBATE DA MALÁRIA” foi submetido à Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. O referido artigo é uma revisão da literatura, com abordagens sobre a malária, terapêutica atual e a aplicação da nanotecnologia como ferramenta alternativa para o controle e combate da malária..

(20) REVISÃO DA LITERATURA.

(21) Pimentel, L. F.. Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático..... 5. 2. REVISÃO DA LITERATURA. 2.1. MALÁRIA A malária é uma doença causada por protozoários do gênero Plasmodium e transmitida pela picada de insetos vetores em humanos. A doença ocorre principalmente nos países tropicais, onde quatro espécies infectam o homem, P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale (Krettli et al., 2001). É caracterizada por quadros de febre alta contínua (38,5 a 40,0ºC) ou em paroxismos febris que apresentam quatro períodos sucessivos: o de frio, calor, de suor e apirexia (James e Leslie, 1996), acompanhada por cefaléia ocasional, náuseas, vômitos, astenia, fadiga e anorexia. (Gomes et al., 2001). Das espécies de Plasmodium existentes três ocorrem em humanos no Brasil: P. falciparum causa a forma de malária mais severa, podendo ser rapidamente fatal se os indivíduos não forem tratados. O P. vivax , registra o maior número de casos, causando cerca de 80% dos registros da doença, de acordo com o Ministério da Saúde, com raros casos de morte. O P. malariae, o de menor prevalência. Este protozoário causa uma malária fraca, mas pode causar nefrite fatal (Krettli et al., 2001; James, 2002). Os mosquitos vetores do Plasmodium spp pertencem ao gênero Anopheles (classe Insecta, ordem Diptera, família Culicidade), onde apenas as fêmeas do mosquito têm o hábito hematofágico tendo, portanto, capacidade de transmissão. Estas quando infectadas, ao picar o homem, durante o repasto sanguíneo, inoculam na pele, os esporozoítos (forma infectante). O esporozoíto penetra a pele, alcançando a corrente sanguínea, concentra-se no fígado e invade os hepatócitos. Nestas células o esporozoíto multiplica-se em um processo conhecido como esquizogonia intra- hepática, originando esquizontes teciduais ou hepáticos (forma evolutiva) ou diferenciam-se em merozoítos (forma infectante de eritócidos). Os merozoítos ganham os capilares intra- hepáticos e na corrente sanguínea invadem os eritrócitos, nos quais se transformam em trofozoítas (forma evolutiva), que.

(22) Pimentel, L. F.. Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático..... 6. crescem e sofrem divisão nuclear, passando a esquizontes sanguíneos, que após nova divisão (esquizogonia), originarão novos merozoítos que irão reiniciar o ciclo. Alguns merozoítos diferenciam-se em gametócitos femininos e masculinos (forma reprodutiva), que amadurecerão e irão contaminar a fêmea do Anopheles quando este picar o homem enfermo, onde seguirão o ciclo evolutivo naquele inseto, até uma nova contaminação no homem (Figura 1) (Krettli e Miller, 2001; Gomes et al., 2001).. Figura 1. Ciclo evolutivo de Plasmodium spp. (Miller et al., 2002). 2.1.1. Epidemiologia A malária é uma protozoose com ocorrência em cerca de 103 países, estando expostas próximo a 2,5 bilhões de pessoas no mundo, incidindo na maioria das regiões tropicais. É endêmica no Sudoeste da Ásia, nas Américas Central e do Sul e na Oceania. Os países da África, a Índia e o Brasil são os países com o maior números de casos no mundo (Krettli et al., 2001; Gome et al., 2001)..

(23) Pimentel, L. F.. Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático..... 7. De acordo com dados da Fundação Nacional de Saúde, em 2000, registaram-se 613.239 casos da doença no País, sendo 99,4% destes na Amazônia Legal. Os estados com maior número de casos foram: Pará (278.203), Amazonas (96.026), Maranhão (78.817) e Rondônia (54.074), os quais contabilizaram 83% dos acometimentos de malária do país (FUNASA, 2001). As condições sócioeconômicas e ambientais da região amazônica favorecem a proliferação do mosquito e, conseqüentemente, a exposição à contaminação de grandes contingentes populacionais (FUNASA, 2002a).. No Brasil o numero de casos de malária nos últimos 10 anos foi em média, pouco mais de 500 mil casos por ano, de acordo com dados do Ministério da Saúde, Fundação Nacional de Saúde e Centro Nacional de Epidemiologia (Figura 2) (FUNASA, 2003).. Figura 2. Número de casos de Malária e óbitos de todas as formas registradas no Brasil nos anos de 1990 – 2001..

(24) Pimentel, L. F.. Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático..... 8. A África Sub-Sahara, é a região onde são registrados o maior número de casos, com cerca de 270 milhões de casos por ano, com quase um milhão de mortes, dos quais 5% são crianças com menos de cinco anos de idade. Entretanto, acredita-se que este números possa estar subestimado, devido ao registro de morte de crianças por infecções respiratórias, diarréia e má nutrição, que tiveram seus quadros clínicos agravados pela malária concomitante (OMS, 1999).. 2.1.2. Indústria Farmacêutica e Malária A maioria das Indústrias Farmacêuticas não desenvolve pesquisa de novos fármacos contra a malária ou de uma vacina. Estima-se que apenas três delas façam pesquisa em malária, devido ao alto custo de investimento e baixa rentabilidade no desenvolvimento de novos agentes antimaláricos (Dias, 2002; Sachs, 2002). De acordo com Trouiller e colaboradores, 2002, no período de 1975 a 1999, dos 1.393 novos compostos químicos comercializados no mundo, apenas 13 eram destinados a doenças tropicais, sendo quatro destes com atividade antimalárica. Algumas iniciativas estão sendo realizadas para o combate e controle da doença. Dentre as mais significativas estão a da Organização Mundial de Saúde, que em 1998, criou o programa Rolling Back Malaria (Recuar a Malária), que foi lançado em consórcio com o Banco Mundial, Programa de Desenvolvimento das Nações Unidas e Fundo de Assistência Infantil das Nações Unidas. Outras iniciativas para o descobrimento de novos fármacos, desenvolvimento de vacinas e aumento do financiamento de ações de controle foram lançados. A Iniciativa Multilateral em Malária - MIM em 1997, Medicamentos para Malária - MMV em 1999 e o Fundo Global de combate aAIDS, tuberculose e malária - GFATM, lançado em janeiro de 2002 constituem alguns programas de cotrole e combate a malária (Sachs, 2002). A OMS recomenda um gasto mundial de pelo menos um bilhão de dólares por ano na prevenção e combate a malária, sendo que a maioria deste valor, deveria ser aplicado na África..

(25) Pimentel, L. F.. Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático..... 9. Estima-se ainda que somente na África os benefícios a curto prazo com o controle da malária seriam entre 3 a 12 bilhões de dólares por ano (OMS, 2000). No ano de 1999, o Governo Brasileiro destinou um investimento total da ordem de 145,7 milhões de reais em ações de combate a malária, com o objetivo geral de reduzir a magnitude da doença em 50% até o ano de 2002 (FUNASA, 2002).. 2.1.3. Agentes Terapêuticos da Málaria Entre os agentes terapêuticos altamente eficazes com ação contra os parasitas da malária estão a cloroquina, quinina, quinidina, mefloquina, halofantrina, pirimetamida, sulfonamidas, sulfonas, tetraciclinas e primaquina. Os antimaláricos podem ser classificados pelo estágio do parasita que afetam e o objetivo clínico correspondente ou mecanismo de ação (Tab. 1). Das quatro espécies de parasitas que afetam o homem o Plamodium falciparum é o mais perigoso. Este parasita tem mostrado a capacidade de desenvo lver resistência aos antimaláricos atualmente utilizados. A cloroquina permanece como o antimalárico mais utilizado, porém tem apresentado falhas contra a malária falciparum em muitas áreas tropicais do planeta (OMS, 1999). Desde os primeiros registros de malária falciparum resistente a cloroquina no sudoeste da África e na América do Sul a quase um século atrás, o problema da resistência dos Plasmodium à fármacos tem sido considerado como o principal problema no controle da malária. A quinina é atualmente reservada como um fármaco de segunda ou terceira escolha para a malária e o fármaco de escolha nos casos de malária não grave ou complicada (Wongsrichanalai et al 2002 ; Sachs, 2002). No Brasil, o Ministério da Saúde, através da FUNASA e seu programa de controle de endemias, estabeleceu que para os casos de malária não grave ou complicada por P. falciparum resistente a cloroquina, o tratamento será realizado com o uso de quinina em monoterapia ou em.

(26) Pimentel, L. F.. Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático..... 10. associação com outros quimioterápicos como a doxiciciclina, tetraciclina, clindamicina e primaquina (FUNASA, 2001).. Tabela 1. Principais fármacos antimaláricos (James, 2002) Grupo de Antimaláricos 4-Metanolquinolinas. Biguanidas. Principais Fármacos Alcalóides Chinchona Quinina Quinidina Meloquina Cloroquina Hidroxicloroquina Amodiaquina Primaquina Tafenoquina Proguanil. Diaminopiridinas. Pirimetamina. Diclorobenzilidinas Hidroxinaftoquinonas. Lumefantrina Atavaquona. 9-fenantrenometano Lactonas Sesquiterpênicas Sulfonamidas. Halofantrina Artemisinina seus derivados Sulfodoxina Sulfametopirazina. Tetraciclinas Lincosamidas. Doxiciclina Tetraciclina Clindamicina. Sulfonas. Dapsona. 4-Aminoquinolinas. 8-Aminoquinolinas. Atividade Esquizonticida sangüíneo de rápida ação. Alguma atividade gametocida.. Esquizonticida sangüíneo. Esquizonticida sangüíneo de rápida ação. Alguma atividade gametocida.. Esquizonticida tecidual. Atividade gametocida e alguma atividade em outros estágios do ciclo de vida do parasita. Esquizonticida tecidual, esquizonticida sangüíneo de ação lenta. Alguma ação esporocida. Inibidor da dihidrofolato redutase. Esquizonticida tecidual e esquizonticida sangüíneo de ação lenta. Alguma ação esporocida. Inibidor da dihidrofolato redutase. Usualmente utilizado com antimaláricos que inibem diferentes estágios da folato sintetase (sulfonamidas ou sulfonas) em combinações sinérgicas. Esquizonticida sangüíneo. Esquizonticida sangüíneo, usualmente dado em combinação com o proguanil. Esquizonticida sangüíneo. e Esquizonticida sangüíneo. Esquizonticida sangüíneo. Inibidor da dihidropteroato e folato sintase. Usualmente dado em combinação com a pirimetamina. Esquizonticida sangüíneo, alguma atividade esquizonticida tecidual. Esquizonticida sangüíneo, alguma atividade esquizonticida tecidual. Esquizonticida sangüíneo. Inibidor da folato sintetase. Usualmente dado em combinação com a pirimetamida.. 2.2. QUININA A quinina é o principal alcalóide extraído das diversas espécies de chinchona, pertencentes à família das rubiáceas, naturais da América do Sul. Com fórmula molecular C20 H24 N2 O2 (8α, 9R-6´-.

(27) Pimentel, L. F.. Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático..... 11. metoxichinchonan-9-ol), (Figura 3A). Possui massa molecular de 324,42 g, ponto de fusão de 177 ºC, pKa 5,07 e 9,7 a 18ºC. Apresenta-se como cristais ortorrômbicos e luminescentes pela cristalização com álcool. Sendo pouco solúvel em água, completamente solúvel em uma mistura de etanol e clorofórmio (1:3), solúvel em álcool, benzeno, clorofórmio, éter e glicerol, porém é insolúvel em éter de petróleo (Moffat et al., 1986; The Index Merck, 1996). A quinina encontra-se sob a forma de base livre ou formando diversos sais, como sulfato, bissulfato, bromidrato, dibromidrato, cloridrato, dicloridrato, carbonato, salicilato. O sulfato de quinina com fórmula molecular (C 20 H24 N2 O2 )2 • H2 SO4 • 2 H2 O e massa molecular de 782,9 g, apresenta-se como pó cristalino branco, inodoro ou cristais ortorrômbicos ou aciculares coloridos (Figura 3B), com pKa de 4,1 e 8,5 a 20 ºC . Sua solubilidade aproxima-se à do alcalóide base (Moffat et al., 1986; The Index Merck, 1996).. a). b). Figura 3. a) Estrutura molecular da Quinina. b) Microfotorafia de Cristais de Sulfato de quinina (aumento 40 ×).. 2.2.1. Farmacocinética da Quinina A quinina e seus sais são rapidamente absorvidos quando administrados por via oral ou intramuscular. No primeiro caso, a absorção ocorre principalmente a partir do intestino delgado superior, com mais de 80% de absorção. As concentrações plasmáticas de pico são alcançadas em aproximadamente 3 horas, com um volume aparente de 1,5 litro por quilograma em indivíduos saudáveis, declinando com uma meia vida de aproximadamente 11 horas após a interrupção da terapia (James e Leslie, 1996; James, 2002)..

(28) Pimentel, L. F.. Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático..... 12. A ligação protéica é de 70% em indivíduos sadios, mas pode aumentar para 90% em muitos pacientes com malária. A farmacocinética da quinina é alterada significativamente com a infecção malárica, o maior efeito está na redução do volume aparente de distribuição e da depuração sistêmica (James e Leslie, 1996; James, 2002). A quinina é extensivamente metabolizada no fígado através de enzimas presentes no sistema Citocromo P450, estando sujeita a reações de hidroxilação nos anéis quinolínicos. É excretada na urina, e estima-se que 5 a 20% da dose administrada seja excretada de forma inalterada (Vieira e Mídio, 2000).. 2.2.2. Aplicações Terapêuticas A atividade antimalárica da quinina está largamente descrita na literatura, com os primeiros registros de uso datandos de mais de 350 anos, por um monge agostiniano de Lima no Peru, sendo incluída somente em 1677 na “London Pharmacopoeia” como “Cortex peruanus” (James e Leslie, 1996; Foley e Tilley, 1998). Age principalmente como esquizonticida sangüíneo, tem pouco efeito nos esporozoítos ou formas pré-eritrocitárias dos parasitas. É gametocida para o P. vivax e o P. malariae, mas não para o P. falciparum, não sendo utilizada para a profilaxia devido o seu espectro de atividade, porém é utilizada como agente supressivo e terapêutico. Apesar de sua toxicidade potencial, a quinina permanece como o esquizontocida sangüíneo prototípico para o tratamento supressivo e cura da malária falciparum resistente a cloroquina e a múltiplos fármacos (James e Leslie, 1996). De acordo com a literatura além da ação antimalárica, a quinina foi utilizada como analgésico, antipirético, anestésico local e abortivo. Contudo diante da sua baixa margem de segurança terapêutica, tais indicações tornaram-se obsoletas. Ainda existem relatos do uso para a ativação da circulação cerebral e periférica em associação com a papaverina. (THE INDEX MERCK, 1996; James e Leslie, 1996;Vieira e Mídio, 2000; James, 2002;)..

(29) Pimentel, L. F.. Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático..... 13. Segundo McCalley et al., (2002) a quinina também é utilizada na produção de bebidas refrigerantes do tipo tônica, em concentrações variadas e com a função de conferir sabor amargo, com esta mesma função, o alcalóide é utilizado em comprimidos de paracetamol para desencorajar o uso inadequado e abusivo do medicamento. Sendo utilizada ainda como matéria prima para a síntese de quinidina (antiarrítimico cardíaco e tratamento da fibrilação atrial). Os alcalóides da chinchona, principalmente a quinina e a quinidina são utilizados como seletores de troca iônica em diferentes técnicas de separação como a Cromatografia líquida de alta performance (CLAE), Cromatografia em Fluído Super Crítico (SFC), Eletroforese Capilar (EC) e Eletrocromatografia Capilar (CEC) (Franco et al., 2000). A quinina produz o relaxamento dos músculos esqueléticos, aumentando o período de refratividade por agir diretamente sobre a fibra muscular, diminuindo a excitabilidade da placa terminal motora em uma ação semelhante ao curare, sendo assim relatado o uso na cãibra noturna idiopática, provocando o alívio sintomático da miotonia congênita. No entanto, o seu uso é de indicação restrita, pois pode causar uma alarmante angústia respiratória e disfagia em pacientes com miastenia grave (Barajas-Lopes e Huizinga, 1989; James e Leslie, 1996).. 2.2.3. Mecanismo de Ação O mecanismo de ação da quinina, ainda não está totalmente elucidado, a teoria mais aceita é baseada no fato da quinina por ser uma base fraca, concentrando-se nos vacúolos alimentares ácidos do Plasmodium. Nestas organelas, a quinina inibi a atividade enzimática da heme polimerase, responsável pela polimerização do grupo heme a hemozoína e dessa forma permite o acúmulo do seu substrato tóxico, o heme. Ainda não foi estabelecido se o heme induz citotoxicidade por si só ou em complexo com a quinina (Chou e Fitch, 1993; Vieira e Mídio, 2000)..

(30) Pimentel, L. F.. Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático..... 14. 2.2.4. Toxicologia da Quinina A quinina possui baixo índice terapêutico, seu emprego como antimalárico geralmente está associado à elevada incidência de efeitos tóxicos. Quando a quinina é dada repetidamente em doses terapêuticas plenas, pode ocorrer um grupo de sintomas típicos relacionados à dose, denominado Chinchonismo (James e Leslie, 1996; Vieira e Mídio, 2000). O Chinchonismo é caracterizado por zumbidos, audição abafada, cefaléia, náuseas e distúrbios visuais. Entretanto, quando a medicação é continuada, ou após grandes doses únicas, podem aparecer manifestações gastrintestinais, cardiovasculares e dérmicas (FUNASA, 2001). Os distúrbios gastrintestinais são proeminentes entre eles a náusea, vômitos, dor abdominal e diarréia resultante da ação irritativa local da quinina, efeitos dérmicos também podem ocorrer, a pele freqüentemente apresenta-se quente e vermelha. Erupções aparecem com freqüência. Angioedema, especialmente da face, ocasionalmente é observado (James e Leslie, 1996; Vieira e Mídio, 2000; James, 2002). A literatura é unânime em caracterizar a hipoglicemia pelo uso de quinina, através de seu poderoso efeito estimulante nas células β-pancreáticas. Esta complicação pode ser potencialmente fatal na gravidez e na infecção grave. Outros efeitos colaterais estão associados ao sistema cardiovascular, sendo citados a hipotensão ortostática, anormalidades na repolarização atrial, taquicardia ventricular com evolução a fibrilação ventricular e óbito por parada cardíaca (James e Leslie, 1996; Vieira e Mídio, 2000; FUNASA, 2001; James, 2002).. 2.3. SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA DE FÁRMACOS (SLC) Até agora, o uso de alguns interessantes e promissores agentes terapêuticos tem sido limitado na clínica por causa de suas restritivas características físico-químicas, como a degradação do agente terapêutico, baixa solubilidade, necessidade de freqüentes administrações, efeitos colaterais inerentes a sua utilização em concentrações elevadas. É possível que estas substâncias possam ter um melhor aproveitamento, se técnicas apropriadas de microencapsulação forem.

(31) Pimentel, L. F.. Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático..... 15. desenvolvidas para sobrepor estes inconvenientes intrínsecos (Benoit et al., 1996; Santos e Castanho, 2002). As formas farmacêuticas convencionais como injetáveis ou sólidos orais possuem pouco controle sobre o modo de liberação do agente terapêutico, as quais em muitas situações, podem resultar em condições não previsíveis e às vezes, concentrações plasmáticas sub ou supraterapêuticas, podendo levar a efeitos adversos (Verma e Garg, 2001; Durán e Azevedo, 2002). Cada fármaco possui uma faixa de ação terapêutica acima da qual ela é potencialmente tóxica e abaixo da qual ela é ineficaz, o chamado índice terapêutico, os níveis plasmáticos são dependentes das doses e dos intervalos de tempo em que são administrados. Este fato é problemático para os fármacos de baixo índice terapêutico. Os SLC promovem uma concent ração uniforme do agente terapêutico no sítio de absorção e assim, permite a manutenção das concentrações plasmáticas na faixa terapêutica, minimizando os efeitos adversos e reduzindo a freqüência de administração (Figura 4).. Figura 4. Perfil farmacocinético de doses múltiplas ou em sistema de liberação controlada de fármacos (Brannon-Peppas, 1997).. Sistemas de Liberação Controlada podem ser definidos como aqueles nos quais o agente ativo é liberado independentemente de fatores externos e com uma cinética bem estabelecida.

(32) Pimentel, L. F.. Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático..... 16. (Baker, 1987). A liberação do agente ativo pode ser constante por um longo período, cíclica em um longo período ou ainda ser condicionada para ser iniciada por evento predeterminado. Em qualquer um dos casos, o propósito do controle da liberação do fármaco é alcançar uma terapia mais efetiva enquanto se elimina o potencial de baixa ou superdosagem (Brannon-Peppas, 1997). Podem ainda serem do tipo sítio direcionados, pela conjugação com anticorpos que possuem ação contra componentes específicos do sítio alvo. (Torchilin et al., 2001). A Tabela 2 apresenta os principais sistemas carreadores de fármacos.. Tabela 2. Principais Sistemas nanobiotecnológicos utilizados para o carreamento de fármacos. Sistema Lipossomas. Definição. Referência. São vesículas submicroscópicas, geralmente compostas. Gabriels e Plaizier-. por. bicamadas. lipídicas. (glicerofosfolipídios, Vercammen., 2003. principalmente a fosfatidilcolina) ao redor de um compartimento aquoso e podem ser estabilizadas por colesterol. Microesferas. Micropartículas monolíticas ou matriciais com tamanhos. Ahsan et al., 2002. entre 1 a 1000 µm, com o fármaco adsorvido em suas superfícies, dissolvido ou disperso na rede polimérica. Microcápsulas. Micropartículas do tipo reservatório, com tamanhos entre Ahsan et al., 2002 1 a 1000 µm, onde o fármaco encontra-se encapsulado em um núcleo.. Nanoesferas. Sistemas Coloidais matriciais submicrômicos, nos quais. Brigger et al., 2002. o fármaco encontra-se disperso ou dissolvido nas partículas, geralmente composto de polímeros. Nanocápsulas. Sistemas Coloidais vesiculares submicrômicos, em que o fármaco está confinado em uma cavidade aquosa ou oleosa,. estabilizada. polimérica.. por. uma. simples. membrana. Brigger et al., 2002.

(33) Pimentel, L. F.. Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático..... 17. Um SLC ideal deve ser inerte, biocompatível, mecanicamente resistente, confortável para o paciente, capaz de encapsular uma grande quantidade de fármaco, estar livre da possibilidade de liberações acidentais, ser de simples administração, remoção, de fácil fabricação e esterilização. Em conclusão os SLC representam um desenvolvimento relativamente novo e têm o objetivo de prolongar e melhorar o controle da administração de fármacos (Durán e Azevedo, 2002; BrannonPeppas, 1997). Entre as vantagens que os SLC podem oferecer, podemos citar o aumento da eficácia terapêutica, liberação progressiva e controlada do fármaco, manutenção de níveis do fármaco com faixas desejáveis, diminuição significativa da toxicidade, diminuição da instabilidade e decomposição de fármacos sensíveis, possibilidade de direcionamento a alvos específicos, possibilidade de incorporação tanto de substâncias hidrofílicas quanto lipofilicas nos dispositivos, menor necessidade de administrações, uso otimizado do fármaco e aumento da aceitação da terapia pelo paciente (Brannon-Peppas, 1997; Durán e Azevedo, 2002).. 2.3.1. Mecanismos de Liberação do Fármaco de SLC Dependendo do tipo de polímero e planejamento de obtenção do dispositivo, diferentes processos físico-químicos podem estar envolvidos no controle da liberação do fármaco. Existem três mecanismos primários pelos quais agentes ativos podem ser liberados de um sistema: a difusão, a degradação do sistema ou ainda a combinação destes. A difusão ocorre quando o fármaco ou outro agente ativo passa através do polímero que forma o dispositivo de liberação. A difusão pode ocorrer na escala macroscópica, através de poros na matriz polimérica ou a um nível molecular, pela passagem entre as cadeias poliméricas (Schaefer e Singh, 2002). A difusão do fármaco através da matriz polimérica, esta condicionada a outras propriedades específicas da molécula do fármaco como coeficiente de difusibilidade no polímero,.

(34) Pimentel, L. F.. Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático..... 18. solubilidade, tamanho da molécula, distribuição do fármaco na matriz polimérica e interações específicas com o polímero (Ghaderi et al., 1996; Faisant et al., 2002). Na degradação do sistema, a quebra de ligações éster por hidrólise, a solubilidade do fármaco, taxa de difusão do fármaco, são fatores que influenciam no controle de liberação.. 2.3.2. Excipientes para Sistemas de Liberação Controlada O termo polímero refere-se a grandes moléculas (macromoléculas), caracterizadas pelo seu tamanho, estrutura química e interação intra e intermoleculares. Possuem unidades ligadas por covalência, repetidas regularmente ao longo da cadeia, denominados “monômeros”. Sua estrutura depende do monômero ou monômeros utilizados em sua preparação. Quando apenas uma pequena quantidade de unidades monoméricas estão juntas resulta em um polímero de baixo peso molecular denominado oligômero (Stevens, 1999). Os polímeros biodegradáveis são susceptíveis de degradação por processos biológicos naturais, eliminando a necessidade de remoção dos mesmos. Assim estes polímeros são assim designados por degradarem em meio aquoso como nos fluídos corpóreos, por hidrólise de suas cadeias poliméricas em compostos biologicamente aceitáveis e progressivamente menores metabolizáveis pelo organismo. (Brennon-Peppas, 1997; Giunchedi, et al., 1998). Uma grande variedade de polímeros naturais e sintéticos biodegradáveis ou não foram estudados para a liberação prolongada de fármacos ou direcionamento sítio específico. Entretanto, apenas poucos destes são biocompatíveis. Polímeros naturais como a albumina sérica bovina (BSA), a albumina sérica humana (HSA), o colágeno, a gelatina e a hemoglobina já foram estudados para liberação de fármacos. Estes polímeros têm uso limitado, devido os altos custos e pela variação de pureza, consequentemente, os polímeros sintéticos biodegradáveis vêm recebendo uma significante atenção nesta área (Jain, 2000; Hans e Lowman, 2002)..

(35) Pimentel, L. F.. Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático..... 19. Os polímeros biodegradáveis são conhecidos por sua biocompatibilidade e reabsorção por mecanismos naturais, além de permitirem que as taxas de degradação e a taxa de liberação do fármaco encapsulado possam sofrer manipulação pela variação da relação entre seus monômeros (Brannon-Peppas, 1997; Jain, 2000). Alguns destes materiais são frequentemente utilizados ou estudados para liberação de fármacos. incluindo. o. álcool. polivinílico,. poliacrilamindas,. poli-alquil-α-cianoacrilatos,. polietilenoglicol, poli- metil- metacrilatos. Além destes, poliesters termoplásticos alifáticos como polilático (PLA) o poliglicólico (PGA) e seus copolímeros, especialmente o poli- lático-co-glicólico (PLGA) tem gerado um grande interesse devido as suas excelentes biocompatibilidade e biodegradabilidade e terem sido aprovados pela Agência de Vigilância Sanitária Americana, a Food and Drug Adminitration (FDA), para uso em liberação de fármacos. Vários dispositivos poliméricos como microesferas, microcápsulas, nanopartículas, pellets, implantes e filmes têm sido formulados usando este polímero para a liberação de uma variedade de classes de fármacos (Jain, 2000; Hans e Lowman, 2002; Faisant et al., 2002).. 2.3.3. Poli(lático-co-glicólico) - PLGA Copolímeros são definidos como polímeros compostos de muitas unidades de monômeros e são classificados em quatro tipos, de acordo com a disposição de seus monômeros: copolímeros randômicos, copolímeros alternados, copolímeros enxertados e copolímeros em bloco (Kumar et al., 2001). Os copolímeros de PLGA são formados por unidades monoméricas de ácido polilático e poliglicólico (Figura 5). Possuem propriedades desejáveis como, taxa constante de biodegradação, morfologia, resistência mecânica, cristalinidade e geometria regular de cadeias individuais (Jain, 2000; Hans e Lowman, 2002; Cai et al., 2003). Os entendimentos das propriedades físicas, químicas e biológicas dos polímeros são úteis na formulação de dispositivos de liberação.

(36) Pimentel, L. F.. Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático..... 20. controlada. As várias propriedades do polímero e do fármaco encapsulado influenciam diretamente em outros fatores como a seleção do processo de microencapsulação ou taxa de liberação do fármaco do polímero (Jain, 2000; Hans e Lowman, 2002).. Figura 5. Estrutura molecular dos ácidos polilático e poliglicólico.. O ácido lático é mais hidrofóbico que o ácido glicólico e assim copolímeros de PLGA ricos em ácido lático são menos hidrofílicos, absorvem menos água e assim degradam mais lentamente. Polímero de PLGA contendo relações de 50:50 de ácido lático e glicólico são hidrolisados com maior velocidade que aqueles que contém elevadas proporções de um dos monômeros (Jain, 2000). A degradação da matriz de PLGA ocorre em meio através da quebra de ligações a uma taxa uniforme. A maior parte da literatura indica que a biodegradação do PLGA não envolve nenhuma atividade enzimática, sendo puramente por meio de hidrólise. O PLGA é biodegradado em ácido lático e glicólico. O ácido lático entra no ciclo do ácido tricarboxílico e é metabolizado e subseqüentemente eliminado do organismo como dióxido de carbono e água. O ácido glicólico é excretato inalterado pelos rins ou entra no ciclo do ácido tricarboxílico, sendo eventualmente eliminado como dióxido de carbono e água (Giunchedi, et al 1998; Jain, 2000)..

(37) Pimentel, L. F.. Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático..... 21. 2.4. MICROPARTÍCULAS Micropartículas podem ser definidas como formas de dosagem onde os dispositivos estão na faixa de 1 a 1000 µm, e podem ser de dois tipos, as microcápsulas e as microesferas, os primeiros são sistemas reservatórios micrométricos, onde é possível identificar um núcleo diferenciado, o qual pode ser sólido ou líquido. Neste caso, a substância encontra-se envolvida por uma parede, geralmente polimérica, isolando o núcleo do meio externo, por outro lado as microesferas são sistemas matriciais micrométricos, onde o fármaco encontra-se disperso ou solubilizado no interior da matriz polimérica. Desde que micropartículas foram desenvolvidas para o controle da liberação de fármacos após a sua administração oral, o desenvolvimento de micropartículas contendo fármacos mostrou-se uma alternativa promissora para a redução da freqüência de administração (Lamprecht, 2000; Ashan et al., 2002).. 2.4.1. Aplicações Terapêuticas Micropartículas de PLGA, em particular, são importantes sistemas de liberação de fármacos, nos quais vários perfis de liberação podem ser obtidos pelo ajuste da composição do PLGA, seu peso molecular, fármaco encapsulado, tamanho da microesfera. Alguns fármacos formulados em dispositivos já foram introduzidos no mercado e muitos se encontram em ensaios clínicos (Brannon-Peppas, 1995; Jain, 2000). Algumas destas aplicações estão listadas na Tabela 3.. 2.4.2. Industria Farmacêutica e SLC Atualmente, a Indústria Farmacêutica está presa entre a guerra de preços reduzidos e o aumento dos custos na descoberta e desenvolvimento de novos fármacos. A magnitude dos custos e o tempo de desenvolvimento para uma nova entidade química são muitos altos (aproximadamente, 500 milhões de dólares e de 10 a 12 anos) quando comparados aos requeridos para o desenvolvimento de novos sistemas de liberação de fármacos (20 a 50 milhões de dólares e de 3 a 4.

(38) Pimentel, L. F.. Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático..... 22. anos). De modo que estes novos sistemas podem proporcionar a uma molécula já existente uma nova vida e com isso aumentar o seu valor comercial e competitividade, além de estender a validade de sua patente.. Tabela 3. Aplicações terapêuticas de Microesferas. Agente Ativo. Polímero Utilizado. Via de Adm. -. Referência. 5-fluorouracil. PLGA. Aciclovir. PDLLA e PLGA. Antígeno HS de Brucella ovis. PLGA, PCL. Camptotecina. PLGA. Injetável. Cidofovir. PLGA. Tópica. Darbeopoetin alfa. PLGA. -. Herberger et al., 2003. Diazepam. PLGA. Oral. Giunchedi et al., 1998. Desferrioxamina. PLGA. -. Schlicher et al., 1997. Etoposídio. PLGA. Injetável. Shaefer e Singh, 2002. Fentamil. PLGA. Injetável. Choi et al., 2002. Fisostigmina. PLGA. Oral. Chaw et al., 2003. Fosforilcolina. PLGA. Gentamicina. PLGA. Injetável. Peptídio gp120. PLGA. -. Cleland et al., 1997. Irpriflavona. PLGA. Oral. Perugini et al., 2003. Isoniazida. PLGA. Subcutânea. Dutt e Khuller, 2001. Levonorgestrel e etinilestradiol. PCL. Intramuscular. Merlasoprol. PCL. Oral. Nalbufina. PLGA. Injetável. Plasmídio de DNA. PLGA. Intramuscular. Rodamina B. PLG. Antígeno SPf66. Intravitral Oral. Faisant et al., 2002 Conti et al., 1997 Murillo et al., 2002 Ertl et al., 1999 Santoyo et al., 2002. Mucosa Nasal Fattal et al., 2002 Blanco-Príeto et al., 2002. Dhanaraju et al., 2003 Gibaud et al., 2002 Liu at al, 2003 Del-Barrio et al., 2003. -. Berkland et al., 2001. PLGA. Intranasal. Carcaboso et al.,2004. Antígeno SPf66. PLGA. Oral. Carcaboso et al., 2003. Sulfasalazina e Betametasona. PLGA e PCL. Oral. Lamprecht et al., 2000. Sulfato de Salbutamol (-) não informado.. PLGA. -. Erden et al., 1996.

(39) Pimentel, L. F.. Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático..... 23. A venda de produtos de liberação controlada de fármacos foi avaliada em torno de 22 bilhões de dólares no mundo todo e espera-se que o seu crescimento no presente século, seja de 120 bilhões em 2007 (Verma e Garg, 2001). Algumas empresas desenvolveram inúmeras pesquisas utilizando a nanobiotecnologia para a formulação de sistemas microparticulados, com a obtenção de SLC patenteados e que já se encontram no mercado, são exemplos o Ceform da Fuisz Technology Ltd., USA; Phamazone da Elan Corporation, ProLease e Medisorb da Alkermes Inc., USA; Microsponge e Retino-A-Micro da Advanced Polymer Systens Inc., US A; Oligosphere da Macromed, Inc. (Verma e Garg, 2001).. 2.5. MICROENCAPSULAÇÃO A microencpasulação de agentes bioativos envolve processos complexos que permitem incorporar a um sistema contendo um agente ativo propriedades funcionais e “inteligentes” , como a liberação controlada por uma condição ou um meio específico. Uma tecnologia de ponta como a microencapsulação, tem grande valor estratégico para o País, por oferecer produtos com maior valor agregado, levando ao aumento da competitividade da indústria na disputa de mercados nacionais ou internacionais (Ré, 2000). Técnicas de microencapsulação são normalmente utilizadas para aumentar a estabilidade de materiais, reduzir os efeitos tóxicos ou aumentar a liberação do agente para diferentes aplicações em vários campos da produção (Dunne et al., 2003). A incorporação de medicamentos já existentes em novos sistemas de liberação pode significar o aumento de sua performance em termos de eficiência, segurança e aceitação pelo paciente. (Benoit et al., 1996; Verma e Garg, 2001).. 2.5.1 Métodos de Preparação de Microesferas Microesferas podem ser preparadas por diferentes métodos. Estes foram desenvolvidos e otimizados ao longo dos anos, entre estas técnicas podemos citar: a separação de fases,.

(40) Pimentel, L. F.. Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático..... 24. emulsificação seguida de extração do solvente, técnicas utilizando spray drying; uso de fluído supercrítico ou ainda métodos isentos do uso de solventes orgânicos. A escolha da técnica depende da natureza do polímero, do fármaco, do fim a que se destina e da duração do tratamento. Os métodos de microencapsulação empregados devem garantir a estabilidade e a atividade biológica do agente ativo, ter elevada eficiência de encapsulação, reprodução da qualidade e perfil de liberação, sob limites especificados (Jain, 2000). Os métodos mais empregados para a preparação de microesferas poliméricas são a separação de fases e as técnicas de remoção de solvente. Dependendo do modo como o solvente é evaporado, este último pode ser subdividido em evaporação do solvente, extração do solvente, spray-drying, ou ainda utilizando a tecnologia de fluído supercrítico. A evaporação de solvente é a técnica mais utilizada para a preparação de micropartículas de poliesteres (Benoit et al., 1996; Giunchedi et al., 1998; Herrmann e Bodmeier, 1998; Jain, 2000).. 2.5.1.1. Métodos de Separação de Fases de Polímeros Também conhecido como coacervação, é uma excelente técnica para o encapsulamento de fármacos solúveis em água como peptídios, proteínas ou vacinas, também pode ser utilizado para fármacos insolúveis em água. Este processo consiste na diminuição da solubilidade do polímero encapsulante pela adição de um terceiro componente na solução orgânica contendo o polímero dissolvido (Benoit et al., 1996).. 2.5.1.2. Métodos de Spray-Drying Nebulização ou spray drying é um método muito utilizado na indústria farmacêutica, envolve condições brandas, pouca dependência dos parâmetros de solubilidade e altas taxas de encapsulamento. O princípio consiste na nebulização ou atomização de uma solução (contendo o.

(41) Pimentel, L. F.. Preparação e Caracterização de Microesferas de Copolímero de Ácido Lático..... 25. fármaco a ser encapsulado) por ar comprimido ou nitrogênio através de um câmara de dessecação e secagem através de uma corrente de ar quente (Conti et al., 1997).. 2.5.1.3. Métodos Utilizando Fluído Supercrítico A técnica de uso de fluídos em temperaturas e pressões que excedam o seu ponto crítico, utilizado-os como meio extrativo, está bem demostrada. Em microencapsulação este método pode ser utilizando, aspergindo-se uma solução orgânica contendo um princípio ativo em uma coluna contendo fluído supercrítico, o solvente orgânico será extraído pelo fluído em condições supercríticas, formado as microesferas (Benoit et al., 1996).. 2.5.1.4. Injeção Sob Pressão Berckland e colaboradores (2001) desenvolveram, um sistema relativamente simples que provoca jatos sob pressão controlada de uma solução polimérica contendo o fármaco solubilizado através de uma agulha, sob excitação acústica controlada, produzindo micropartículas de tamanho uniforme com desvios de apenas 1,0 a 1,5 µm da média em 95% das microesferas.. 2.5.1.5. Métodos de Trituração A preparação de micropartículas sem o uso de solventes baseia-se em triturar partículas do polímero. O polímero em pó sofre uma prévia fusão, seguida da redução do tamanho e pode ser completada por um processo de esferonização, que consiste em promover o degaste das partículas de modo a obter uma forma arredondada (Herrmann e Bodmeier, 1998).. 2.5.1.6. Sistema de Recirculação Total (TROMS) Este método evita o uso de técnicas agressivas de homogenização, podendo ser utilizado para agentes que necessitem conservar a sua integridade estrutural. Utiliza um equipamento.

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