UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
LETICIA OLOPS MARANI
CARACTERIZAÇÃO DA PROTEÍNA LRP1 NAS DOENÇAS
FALCIFORMES
Campinas 2018
LETICIA OLOPS MARANI
CARACTERIZAÇÃO DA PROTEÍNA LRP1 NAS DOENÇAS
FALCIFORMES
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências, na área de Clínica Médica.
Orientador: Kleber Yotsumoto Fertrin
Esse exemplar corresponde à versão final da dissertação defendida pela aluna Leticia Olops Marani e orientada pelo Prof. Dr.Kleber Yotsumoto Fertrin.
Campinas 2018
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
Leticia Olops Marani
Orientador: PROF. DR. KLEBER YOTSUMOTO FERTRIN
MEMBROS
1) Prof. Dr. Kleber Yotsumoto Fertrin
(Presidente da Banca)2) Profa. Dra. Maria Stella Figueiredo
3) Profa. Dra. Carla Fernanda Franco Penteado
Programa de Pós Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP
A Ata de Defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica da aluna
Gostaria de dedicar esta dissertação às pessoas que me acompanharam desde os primeiros passos, tanto da vida propriamente dita quanto da vida acadêmica. Seus questionamentos e incentivos guiaram meus passos até aqui e me deram equilíbrio para escolher os caminhos: meu pai (Luiz Lauro), minha mãe (Lenir – in memoriam), meu marido (Ronaldo) e meu orientador (Kleber).
Aos meus filhos, que de formas diferentes e inerentes às suas personalidades, me incentivaram com seus olhinhos ávidos por respostas. Olhinhos nos quais me inspirei tantos dias, pois o encantamento de uma criança perante às respostas da vida é o que o adulto precisa não perder. Por terem me ensinado que o foco e a perseverança superam a dificuldade e a falta de tempo, e que tudo vale a pena quando estou com eles.
Aos familiares, que mesmo sem compreender ao que eu me dedicava, conseguiram me apoiar, fosse com palavras ou cuidando dos meus filhos.
Aos amigos conquistados, reconquistados e aos afastados pela falta de tempo. O importante não é estar junto, mas do lado de dentro (do coração).
À minha amiga irmã, Patricia, que me prova que não importa o tempo, a distância ou a situação, esteve e sempre estará ao meu lado.
Aos pacientes, que ansiosos pela cura, também se dedicaram ao nosso trabalho, doando-se.
“Viver é enfrentar um problema atrás do outro. O modo como você o encara é que faz a diferença” Benjamin Franklin
Agradeço ao meu orientador, Dr. Kleber Fertrin, exemplo de orientador, profissional louvável, dotado de ética e capaz de motivar, ensinar e encantar. Agradeço por ter reaberto uma porta que eu pensei que estava fechada. Por ter acreditado e confiado em mim, não apenas na execução desse projeto, mas em tantos momentos da vida. Foram tantos os sonhos e planos que fizemos juntos, que, de certa forma, acredito que estejam se concretizando finalmente com conclusão desse trabalho. Espero que não seja o fim!
Aos professores do grupo: Dr. Fernando Ferreira Costa, Dra. Nicola Conran, Dr. Erich de Paula, Dra. Carla Penteado Franco, Dra. Dulcineia Albuquerque, Dra. Flavia Leonardo, Dra. Carolina Lanaro e Dra. Ana Leda Longhini, que a cada reunião me ensinaram um novo ponto, um novo ponto de vista ou mesmo uma nova forma de apresentar.
Aos colegas de laboratório, que fizeram tudo ainda mais prazeroso: Priscila, Daniela, Dilmara, Cris, Myriam, Athos, Felipe, Hanan, Lediana, Lidiane, Cecilia, Carolina (Japa), Pâmela, Érica, Rafaela, Marina Borges, Marina Erê, Marina Dal’Bó, Isabella, Wilson, Angélica, Juliete, Álvaro, Fernanda, Fábio.
À CAPES pelo apoio financeiro (aprimoramento pessoal)
A todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.
A Banca Examinadora da Dissertação pelo tempo atribuído à leitura dessa dissertação.
Agradeço especialmente aos meus familiares, principalmente o núcleo mais próximo: Ronaldo, Otávio e Luca, meus amores.
A Deus que me motiva a entender as realidades da vida e me acalenta de forma transcendental.
Aos amigos que pacientemente me ouviram e aconselharam: Kleber, Felipe, Hanan, Lediana, Pâmela e Érica. A convivência com vocês foi de tamanha riqueza que me trouxe leveza. Obrigada por tornarem meus dias melhores.
Doenças falciformes são enfermidades hereditárias de gravidade variável causadas por mutações dos genes da cadeia β da hemoglobina com produção da hemoglobina S, que se polimeriza no interior das hemácias em condições de hipóxia ou acidose. A hemólise crônica e a vaso-oclusão caracterizam essas doenças porque o eritrócito falcizado tem tempo de vida menor e há interrupção da oferta de oxigênio para os tecidos pela adesão de hemácias falcizadas e outras células sanguíneas ao endotélio vascular. A hemólise libera o grupamento heme através da quebra da molécula de hemoglobina, gerando estresse oxidativo e recrutamento de células inflamatórias, resultando em dano celular e tecidual responsáveis pelas lesões de órgãos-alvo. Para a pesquisa de novas estratégias terapêuticas contra esse efeito da hemólise, é fundamental compreender e caracterizar o principal mecanismo de defesa contra o excesso de heme circulante. A hemopexina é a principal proteína endógena que forma complexos com o heme livre e, em modelos animais, demonstrou-se sua capacidade de reduzir os efeitos do heme livre na fisiopatologia da vaso-oclusão da doença falciforme. O receptor final do complexo heme-hemopexina é a proteína LRP1 (do inglês “low-density lipoprotein receptor-related protein-1”), expressa em hepatócitos, macrófagos e monócitos. Além de possuírem receptor LRP1 para esses complexos, monócitos participam da vaso-oclusão em interações heterocelulares e na produção de citocinas pro-inflamatórias. Essas células podem ser subdivididas em monócitos clássicos, intermediários e não clássicos com base na expressão de CD14 e CD16 na membrana celular. Neste estudo, estudamos pacientes com gravidades diferentes de doença falciforme (anemia falciforme e hemoglobinopatia SC). Observou-se aumento dos níveis circulantes de LRP1 em pacientes com anemia falciforme associado ao aumento de monócitos não clássicos e intermediários circulantes, e expressão monocítica heterogênea de LRP1 em ambos grupos de pacientes. Nossos resultados ressaltam como a heterogeneidade monocítica pode contribuir para a complexidade da fisiopatologia das diferentes doenças falciformes, e como alguns subtipos monocíticos são potencialmente mais propensos a captar complexos heme-hemopexina.
Sickle cell disease (SCD) is a group of hereditary disorders with variable severity caused by β-globin gene mutations with the production of hemoglobin S (HbS), which polymerizes inside the erythrocytes in acidosis or hypoxia. Chronic hemolysis and vaso-occlusion are hallmarks of SCD because sickled red blood cells have a shorter half-life and the adhesion of such cells and other circulating in the blood to the endothelium cause the interruption of oxygen delivery to the tissues. Hemolysis releases heme from hemoglobin breakdown, generates oxidative stress and recruits inflammatory cells, ultimately responsible for end organ damage. In order to research novel therapeutic strategies against this effect of hemolysis, it is fundamental to understand and characterize the main mechanism of defense against the excess of circulating heme. Hemopexin is the main endogenous protein which forms complexes with heme, and its ability to reduce the effects of free heme in the pathophysiology of sickle cell disease (SCD) has been demonstrated in animal models of SCD vaso-occlusion. The final receptor for the heme-hemopexin complex is low-density lipoprotein receptor-related protein-1 (LRP1) and is expressed in hepatocytes, macrophages, and monocytes. Monocytes are involved in vaso-occlusion through heterocellular interactions and production of pro-inflammatory cytokines, and can be subdivided into classical, intermediate, and nonclassical on the basis of their expression of surface CD14 and CD16. In this study, we report increased circulating LRP1 levels in sickle cell anemia patients, and increase in intermediate and non-classical monocytes with heterogeneous monocytic expression of LRP1 in both sickle cell anemia and hemoglobin SC disease patients. Our results highlight how monocyte heterogeneity may contribute to the complexity of the pathophysiology of SCD across different degrees of severity, with some cell subtypes being potentially more prone to interacting with hemopexin-bound heme.
Figura Descrição Página Figura 1 Organização modular das proteínas da família LDL 20
Figura 2 Subtipos de monócitos e seus respectivos receptores de membrana
22
Figura 3 Estratégia de análise de imunofenotipagem de monócitos 30
Figura 4 Dosagem de LDH 33
Figura 5 Dosagem de bilirrubina 33
Figura 6 Dosagem de heme total 34
Figura 7 Concentração de hemopexina 34
Figura 8 Correlação de Spearman entre heme e hemopexina 35
Figura 9 Dosagem de sLRP1 35
Figura 10 Correlação de Spearman entre sLRP1 e LDH 36
Figura 11 Distribuição dos subtipos de monócitos por grupo 37
Figura 12 Expressão de LRP1 de acordo com subtipo de monócito 38
Figura 13 Distribuição de receptores CD14, CD 16 e LRP1 de acordo com subtipo de monócito
41
Figura 14 Modelo de resposta monocítica a heme livre e complexado a hemopexina
Tabela Descrição Página
Tabela 1 Especificações dos anticorpos monoclonais utilizados na imunofenotipagem de monócitos a partir de sangue periférico
29
Tabela 2 Especificações dos anticorpos monoclonais utilizados na imunofenotipagem de população não monocítica de sangue periférico
31
Tabela 3 Características clínico-laboratoriais da população estudada
AF Anemia Falciforme
ANOVA Análise de variância (analysis of variance) APC Aloficocianina
CD14 Grupamento de diferenciação (cluster de diferenciação) 14 CD16 Grupamento de diferenciação (cluster de diferenciação) 16 CD45 Grupamento de diferenciação (cluster de diferenciação) 45 CD64 Grupamento de diferenciação (cluster de diferenciação) 64
CD91 Grupamento de diferenciação (cluster de diferenciação) 91 ou LRP1 CD123 Grupamento de diferenciação (cluster de diferenciação) 123 DF Doença Falciforme
eDAMPs Erythrocyte danger-associated molecular patterns EDTA Ácido Etilenodiaminotetraacético
EGF Fator de crescimento epidérmico ELISA Enzyme linked immunosorbent assay FCS Forward Scatter
FITC Isotiocianato fluorescente Hb Hemoglobina
HbA Hemoglobina A HBA1 Hemoglobina alpha 1 HBA2 Hemoglobina alpha 2 HBB Hemoglobina beta HbC Hemoglobina C HbE Hemoglobina E HbF Hemoglobina F
HBG1 Hemoglobina subunidade gamma-1 HBG2 Hemoglobina subunidade gamma-2 HbS Hemoglobina S
HDL High-density lipoprotein
HLA-DR Human Leukocyte Antigen - antigen D related HMOX1 Heme oxygenase decycling 1
HMOX2 Heme oxygenase decycling 2 HO Heme oxigenasse
HO-1 Heme oxigenase 1 HO-2 Heme oxigenase 2 Hp Haptoglobina
HPLC Cromatografia líquida de alta performance Hpx Hemopexina
HU Hidroxiureia
ICAM-1 Intercellular adhesion molecule-1 IL-1 Interleucina 1
IL-1β Interleucina 1β IL-6 Interleucina 6
LDH Lactato Desidrogenase LDL Low-density lipoprotein LPS Lipopolissacarídeo
LRP1 Low Density Lipoprotein Receptor-related protein 1 PBS Tampão fosfato
PE Ficoeritrina
ROS Espécies reativas de oxigênio SCD Sickle Cell Disease
sLRP1 LRP1 solúvel SSC Side Scatter TLR4 Toll like receptor 4
TNF-α Fator de necrose tumoral α VCAM-1 Vascular cell adhesion molecule 1 VCM Volume corpuscular médio
1 Introdução 15
1.1 Hemoglobinopatias 15
1.1.1 Hemoglobina 15
1.1.2 Hemoglobinopatias e doenças falciformes 15
1.2 Hemólise e Inflamação 17
1.3 LRP1 19
1.4 Monócitos e LRP1 21
1.5 Monócitos e anemia falciforme 23
2 Justificativa 24
3 Objetivo Geral 25
3.1 Objetivos específicos 25
4 Casuística e métodos 26
4.1 Tipo de estudo 26
4.2 Critérios de suspensão ou encerramento da pesquisa 26
4.3 Local de realização da pesquisa 26
4.4 Pacientes 26
4.5 Indivíduos saudáveis / controles 27
4.6 Métodos 27
4.6.1 Coleta de sangue 27
4.6.2 Dosagens hematológicas, bioquímicas e imunológicas 28
4.6.3
Imunofenotipagem para caracterização de subtipos de
monócitos 28
4.6.4 Coleta de dados do prontuário médico dos pacientes 31
4.7 Análise estatística 31
5 Resultados 32
5.1 Dosagens hematológicas, bioquímicas e imunológicas 33
5.2 Imunofenotipagem de monócitos 36
5.2.1 Subtipos de monócitos 37
5.2.2 Expressão monocítica de LRP1 37
6 Discussão 39
7 Conclusões e comentários finais 44
8 Referências 45
9 Apêndice – artigo em submissão 53
INTRODUÇÃO
1.1. Hemoglobinopatias
1.1.1. Hemoglobina
A hemoglobina (Hb) é o pigmento contido no interior dos glóbulos vermelhos humanos cuja função é transportar gases sanguíneos(1). É uma proteína composta de quatro cadeias globínicas, com um grupamento heme contendo um átomo de ferro para cada cadeia. Nos adultos, a hemoglobina predominante é a HbA, composta de duas cadeias de globinas α e duas de globina β (α2β2), enquanto da fase fetal até o sexto mês de vida extrauterina,
predomina a hemoglobina fetal (HbF), composta de duas cadeias α e duas γ (α2γ2). No período pós-natal, a redução da transcrição dos genes que codificam a
globina γ causa uma substituição gradual da HbF pela HbA, de modo que pacientes com mutações nos genes da globina β comumente passam a apresentar alguma manifestação clínica desse tipo de hemoglobinopatia a partir de seis meses de idade(2). Os genes HBA1 e HBA2, que codificam as cadeias α, estão localizados no braço curto do cromossomo 16, e os genes que codificam as cadeias β (HBB) e γ (HBG1 e HBG2), no cromossomo 11(3). A sequência completa dos nucleotídeos desse cluster determina a etiologia molecular da maior parte das doenças da hemoglobina.(4) .
1.1.2. Hemoglobinopatias e doenças falciformes
As hemoglobinopatias são classificadas em três grandes grupos: variantes estruturais de hemoglobina, talassemias e persistências hereditárias de hemoglobina fetal(5). As talassemias são classificadas de acordo com a síntese insuficiente ou desequilibrada das cadeias globínicas, sendo as mais comuns α e β (tal- α e tal- β). Persistências hereditárias de HbF são condições mais raras em que há superexpressão de um dos genes γ e frequentemente são assintomáticas(5,6).
De forma geral, as variantes estruturais são causadas por mutações de ponto com substituição de aminoácidos nas cadeias α ou β que podem alterar a estabilidade da proteína ou suas propriedades funcionais, levando a enfermidades
clínicas. Apesar de haver mais de 700 variantes estruturais de hemoglobina, apenas três possuem alta frequência na população: HbS, HbC e HbE(4). A anemia falciforme (AF) é uma doença genética, com herança autossômica recessiva, com presença da hemoglobina variante S (HbS), que é determinada pela homozigose para a mutação de ponto GAG > GTG no sexto códon do gene HBB, que leva a substituição de um resíduo aminoácido de ácido glutâmico por uma valina na sexta posição da cadeia polipeptídica (7). A hemoglobina variante C é originada da mutação no mesmo códon do gene HBB, levando a troca do ácido glutâmico por uma lisina. Em heterozigose com a HbS, a HbC causa a hemoglobinopatia SC (SC). Com um fenótipo mais brando, os pacientes portadores de SC apresentam hemólise mais leve e menos crises vaso-oclusivas que os pacientes com AF(8).
Devido à miscigenação da população brasileira, a AF tem ocorrência randômica, apesar da frequência na população afrodescendente ser predominante. De acordo com o Ministério da Saúde, cerca de 3.500 crianças nascem anualmente com a doença no Brasil, sendo que o número de casos estimado seja entre 25.000 e 30.000(9). Dados dos programas estaduais de triagem neonatal mostram que no estado da Bahia a incidência da AF é de 1:650, enquanto a da condição heterozigótica, denominada traço falciforme, é de 1:17, entre os nascidos vivos. No Rio de Janeiro, a incidência é de 1:1300 para a doença e 1:20 para o traço. Em Minas Gerais, ocorre na proporção de 1:1400 para a doença e 1:30 para traço falciforme e no estado de São Paulo é de 1:35(10).
Entre as manifestações clínicas possíveis em pacientes portadores de doença falciforme estão a anemia hemolítica crônica, eventos vaso-oclusivos com dor isquêmica, síndrome torácica aguda por vaso-oclusão acometendo pulmões, maior incidência de infecções e bacteremia que na população em geral, úlceras de membros inferiores, acidente vascular encefálico, insuficiência renal crônica, retinopatia, hipertensão pulmonar e priapismo (11). Pacientes SC apresentam com mais frequência a retinopatia proliferativa e osteonecrose de fêmur e úmero em relação aos pacientes portadores de AF(8).
Diversos estudos(12–14) da área demonstram a importância da hemoglobina fetal (HbF) nas doenças falciformes, uma vez que a HbF não participa da polimerização e reduz a falcização(15). Dessa forma, estratégias terapêuticas de
modulação da produção de HbF são de grande interesse para o manejo da doença falciforme com o objetivo de reduzir ou inibir a polimerização da HbS.
O único tratamento curativo disponível para doenças falciformes é o transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico de doador aparentado(16– 18). No Brasil, ele só está indicado para pacientes com menos de 18 anos de idade, e que tenham doador 100% compatível, devendo ser pai, mãe ou irmão do paciente(19). Isso significa que a maioria dos pacientes não é candidato a transplante, e será tratado de forma paliativa com transfusão de concentrados de hemácias. A transfusão permite corrigir a anemia em períodos em que esteja grave e reduzir a concentração de hemoglobina S temporariamente, melhorando a vaso-oclusão na fase aguda, ou de forma crônica na profilaxia primária ou secundária de algumas complicações, como o acidente vascular encefálico isquêmico(10,20).
A hidroxiureia (HU) é atualmente o único tratamento farmacológico específico para doenças falciformes aprovado no Brasil e fornecido pelo Sistema Único de Saúde. É um quimioterápico inibidor da ribonucleotídeo redutase, capaz de induzir a produção de maiores níveis de HbF, levando a menor falcização das hemácias e redução da frequência de crises de vaso-oclusão, hospitalização e morbimortalidade nesse grupo de pacientes(21,22). A HU também é capaz de reduzir contagens de neutrófilos, monócitos e reticulócitos circulantes que participam dos fenômenos vaso-oclusivos, diminui a adesão celular e expressão de moléculas de adesão e funciona como um doador de Óxido Nítrico (NO), um vasodilatador endógeno. Entretanto, cerca de 10 a 20% dos pacientes não responde ou é intolerante ao medicamento(12,23–25).
1.2. Hemólise intravascular e inflamação
A hemólise é um dos processos fundamentais na anemia falciforme e decorre do encurtamento da vida média do eritrócito por causa da polimerização da HbS(26), que leva a danos irreversíveis da membrana celular, perda da elasticidade para atravessar capilares sanguíneos e sua destruição precoce nos meios intra e extravascular. A hemólise intravascular tem como consequência a liberação de moléculas de Hb livre no plasma, que se ligam à haptoglobina, uma proteína de
origem hepática que se complexa com a hemoglobina livre e a leva para ser metabolizada em macrófagos e hepatócitos. Nas doenças falciformes, a hemólise crônica depleta os níveis de haptoglobina circulante e o excesso de hemoglobina livre produzido é oxidado a meta-hemoglobina, liberando o grupamento heme na circulação. Tanto hemoglobina quanto heme livres representam padrões eritroides de reconhecimento moleculares de danos – eDAMPs (erythrocyte
danger-associated molecular patterns) - e atuam como potentes agentes pró-oxidantes com efeito citotóxico(27,28), gerando estresse oxidativo e inflamação estéril (29,30). Inflamassomas, um complexo multiproteico intracelular que atua na ativação de enzimas da família das caspases, são gerados a partir de eDAMPs, e resultam na expressão de citocinas pró-inflamatórias, tais como a interleucina 1 beta (IL-1β)(31,32). Além da haptoglobina, que reduz a quantidade de hemoglobina livre circulante que origina heme, outras proteínas são responsáveis pela contenção do heme livre, atuando como protetores, tais como hemopexina, albumina, α1-microglobulina e as lipoproteínas de alta e baixa densidade (HDL e LDL, respectivamente). Em modelo murino de doença falciforme, o heme livre é capaz de ativar diretamente o endotélio vascular através de receptores “tipo toll” 4 (TLR4, do inglês toll-like receptor), levando à produção de mediadores inflamatórios (IL-1, IL-6, IL-8) e espécies reativas de oxigênio (ROS, do inglês reactive oxygen species) (33,34). Doenças inflamatórias imunomediadas também estão associadas ao acúmulo de heme livre na circulação (35–39).
A hemopexina (Hpx) é a proteína plasmática de maior afinidade pelo heme livre(40,41). Ela é sintetizada majoritariamente pelo fígado, mas também na retina e no cérebro(42). O complexo heme-Hpx é reconhecido e captado pelos hepatócitos e macrófagos(43), permitindo o catabolismo intracelular do heme por meio da endocitose (44). No interior do endossomo, o heme é liberado da Hpx, que pode ser reciclada. Em casos de hemólise grave, a Hpx também é depletada do plasma, sugerindo que a reciclagem pode ser incompleta(43,45).
Concentrações de heme em anemias hemolíticas estão aumentadas e, inversamente, as concentrações de Hpx estão depletadas. Alguns estudos com número pequeno de pacientes relataram que os níveis de Hpx circulante se encontram reduzidos em pacientes com doença falciforme, semelhantemente ao que é observado com a haptoglobina(45). Dados mais recentes confirmam Hpx sérica reduzida em pacientes com doenças falciformes, por exemplo em hemoglobinopatia
SC, independentemente do grau de hemólise (46). Em corroboração à hipótese de que o heme tem papel importante no processo de vaso-oclusão, Belcher e colaboradores demonstraram que a infusão de Hpx bloqueia a capacidade do heme em causar vaso-oclusão em modelo murino de doença falciforme(33). Sua administração também foi capaz de reverter a inflamação mediada por heme(47) e prevenir dano endotelial e congestão hepática em modelo animal de sobrecarga de heme(48). Em modelo murino de sepse, Hpx reduziu significativamente os danos teciduais e mortalidade(37).
O heme transportado via Hpx é degradado pela ação enzimática das heme oxigenases (HOs) (49). Há duas isoformas de HO, HO-1 e HO-2, codificadas pelos genes HMOX1 e HMOX2, respectivamente (50,51). A HO-2 é constitutivamente expressa em diversas células sob condições homeostáticas normais, enquanto a HO-1 é induzida em diferentes situações de estresse em que há aumento do catabolismo do heme(52). A expressão de HO-1, transferrina, receptor de transferrina e ferritina pode ser regulada pela ligação de complexos heme-Hpx a seu receptor(48).
A intensidade da força de ligação entre heme e Hpx parece indicar que a Hpx é a grande responsável por prevenir os efeitos oxidativos indesejáveis do heme livre e por transportar de forma segura o complexo heme-Hpx para diferentes células que expressam o receptor desse complexo, a proteína LRP1 (42).
1.3. LRP1
LRP1 (do inglês low density lipoprotein receptor-related protein 1, proteína relacionada ao receptor de lipoproteínas de baixa densidade 1), denominada também CD91, é um receptor transmembrana do tipo 1, membro da família dos receptores de LDL compostos por estruturas modulares incluindo complementos de repetições ricas em cisteína, repetições do tipo EGF, domínios β, domínio transmembrana e um domínio citoplasmático (53), como detalhado na figura 1. É composta de duas cadeias distintas, α e β, cuja clivagem é realizada pela enzima furina, gerando uma forma solúvel em plasma humano, sLRP1. (54,55).
Figura 1: Organização modular dos membros da família de receptores relacionados a LDL.
(Adaptado de Lillis et al, 2008 (56)
A cadeia α, de 515 kDa, é inteiramente extracelular e se liga por fortes ligações não-covalentes com a cadeia β, de 85 kDa. A estrutura da cadeia α é capaz de se ligar a mais de 40 ligantes, incluindo proteases, inibidores de proteases, fatores de crescimento, proteínas de matriz extracelular(57,58) e partículas de lipoproteínas, como, por exemplo, a apoproteína E e a HDL. (54,55). Gorovoy e colaboradores (59) demonstraram a indução de sLRP1 in vivo em roedores e aumento das concentrações de sLRP1 em plasma humano em portadores de artrite reumatoide e lúpus eritrematoso sistêmico, sugerindo que eventos inflamatórios podem estar associados à presença dessa fração solúvel e detectável, sugerindo que sLRP1 poderia ser considerada um biomarcador de inflamação. Gaultier e colaboradores (2008) demonstraram em um modelo de lesão nervosa periférica e dor neuropática em roedores que sLRP1 bloqueou a expressão de citocinas proinflamatórias, reduzindo a resposta da dor neuropática e diminuindo a expressão de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e interleucina 8 (IL-8)(60). A cadeia β possui ligantes intracelulares para proteínas sinalizadoras como Shc e c-Jun aminoterminal quinase(61–63) e, dessa forma, participa de eventos fisiológicos como migração, proliferação celular e regulação da permeabilidade vascular, atuando como co-receptor(64).
Em camundongos, a deleção do gene LRP1 impede a implantação embrionária, sendo letal(65). Polimorfismos nesse gene em humanos estão associados a doença coronariana em população caucasiana, trombose coronária e risco de doença cardiovascular prematura em pacientes com hipercolesterolemia familial(66–68) A diversidade da natureza multifuncional dos ligantes desse receptor representa sua complexidade, capaz de regular o desenvolvimento e progressão de diversas doenças e sendo alvo de estudos em aterosclerose, câncer, lesões nervosas e demência de Alzheimer.
Apesar de ser considerada um receptor endocítico, a LRP1 tem sido atualmente relatada como promotora de sinalização interna, que medeia a proliferação, a migração e a diferenciação de diferentes tipos celulares, incluindo macrófagos(69) e linfócitos T(70,71), de forma que o aumento de sua expressão poderia representar uma estratégia terapêutica antiviral e antitumoral.
Há relatos de que níveis séricos de sLRP1 estão elevados em pacientes portadores de doenças inflamatórias crônicas, tais como artrite reumatóide e lúpus(59). A LRP1 surge também como uma reguladora da resposta à injúria e inflamação(72), mecanismos presentes no processo vaso-oclusivo das doenças falcifomes, em que um dos gatilhos é a liberação de heme. Essa proteína é expressa em diferentes tipos celulares, incluindo macrófagos, células dendríticas, neurônios, hepatócitos e timócitos(73). Entre os leucócitos do sangue periférico, diversos estudos relatam LRP1 majoritariamente expressa em monócitos(74–76), o que pode ser particularmente importante para a resposta à formação de complexos heme-Hpx na circulação sanguínea nas doenças falciformes.
1.4. Monócitos e LRP1
Os monócitos do sangue periférico (Mo) são originados de células progenitoras na medula óssea e tem papel fundamental na imunidade inata e adquirida devido à sua capacidade de diferenciação em macrófagos (MΦ) e células dendríticas(77,78). Baseado na diferença de expressão de receptores para lipopolissacarídeos (LPS) CD14 e receptores tipo III para porção Fc de imunglobulina G (FcγIIIR) CD16, é possível definir subpopulações de monócitos:
clássica (CD14++CD16-), e não-clássica (CD14+CD16++). Posteriormente, definiu-se também uma subpopulação denominada intermediária (CD14++CD16+)(79). A Figura 2 resume a distribuição relativa dos receptores CD14 e CD16 na membrana dos monócitos, de acordo com o subtipo celular.
Figura 2: Subtipos de monócitos de acordo com expressão relativa de receptores CD14 e CD16 na
membrana.
Monócitos clássicos estão ligados à função anti-inflamatória, com baixo potencial de migração para sítios inflamatórios, produção de IL-10 e propensão à maturação em células apresentadoras de antígenos após estímulo com citocinas. Monócitos não-clássicos (CD14+CD16++) apresentam padrão de expressão gênica ligada a um atividade pró-inflamatória e são encontrados em alta frequência em doenças inflamatórias crônicas(80,81).
Ancuta e colaboradores (2009) demonstraram diferentes funções biológicas para as populações de monócitos em função da expressão diferencial de CD16, evidenciando que ambos subtipos de monócitos são originados a partir de um precursor mieloide comum, sendo CD16+ um estágio de diferenciação mieloide mais avançado e CD16- com perfil mais próximo do precursor. Genes relacionados à adesão celular, resposta inflamatória e imunológica, resposta ao estresse, transdução de sinal, proliferação e sinalização e ciclo celular foram diferencialmente superexpressos em monócitos CD16+ em relação aos CD16-. Enquanto isso, monócitos CD16- tem padrão de expressão relacionado à linhagem celular hematopoética, endocitose mediado por receptores, metabolismo da arginina e prolina e ligação de lipídeos. Ferrer e colaboradores(69) demonstraram que, em indivíduos saudáveis, monócitos clássicos têm maior expressão de LRP1 que monócitos não-clássicos.
1.5. Monócitos e anemia falciforme
Embora a patogênese das doenças falciformes se baseie na polimerização da HbS nos eritrócitos, as hemácias falcizadas apresentam aumento de suas propriedades adesivas, e o processo vaso-oclusivo nessas doenças sabidamente envolve a interação dos eritrócitos, células endoteliais e outros tipos celulares, incluindo neutrófilos, plaquetas e monócitos, em um complexo gerador de um estado inflamatório crônico.
Pacientes com anemia falciforme têm monocitose no sangue periférico (82) e o monócito tem papel importante na fisiopatologia da vaso-oclusão. Monócitos de pacientes com doenças falciformes são ativados e ativam o endotélio, amplificando o processo vaso-oclusivo(83). A liberação de endotelina-1, um potente vasoconstritor, aumenta as concentrações de VCAM-1 e ICAM-1 solúveis de forma a estimular a secreção de citocinas por monócitos (IL-1, IL-6, TNF-α), ativando neutrófilos, que aumentam a expressão de moléculas de adesão, facilitando a adesão ao endotélio(60,61,62). A administração de hidroxiureia como tratamento para as doenças falciformes reduz o número circulante de leucócitos, plaquetas, de reticulócitos e a expressão de fosfatidilserina na superfície das células vermelhas, reduzindo a adesão dos eritrócitos e outras células ao endotélio, prevenindo a vaso-oclusão(87). Assim, a melhora clínica dos pacientes não está sempre associada ao aumento dos níveis de HbF, efeito primário da HU, indicando o efeito desse medicamento em outros processos. Chaar e colaboradores demonstraram que os monócitos se agregam preferencialmente com hemácias contendo HbS, o que pode ser resultado da presença de ativação desse tipo celular, e também observaram que o tratamento com HU reduziu a formação de agregados heterocelulares entre monócitos e eritrócitos em pacientes com anemia falciforme(88).
Dados preliminares de nosso grupo de pesquisa indicam que o uso crônico de HU em pacientes com anemia falciforme se associou a uma maior população de monócitos não-clássicos (CD14+CD16++) e essa população se correlacionou com os níveis de hemoglobina fetal nesse grupo de pacientes, reforçando a importância dos monócitos e uma possível diferença entre seus subtipos em relação ao processo de vaso-oclusão da anemia falciforme (89).
Apesar do conhecimento atual sobre a heterogeneidade dos monócitos circulantes, e da existência de expressão do receptor LRP1 nessas células, pouco se sabe ainda sobre seu papel no processo vaso-oclusivo das doenças falciformes e sobre a capacidade dessas subpopulações monocíticas de responderem a liberação de heme livre na circulação, um estímulo deflagrador de ativação endotelial e de vaso-oclusão na AF.
2. JUSTIFICATIVA
As doenças falciformes são frequentes na população brasileira e o único tratamento curativo disponível é o transplante de células-tronco hematopoéticas, indicado somente para pacientes que tenham idade e doador adequados. Assim, a grande maioria dos pacientes que não são elegíveis para transplante será tratada paliativamente com as únicas opções terapêuticas disponíveis no Brasil: transfusão de concentrado de hemácias e hidroxiureia, que corrigem a anemia e modulam a produção de hemoglobina fetal, mas tem eficácia e tolerância limitada. Isso torna evidente a necessidade de encontrar novas estratégias terapêuticas que atuem em outros aspectos da fisiopatologia da doença falciforme.
A liberação de heme livre é um evento importante nessa fisiopatologia, pois causa ativação do endotélio vascular e comprovadamente precipita vaso-oclusão em modelos animais da doença. As crises dolorosas de vaso-oclusão constituem a principal morbidade aguda dos portadores dessa doença, e os efeitos da vaso-oclusão a longo prazo causam as lesões de órgão-alvo que afligem essa população na idade adulta, tais como a insuficiência cardíaca e renal. A gravidade das manifestações clínicas é diferente entre os tipos de doença falciforme, e não se sabe até que ponto variações no heme livre influenciam essas diferenças.
Dessa forma, ampliar o conhecimento sobre a biodisponibilidade de LRP1, o receptor do complexo heme-Hpx que permite a detoxificação do heme, em pacientes com doenças falciformes é de fundamental importância para compreender a variabilidade clínica e para que novas estratégias terapêuticas que reduzam ou eliminem a contribuição do heme livre para a vaso-oclusão sejam desenvolvidas no futuro.
3. OBJETIVO GERAL
Caracterizar a produção da proteína LRP1 nas doenças falciformes
3.1. Objetivos específicos
A) Em amostras de sangue de doadores sadios voluntários e pacientes com doença falciforme de maior ou menor gravidade (anemia falciforme ou hemoglobinopatia SC, respectivamente), determinar, comparar e correlacionar: - Parâmetros hematológicos (Hb, hematócrito, volume e hemoglobina corpuscular médios, contagem de eritrócitos, de leucócitos e seus subtipos, de plaquetas, e de reticulócitos)
- Heme sérico;
- Hemopexina sérica; - LRP1 solúvel sérica;
- Marcadores bioquímicos de hemólise (Lactato Desidrogenase e Bilirrubina total);
B) Em amostras de sangue de doadores sadios voluntários e pacientes com doença falciforme, caracterizar as subpopulações de monócitos circulantes e expressão de LRP1.
4. CASUÍSTICA E MÉTODOS
4.1.Tipo de estudo
Trata-se de um estudo observacional transversal.
4.2. Critérios de suspensão ou encerramento da pesquisa
O estudo se encerraria somente se não houvesse sujeitos interessados em participar da pesquisa, uma vez que sua realização e seus resultados não tiveram nenhuma implicação no tratamento dos pacientes recrutados.
4.3. Local de realização da pesquisa
O projeto foi realizado no Laboratório de Hemoglobina e Genoma do Centro de Hematologia e Hemoterapia da UNICAMP – Hemocentro Campinas.
4.4. Pacientes
Foram convidados a participar do estudo pacientes portadores de doenças falciformes em seguimento no Ambulatório de Hemoglobinopatias do Hemocentro de Campinas, UNICAMP.
Os critérios de inclusão foram obedecidos os critérios abaixo relacionados: 1. Idade igual ou superior a 18 anos;
2. Diagnóstico de anemia falciforme (grupo SS) ou hemoglobinopatia SC (grupo SC) confirmado por hemograma completo e eletroforese de hemoglobina por HPLC;
3. Assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido (CEP CAAE: 37303714.7.0000.5404, processo 849962 – vide Anexos)
Os critérios de exclusão foram a presença de qualquer dos abaixo:
1. Diagnóstico concomitante de neoplasia hematológica que pudesse influenciar a produção de monócitos (p.ex. leucemia mielomonocítica crônica);
2. Diagnóstico concomitante de doença reumatológica (P.ex., lúpus, artrite reumatoide, etc);
3. Uso de imunossupressores (azatioprina, corticosteroides, metotrexate, quimioterápicos exceto hidroxiureia);
4. Gestação;
5. Transfusão sanguínea nos três meses antecedentes à coleta; 6. Crise álgica nos três meses antecedentes à coleta;
7. Não satisfação de qualquer dos critérios de inclusão.
4.5. Indivíduos saudáveis (controles)
Foram convidados indivíduos sem hemoglobinopatias (grupo AA) para comparação como grupo controle.
Os critérios de inclusão incluíram todos os abaixo: 1- Idade igual ou superior a 18 anos;
2- Assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido (CEP CAAE: 37303714.7.0000.5404, processo 849962– vide Anexos)
3- Hemograma completo dentro dos parâmetros da normalidade para idade e sexo;
4- Teste de solubilidade da Hemoglobina S negativo.
4.6. Métodos
4.6.1. Coleta de sangue
Amostras de sangue (volume de aproximadamente 20mL) foram coletadas por punção venosa periférica em tubos contendo EDTA como anticoagulante ou em tubo seco. As amostras em tubo seco foram submetidas à centrifugação a 428 g (Centrífuga Eppendorf AG 5810R, Hamburgo, Alemanha) por 20 minutos, aliquotadas e preservadas a -80 graus Celsius até a realização das dosagens.
4.6.2. Dosagens hematológicas, bioquímicas e imunológicas
As amostras de sangue anticoagulado com EDTA foram utilizadas para realização de hemograma completo em um aparelho ADVIA 2120i (Siemens, Erlangen, Alemanha), com diferencial de leucócitos e contagem de reticulócitos automatizados.
Foi utilizado kit comercial para medição dos níveis séricos de heme (QuantiChrom Heme Assay kit, Bioassay Systems, EUA).
Para determinação da dosagem de hemopexina e LRP1 em soro foram utilizados kits comerciais de imunoensaio: Hemopexin (HPX) Human Simple Step ELISA® Kit #ab171576 (Abcam, EUA) Human LRP1/CD91 Elisa® kit #F4389 (LifeSpan BioSciences, Inc., EUA).
As determinações de lactato desidrogenase (LDH) sérica e bilirrubina total foram realizadas em equipamento AU 5811 (Beckman Coulter, EUA).
4.6.3. Imunofenotipagem para caracterização da subpopulação de monócitos
Amostras frescas de sangue total periférico coletadas em tubo anticoagulado com EDTA foram utilizadas para a imunofenotipagem de monócitos por citometria de fluxo, para caracterização das subpopulações. Para cada reação, foram usados 50µl de sangue total. As amostras foram marcadas com anticorpo específico para imunofenotipagem de monócitos (marcação de superfície), em volume final ajustado para 100µl com tampão fosfato tamponado (PBS), incubadas em temperatura ambiente por 30 minutos em campo escuro. Após incubação, as amostras foram tratadas com tampão de lise de hemácias (0.155 mM NH4Cl, 7.4 mM KHCO3) por 15 minutos, posteriormente lavadas com PBS e ressuspensas em 200µl de PBS (volume final).
Os anticorpos monoclonais utilizados para determinação da subpopulação monocítica foram anticorpos murinos anti-CD14 com conjugado com aloficocianina (APC), anti-CD16 conjugado com ficoeritrina (PE), e anti-CD45 conjugado com PerCyP Cy5.5 (usado como controle positivo para leucócitos). Para determinação da expressão de LRP1 ligada a membrana em cada subpopulação de monócitos, foi
utilizado anticorpo murino anti-LRP1/CD91 conjugado com isotiocianato fluorescente (FITC). A Tabela 1 contém as informações referentes aos anticorpos monoclonais:
Tabela1: Especificações dos anticorpos monoclonais utilizados na imunofenotipagem de sangue periférico.
Antígeno Conjugação Fabricante
CD45 PerCPCy5.5 BD Pharmigen®
CD14 APC BD Pharmigen®
CD16 PE BD Pharmigen®
LRP1/CD91 FITC BD Pharmigen®
As amostras foram imediatamente adquiridas em citômetro de fluxo FACS Calibur (BD Biosciences®) e analisados com o software FACS Diva (V. 8.2) utilizando o sistema de análise como descrito por Ferrer e colaboradores(69).
Após a estratégia de seleção dos eventos considerados como monócitos e de acordo com a expressão de membrana de CD14 e CD16, cada amostra (paciente ou controle) gerou uma tabela de valores individual com a classificação dos subtipos de monócitos (contendo número de eventos, porcentagem em relação ao total de monócitos) e a expressão de LRP1 mensurada de acordo com a Intensidade Média de Fluorescência com média, mediana, desvio padrão e coeficiente de variação em porcentagem. Todos os dados individuais foram plotados e planilhados para permitir a realização de análise de acordo com os grupos selecionados no presente estudo (grupos SS, SC e AA).
Figura 3: Estratégia de análise da imunofenotipagem de leucócitos do sangue periférico, mostrando a localização das populações celulares conforme tamanho FSC e granularidade SSC (painel A), expressão de CD45 e granularidade SSC (painel B), expressão de LRP1/CD91 e granularidade SSC (painel C) e classificação final das 3 populações distintas sendo monócitos
clássicos CD14++CD16dim (azul), intermediários CD14++CD16+ (rosa), não-clássicos
CD14dimCD16+ (verde) e uma quarta população celular não monocítica CD14dimCD16dim (vermelho).
C D
Tabela 2: Especificações dos anticorpos monoclonais utilizados na imunofenotipagem de população não monocítica a partir de sangue periférico.
Antígeno Conjugação Fabricante
CD45 PerCPCy5.5 BD Pharmigen®
CD14 APC H7 BD Pharmigen®
CD16 PE Cy7 BD Pharmigen®
CD91 FITC BD Pharmigen®
HLA-DR Pacific Blue BD Pharmigen®
CD64 APC BD Pharmigen®
CD123 PE Biolegend®
4.6.4. Coleta de dados do prontuário médico dos pacientes
Os dados clínicos dos pacientes foram consultados previamente via prontuário eletrônico disponibilizado pelo Centro de Hematologia e Hemoterapia do Hemocentro Campinas, e os candidatos foram entrevistados para confirmação da presença ou ausência dos critérios de inclusão e exclusão. Quando selecionados e concordantes com a participação, pacientes e controles assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.
4.7 Análise estatística
Variáveis categóricas foram avaliadas quanto a porcentagens de pacientes e comparadas pelo teste de Fisher. A análise de variância (ANOVA), com pós-teste de Bonferroni, foi aplicada a variáveis com distribuição normal e o teste de Kruskal-Wallis aplicado para as demais variáveis. Todos os testes foram bicaudais com valores de P<0,05 considerados estatisticamente significativos. Para a análise estatística, foi utilizado o software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA).
5. RESULTADOS
5.1 Dosagens hematológicas, bioquímicas e imunológicas
De maio de 2016 a maio de 2017, foram recrutados 80 pacientes com doença falciforme, provenientes do ambulatório de Hemoglobinopatias do Hemocentro Campinas (UNICAMP), sendo 36 com hemoglobinopatia SC e 44 com anemia falciforme, dentre os quais 8 sem tratamento com hidroxiurea. Como controles, foram selecionados 39 indivíduos. A Tabela 3 resume os dados clínico-laboratoriais na população estudada.
Tabela 3. Características clínico-laboratoriais da população estudada.
Dados estão expressos em média ± desvio-padrão. AA, indivíduos saudáveis; SC, pacientes portadores de hemoglobinopatia SC; SS, pacientes portadores de anemia falciforme; HU, hidroxiureia; LRP1, low-density lipoprotein receptor-related protein-1; IMF, Intensidade Média de Fluorescência; CD, cluster de diferenciação; UA, Unidades arbitrárias. * significa diferente de AA. † significa diferente de SC.P<0,05
Houve diferença significativa entre os pacientes em comparação com o grupo controle em relação a Hb, reticulócitos e LDH (Figura 4), assim como o VCM nos pacientes com anemia falciforme em uso de hidroxiureia (p<0.0001, Kruskal-Wallis) em comparação com os demais.
Figura 4: Dosagens de lactato desidrogenase sérica em indivíduos saudáveis (AA), pacientes com
anemia falciforme (SS) e hemoglobinopatia SC (SC). O valor de P corresponde ao resultado do ANOVA.
As dosagens de bilirrubina (Figura 5) e heme sérico (Figura 6) foram significativamente maiores em pacientes SS do que SC, enquanto as dosagens de hemopexina foram significativamente menores nos pacientes que nos controles saudáveis (Figura 7).
Figura 5: Dosagens de bilirrubina total em indivíduos saudáveis (AA), pacientes com anemia
Figura 6: Dosagens de heme total sérico em indivíduos saudáveis (AA), anemia falciforme (SS) e
hemoglobinopatia SC (SC). O valor de P corresponde ao resultado do ANOVA.
Figura 7: Dosagens de hemopexina sérica em indivíduos saudáveis (AA), anemia falciforme (SS) e
hemoglobinopatia SC (SC). O valor de P corresponde ao resultado do ANOVA.
Neste estudo, na avaliação global das concentrações de heme e hemopexina séricas em pacientes portadores de doença falciforme (grupos SS e SC) e indivíduos saudáveis (AA), foi observada uma correlação negativa entre os níveis de heme e de hemopexina, conforme destacado na Figura 8.
Figura 8: Correlação de Spearman e reta de regressão linear entre as concentrações de heme e
hemopexina no soro de pacientes com doença falciforme e indivíduos saudáveis (n=66)
As concentrações séricas de LRP1 (sLRP1) foram comparadas quanto aos grupos de indivíduos saudáveis AA, e pacientes portadores de doença falciforme, grupos SS e SC, conforme representado na Figura 9, com os maiores níveis sendo encontrados no grupo SS. AA SS SC 0 2 4 6 8 s -L R P 1 ( µ g /m l) * s - L R P 1 P = 0 , 0 4 4 8
Figura 9: Dosagens de sLRP1 em indivíduos saudáveis (AA), anemia falciforme (SS) e
No grupo de pacientes de anemia falciforme (SS), foi observada uma correlação positiva entre os níveis séricos de sLRP1 e LDH, como demonstrado na Figura 10.
Figura 10: Correlação de Spearman com reta de regressão linear entre dosagens de sLRP1 e LDH no
subgrupo de pacientes portadores de anemia falciforme (SS, n=29)
5.2 Imunofenotipagem de Monócitos
Na padronização da imunofenotipagem dos monócitos a partir de sangue periférico, foi observada a presença de uma quarta população com baixa expressão de CD14 e CD16, mas que expressava LRP1 e tinha características de tamanho e granularidade semelhantes aos monócitos (vide Figura 3D).
Para melhor caracterização dessa população, foram realizadas duas estratégias utilizando anticorpos monoclonais. Na primeira estratégia, a população de interesse foi duplamente positiva para HLA-DR e CD14 (mais fracamente que monócitos clássicos e intermediários), o que justifica sua presença entre os monócitos. A população então foi analisada quanto à expressão de CD123 e CD64, classificadas de acordo com a expressão de CD16. Na segunda estratégia, a população de interesse foi selecionada quanto à expressão de LRP1, repetindo os passos seguintes da primeira estratégia. De acordo com os resultados obtidos, em ambas estratégias, a população foi identificada como de células dendríticas pelo
fenótipo CD14dim CD16dim HLA-DR+ CD123+ CD64+ e portanto foram descontadas da contagem de monócitos nos dados apresentados a seguir.
5.2.1 Subtipos de monócitos
A Figura 11 mostra os resultados percentuais da imunofenotipagem de monócitos. Em relação às porcentagens totais e suas subpopulações, os grupos de pacientes (SS e SC) apresentaram mais monócitos intermediários e não-clássicos que os indivíduos saudáveis (AA) (P <0.0001 e P =0.0002, respectivamente). Foi observada menor porcentagem de monócitos não-clássicos em pacientes do grupo SS quando comparados ao grupo AA (P=0,0112).
Figura 11: Distribuição, em porcentagem, dos subtipos de monócitos clássicos (azul), não-clássicos
(verde) e intermediários (rosa) em cada grupo da população estudada: controles (AA), anemia falciforme (SS) e hemoglobinopatia SC (SC). O valor de P corresponde ao resultado do ANOVA.
5.2.2 Expressão monocítica de LRP1
A expressão de LRP1 de membrana em monócitos medida a partir da intensidade média de fluorescência dos monócitos em amostras no grupo SS foi significativamente maior que nos grupos SC e AA, e particularmente maior em monócitos intermediários e clássicos do que em não-clássicos, como mostrado na Figura 12.
Figura 12: Expressão de LRP1 em membrana celular por citometria de fluxo nos subtipos de
monócitos clássicos (azul), não-clássicos (verde) e intermediários (rosa) em cada grupo da população estudada: controles (AA), anemia falciforme (SS) e hemoglobinopatia SC (SC). O valor de P corresponde ao resultado do ANOVA.
6. DISCUSSÃO
Apesar de compartilharem a produção de hemoglobina S e os efeitos da polimerização dessa hemoglobina no interior dos eritrócitos, que resultam em hemólise e vaso-oclusão, as doenças falciformes são heterogêneas clinica e laboratorialmente. No presente estudo, foram comparados dois grupos de pacientes portadores de doença falciforme entre os mais frequentemente encontrados na população brasileira, a hemoglobinopatia SC e a anemia falciforme. A avaliação laboratorial dos indivíduos participantes nesse estudo apoia o conceito de que a hemoglobinopatia SC é uma forma mais branda de doença que a anemia falciforme: os pacientes SC apresentaram níveis mais elevados de hemoglobina que AF, menor reticulocitose e menores concentrações de LDH. Além disso, confirmou-se a maior intensidade de hemólise em pacientes SS, que apresentaram maiores concentrações de heme circulante detectado no plasma. Isso apoia a ideia de que pacientes SS estão mais expostos aos efeitos nocivos do heme livre que pacientes SC, e ambos grupos de pacientes foram significativamente diferentes dos controles saudáveis.
Em relação ao principal mecanismo de detoxificação do heme(40–43), mediado pela ligação a hemopexina para direcionar o complexo heme-hemopexina para degradação, observou-se que os níveis de hemopexina circulante estão diminuídos nos pacientes SS e SC em comparação com os controles saudáveis, sugerindo que a presença de hemólise crônica causa um consumo dessa proteína de síntese hepática. Isso também remete ao mecanismo de detoxificação da hemoglobina livre, em que a haptoglobina é consumida e o complexo hemoglobina-haptoglobina é direcionado para as células que degradam esse complexo(44,45). Trata-se, no entanto, de uma segunda linha de defesa, pois o heme é liberado a partir da hemoglobina livre oxidada que não foi captada pela haptoglobina. Além disso, é notável que, apesar da correlação negativa entre os níveis de heme e hemopexina, há uma população pequena de pacientes em que se encontraram altos níveis de ambos analitos (Figura 8). Não é claro por que esses pacientes manteriam altos níveis de hemopexina circulante apesar de alta produção de heme circulante, e uma possibilidade seria haver alguma redução na capacidade de captação dos complexo heme-hemopexina por parte das células portadoras de LRP1. Outro aspecto importante é a limitação da medida de heme realizada neste estudo: não se
pode determinar se o heme total medido está livre ou ligado a alguma proteína, de modo que o excesso de heme detectado em algumas amostras com grande quantidade de hemopexina pode ser devido a heme complexado a outras proteínas circulantes, tais como albumina, alfa1-microglobulina, lipoproteínas etc.
Sobre a proteína receptora do complexo heme-hemopexina, a correlação encontrada entre a forma solúvel (sLRP1) e LDH nos pacientes com anemia falciforme aponta para uma relação entre hemólise e ativação endotelial. Observou-se anteriormente que os níveis de sLRP1 estão aumentados em pacientes portadores de aterosclerose(66–68). Considerando que a LDH é um marcador reconhecido de gravidade da hemólise e de seu impacto em doenças falciformes, a correlação entre ambos parâmetros parece apoiar que o ritmo de hemólise afeta de fato a lesão endotelial. Além disso, considerando que a LRP1 é o receptor de heme-hemopexina, isso sugere que a clivagem de LRP1 de superfície em sLRP1 aumenta quanto maior a intensidade da hemólise. Em função dos maiores níveis de hemoglobina em SC, associados a concentrações de LDH muito mais baixas e próximas do normal, que retratam o menor ritmo hemolítico desse grupo, não se esperava que houvesse correlação entre LDH e sLRP1. Isso reforça que o heme livre deve ter um menor papel na fisiopatologia da hemoglobinopatia SC que na anemia falciforme.
Os dados obtidos sobre os monócitos circulantes mostram que seus subtipos estão alterados nos pacientes em comparação com indivíduos saudáveis. Apesar de originários de um precursor mieloide comum, monócitos podem mudar de função e são capazes de diferenciação celular, originando macrófagos e células dendríticas(77–81). Mesmo sem se diferenciarem em outros tipos celulares, mediante diferentes estímulos, os monócitos são capazes de alterar sua expressão de marcadores celulares como resposta adaptativa. Sua heterogeneidade é detectável baseada na diferença de expressão de receptores lipopolisacarídeos (LPS) CD14 e receptores FCγIIIR CD16, e seria, portanto, esperado que essas células alterassem seus marcadores celulares em resposta a hemólise e aumento de adesividade outras células circulantes sobre o endotélio, presentes nas doenças falciformes.
O aumento da porcentagem de monócitos CD16+ nos pacientes de ambos grupos é compatível com o processo inflamatório crônico dessas doenças, pois
monócitos CD14+CD16++ intermediários estão aumentados em diversas doenças de cunho inflamatório sistêmico, tais como artrite reumatoide, sepse e hepatites virais(90–93). O grupo SS apresentou concentrações de heme aumentadas quando comparada ao grupo controle e concentrações de hemopexina diminuídas, dados concordantes com a literatura, de modo que não surpreende que as alterações mais significativas tenham sido encontradas na anemia falciforme. Esse grupo também apresentou distinta distribuição dos monócitos em seus subtipos, sendo maiores as porcentagens obtidas em monócitos não-clássicos e intermediários e diminuída em monócitos clássicos, de forma que o aumento da proporção de monócitos CD16+ poderia estar associada e regulada pelo excesso de heme e depleção de hemopexina. A Figura 13 representa graficamente uma proposta da distribuição relativa dos receptores CD14, CD16 e LRP1/CD91 na membrana dos monócitos circulantes, de acordo com seus subtipos, encontrada neste estudo.
Figura 13: Representação da distribuição dos receptores CD14, CD16 e LRP1/CD91 de acordo com
subtipo de monócito.
Nossos dados demonstram uma associação entre a maior atividade hemolítica em SS e aumentos tanto da expressão monocítica de LRP1, quanto de sLRP1. Apesar de significativamente aumentada em pacientes do grupo SS, sLRP1 não se correlacionou com outros marcadores de hemólise, exceto com a lactato desidrogenase (LDH), o que parece indicar que a cadeia α da proteína (que é a parte clivada) não tem origem monocítica, e pode derivar de hepatócitos em resposta a inflamação em nível sistêmico deflagrada, entre vários estímulos, pela ativação por heme livre na circulação.
Foi previamente descrito que monócitos intermediários superexpressam o gene da heme oxigenase 1 (HMOX-1) em comparação com as demais subpopulações (77), além de outros genes relacionados ao metabolismo de estresse, de forma que é possível hipotetizar que monócitos equipados com CD16 sejam mais preparados para internalizar complexos heme/Hpx e degradar heme que outros subtipos.
Foi demonstrado, em modelo murino de anemia falciforme, que o heme livre é capaz de ativar o endotélio vascular através de receptores TLR4, levando à produção de mediadores inflamatórios (IL-1, IL-6, IL-8) e vaso-oclusão. A proteína de ligação do LPS, (LBP, do inglês LPS binding protein) transfere o estímulo patogênico ao receptor CD14 na membrana celular, de forma a possibilitar a transferência do sinal para a proteína MD2. A interação de LPS-MD2 com TLR4 forma um complexo, que inicia, via MyD88, a sinalização celular e produção de citocinas pró-inflamatórias(94).
No presente estudo, detectou-se aumento da expressão de LRP1, receptor responsável pela internalização do complexo heme/Hpx, em monócitos com maior expressão de CD14 (monócitos clássicos e intermediários), que é co-expresso com TLR4. Isso sugere que, quanto maior a expressão de LRP1, mais facilmente esses monócitos podem internalizar esses complexos, de modo que é possível resposta celular ao excesso de heme na circulação seja ele livre ou ligado a Hpx.
Uma vez internalizado, seja pela forma livre ou complexado a Hpx, o heme metabolisado gera aumento da biodisponibilidade de ferro intracelular. Dagur e colaboradores (95) demonstraram que o ferro proveniente do heme, liberado durante a hemólise intravascular, pode contribuir para a ativação e manutenção do estado inflamatório em monócitos de pacientes com doença falciforme.
A Figura 14 resume graficamente o modelo proposto para resposta simultânea dos monócitos frente ao heme livre ou complexado a hemopexina:
Figura 14: Mecanismos de resposta a heme em um monócito. O heme livre (1), pode ativar a célula
via receptor tipo toll 4 (TLR4) gerando produção de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), em condições em que ocorre depleção de hemopexina (Hpx). A mesma célula, equipada com LRP1, pode internalizar o complexo heme/Hpx (2), e através de metabolização via heme oxigenase (HO), há aumento do ferro intracelular, promovendo a liberação de citocinas inflamatórias, tais como interleucina 6 (IL-6).(96)
Dessa forma, a heterogeneidade monocítica corrobora que as células possam responder simultaneamente a heme livre para produzir TNF-α via TLR4/CD14, e a heme complexado a Hpx para produzir IL-6 estimulada pela aquisição do ferro do heme via LRP1. Em contrapartida, o subtipo não-clássico, com menor expressão tanto de CD14 quanto de LRP1, seria menos propenso a reagir ao heme em ambas formas, e pode ser vantajoso desviar o fenótipo monocítico para a forma não-clássica para reduzir a resposta inflamatória em condições de aumento crônico de heme circulante, tais como as doenças falciformes.
7. CONCLUSÕES E COMENTÁRIOS FINAIS
Com relação aos objetivos propostos neste estudo, conclui-se que:
A) Em comparação com indivíduos saudáveis e pacientes com hemoglobinopatia SC, pacientes com anemia falciforme apresentam anemia hemolítica mais grave (menor hemoglobina, maior contagem de reticulócitos, LDH e bilirrubina), maior quantidade de heme sérico, fração solúvel de LRP1 (sLRP1) e menores concentrações de hemopexina. Houve correlação positiva entre LDH e sLRP1.
B) As subpopulações de monócitos circulantes diferem entre indivíduos saudáveis, pacientes com hemoglobinopatia SC e anemia falciforme. Há maior porcentagem de monócitos intermediários e não-clássicos nos pacientes, e a expressão de LRP1 na superfície celular é mais intensa nos pacientes com anemia falciforme, particularmente nos monócitos intermediários.
Este estudo ressalta a importância da expressão da proteína LRP1/CD91 nas doenças falciformes. Alterações da LRP1 solúvel e na superfície celular de monócitos são mais evidentes em fenótipos com hemólise mais grave. Além disso, as subpopulações de monócitos são heterogêneas em sua disponibilidade de receptores para o complexo heme/Hpx, e é necessário um melhor entendimento de mecanismos que determinam a expressão de LRP1.
Futuramente, a modulação desse receptor pode alterar o perfil de citocinas induzidas pelo estímulo de heme excessivo em doenças falciformes e também possivelmente a outras situações com hemólise e aumento do heme circulante.
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