UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
YURI RAMATIS SILVA MIRANDA
FERMENTADOR CONTÍNUO POR GRADIENTE DE DENSIDADE PARA PRODUÇÃO DE CERVEJA
Campinas – SP 2019
FERMENTADOR CONTÍNUO POR GRADIENTE DE DENSIDADE PARA PRODUÇÃO DE CERVEJA
Dissertação
apresentada
à
Faculdade de Engenharia de
Alimentos
da
Universidade
Estadual de Campinas como
parte dos requisitos exigidos para
a obtenção do título de Mestre em
Tecnologia de Alimentos.
Orientador: Prof. Dr. Flávio Luís Schmidt (FEA/UNICAMP)
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO
DEFENDIDA PELO ALUNO YURI
RAMATIS SILVA MIRANDA, E
ORIENTADO PELO PROFESSOR DR. FLÁVIO LUÍS SCHMIDT.
Campinas – SP 2019
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos Claudia Aparecida Romano - CRB 8/5816
Miranda, Yuri Ramatis Silva,
M672f MirFermentador contínuo por gradiente de densidade para produção de cerveja
/ Yuri Ramatis Silva Miranda. – Campinas, SP : [s.n.], 2019.
MirOrientador: Flávio Luís Schmidt.
MirDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade
de Engenharia de Alimentos.
Mir1. Leveduras. 2. Densidade. 3. Fermentação. 4. Bebidas. I. Schmidt, Flávio
Luís. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Continuous fermenter by density gradient for beer production Palavras-chave em inglês:
Yeasts Density Fermentation Beverages
Área de concentração: Tecnologia de Alimentos Titulação: Mestre em Tecnologia de Alimentos Banca examinadora:
Flávio Luís Schmidt [Orientador] Alfredo de Almeida Vitali
Marcelo Alexandre Prado Data de defesa: 15-03-2019
Programa de Pós-Graduação: Tecnologia de Alimentos
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0002-3517-3564
- Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/1085878222647802
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.
Prof. Dr. Flávio Luís Schmidt Universidade Estadual de Campinas
Orientador
Prof. Dr. Marcelo Alexandre Prado Universidade Estadual de Campinas
Membro Titular
Dr. Alfredo de Almeida Vitali Pesquisador
Aos meus pais Sérgio e Elza, pelo amor incondicional, pelo exemplo de
dedicação e valores transmitidos, por todos os ensinamentos, por me
apoiarem e acreditarem em todos meus passos.
A minha amada Ditinha (
in memoriam
) por todo amor, dedicação, e carinho.
Por todas as histórias contadas, por ser um exemplo de humildade e doação
ao próximo.
Aos meus grandes amores, Vó Elza (
in memoriam
) e Vô Antônio (
in
memoriam
), por todo o carinho e dedicação em vida. A memória de meus
queridos avós Rosalina e Raimundo, que apesar da distância sempre
transmitiam todo seu amor e carinho em nossas agradáveis conversas.
Ao meu eterno amor Flávia, por todo amor incondicional, por estar sempre
ao meu lado, me incentivando, me apoiando em todos os momentos, por
todas as risadas, pela paciência e dedicação nessa caminhada.
Primeiramente à Deus pelo dom da vida, por todas as oportunidades e momentos maravilhosos proporcionados, por dar-me sempre forças para seguir em frente.
Ao meu orientador, Professor Dr. Flávio Luís Schmidt por todos os ensinamentos, paciência e dedicação nessa caminhada.
Aos membros da banca, Prof. Dr. Marcelo Alexandre Prado, Dr. Alfredo de Almeida Vitali, Prof. Dr. Marcus Bruno Soares Forte, Prof. Dr. Júlio Cesar Barbosa Rocha, pela disponibilidade e colaboração.
A todos os colegas do laboratório de Frutas e Hortaliças, pela companhia, momentos de descontração, pelos ensinamentos, pelo apoio e por toda ajuda e colaboração.
À Ana Koon pela amizade e pelos ensinamentos.
Ao João Pedro por toda a ajuda no desenvolvimento desse trabalho. À Sandra e Leila, por todo auxílio durante estes dois anos.
Ao laboratório de Óleos e gorduras, que gentilmente nos emprestou a bomba peristáltica utilizada nos experimentos.
À CNPq pela ajuda financeira concedida para realização deste trabalho.
O presente trabalho foi realizado com o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001.
A todos aqueles que de alguma forma contribuíram para que este trabalho fosse realizado.
A cerveja é uma das bebidas mais apreciadas pelo mundo, apresentando taxas de consumo crescente ano após ano. Essa demanda faz com que as cervejarias busquem alternativas tecnológicas que permitam torná-las cada vez mais competitivas. A etapa de fermentação, por se tratar da etapa mais prolongada do processo, recebe atenção especial na busca por novas soluções que visam aperfeiçoar a produção de cerveja. O sistema de fermentação contínuo é relatado como uma alternativa para aumentar a produtividade do processo. No presente trabalho foi desenvolvido um fermentador tubular espiral com 15 m de comprimento e 0,0254 m de diâmetro interno, alimentado com uma bomba peristáltica com vazão de 0,85 a 2,60 mL/min, utilizando em seu projeto a variação no gradiente de densidade do mosto. Os ensaios foram realizados com mosto em concentrações de 10,5 e 15 °Brix. As concentrações máximas (°GL) de etanol nos processos contínuos foram de 7,1% (mosto 15 ºBrix) e 5,4% (mosto 10,5 ºBrix), ambas com 5 dias de processo; enquanto no fermentador contínuo foram de 7,1% (mosto 15 ºBrix) e 4,9% (mosto 10,5 ºBrix), em 5 e 6 dias de processo, respectivamente. A concentração de diacetil encontrada durante o processo contínuo a 10,5 ºBrix com 149 h de processo (0,28 mg/L) foi 72% inferior ao processo descontínuo (1 mg/L), em tempos de processo similares. Os dados obtidos corroboram com a hipótese do produto final do sistema contínuo ser equivalente ao sistema descontínuo, indicando potencial de viabilidade do sistema projetado, considerando o gradiente de densidade do mosto, com perspectiva de ampliação de escala.
Beer is one of the most appreciated beverages in the world, and its consumption rates rise year after year. This demand makes breweries to look for technological alternatives to become more competitive. The fermentation step, due to its extended time, receives special attention in the search for new solutions to improve beer production. In this context, the continuous fermentation system is reported as an alternative to increase process productivity. In the present study, a 15m spiral tubular fermenter, 0.0254 m internal diameter was developed. The equipment was supplied with a peristaltic pump with flow rate from 0.85 to 2.60 mL/min. Tests were carried out with wort concentrations of 10.5 and 15 ºBrix. The maximum concentrations of ethanol (°GL) found in the continuous processes were 7.1% (15 ºBrix) and 5.4% (10.5 ºBrix), both in 5 days of the process; while in the continuous fermenter it was achieved 7.1% (15 ºBrix) and 4.9% (10.5 ºBrix) in 5 and 6 days, respectively. The diacetyl concentration during the continuous process at 10.5 ºBrix after 149 h of process (0.28 mg/L) was 72% lower when compared to the batch process (1 mg/L), at similar times of process. The obtained data corroborate with the hypothesis that the final product of the continuous system can be equivalent to the batch system, indicating potential viability of the developed system with a perspective for scale expansion.
Figura 1. Fluxograma geral do processo de fabricação de cerveja (os fluxos de entrada são indicados no lado esquerdo e os fluxos de saída do lado direito). 22 Figura 2. Representação celular de Saccharomyces cerevisiae. ... 25 Figura 3. Vias aeróbias e anaeróbias de respiração celular. ... 29 Figura 4. Curso de tempo de fermentação para cervejas ale (a) e lager (b). fa, nível de álcoois superiores (μg/L); e, nível de ésteres (μg/L) t, temperatura (ºC); SG, gravidade específica (g/cm³); pH. ... 30 Figura 5. Fase de crescimento microbiano. ... 31 Figura 6. Utilização de açúcares durante a fermentação de um mosto de cerveja de densidade original 1.040 g/cm³. ... 33 Figura 7. As principais vias utilizadas pela levedura para a dissimilação da glicose. ... 35 Figura 8. Compostos de aroma formados durante a fermentação. ... 36 Figura 9. A síntese e redução de dicetonas vicinais em S. cerevisiae. ... 39 Figura 10. Esquema do processo de fermentação contínua da cervejaria de Auckland... 43 Figura 11. Protótipo de fermentador contínuo proposto por Portno. ... 46 Figura 12. Sistema adotado para fermentação descontínua. ... 49 Figura 13. A) Visão geral do sistema de fermentação contínua de cerveja; B) Visão do fermentador tubular espiral montado no interior do tanque de refrigeração; C) Válvula de reciclo para coleta de amostra da parte inferior do fermentador; D) Reservatório de armazenamento do produto. ... 51 Figura 14. Alimentação do sistema. ... 52 Figura 15. Pontos de coleta de amostra ao final do tempo simulado. A) Pescador de inox acoplado na mangueira de silicone para sifonamento da amostra; B) Recipiente de coleta de amostra final; C) Válvula de reciclo para coleta de amostra em transição. ... 54
Figura 17. Variação do Grau real de fermentação (GRF) durante os processos contínuo (linha contínua) e descontínuo (linha tracejada), a 15 ºBrix (■) e 10,5 ºBrix (●) ... 61 Figura 18. Variação da densidade (g/cm3) (-—■-—), viabilidade celular (%) (— —), e produção de álcool % (v/v) (—□—) ao longo do processo contínuo a 15 ºBrix. ... 62 Figura 19. Variação da densidade (g/cm3) (—●—), viabilidade celular (%) (——) e produção de álcool % (v/v) (—о —), ao longo do processo contínuo 10,5 ºBrix ... 63 Figura 20. Variação da densidade (g/cm3) (---■---), viabilidade celular (%)(----), e produção de álcool % (v/v) (---□---) ao longo do processo descontínuo a 15 ºBrix. ... 63 Figura 21. Variação da densidade (g/cm3) (---●---), viabilidade celular (%)(---) e produção de álcool % (v/v) (---о---), ao longo do processo descontínuo 10,5 ºBrix ... 64 Figura 22. Processo contínuo 15 ºBrix. (—●—) Contagem de células totais no produto final (—■—) Contagem de células viáveis na amostra coletada do fundo ... 65 Figura 23. Processo contínuo a 10,5 ºBrix. Contagem de células em log (cel/mL) no produto final (—●—); Contagem de células em log (cel/mL) na amostra coletada do fundo (—■—). ... 66 Figura 24. Variação densidade (g/cm3) (—●—),Viabilidade celular (%) (——) e concentração de álcool (v/v) (—о—) ao longo do processo contínuo 10,5 ºBrix com vazão constante de 1,88 mL/min. ... 69 Figura 25. Variação da concentração de álcool isoamílico durante a fermentação no processo contínuo (—●—) e descontínuo (---о---). ... 71 Figura 26. Variação da concentração de acetato de etila no processo contínuo (—●—) e descontínuo (---о---). ... 73
Figura 28. Variação da concentração de acetaldeído no processo contínuo (—
●—) e descontínuo (---о---). ... 77
Figura 29. Representação do projeto com três zonas de temperaturas, pra fermentação, fermentação complementar e maturação da cerveja, na mesma tubulação. ... 78
Figura 30. Pré-teste realizado com azul de metileno. ... 92
Figura 31. Pré-teste realizado com mosto 15 ºBrix. ... 93
Figura 32. Visão geral do sistema de fermentação contínua... 95
Figura 33. Componentes do sistema contínuo. A) Bomba peristáltica utilizada no experimento. Vazão de operação entre 0,1 a 2,6 mL/min; B) Agitador magnético utilizado nos experimentos; C) Kitassato utilizado para armazenamento do mosto de alimentação; D) Tanque utilizado para controle de temperatura; E) Válvula de coleta de amostra no fundo do reator; F) Sistema para armazenamento do produto final. ... 95
Tabela 1. Principais álcoois superiores comumente presentes em cerveja. .... 37 Tabela 2. Principais ésteres encontrados na fermentação primária da cerveja. ... 38 Tabela 3. Características físico-químicas de extrato de malte seco Dry Brew. 48 Tabela 4. Correspondência das vazões utilizadas no processo de fermentação contínua... 53 Tabela 5. Resultados obtidos com ensaios realizados com mosto de concentração 15 ºBrix. ... 59 Tabela 6. Resultados obtidos com ensaios realizados com mosto de concentração 10,5 ºBrix. ... 60 Tabela 7. Resultados obtidos com ensaios realizados com mosto de concentração 10,5 ºBrix com vazão constante de 1,88 mL/min. ... 68 Tabela 8. Compostos de aromas produzidos no processo contínuo em diferentes tempos de fermentação. ... 70 Tabela 9. Compostos de aromas produzidos no processo descontínuo em diferentes tempos de fermentação. ... 70 Tabela 10. Parâmetros avaliados durante a fermentação. ... 93
1. INTRODUÇÃO ... 16
2. OBJETIVOS ... 18
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 19
3.1 UM BREVE HISTÓRICO DA CERVEJA ... 19
3.2 A PRODUÇÃO DE CERVEJA ... 21 3.2.1Ingredientes ... 22 3.2.1.1 Água ... 22 3.2.1.2 Malte... 23 3.2.1.3 Lúpulo ... 23 3.2.1.4 Levedura ... 24
3.2.2Produção do mosto cervejeiro ... 26
3.2.2.1 Moagem ... 26
3.2.2.2 Mosturação ... 27
3.2.2.3 Fervura ... 28
3.2.2.4 Fermentação ... 29
3.3 ASPECTOS BIOQUÍMICOS DA FERMENTAÇÃO ... 32
3.3.1Metabolização dos carboidratos ... 32
3.3.2Formação de compostos de sabor ... 35
3.3.2.1 Álcoois superiores ... 36
3.3.2.2 Ésteres ... 37
3.3.2.3 Ácidos orgânicos ... 38
3.3.2.4 Dicetonas vicinais ... 39
3.3.2.5 Aldeídos ... 40
4. MATERIAIS E MÉTODOS ... 46 4.1 LEVEDURA ... 47 4.2 PREPARO DO PRÉ-INÓCULO ... 48 4.3 PRODUÇÃO DO MOSTO ... 48 4.4 FERMENTAÇÃO DESCONTÍNUA ... 49 4.5 FERMENTAÇÃO CONTÍNUA ... 50
4.5.1Descrição do fermentador utilizado ... 50
4.5.2Condições de operação ... 51
4.5.2.1 Higienização do sistema de fermentação ... 51
4.5.2.2 Alimentação do sistema ... 52
4.5.2.3 Coleta de amostra ... 53
4.6 ACOMPANHAMENTO ANALÍTICO DOS EXPERIMENTOS ... 54
4.6.1Contagem de células ... 54
4.6.2Concentrações de extrato original, aparente e real, densidade, etanol e grau real de fermentação (taxa de atenuação). ... 56
4.7 DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS DE SABOR ... 56
4.7.1Determinação de diacetil ... 56
4.7.2Determinação de acetaldeído, acetato de etila e álcool isoamílico ... 56
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 57
5.1 ELABORAÇÃO DO SISTEMA ... 57
5.1.1Componentes do sistema ... 57
5.1.2Dimensionamento da tubulação ... 58
5.2 COMPARAÇÃO DOS PARÂMETROS FERMENTATIVOS ENTRE OS PROCESSOS CONTÍNUO E DESCONTÍNUO ... 58
5.4.1Álcool isoamílico ... 71 5.4.2Acetato de etila ... 72 5.4.3Diacetil ... 74 5.4.4Acetaldeído ... 76 5.5 AMPLICAÇÃO DE ESCALA ... 77 6. CONCLUSÃO ... 80
7. SUGESTÃO PARA TRABALHOS FUTUROS ... 81
8. REFERÊNCIAS ... 82
ANEXO I ... 92
ANEXO II ... 95
1. INTRODUÇÃO
A cerveja é uma das bebidas mais antigas do mundo, com relatos de sua produção desde 5.000 anos A.C., na região da Mesopotâmia. (KUNZ, 1999). Com a evolução dos tempos a bebida se popularizou, passando a ser produzida em quase todos os países do globo (KUNZ, 1999). Com consumo aproximado de 180 bilhões de litros anuais (KIRIN HOLDINGS, 2015), a cerveja atualmente se destaca como uma das bebidas mais consumidas no mundo (NEVES; TROMBIN, 2011).
Devido sua alta demanda de consumo, as cervejarias vêm investindo cada vez mais na aplicação de novas tecnologias, com o objetivo de aumentar sua produtividade (PIRES et al., 2015). O processo de fermentação é uma das fases mais críticas na fabricação de cerveja (WHITE; ZAINASHEFF, 2010), o qual utiliza a capacidade metabólica das leveduras para converter açúcares em etanol e dióxido de carbono, os principais produtos de seu metabolismo, além de outros compostos voláteis de fundamental importância para as características sensoriais do produto (BRIGGS et al., 2004).
O prolongado tempo requerido na fermentação faz com que novas soluções sejam propostas para um maior rendimento (PIRES et al., 2014). Neste sentido, o processo de fermentação contínua é relatado como uma alternativa para aumento da produtividade (BRÁNYIK et al., 2008; TARKIAINEN et al., 2005; LINKO et al., 1998; PILKINGTON et al., 1998).
Segundo Dragone e colaboradores (2007), a fermentação da cerveja por um sistema contínuo promove uma série de vantagens em relação à fermentação em batelada convencional, como a redução no tamanho dos equipamentos, obtenção de um produto com características uniformes e, principalmente, uma significativa diminuição do tempo de fabricação.
Diversos sistemas para produção contínua de cerveja veem sendo descritos ao longo dos anos (COUTTS, 1958; BAKER; KIRSOP, 1973; PIRT, 1975; VASSILEV et al., 2015). Uma vertente estudada por diferentes autores é a fermentação contínua com células imobilizadas (PIRES, 2015, BRÁNYIK et al., 2008; DRAGONE, 2007), tendo como limitação a alta concentração de diacetil encontrada ao final da fermentação, sendo necessários longos períodos de
maturação para que esse composto seja reduzido (BRÁNYIK et al., 2008). Apesar de uma menor produtividade em etanol, a fermentação contínua com células livres permite um melhor balanço dos compostos de aroma, em comparação ao processo utilizando células imobilizadas (PIRES, 2014a).
O tipo do reator utilizado também é relatado como uma parte fundamental para o projeto do processo fermentativo contínuo (AIBA, 1962). Reatores tubulares permitem a otimização do espaço da planta, uma melhor facilidade de higienização, além de alta produtividade e ótima conversão, realizadas simultaneamente (MOSER, 1988).
Contemplando o potencial inovador envolvido na aplicação da tecnologia de fermentação contínua para produção de cerveja, e considerando a escassez de estudos recentes publicados sobre o tema, sobretudo com aplicação de células livres, o presente trabalho teve como finalidade desenvolver um novo projeto de fermentação contínua do mosto cervejeiro, utilizando a diferença de densidade do produto ao longo do processo no seu projeto.
2. OBJETIVOS Objetivo geral
Desenvolver um sistema de fermentação contínua de cerveja em reator tubular, utilizando a diferença de densidade do mosto, e com células livres para obter cerveja com características semelhantes ao processo convencional por batelada.
Objetivos específicos
- Comparar os processos de fermentação contínua e descontínua; - Avaliar a qualidade do produto produzido;
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 UM BREVE HISTÓRICO DA CERVEJA
A história da fabricação da cerveja possui, pelo menos, 6 mil anos, tendo os primeiros registros de sua fabricação atribuídos aos povos que habitavam a região da antiga Mesopotâmia (KUNZE, 1999; ANDERSON, 2006; HORNSEY, 2003). Nessa época, os Sumérios faziam uma massa consistente com os grãos moídos que, após o cozimento, era consumida como pão. Essa massa, quando deixada ao tempo, umedecia e fermentava, tornando-se uma espécie de "pão líquido", uma bebida alcoólica por eles ingerida. Essa bebida guarda uma semelhança, ainda que distante, com a atual cerveja (BAMFORTH, 2009).
A cerca de 1.600 km da Mesopotâmia, outra civilização também é relatada como um dos berços da produção de cerveja na antiguidade. Uma grande quantidade de achados arqueológicos na região do antigo Egito evidencia a importância da cerveja para esse povo (HORNSEY, 2003). Os egípcios acreditavam que a cerveja foi inventada por Osíris, uma das suas divindades mais importantes, cujas principais associações eram com a fertilidade, a morte e a ressurreição. Nessa época, cada templo possuía uma cervejaria que produziam grandes quantidades de cerveja, ofertadas aos deuses (HORNSEY, 2003; DOLLINGER, 2000).
Em 332 a.C., os gregos, liderados por Alexandre, o Grande, assumiram o controle do Egito. A fabricação de cerveja continuou em ritmo acelerado, acarretando a necessidade de uma maior fiscalização do produto. Os fiscais chegaram, carregando títulos como “Inspetor das Cervejarias” e “Inspetor Chefe de Cerveja Real”. Após Cleópatra e seu amante Marco Antônio assumirem o controle do governo, o Egito tornou-se uma província romana e, com a expansão do império, a cerveja foi introduzida às diversas regiões onde os romanos se estabeleciam (HORNSEY, 2003).
No sul da atual Alemanha, os romanos encontraram os celtas e, no norte, encontraram os alemães, que haviam seguido os celtas para a Europa Ocidental, vindos da Ásia. Ao contrário dos romanos, essas tribos eram, em grande parte, analfabetas, mas eram bastante proficientes em fazer cerveja. Quando o Império Romano finalmente desmoronou com a abdicação do último imperador romano em
476, os romanos, alemães e celtas assimilaram-se nas em suas culturas, e a Europa Ocidental assumiu o catolicismo romano. Mosteiros foram então criados e se tornaram locais de aprendizado. Para sustentar-se e fornecer hospitalidade para viajantes cansados, os monges estabeleceram cervejarias (DORNBUSCH, 1998).
Instalados em comunidades maiores, os europeus começaram a construir cervejarias em uma escala que até então desconhecida. As cervejarias saíam das cozinhas para instalações construídas especificamente para este propósito, com instalações de malteação, áreas de fermentação e equipes de trabalhadores treinados. O sabor da cerveja advinha, geralmente, de uma mistura de ervas chamada gruit. No início dos anos 800, os monges do mosteiro de St. Gallen, na Suíça, haviam construído a primeira operação de fabricação de cerveja em larga escala na Europa, em muitos aspectos centenas de anos à frente de seu tempo. A planta da cervejaria, elaborada em 820, seria essencialmente reconhecida por qualquer cervejaria moderna (OLIVER, 2018).
No início dos anos 1100, Hildegard von Bingen estabeleceu o convento beneditino de Rupertsberg, perto da cidade de Bingen, no rio Reno. Mais tarde, conhecida como St. Hildegard, ela escreveu vários livros, incluindo o texto de história natural Physica Sacra. Nesta obra, ela descreveu o lúpulo como uma planta particularmente útil, que era excelente para a saúde física e preservava todo tipo de bebida. Nos anos 1100, grande parte da cerveja da Europa foi transformada pelo uso de lúpulo (BURNETT, 2005).
A Europa Central se transformou em uma central de produção de cerveja. Leis foram promulgadas para proteger o fornecimento de grãos e a pureza da cerveja: a Lei de Augsburg em 1158, a de Paris em 1268, e de Nuremberg em 1293. Estes decretos foram os precursores da famosa Reinheitsgebot de 1516, a “Lei da pureza da cerveja”. Mas foi apenas na revolução industrial, durante o século XVIII, que as cervejarias se tornaram grandiosas e sua produção começou a atingir níveis gigantescos (HORNSEY, 2003).
Em toda a Europa e nos Estados Unidos, as cervejarias construíram grandes impérios do comércio no final do século XIX. Embora a cerveja americana já tenha divergido de suas raízes europeias, usando uma proporção de arroz e milho para substituir o malte, foi o "nobre experimento" de 13 anos da Proibição, de 1920 a
1933, que mudou a cerveja americana nos 70 anos seguintes. Quando produção ressurgiu em 1933, as cervejarias americanas voltaram à vida. O comércio, a tecnologia e a publicidade convergiram para produzir a moderna cerveja americana de mercado de massa, um produto tecnicamente impressionante, com muito menos sabor do que seus ancestrais, porém, tomando seu lugar nas prateleiras (OLIVER, 2018).
No Brasil, há relatos que em 1640 o holandês Maurício de Nassau inaugurou a primeira cervejaria em Recife, porem foi em 1808, com a chegada da família real portuguesa, que o cenário se modificou. Logo ao chegar ao Brasil, o Rei Dom João decretou a abertura dos portos às nações amigas, que favoreceu quase que exclusivamente a Inglaterra, sendo a cerveja britânica a cerveja mais consumida no Brasil. A partir da segunda metade do século, por influência da imigração, a preferência passou a ser pela cerveja alemã(COUTINHO, 2017).
Atualmente a cerveja possui representatividade global de aproximadamente 11% no mercado de bebidas, aparecendo como a quarta bebida mais consumida no mundo (desconsiderando a água), perdendo apenas para chá (20,9%), leite (12,8%) e refrigerante (12,5%) (NEVES; TROMBIN, 2011). Com produção global estimada em 192,71 bilhões de litros, registra um aumento anual consecutivo desde 1985. O Brasil, apesar de não figurar entre os países com maior consumo per capta, apresenta a terceira maior produção mundial, com aproximadamente 13 bilhões de litros por ano, ficando atrás apenas da China e dos Estados Unidos (KIRIN HOLDINGS, 2015).
3.2 A PRODUÇÃO DE CERVEJA
O processo de fabricação de cerveja envolve basicamente quatro ingredientes: água, malte, lúpulo e levedura (BRIGGS et al., 2004; LEWIS; BAMFORTH, 2006). Existem muitas variações do processo de fabricação, dependendo do tipo específico de cerveja que se deseja obter (KUNZE, 1999), no entanto, todos os processos consistem primordialmente nas seguintes etapas: produção de mosto (extração e hidrólise dos componentes de malte e possivelmente outros cereais, seguida de separação de componentes não solúveis); fervura (adição de lúpulo ou extratos de lúpulo); fermentação (na maioria dos casos dividida em
fermentação primária ou principal, e maturação) (LINKO et al., 1998). A Figura 1 ilustra de forma geral as etapas do processo de cerveja.
Figura 1. Fluxograma geral do processo de fabricação de cerveja (os fluxos de entrada são indicados no lado esquerdo e os fluxos de saída do lado direito).
Fonte: Adaptado de Willaert (2007).
3.2.1 Ingredientes
3.2.1.1 Água
A água é a principal matéria-prima utilizada na produção de cerveja, não apenas como componente, mas também no processo de higienização da planta. Assim, a qualidade da água determinará a qualidade final da cerveja (PALMER; KAMINSKI, 2013). A água cervejeira deve ser potável, pura e livre de patógenos,
parâmetros que devem ser determinados por análises químicas e microbianas (BRASIL, 1997). A maior parte da água destinada para produção de cerveja deve ser previamente ajustada, com objetivo de se obter um melhor equilíbrio dos compostos presentes nesta matéria prima (KUNZE, 1999). Dentre eles, o sulfato é capaz de proporcionar à cerveja um caráter um pouco mais seco, porém favorece a ação do lúpulo. Já a presença de teores de ferro e manganês, se superior a 0,2 mg/L, resulta em cor e sabor desagradáveis no produto final. Enquanto o cálcio protege a α-amilase da inativação precoce durante a mostura, o zinco estimula o crescimento e a fermentação da levedura, processos que são inibidos pelos nitratos (PIRES, 2014a).
3.2.1.2 Malte
Depois da água, a cevada maltada é o ingrediente usado em maior quantidade (PIRES, 2014b). O malte é o produto obtido através da etapa de malteação, que consiste na germinação do grão de cevada (ou outros grãos, como, trigo, sorgo, aveia) sob condições controladas de temperatura e umidade (BRIGGS et al., 2004). A malteação altera a estrutura física e química da cevada, fazendo do malte um produto facilmente moído, fonte de enzimas capazes de decompor os polímeros (amidos e proteínas) presentes no próprio malte (LEWIS; YOUNG, 2001).
Fontes alternativas de amido usadas como adjuntos são de grande interesse industrial por sua disponibilidade, lucratividade e sua contribuição especial de cor e aroma. Os adjuntos mais usados são o arroz ou o milho, não maltado. Muitas vezes ingredientes como maltose, sacarose, glicose e xaropes correspondentes também são empregados (BAMFORTH, 2009). Cada país regula a quantidade máxima de adjuntos usados em suas cervejas, sendo que no Brasil os cereais não maltados podem corresponder, no máximo, a 45% do extrato primitivo (BRASIL, 2001).
3.2.1.3 Lúpulo
O lúpulo é classificado botanicamente como Humulus lupulus. Apenas as flores, ou cones, das plantas femininas são de interesse para produção de cerveja. Seu valor vem das resinas e óleos essenciais encontrados nas glândulas de lupulina (NEVE, 1991). Como existem diferentes variedades desta planta espalhadas pelo
mundo, é normal que a qualidade das flores também varie. Assim, algumas variedades são classificadas conforme suas características em: “variedades de aromas/sabores” enquanto outras como “variedades de amargor”. O teor de α-ácidos é responsável pela intensidade de amargor de uma determinada variedade, enquanto o aroma está relacionado com os óleos essenciais dessas flores. Assim, o lúpulo de aroma tem menor teor de α-ácido, mas maior teor de óleos essenciais. O lúpulo de amargor, por outro lado, tem maiores teores de α-ácido, mas não possui quantidades expressivas de óleos essenciais. Atualmente, as cervejarias raramente usam cones, mas pellets e/ou extrato de lúpulo (HIERONYMUS, 2012).
3.2.1.4 Levedura
Leveduras são fungos unicelulares e, em termos econômicos, o grupo mais importante de micro-organismo empregado industrialmente (KURTZMAN et al., 2011). O gênero Saccharomyces foi primeiramente descrito por MEYEN (1838) quando ele caracterizou a levedura Saccharomyces cerevisiae a partir das observações de seus ascósporos e sua germinação. Sua nomenclatura é derivada das palavras gregas sákcharon (açúcar) e mykes (fungo). O número de espécies de
Saccharomyces mudou ao longo dos anos de acordo com os critérios usados para
delimitar espécies (KURTZMAN, 2011).
As células de levedura exibem grande diversidade em relação ao tamanho e forma. Mesmo células individuais de uma linhagem pura de uma única espécie podem exibir heterogeneidade morfológica. Além disso, alterações profundas na morfologia celular individual são induzidas pela alteração das condições físicas ou químicas no crescimento (KURTZMAN et al., 2011). O tamanho das células de levedura varia muito - algumas leveduras podem ter apenas 2-3 μm de comprimento, enquanto outras espécies podem atingir comprimentos de 20 a 50 μm. Sob um microscópio, as células de Saccharomyces cerevisiae aparecem como estruturas ovóides ou elipsoidais, circundadas por uma parede celular bastante espessa. Valores médios para o maior diâmetro variam entre 5 e 10 μm e para o menor diâmetro entre 1 e 7 μm (FELDMANN, 2012).
Para manter seu metabolismo ativo, a estrutura celular de uma levedura conta com organelas de fundamental importância dispersas no citoplasma. O núcleo conserva e transmite a informação genética na reprodução das leveduras. Os
ribossomos sintetizam e decodificam as proteínas. O complexo de Golgi regula e concentra as proteínas a serem secretadas pela célula. Os vacúolos e lisossomos atuam no processo de digestão intracelular através da ação de enzimas hidrolíticas. Os retículos endoplasmáticos, liso e rugoso, atuam na síntese de lipídios e transporte de proteínas. As mitocôndrias são responsáveis pela respiração celular (VAN DER KLEI et al., 2011). A Figura 2 representa o esquema celular de
Saccharomyces cerevisiae, indicando alguns de seus principais componentes e
organelas.
Figura 2. Representação celular de Saccharomyces cerevisiae. Fonte: Stewart, (2017).
Na produção de cerveja a levedura desempenha um papel de protagonista, responsável pelo processo de fermentação, não apenas convertendo o açúcar fermentescível do mosto em etanol e dióxido de carbono, mas também produzindo uma variedade de compostos voláteis que contribuem para o sabor da cerveja (WHITE; ZAINASHEFF, 2010). Duas espécies do gênero Saccharomyces são consideradas importantes para a fermentação, dependendo do tipo de processo usado pela cervejaria, as leveduras lagers e as ales (REED; NAGODAWITHANA, 1991). Estas espécies diferem entre si pelas características morfológicas, propriedades de floculação, capacidade de atenuação do mosto, compostos secundários formados, porém, a principal diferença entre elas é a temperatura na
qual fermentam açúcares no mosto. As leveduras ales atuam em uma temperatura ótima de 16 a 20 ºC, enquanto as lagers de 8 a 14 ºC (FIX, 1999).
A maioria das cervejas produzidas em larga escala é produzida por cepas da levedura do tipo lager (REED; NAGODAWITHANA, 1991), conhecidas como leveduras “de fermentação de fundo” ou ”leveduras de baixa fermentação”, devido à sua tendência de se concentrar no fundo de fermentadores abertos (PIRES, 2014a). A nomenclatura da espécie evoluiu, passando por iterações de S. carlsbergensis e
S. cerevisiae para o nome atualmente aceito S. pastorianus (STEWART, 2017). Além de sua propensão de atividade em temperaturas mais baixas (8 – 14 ºC), a S.
pastorianus também tem a capacidade de metabolizar a melibiose e a rafinose, dois
açúcares complexos, os quais as leveduras ales não são capazes de metabolizar (FIX, 1999).
As cervejas ale são produzidas por cepas de Saccharomyces cerevisiae. Essas leveduras são conhecidas como leveduras “de fermentação de topo” ou “leveduras de alta fermentação”, pois em fermentadores abertos tradicionais elas sobem à superfície, facilitando sua coleta. No entanto, a pressão hidrostática de fermentadores cilíndricos modernos tende a superar essa tendência, também levando a levedura ao fundo, a qual pode ser coletada no cone do tanque (PIRES, 2014a).
3.2.2 Produção do mosto cervejeiro
3.2.2.1 Moagem
Antes da mostura, o malte deve ser moído, para expor o endosperma, que contém a maior concentração de carboidratos do grão, facilitando a extração dos açúcares durante a etapa de mostura (KUNZE, 1999). Nesta etapa alguns cuidados devem ser tomados para garantir que as reservas de amido sejam suficientemente moídas, sem danificar em demasia a casca, que por possuir propriedades filtrantes, deve ser mantida, facilitando a etapa de separação do mosto (EATON, 2006). Os grãos são tipicamente moídos a seco com moinhos de rolos ou moinhos de martelos, sendo que este último produz uma mistura muito fina e são frequentemente usados com filtros no processo de separação, não necessitando assim da presença da casca íntegra (BRIGGS et al., 2004).
3.2.2.2 Mosturação
O grão de malte possui muitas substâncias insolúveis (principalmente amido), o principal objetivo da etapa de mosturação é converter o material insolúvel do grão em material solúvel, produzindo a maior quantidade de extrato (mosto) possível, por meio da ação enzimática (KUNZE, 1999). A mostura começa com a adição de água ao grão de malte moído, esta hidratação permite que as enzimas do malte se tornem ativas (FIX, 1999). Com o aquecimento da mistura os açúcares presentes no grão são solubilizados pela ação das enzimas, obtendo-se ao final do processo o mosto cervejeiro. Ao manipular o perfil de temperatura do processo é possível influenciar a composição e a eficiência com que o os açúcares são extraídos (WILLAERT, 2007). O mosto obtido a partir do malte de cevada contém açúcares fermentáveis, como maltose, maltotriose, sacarose e hexoses além de dextrinas, que normalmente não podem ser utilizadas pelas leveduras cervejeiras. A concentração desses açúcares no mosto influenciará a concentração de álcool, corpo e o aroma final da cerveja. (KUNZ, 1999).
O amido é degradado nesta etapa principalmente pela ação das enzimas α e β-amilase (WILLAERT, 2007). A primeira fase da degradação do amido requer que a molécula sofra o processo de gelatinização (EATON, 2006; BRIGGS et al., 2004; KUNZE, 1999). Em solução aquosa aquecida, uma maior quantidade de água é incorporada nas moléculas de amido, isto resulta num aumento do volume, o que faz com que os grânulos de amido se rompam, formando uma solução viscosa. Como o amido gelatinizado perde parte de sua estrutura granular estável, pode ser atacada facilmente por enzimas contidas na solução, a temperatura de gelatinização do amido de cevada é de aproximadamente a 60 ºC (KUNZE, 1999). As cadeias longas de amido (amilose e amilopectina), compostas de glicose, são quebradas muito rapidamente em cadeias menores pela ação α-amilase, o que provoca uma redução muito rápida da viscosidade do mosto gelatinizado (liquefação) (KUNZE, 1999).
A degradação completa do amido pelas amilases é chamada sacarificação. A α-amilase rompe progressivamente as cadeias de amilose e amilopectina para formar dextrinas contendo 7 a 12 resíduos de glicose. Enquanto a β-amilase quebra essas cadeias maiores em moléculas de maltose (EATON, 2006).
Devido aos diferentes comprimentos das cadeias, outros açúcares, como a glicose e a maltotriose, também são produzidos (FIX, 1999). Em todos os casos, a decomposição é interrompida 2 a 3 resíduos de glicose distantes das ligações 1,6 da amilopectina, porque nem a α-amilase nem a β-amilase podem romper essas ligações 1,6, desta forma, essas dextrinas limites estão sempre presentes no mosto normal. A α-amilase tem maior atividade entre 72 a 75 ºC e pH entre 5,6 a 5,8, já a β-amilase possuem maior atividade em temperaturas entre 60 a 65 ºC e entre pH 5,4 a 5,5 (KUNZE, 1999; BRIGGS et al., 2004).
Além das às amilases outras enzimas exercem papel importante durante a etapa de mosturação, agindo sobre outros carboidratos e proteínas (FIX, 1999). As endo-glucanases, e endo-xilanases são responsáveis pela degradação de β-glucano e hemiceluloses respectivamente (COOTE; KIRSOP, 1976; CACH; ANNEMU, 1995, HAN; SCHWARZ, 1996; STEWART; RUSSELL, 1993). Uma degradação insuficiente de moléculas de alto peso como β-glucanos, resulta em alta viscosidade e pode causar problemas durante a filtração do mosto e da cerveja (MEILGAARD, 1976). Uma degradação insuficiente de hemicelulose pode resultar em problemas de filtração e turvação (COOTE; KIRSOP, 1976). A degradação enzimática das proteínas ocorre predominantemente por proteases a 45 – 55 ºC. É necessário fornecer aminoácidos suficientes para o crescimento e o metabolismo da levedura. A concentração de nitrogênio deve ser de pelo menos 20 mg/100 mL de mosto (KUNZE 1999). Mostos de maltes normalmente modificados sempre contêm aminoácidos suficientes (STEWART; RUSSELL, 1993).
3.2.2.3 Fervura
Após a separação dos sólidos residuais (Beer spend grains - BSG), o líquido açucarado quente (mosto) é fervido com lúpulo. Algumas receitas também usam outros os tipos de "tempero" para o mosto nesta etapa. A ebulição demora normalmente de 60 a 120 min e tem por consequência: a concentração do mosto; a inativação das enzimas; a acidificação do mosto; favorecimento das reações de escurecimento como Maillard e caramelização; a transferência de compostos amargos do lúpulo para o mosto; a esterilização e também eliminação de voláteis indesejados como dimetilsulfureto (DMS) (WILLAERT, 2007).
3.2.2.4 Fermentação
O processo de fermentação ocorre como uma via alternativa de degradação da glicose, quando a respiração celular normal, que usa oxigênio (aeróbica) não é possível, isto é, quando o oxigênio não está disponível para atuar como receptor no final do transporte de elétrons. Em leveduras, o processo fermentativo produz álcool e CO2 em grandes quantidades, enquanto nos músculos, por exemplo, produzem ácido láctico (FELDMANN, 2012). As vias aeróbias e anaeróbias de respiração celular estão representadas na Figura 3.
Figura 3. Vias aeróbias e anaeróbias de respiração celular. Fonte: Feldmann, (2012).
O objetivo da fermentação da cerveja é utilizar a capacidade das células de levedura para converter açúcar em etanol e dióxido de carbono como os principais produtos do metabolismo (BRIGGS et al., 2004). A equação (1) representa a estequiometria desta reação.
Eq. 1.
A levedura também produz uma série de metabólitos menores, como ésteres, álcoois superiores e ácidos que contribuem positivamente para o sabor. É essa infinidade de componentes secundários que caracterizam a cerveja
(BOULTON; QUAIN, 2001). A levedura escolhida deve também controlar a eliminação de componentes indesejáveis de sabor provenientes da matéria-prima ou da própria fermentação. Grande parte dessa melhoria de sabor ocorre durante a maturação (PIRES, 2014a; BOULTON; QUAIN, 2001; BRIGGS et al., 2004; KUNZE, 1999). O progresso da fermentação é geralmente monitorado medindo a gravidade específica (BRIGGS et al., 2004). Perfis típicos de fermentação para produção de
ale e lager são mostrados na Figura 4.
Figura 4. Curso de tempo de fermentação para cervejas ale (a) e lager (b). fa, nível de álcoois superiores (μg/L); e, nível de ésteres (μg/L) t, temperatura (ºC); SG, gravidade específica (g/cm³); pH.
O declínio na gravidade específica é acompanhado pelo crescimento da levedura, uma vez que os açúcares são usados e o etanol é produzido. O pH decresce à medida que os íons de amônia e aminoácidos são consumidos e a levedura secreta ácidos orgânicos. A maioria dos compostos aromatizantes também é secretada de acordo com o crescimento das leveduras. A concentração de compostos de sabor pode diminuir até o final da fermentação e durante o armazenamento, este declínio surge quando alguns voláteis são arrastados com o dióxido de carbono ou absorvidos e metabolizados pela levedura. A fermentação primária em fermentadores tradicionais leva cerca de 4 dias a 20 ºC e 10 dias a 12 ºC (LEWIS E YOUNG, 2002).
Souza (2016) divide simplificadamente a fermentação alcoólica em três etapas, que podem ser correlacionadas com as fases da curva de crescimento celular (Figura 5).
Figura 5. Fase de crescimento microbiano. Fonte: Souza, (2016).
Segundo o autor, as fases de crescimento podem ser classificadas como: 1. Etapa de adaptação (fase de adaptação) - Caracteriza-se pela multiplicação
celular intensa, e pequeno desprendimento de CO2.
2. Etapa tumultuosa (fase exponencial) - As principais características dessa etapa são a intensa produção de álcool e desprendimento de CO2; aumento da temperatura e incremento da acidez do mosto.
3. Etapa complementar ou pós-fermentação (fase estacionária e/ou de morte celular) - Ocorre a diminuição do desprendimento de CO2 devido à menor agitação do liquido, diminuição da temperatura do meio e diminuição da atividade de fermentação da levedura pelo esgotamento de açúcares e acúmulo de subprodutos do processo.
3.3 ASPECTOS BIOQUÍMICOS DA FERMENTAÇÃO 3.3.1 Metabolização dos carboidratos
Os carboidratos dispersos representam 90-92% dos sólidos solúveis no mosto (MACWILLIAM, 1968). Os três principais açúcares fermentáveis presente no mosto são a glicose, maltose e maltotriose, sendo a maltose o mais abundante desses açúcares, geralmente representando 50 a 70% dos açúcares fermentáveis totais em um mosto de malte de cevada (MACWILLIAM, 1968).
As cepas de leveduras utilizadas na fabricação de cerveja consomem os açúcares do mosto em uma sequência específica: primeiramente a glicose é consumida, seguida da frutose, maltose e, finalmente, maltotriose. A absorção e o consumo de maltose e maltotriose são reprimidos ou inativados em concentrações elevadas de glicose (BOULTON; QUAIN, 2001). Somente quando 60% da glicose do mosto forem metabolizadas pela levedura, se iniciará o consumo da maltose (MACWILLIAM, 1968).
A eficiência das leveduras para efetuar a fermentação alcoólica depende da sua capacidade de utilizar os açúcares presentes no mosto. Esta habilidade determina em grande parte a taxa de fermentação, bem como a qualidade final da cerveja produzida. A fim de otimizar a eficiência da fermentação primária, é necessário um conhecimento da cinética do consumo de açúcar (WILLAERT, 2007). Os padrões de absorção de açúcares durante uma fermentação ale de densidade inicial de aproximadamente 1,040 g/cm3 são mostrados na Figura 6.
Figura 6. Utilização de açúcares durante a fermentação de um mosto de cerveja de densidade original 1.040 g/cm³.
Fonte: Boulton e Quain (2001).
A levedura S. cerevisiae transporta os monossacarídeos através da membrana celular usando transportadores de hexose. Segundo KRUCKEBERG e DICKINSON, (2004) existem 20 genes que codificam transportadores de hexose. O dissacarídeo maltose e o trissacarídeo maltotriose são transportados por transportadores específicos para o citoplasma, onde essas moléculas são
hidrolisadas pela α-glicosidase, produzindo duas ou três moléculas de glicose, respectivamente.
A utilização de maltose na levedura é conferida por qualquer um dos cinco locus MAL: MAL1 a MAL4 e MAL6 (KRUCKEBERG; DICKINSON, 2004). Cada
locus consiste de três genes: o gene 1 codifica um transportador de maltose
(permease), o gene 2 codifica uma maltase (α-glicosidase) e o gene 3 codifica um ativador transcricional dos outros dois genes (MICHELS et al., 1992).
A maltotriose presente no mosto tem a menor prioridade de absorção pelas células de levedura (STEWAR; RUSSELL 1993). A absorção de maltotriose a partir do mosto é sempre mais lenta com cepas de ale do que com cepas lager sob semelhantes condições de fermentação. No entanto, as taxas iniciais de transporte são similares às da maltose em várias variedades de ale e lager. A pressão osmótica elevada inibe o transporte e a captação de glicose, maltose e maltotriose, sendo a maltose e a maltotriose mais sensíveis à pressão osmótica do que a glicose tanto na cepa lager quanto na ale. O etanol (5% p/v) estimula o transporte de maltose e maltotriose, devido provavelmente a uma mudança induzida pelo etanol na configuração da membrana plasmática, mas não teve efeito sobre o transporte de glicose. Concentrações mais altas de etanol inibem o transporte dos três açúcares (WILLAERT, 2007).
Antes do início do processo de fermentação, o mosto é incorporado com oxigênio, como resultado da etapa de aeração, os carboidratos são degradados aerobicamente durante as primeiras horas do processo de fermentação. O catabolismo do carboidrato aeróbico geralmente leva 12 h para uma fermentação
lager (LEWIS; YOUNG, 2002).
Durante as primeiras horas do processo de fermentação, a degradação oxidativa dos carboidratos ocorre através do ciclo da glicólise e do Krebs (TCA). A eficiência energética da oxidação da glicose é derivada do grande número de NADH2 produzido para cada mol de glicose oxidada a CO2. A fermentação real do mosto produz álcool e dióxido de carbono através da via glicolítica de Embden – Meyerhof – Parnas. A via redutora do piruvato para o etanol é importante porque regenera o NAD+. A energia é obtida somente a partir das etapas de produção de ATP pela via Embden – Meyerhof – Parnas. Durante a fermentação, a atividade do
ciclo de TCA é bastante reduzida, embora ainda sirva como fonte de intermediários para a biossíntese (WILLAERT, 2007). As principais vias utilizadas pela levedura para a dissimilação da glicose são mostradas na Figura 7.
Figura 7. As principais vias utilizadas pela levedura para a dissimilação da glicose. Fonte: Boulton e Quain, (2001).
3.3.2 Formação de compostos de sabor
Durante o processo de fermentação da cerveja uma infinidade de compostos secundários é produzida. Estes compostos são responsáveis pela caracterização sensorial da cerveja, sendo sua formação dependente da matéria-prima empregada e principalmente da levedura escolhida. (BOULTON; QUAIN 2001). A inter-relação entre o metabolismo das leveduras e a produção de subprodutos de sabor é ilustrada na Figura 8.
Figura 8. Compostos de aroma formados durante a fermentação. Fonte: Hammond, (1993).
3.3.2.1 Álcoois superiores
Mais de 35 álcoois superiores já foram descritos resultantes da fermentação do mosto cervejeiro. Os compostos mais importantes podem ser classificados em alifáticos (n-propanol, isobutanol, 2-metilbutanol ou álcool amílico ativo) e 3-metilbutanol (álcool isoamílico) e aromáticos (2-feniletanol, tirosol, triptofol). Os álcoois superiores alifáticos contribuem para o aroma alcoólico ou solvente da cerveja e produzem uma sensação de ardência. O álcool aromático 2-feniletanol tem um aroma doce e tem uma contribuição positiva para o aroma da cerveja, enquanto que os aromas do tirosol e do triptofol são indesejáveis (WILLAERT, 2007).
Álcoois superiores são sintetizados durante a fermentação através da via catabólica e metabolismo de aminoácidos, envolvendo a descarboxilação de cetoácidos, formando aldeídos, os quais sofrem posterior redução para formar os referidos álcoois (HAMMOND, 1993).
Diferentes são as condições que promovem o crescimento da célula de levedura, tais como altos níveis de nutrientes (aminoácidos, oxigênio, lipídios, zinco),
aumento da temperatura e agitação, estimulam a produção de álcoois superiores. Por outro lado, as condições que restringem o crescimento das leveduras, como temperatura mais baixa, reduzem a produção de álcool (LANDAUD et al., 2001). Os principais álcoois superiores comumente presentes na cerveja estão listados na Tabela 1.
Tabela 1. Principais álcoois superiores comumente presentes em cerveja.
Composto Limiar de
detecção (mg/L) Aroma ou sabor
Variação concentração em lager (mg/L) Variação concentração em ale (mg/L) n-propanol 600; 800 Álcool 7-19 20-45 Isobutanol 100; 80-100; 200 Álcool 4-20 10-24 2-metilbutano 50; 50-60; 70 Álcool 9-25 80-140 3-metilbutanol 50; 50-60; 65 Solvente, picante. 25-75 80-140 2-feniletanol 5; 40; 45-50; 75; 125 Rosas, adocicado 11-51; 4-22; 16-42 35-50 tirosol 10; 10-20; 20; 100; 200 Amargor químico 6-9; 6-15 8-25; 18-45 tripofano 10; 10-20; 200 Amêndoa, solvente 0,5-15 8-12 Fonte: Willaert, (2007). 3.3.2.2 Ésteres
Um dos compostos mais importantes na composição do buquê de aroma da cerveja, os ésteres são componentes desejáveis na cerveja quando presentes em quantidades adequadas, tornando-se desagradáveis quando em excesso. A formação de ésteres é altamente dependente da cepa de levedura utilizada e de certos parâmetros de fermentação, como a temperatura, taxa de crescimento, concentrações de compostos nitrogenados assimiláveis, fontes de carbono, oxigênio dissolvidos e ácidos graxos (KUNZE, 1999). A fermentação de mosto de alta densidade também pode resultar em uma síntese desproporcional de ésteres, particularmente acetato de etila e isoamílico (ANDERSON E KIRSOP, 1974; CASEY et al., 1985).
Os ésteres são sintetizados por levedura tanto durante a fase de crescimento como também durante a fase estacionária (WILLAERT, (2007). São extensamente produzidos no meio intracelular como resultado da condensação de
CoA de ácidos graxos e um álcool. Uma vez formado, tornando-se lipossolúvel, passa por difusão para o meio extracelular (cerveja fermentada), sendo a reação catalisada por uma álcool-aciltranferase (HAMMOND, 1993). Como o acetil CoA que também é uma molécula central na síntese de lipídios e esteróis, a síntese de ésteres está diretamente ligada ao metabolismo dos ácidos graxos (CASEY et al., 1985).
Na Tabela 2 estão listados os principais ésteres encontrados após a fermentação primária da cerveja.
Tabela 2. Principais ésteres encontrados na fermentação primária da cerveja.
Composto Limiar de
detecção (mg/L) Aroma
Concentração (mg/L) em 48
lagers
Acetato de etila 20-30 Fruta, solvente 8-32
Acetato de isoamila 0,6-1,2 Banana, pera 0,3-3,8
Hexanoato de etila 0,17-0,21 Maçã, Anis 0,05-0,3
Octanoato de etila 0,3-0,9 Maçã 0,04-0,53
Acetato de fenetila 3,8 Rosas, mel, maçã, doces 0,10-0,73
Fonte: Willaert, (2007).
3.3.2.3 Ácidos orgânicos
Ácidos orgânicos são sintetizados via biossíntese de aminoácidos e metabolismo de carboidratos. Em particular, eles são produtos do ciclo incompleto de Krebs durante a fermentação da cerveja. A excreção de ácidos orgânicos é influenciada pela tensão da levedura e pelo vigor da fermentação (WILLAERT, 2007).
Importantes ácidos orgânicos detectados na cerveja incluem acetato, lactato, succinato, piroglutamato, malato, citrato, um cetoglutarato e α-hidroxiglutarato). Estes ácidos influenciam diretamente a qualidade da cerveja quando presentes acima do limiar de sabor e por sua influência na acidez da cerveja. Esses componentes têm origem em matérias-primas (malte, lúpulo) e são produzidos durante a fermentação da cerveja (COOTE E KIRSOP, 1974)
3.3.2.4 Dicetonas vicinais
As dicetonas vicinais são cetonas com dois grupos carbonila vizinhos. São produzidos como subprodutos das vias de síntese de isoleucina, leucina e valina, estando diretamente ligados ao metabolismo de aminoácidos e a síntese de álcoois superiores. Estes compostos conferem um aroma amanteigado ao produto, os mais importantes na cerveja são: diacetil (2,3-butanodiona) e 2,3-pentanodiona, sendo o primeiro quantitativamente mais importante que a 2,3-pentanodiona por ser mais facilmente detectado (KROGERUS E GIBSON, 2013). Um esquema da produção de dicetonas é representado na Figura 9.
Figura 9. A síntese e redução de dicetonas vicinais em S. cerevisiae. Fonte: Willaert, (2007).
As células de levedura possuem as enzimas necessárias (álcool desidrogenase, diacetil redutases) para reduzir o diacetil a acetoína e posteriormente para 2,3-butanodiol, e 2,3-pentanodiona para 2,3-pentanodiol (HARDWICK et al.,1976). Esses compostos reduzidos têm um limiar de sabor muito mais alto e não têm impacto sobre o sabor da cerveja (LU et al., 2012). A redução ocorre no final da fermentação primária e durante a maturação.
Willaert (2007) lista algumas estratégias que podem reduzir a quantidade de dicetonas vicinais durante a fermentação:
1. Como a temperatura tem um efeito positivo na eficiência de redução dos ácidos α-aceto-hidroxi, um período de repouso a temperaturas mais elevadas no final da fermentação principal e maturação podem ser aplicados. Neste caso, a temperatura deve ser bem controlada para evitar a autólise da levedura;
2. Como a remoção rápida de dicetonas vicinais requer células de levedura em uma condição metabólica ativa, a adição de 5-10% de
Krausen (contendo levedura ativa) é um procedimento que dá maior
transformação das dicetonas vicinais. Este procedimento pode levar à superprodução de sulfeto de hidrogênio, dependendo das proporções de treonina e metionina transportadas da fermentação primária.
3. Adição da enzima α-acetolactato descarboxilase, esta enzima descarboxila o α-acetolactato diretamente na acetoína. Apesar de não estar presente em S. cerevisiae, foi isolada de várias bactérias tais como
Enterobacter aerogenes, Aerobacter aerogenes, Streptococcos lactis, Lactobacillus casei, Acetobacter aceti e Acetobacter pasteurianus.
Segundo Godtfredsen e colaboradores (1984), foi demonstrado que a adição de a-acetolactato descarboxilase de Lactobacillus casei pode reduzir o tempo de maturação para 22 h.
3.3.2.5 Aldeídos
Os aldeídos exercem um importante impacto no sabor da cerveja, especialmente o acetaldeído (sabor de maçã verde). Sua síntese está ligada ao crescimento das leveduras, com máxima concentração na fase exponencial, sendo atenuada no final da fermentação primária e durante a maturação pela própria levedura. Tal como acontece com o diacetil, os níveis podem ser aumentados se o metabolismo da levedura for estimulado, especialmente pela incorporação de oxigênio. A remoção também requer a presença de levedura ativa suficiente. (KUNZE, 1999).
3.4 FERMENTAÇÃO CONTÍNUA PARA PRUDUÇÃO DE CERVEJA
Na maioria das cervejarias a fermentação primária (principal) e secundária (maturação) são realizadas em tanques cilíndricos (cylindroconical tanks – CCT). O
conceito de usar esse modelo de tanque para fermentação de cerveja é bastante antigo, Leopold Nathan patenteou os sistemas CCT para fermentação de cerveja em 1908. Somente a partir de 1960, no entanto, que eles foram usados extensivamente pela indústria. Esses tanques possuem uma série de características desejáveis: ocupam uma pequena área da planta; podem ser usados para todos os tipos de cerveja; são de fácil remoção da levedura; possuem higienização facilitada; refrigeração eficiente e automação simplificada, usando sistema CIP - Clean in Place (MAULE, 1986). Entretanto, a grande desvantagem desse processo é o elevado tempo de fermentação requerido, que faz com que as indústrias busquem novas alternativas que permitam maior rendimento fermentativo (PIRES et al., 2015).
A fermentação contínua apresenta uma abordagem alternativa ao processo em batelada (PIRES et al., 2015). Nesse processo de fermentação, um único tanque (ou grupo de tanques ligados) produz uma corrente de cerveja continuamente, proporcionando uma alta produtividade devido à redução tempo de inatividade da linha e aos custos associados ao envase, esgotamento e higienização do equipamento (BOULTON; QUAIN, 2001). As perdas associadas a esse processo são consideradas baixas, já que as condições são organizadas de tal forma que as taxas de fermentação são rápidas, aumentando o volume de produção. Quando totalmente operacional com uma taxa de fluxo constante, o grau de qualidade da cerveja tende a ser melhor do que o obtido com fermentação em bateladas, uma vez que a variabilidade devido à inconsistência na condição fisiológica de lotes de levedura inicialmente inoculada é eliminada (BOULTON E QUAIN, 2001).
As operações industriais com culturas microbianas podem ser classificadas como um sistema "fechado" ou "aberto". No sistema fechado, algum componente que tem uma influência positiva ou negativa no crescimento, está contido no sistema, um exemplo de um componente crítico seria um nutriente essencial ou um metabólito inibidor do crescimento. A taxa de crescimento tenderá sempre a zero quando o nutriente essencial se esgotar ou a concentração de um metabolito aumentar para um nível tóxico. Em contraste, as fermentações contínuas são sistemas abertos nos quais, por definição, os componentes podem entrar ou sair livremente. Consequentemente, é possível pela reposição contínua de nutrientes, e remoção de metabólitos potencialmente tóxicos, produzir condições em que a taxa
de crescimento microbiano e a taxa de produção de metabólitos seja constantemente eliminada (BOULTON; QUAIN, 2001).
A proposta contínua de fermentação para cerveja não é um conceito novo, Kleber (1987) descreve o sistema o Van Rijn, que foi patenteado em 1906. Da mesma forma, Ricketts (1971) referiu-se a sistemas contínuos de fermentação de cerveja que datam do final do século XIX. No entanto, o período de maior interesse nesta abordagem foi a partir de 1960 com o desenvolvimento de vários sistemas interessantes: (1) Tanque com agitação versus reatores de tanque não agitados; (2) Sistemas de tanque único versus vários tanques conectados em série e (3) Sistemas que permitem que a levedura flutue livremente (sistema aberto) versus sistemas de concentração de leveduras (sistema fechado ou semifechado) (HARPER et al., 1980; COUTTS, 1957; BISHOP, 1970).
Os processos contínuos de fermentação de cerveja não foram comercialmente bem-sucedidos devido a muitos problemas práticos, como o aumento do risco de contaminação (não apenas durante a fermentação, mas também durante o armazenamento de mosto em tanques suplementares, que são necessários), mudanças no sabor da cerveja e uma má compreensão da cinética da fermentação da cerveja em condições contínuas (BOULTON; QUAIN, 2001). Uma exceção bem conhecida é a implementação de um processo contínuo de produção de cerveja na Nova Zelândia por Morton Coutts (Dominion Breweries), que ainda está em uso nos dias atuais. O processo consiste no fluxo de mosto lupulado através de uma série de tanques por um período de 40 a 120 h. Após a produção do etanol, a cerveja é então transferida para os tanques de maturação onde permanecem por 2 dias antes de serem armazenadas sob refrigeração para facilitar a precipitação da levedura, que é removida em seguida (DB BREWERIES, 2017). Um esquema desse processo está esquematizado na Figura 10.
Figura 10. Esquema do processo de fermentação contínua da cervejaria de Auckland. Fonte: DB Breweries, (2017).
Em 1970, ocorreu um incremento no desenvolvimento de sistemas contínuos de fermentação de cerveja devido ao progresso na pesquisa sobre bioprocessamentos com imobilização de células vivas. Narziss e Hellich (1972) desenvolveram um dos primeiros processos bem descritos para a produção de cerveja, as células de levedura foram imobilizadas em kieselguhr (que é amplamente utilizado na indústria de fabricação de cerveja como um auxiliar de filtração), e um filtro de kieselguhr foi empregado como biorreator (chamado bio-brew biorreator). Este processo foi caracterizado por um tempo de residência muito baixo de 2,5 h, mas exigiu a adição de levedura viável e um período de maturação de 7 dias para reduzir a alta concentração de dicetonas vicinais na cerveja. Embora este resultado pareça muito bom, o bio-brew biorreator, em geral, não deu resultados satisfatórios. O problema mais grave foi a grande quantidade de α-acetolactato na cerveja.
Baker e Kirsop (1973) utilizaram o tratamento térmico de cerveja para acelerar consideravelmente a conversão química de α-acetolactato para diacetil, criando um processo contínuo em duas etapas. O primeiro reator é um reator de leito contendo também kieselguhr com células de levedura imobilizadas para realizar a fermentação primária. A cerveja “verde” foi aquecida usando uma bobina de aquecimento para acelerar a conversão α-acetolactato, sendo resfriado antes de entrar no reator de leito encamisado para realizar a fermentação secundária. Os
problemas associados a este processo incluíram um bloqueio gradual do leito encamisado e um sabor de cerveja alterado.
Pires e colaboradores (2014b), avaliaram um sistema de reator contínuo utilizando células imobilizadas de levedura para fermentação primária de longo prazo (54 dias), o experimento foi realizado em um biorreator tipo airlift de 4 L e a imobilização de biomassa foi atingida unicamente por floculação. Apesar da constante agitação líquida e lavagem de biomassa, até 53 g/L de leveduras permaneceram imobilizadas no sistema. Dois tipos de cerveja foram produzidos de modo contínuo no reator, com base em dois tipos de mosto: um tipo pilsener com alta densidade específica de 15,6 ± 0,3 °P; e um mosto tipo lager escuro com densidade específica de 14,4 ± 0,03 °P. Mesmo durante a entrada do mosto de alta densidade, a atenuação desejada foi alcançada sem a necessidade de recirculação ou de um biorreator de segunda fase auxiliar. A produtividade de etanol oscilou a 3,36 ± 0,2 g/L/h por quase um mês. Durante este período, a produtividade volumétrica do biorreator atingiu 1,6 L de cerveja/dia. As cervejas atingiram padrões de fermentação primária, porém com considerável teor de diacetil. Os autores observaram que a produção de diacetil foi fortemente correlacionada com a composição do mosto injetada no sistema (PIRES et al., 2015).
3.5 EMPREGO DE REATORES TUBULARES EM PROCESSOS
FERMENTATIVOS
Reatores de fluxo pistonado conhecidos também por plug flow reactor (PFR), desempenham um papel importante em muitas instalações de produção envolvendo a transformação química de substâncias. Reatores tubulares geralmente operam em condições adiabáticas ou não-isotérmicas (MINSKER et al., 1999). Um PFR é alimentado em uma extremidade de um tubo cilíndrico e a corrente de produto sai na outra extremidade. O tubo longo e a falta de agitação impedem a mistura completa do fluido no tubo. Assim, as propriedades do fluido variam de um ponto para outro. Consequentemente, do ponto de vista dos parâmetros cinéticos de uma reação química em condições isotérmicas, os reatores de fluxo pistonado são mais eficientes que os reatores de tanque agitado, especialmente quando ambos os volumes são iguais (DEY, HERZOG; SRINIVASAN, 2007). Os reatores PFR podem ser operados por longos períodos de tempo sem manutenção (FOGLER, 2006).