MICHELI SEVERO SIELSKI
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PAPEL DAS CÉLULAS PROGENITORAS ENDOTELIAIS NA TROMBOSE ARTERIAL E VENOSA E NO REMODELAMENTO VASCULAR EMCAMUNDONGOS ATEROSCLERÓTICOS
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FICHA CATALOGRÁFICA
Dedico
Agradeço a Deus pela força e determinação durante essa caminhada.
A minha orientadora Profa Dra. Cristina Pontes Vicente, pela confiança,
companheirismo, paciência e por todos os ensinamentos passados.
Ao Profe. Dr. Claudio Werneck pela disposição, sugestões e por
disponibilizar seu laboratório.
Agradeço ao programa de Pós- Graduação em Biologia Celular e
Estrutural e aos docentes, que dão o seu melhor deixando o curso cada vez
melhor.
A secretária Lilíam Alves Senne Panagio, pelo auxilio durante nesses anos.
A fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo – Fapesp pelo
apoio financeiro.
A minha mãe Iraídes, meu porto seguro, pelo incentivo, por acreditar em
mim, estar sempre ao meu lado. Ao meu pai Jorge Luis por todo apoio e
incentivo. Amo vocês!
Ao meu irmão Cristian por estar sempre ao meu lado me incentivando e
torcendo por mim. Mano te amo.
A minha madrinha Márcia, obrigado pelo incentivo, por acreditar e torcer
por mim.
Aos meus tios e primos por estarem ao meu lado, sei que posso contar com
vocês.
Aos meus avós, que sempre estiveram ao meu lado, me ajudaram cada um
da sua maneira. Alguns não estão mais presentes fisicamente, mas
continuam no meu coração.
Aos meus amigos de laboratório Denise, Giane, Juliana, Luiz, Julia,
Andressa, Maiara, Roseane, vocês deixam meus dias mais felizes, fazem
crescer profissionalmente e como pessoa. Muito obrigada por estarem
comigo nesta caminhada, me ajudando, auxiliando, aconselhando.
Aos meus amigos da proteômica Camila, Danielle e Guilherme obrigado
pelos conselhos e pelo auxilio.
pelo incentivo. Muito obrigada
Ao meu amigo Daniel, pela ajuda, por me receber em sua casa no inicio da
minha caminhada, quando, o vim para Campinas fazer meu estágio.
Aos colegas Kaleb, Tobias e Karen, só vocês entendem como é bom comer
bergamota no sol. Obrigada pelo companheirismo e amizade.
A minha amiga e irmã Taci, por me ouvir, me aconselhar a seguir em
frente sempre. Não importa a distância, eu sei que posso contar com você
sempre.
A minha família do coração Anilda, Jeolar, Jessica, Thaís e Emanuel,
muita obrigada pela ajuda, por me receberem na casa de vocês como da
família. O tempo que passei com vocês me fez crescer muito como pessoa.
Vocês moram no meu coração.
Aos meus amigos de republica Matheus, Melina, Maria, Joyce e Cassiano.
Ao meu amigo Marcão por me receber, me ajudar e aconselhar.
Resumo
A Trombose arterial e venosa são consideradas uma das principais causas de morte no mundo de hoje. A trombose arterial pode favorecer a ocorrência de acidente vascular cerebral e de infarto do miocárdio, enquanto que a trombose venosa pode levar à embolia pulmonar. As células progenitoras endoteliais (CPE) foram descritas em 1997, por Asahara et al., e estão presentes no sangue periférico e medula óssea. Estas células apresentam características de células imaturas pluripotentes que se proliferam, migram e se diferenciam em células endoteliais maduras, e são capazes de migrar para o local da lesão ajudando no reparo vascular. O objetivo deste trabalho foi verificar a influência das CPE, utilizadas como terapia celular na trombose arterial e venosa e na formação da camada neointima em camundongos ateroscleróticos.
No presente trabalho, foram utilizados camundongos deficientes para o receptor de LDL. Estes camundongos quando alimentados com uma dieta rica em gorduras apresentam níveis elevados de colesterol e são propensos a desenvolver placas ateroma na parede do vaso. Foram isoladas células mononucleares do fêmur e da tíbia utilizando-se gradiente de Ficoll e em seguida estas células são diferenciadas em CPE com meio EGM-2, e utilizamos estas células para terapia celular a partir da quinta passagem.
As tromboses arteriais e venosas foram induzidas utilizando cloreto férrico e o tempo de trombose foi determinado com uma sonda de ultrasson. Para o tratamento de CPE utilizamos duas injeções, uma 15 minutos e a outra 24 horas após a lesão. Os animais do grupo controle não receberam nenhum tipo de injeção. Após a indução de trombose arterial, os animais foram sacrificados imediatamente, 3, 7 ou 14 dias após a lesão. Na trombose venosa, os animais foram sacrificados no tempo zero, 3 ou 7 dias após a lesão. Os vasos lesionados foram coletados e analisados histologicamente.
Fomos capazes de observar que as injeções CPE interferem no tempo de ambas tromboses, aumentando significativamente o tempo de trombose arterial e venosa. As injeções de CPE também diminuíram a formação neointima em ambos os vasos lesionados. Após 14 dias da lesão, também se observou um aumento na atividade de gelatinases em artérias lesionadas, mas o mesmo aumento não foi observado em veias lesionadas.
Abstract
Venous and arterial thrombosis are considered the leading cause of death the world nowdays. One of the main health complications is that arterial thrombosis may facilitate the occurrence of stroke and myocardial infarction, and also venous thrombosis may lead to pulmonary embolism. Endothelial progenitor cells (EPC) were described in 1997 by Asahara et al., and are present in peripheral blood and bone marrow. These cells present characteristics of pluripotent imature cells that can proliferate, migrate and differentiate into mature endothelial cells, and are able to migrate to the lesion site helping in vascular repair. The objective of this work was to verify the influence of EPC, used as cellular therapy in arterial and venous thrombosis and neointimal formation in atherosclerotic mice.
In these work, we used LDL receptor deficient mice. These mice are fed with high fat diet present elevated cholesterol levels and are prone to develop artheroma plaques in the vessel wall. We also isolated mononuclear cells from mice femur and tibia using ficoll gradient and differentiated them in to EPC with EGM-2 medium until the 5th passage. Arterial and venous thrombosis were induced using Ferric chloride and thrombosis time was determined using an ultrasound probe. The treatment using EPCs was made using two injections, 10 min and 24 hours after lesion. No injection were done in control animals. After thrombosis induction the animals were euthanized immediately, 3, 7 or 14 days after lesion. while in venous thrombosis the animals were euthanized at time zero, 3 or 7 days after lesion. Lesioned vessels were collected and histologically analyzed.
We were able to observe that EPC injections interfere with thrombosis time, increasing it significantly in both arterial and venous thrombosis. EPC injection also decreased neointimal formation in both vessels. After 14 days of lesion, we also observed an increase in gelatinases activity in lesioned arteries, but the same increase was not observed in lesioned veins.
We conclude that EPC when used as a treatment can reach the lesioned site altering thrombosis time and thrombus matrix remodeling promoting vascular repair.
Figura 1 Gráfico da incidência das principais causas de morte. ... 16
Figura 2 Trombose arterial ... 19
Figura 3 Processo de trombose venosa profunda. ... 20
Figura 4 Caracterização e maturação das células progenitoras endoteliais ... 22
Figura 5 Lesão endotelial. ... 24
Figura 6 Modelo de lesão arterial ... 32
Figura 7 Modelo de lesão venosa ... 33
Figura 8. Divisão dos grupos de camundongos submetidos a trombose arterial. ... 34
Figura 9. Divisão dos grupos de camundongos submetidos à trombose venosa. ... 35
Figura 10 Citometria de fluxo. ... 38
Figura 11 Imunofluorescência de CPE ... 40
Figura 12. Nível do colesterol do soro de camundongos LDL ... 42
Figura 13. Nível de triglicerídeos do soro de camundongos LDL ... 43
Figura 14. Nível de glicose do sangue de camundongos LDL -/- . ... 44
Figura 15. Artéria carótida de camundongos LDL -/- coradas com oil red. ... 45
Figura 16. Tempo de oclusão do vaso arterial em camundongos LDL-/- ... 46
Figura 17. Tempo de oclusão do vaso venoso em camundongos LDL -/-. ... 47
Figura 18. Cortes transversais das artérias carótida esquerda corados com hematoxilina eosina (HE). ... 49
Figura 19. Análise da área de trombo arterial. ... 50
Figura 20. Cortes transversais da artéria carótida esquerda de camundongos LDL-/- corados com hematoxilina eosina (HE) ... 51
Figura 21. Analise da área de neointima. ... 52
Figura 22. Analise da migração de CPE. ... 53
Figura 23. Zimografia ‘in situ’ nas artérias de camundongos LDL-/- ... 55
Figura 24. Zimografia ‘in situ’ para a detecção de atividade de gelatinases em arteris no tempo zero ... 56
Figura 25. Zimografia ‘in situ’ nas artérias de camundongos LDL-/- ... 57
Figura 26. Zimografia ‘in situ’ para a detecção de atividade de gelatinases em artérias após 14 dias ... 58
Figura 27. Cortes transversais da veia jugular esquerda corados com hematoxilina eosina (HE) ... 59
Figura 28. Analise da porcentagem da área de neointima venoso. ... 60
Figura 29. Cortes transversais da veia jugular esquerda de camundongos LDL-/- corados com hematoxilina eosina (HE) ... 61
Figura 30 Analise da porcentagem da área de neointima venoso. ... 62
Figura 31. Migração das células marcadas com PKH26 para o local da lesão. ... 63
Figura 32. Quantificação do Fator de transformação do Crescimento β (TGFβ) ... 64
Figura 33. Zimografia ‘in situ’ nas veias de camundongos LDL-/- ... 65
Figura 34. Zimografia ‘in situ’ para a detecção de atividade de gelatinases – analise densidade integrada ... 66
AVC- Acidente vascular cerebral CE – Células endoteliais
CPE – Células progenitoras endoteliais DAPI – 4’6 diamino – 2 fenilindole
DMEM – Meio de cultura modificado por Dulbecco EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acétco
FeCl3 - Cloreto Férrico
FITC – Isotiocianato de Fluoresceína EGM-2 – Meio de crescimento endotelial 2 HE – hemotoxilina eosina
LDL - lipoproteína de baixa densidade MMP- Metaloproteinases
OMS- Organização mundial da saúde PBS - Tampão fosfato-salino
SFB – Soro fetal bovino TF- Fator tecidual
TGF-β – Fator de crescimento transformante TIMP- Regulador tecidual de metaloproteinase VEGFR – Fator de crescimento endotelial vascular
Resumo ... 8 Abstract ... 9 Lista de Figuras ... 11 Lista de abreviaturas ... 13 INTRODUÇÂO ... 16 Doenças Cardiovasculares ... 16 Sistema Vascular ... 16 Aterosclerose ... 17
Trombose Arterial e Venosa ... 18
Camada neointima ... 21
Células Progenitoras Endoteliais... 21
Modelo Aterosclerótico ... 24
Modelo de Trombose por Cloreto Férrico ... 25
Fator de crescimento transformante – β ... 25
Metaloproteinases da Matriz extracelular ... 26
OBJETIVO GERAL ... 27
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 27
MATERIAIS E METODOS ... 28
Isolamento das Células Mononucleares de medula óssea de camundongo ... 28
Cultura das Células mononucleares e Proliferação celular ... 28
Citometria de fluxo ... 28
Imunohistoquimica das células ... 28
Camundongos ... 29
Dieta hiperlipídica ... 29
Quantificação dos níveis de colesterol, triglicerídeos e glicose do plasma sanguíneo. ... 30
Modelo da Trombose Arterial ... 31
Modelo da Trombose Venosa ... 32
Tratamento da trombose arterial com CPE ... 34
Tratamento da trombose venosa com CPE ... 34
Análise do tempo de trombose venosa e arterial ... 35
ELISA ... 37 Análise Estatística ... 37 RESULTADOS ... 38 DISCUSSÃO ... 69 CONCLUSÃO ... 74 BIBLIOGRAFIA ... 75 ANEXOS ... 79
INTRODUÇÃO
Doenças Cardiovasculares
As doenças cardiovasculares são uma das principais causas de morte no mundo globalizado atingindo principalmente os países em desenvolvimento [1]. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS) em 2011 foram 17,5 milhões de mortes no mundo, representando 31% das causas de óbito, mostrado pela figura 1.
Figura 1 Distribuição das principais causas de morte. As doenças cardiovasculares são uma das principais causas representando 31 % das mortes. Gráfico modificado do Atlas global de prevenção e controle de doenças cardiovasculares da OMS.
Devido à alta taxa de mortalidade, a perda de produtividade e os enormes gastos com a saúde, são necessárias mais pesquisas para a profilaxia e o tratamento destas doenças.
O Sistema Vascular
A principal função do sistema vascular é levar oxigênio e nutrientes para os órgãos e tecidos do corpo. Este sistema é formado por artérias, arteríolas, veias, vênulas e capilares. Os vasos são revestidos internamente por uma monocamada de células endoteliais (CE) formando o endotélio, o qual fica apoiado sobre uma matriz extracelular [2, 3]. Ele regula a homeostasia vascular, que é o processo fisiológico que mantêm o sangue líquido no sistema vascular após a lesão [4].
31%
27% 9%
33%
Doenças Cardiovasculares Condições maternal, perinatal e nutricional
Lesões
Em condições normais, a função do sistema vascular é manter o tônus dos vasos e a fluidez do sangue, bem como limitar a inflamação e a proliferação de células de musculo liso na camada média dos vasos. Quando fatores de risco estão presentes pode ocorrer uma ativação do endotélio contribuindo para o desenvolvimento de doenças como a aterosclerose, a trombose e inflamação [2, 5]. Com a ativação das CEs o endotélio adquire um perfil inflamatório, com aumento da expressão de proteínas envolvidas na adesão de células inflamatórias, e se torna trombótico, aumentando a adesão de plaquetas e estimulando a formação de trombos. Estes processos deixam de manter a homeostase vascular e liberam fatores pró-inflamatórios, tais como moléculas de adesão e citocinas, causando a migração e adesão de monócitos, linfócitos e neutrófilos para o espaço subendotelial [6].
Aterosclerose
A aterosclerose é uma doença que atinge as paredes das artérias, principalmente de médio e grande calibre [7]. As lesões se iniciam pelo espessamento da camada intima, evoluindo para a média e adventícia. [8] A retenção e oxidação de lipídios do plasma sanguíneo para a camada intima da artéria iniciam o processo aterosclerótico, induzindo as células endoteliais e de musculo liso a expressar moléculas de adesão. Estas interagem com monócitos, estimulando sua migração e diferenciação em macrófagos, que, por sua vez, perdem sua função transformando-se em células espumosas, podendo até se calcificar com o tempo. Em volta das lesões ocorre o crescimento das células de músculo liso, formando uma capa fibrosa de células e colágeno induzindo a formação de placas de ateroma na parede dos vasos sanguíneos [9].
As placas de ateroma têm por consequência a diminuição do lúmen do vaso e do fluxo sanguíneo. Quando em estágio avançado estas placas podem romper, levando a ativação de plaquetas, à exposição das camadas subendoteliais do vaso, e à formação de trombos. [8, 10]
O desenvolvimento da aterosclerose é estimulado pelo aumento de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) no plasma sanguíneo [9], especialmente quando, associado a fatores riscos [11]. Como por exemplo, o tabagismo, hipertensão arterial, diabetes mellitus, fatores genéticos, idade avançada, sedentarismo, sobrepeso e obesidade [8]. Trata-se de uma doença silenciosa, e pode levar décadas para manifestar os primeiros sintomas [12]. Os principais
tratamentos para a aterosclerose levam à revascularização tais como o bypass e a angioplastia [13].
Esta doença acomete as paredes das artérias, mas Prandoni e seu grupo (2003) relataram que a aterosclerose assintomática também está relacionada ao aumento de trombos venosos, dos 153 pacientes com trombose venosa espontânea, analisados pelo grupo, 72 apresentavam placas de ateroma na artéria carótida. O aumento da ativação de plaquetas, da coagulação e de fibrina no sangue, causada pela aterosclerose, podem favorecer um estado pro-trombótico, aumentando os riscos de desenvolver trombose venosa espontânea [14].
A aterosclerose é umas das causas da trombose arterial, devido à ruptura de placas ateroscleróticas, e está relacionada também ao aumento da incidência de trombos venosos. Os trombos venosos e arteriais têm diferenças em suas composições e causas.
Trombose Arterial e Venosa
Segundo o Ministério da Saúde no Brasil os ataques cardíacos e os acidentes vasculares cerebrais (AVC) são as complicações da trombose arterial que mais levam pacientes a óbito. Estas complicações ocorrem pela formação de trombos nas artérias impedindo o fluxo sanguíneo bloqueando o fluxo de oxigênio e, causando danos nos tecidos adjacentes. Os trombos arteriais são constituídos principalmente de plaquetas, que após a lesão vascular são rapidamente recrutadas para o local interagindo com o colágeno e o fator de Von Willebrand, evitando assim hemorragias [15], conforme observado na figura 2:
Figura 2 Trombose arterial A lesão no endotélio irá expor o fator tecidual (TF) levando a ativação e migração de plaquetas para o local formando o trombo arterial.
A trombose venosa é a terceira maior causa de morte associada a doenças cardiovasculares [16, 17], sendo as principais à trombose venosa profunda e a embolia pulmonar [18]. Trombos venosos podem ocorrer por estagnação do fluxo, sem ocorrer necessariamente dano no endotélio [19]. A estase induz a disfunção endotelial e a expressão de moléculas de adesão, como as P-selectina e E-selectina, que irão recrutar leucócitos para a parede do vaso, e darão início à atividade pró-coagulante, estimulando o acumulo de fibrina e glóbulos vermelhos. Como consequência disso, o processo de trombose venosa profunda é desencadeado, conforme ilustrado na figura 3 [17, 20]. A veia fica obstruída, e quando uma parte deste trombo se desprende, podendo ocasionar a embolia pulmonar [17].
O principal tratamento para a trombose venosa é a administração de anticoagulantes o que pode ocasionar complicações como hemorragias [21, 22] em caso de tratamentos a longo prazo.
Figura 3. Processo de trombose venosa profunda: A estase do fluxo sanguíneo ativa o endotélio, que expressa moléculas de adesão recrutando leucócitos para o local levando a atividade pró trombótica e a formação do trombo venoso. Figura modificada de Wolberg (2015).
Enquanto trombos arteriais podem ser desencadeados pelo rompimento das placas ateroscleróticas [16], hipertensão arterial e hipercolesterolemia [23]. A trombose venosa, é desencadeada por fatores como a idade avançada, em que há um aumento de fatores da coagulação sanguínea no plasma[24], traumas, cirurgia, imobilização, câncer e gravidez. [20]. Com o aumento dos fatores de risco que a população está exposta, e, considerando a alimentação desregrada da população em geral, sedentarismo e o aumento da expectativa de vida, a OMS estima que em 2030 serão mais de 23 milhões de mortes por doenças cardiovasculares. Assim novos estudos que visam melhorar a qualidade de vida dos pacientes e até mesmo prevenir estas doenças são necessários.
Camada neointima
O crescimento das células de musculo liso está associado ao dano no endotélio, que pode ocorrer por intervenção cirúrgica que promova o dano no endotélio ou pelo rompimento de placas de ateroma [26]. Após a angioplastia, ocorre crescimento das células de musculo liso, que é um processo normal de cicatrização do vaso lesionado para evitar o contato do stent com o fluxo sanguíneo. No entanto, o crescimento exagerado desta camada leva à formação da camada neointima e ao consequente estreitamento do vaso, com extenso remodelamento vascular e formação de matriz extracelular [25].
A camada neointima é o espessamento da camada intima do vaso sanguíneo, através da migração de células musculares lisas da camada média para o lúmen do vaso onde elas se proliferam e secretam matriz extracelular. Com o crescimento destas células, ocorre o estreitamento do vaso sanguíneo dificultando o fluxo sanguíneo [26].
Este estreitamento vascular, também conhecido como reestenonse, é um fator limitante na colocação de stents [25], problema que atinge de 16 % a 44% dos pacientes que colocaram stents. Muitos avanços estão sendo feitos com stents farmacológicos, mas ainda assim observa-se uma falha em até 16% dos pacientes, levando a reestenose, e muitas vezes faz-se necessário uma nova submissão cirúrgica [27].
No vaso venoso, o crescimento das células de músculo liso é chamado de hiperplasia neointimal, e é uma das complicações da fístula arteriovenosa feita em pacientes que precisam fazer hemodiálise, levando à disfunção e gastos exorbitantes com tratamento de complicações vasculares [28, 29].
Células Progenitoras Endoteliais
As células progenitoras endoteliais (CPE) foram descritas pela primeira vez por Asahara et al., tendo sido isoladas do sangue periférico humano como uma população de células CD34 positivas [1]. Elas estão principalmente presentes no sangue periférico, no cordão umbilical e na medula óssea, onde estão em maior quantidade [2, 3]. Elas formam uma população de células pluripotentes com capacidade de migrar e se diferenciar em uma linhagem de células endoteliais [4], e podem estar diretamente relacionadas com processos de remodelamento vascular após a lesão arterial.
As CPE são caracterizadas principalmente pela presença de marcadores de superfície como o CD34, o CD133, o receptor para o fator de crescimento endotelial (VEGFR-2) e o CD 31. Inicialmente, elas expressam os marcadores CD34 e o CD133 e durante o processo de maturação e diferenciação, a expressão destes marcadores diminui, aumentando a expressão do marcador CD 31 [5].
O marcador CD34 é encontrado em células no início da hematopoiese, servindo para o isolamento de células tronco [6]; o CD 133 também está expresso em células hematopoiéticas imaturas [7], e é considerado, um marcador de CPE imaturas; já o VEGFR-2 (FLK-1 ou KDR) é um indutor da angiogênese que estimula a proliferação, migração e a formação de vasos endoteliais [8, 9]; e o CD 31, que tem um papel vascular característico, é expresso por todas as células com comportamento vascular em diferentes graus de diferenciação [10]. Os marcadores celulares e a maturação das CPE podem ser observados na figura 4.
Figura 4 Caracterização e maturação das células progenitoras endoteliais e a expressão dos marcadores. (Figura modificada de Kasprzak, 2007) [30].
As CPE participam da vasculogênese e angiogênese que ocorre na vida pós-natal, fato que as tornam importantes no reparo vascular e na criação de novos vasos[31]. Para auxiliar na neovascularização, as CPEs podem ser mobilizadas da medula óssea para a circulação por meio de citocinas, ou serem utilizadas como terapia celular. Nesse caso essas células são obtidas a partir da medula óssea, do sangue de cordão, e cultivadas para sua indução ou aumento de seu número inicial, e também podem ser manipuladas in vitro para aprimorar sua capacidade de reparo vascular [32].
Em humanos, a quantidade de CPE circulantes é pequena e tem sido observado que sua função se encontra prejudicada em pacientes com doenças cardíacas, diabetes, doença pulmonar e hipertensão arterial [33]. Estudos recentes têm demonstrado que elas podem ser utilizadas como biomarcadores destas doenças [34]. Um recente trabalho desenvolvido em nosso laboratório demonstrou uma diminuição significativa do número de CPE circulantes em mulheres apresentando hipertensão arterial moderada e severa [35].
Trabalhos com animais e humanos sugerem a habilidade das CPEs em melhorar as funções de órgãos isquêmicos, possivelmente pela indução e modulação da angiogênese e vasculogênese, ou pelo estímulo da re-endotelização de injúrias nos vasos [36]. Em camundongos diabéticos ocorre a diminuição do número de CPE na circulação sanguínea, que pode estar relacionado ao comprometimento na cicatrização de feridas, observado nesta doença [37].
Xu et al (2015) demonstrou a atividade das CPE em ratos com sepse, tendo sido observado que a injeção dessas células ajudaram a regular o processo pró e anti-inflamatório, auxiliando significativamente no reparo de danos no pulmão, rim e fígado [38].
Rosell (2013) utilizou o meio condicionado da cultura de CPE no tratamento de isquemia cerebral de camundongos, demonstrando que o meio condicionado ajudou a recuperar a lesão isquêmica. Sugere-se que as CPE secretam citocinas que ajudam a recuperar as lesões, e este tratamento pode ser mais seguro, pois evita a injeção de células [39].
Como mostrado na figura 5, as CPE podem ser mobilizadas e recrutadas do sangue periférico e da medula óssea para local de lesão endotelial onde fazem o reparo do endotélio. O uso terapêutico das CPEs na substituição do endotélio lesionado é um dos principais focos das pesquisas vasculares no mundo. Considerando-se que as doenças vasculares são uma das principais causas de morte no mundo, destaca-se a aterosclerose, que é caracterizada pelo depósito de placas de ateroma na parede das artérias. Isto torna o endotélio disfuncional, reduzindo o calibre, e trazendo déficit sanguíneo aos tecidos por eles irrigados [40]. Estudos que aumentem a compreensão sobre o mecanismo de ação destas células no reparo vascular podem auxiliar no tratamento e na diminuição dos efeitos deletérios das doenças vasculares na população.
Figura 5 Lesão endotelial pela presença de fatores de risco e migração das CPE para regeneração do endotélio.
Modelo Aterosclerótico
Os modelos animais são a base para o entendimento de muitas doenças, acelerando as pesquisas com tratamento e profilaxia das mesmas. Um dos modelos para a aterosclerose é o camundongo deficiente no gene que codifica o receptor de LDL (lipoproteína de baixa densidade) [41]. A ausência do receptor de LDL leva ao acúmulo do colesterol no plasma sanguíneo e ao desenvolvimento de placas de ateroma na parede da aorta destes camundongos [42]. Em humanos, a mutação no gene do LDLr causa a hipercolesterolemia familial, resultando no aumento do colesterol LDL nestes pacientes [43].
Os camundongos LDL-/- tem os níveis de colesterol aumentado e placas de ateromas nas paredes dos vasos sanguíneos quando alimentado com uma dieta rica em lipídios. A quantidade e tamanho das lesões são proporcionais ao tempo de alimentação que os camundongos são expostos. Com uma dieta normal os animais desenvolvem pouca ou nenhuma placa de ateroma e os níveis de colesterol não são alterados [44].
Os camundongos deficientes no receptor de LDL e com a dieta hiperlipídica desenvolvem placas de aterosclerose mimetizando em partes os riscos em que a população está exposta. Visto que o aumento do colesterol é um fator de risco para a aterosclerose, e
para o aumento da incidência da trombose venosa profunda, esse modelo foi eleito neste estudo como modelo de trombose arterial e venosa.
Modelo de Trombose por Cloreto Férrico
Os camundongos ateroscleróticos desenvolvem a fase assintomática da aterosclerose, não chegando a desenvolver trombose arterial e venosa espontaneamente [9]. Por isso escolhemos o modelo de formação de trombos por cloreto férrico (FeCl3) para estudar a trombose venosa e a arterial, pois além de formar trombos que ocluem o vaso este modelo leva a formação da camada neointima [45].
O cloreto férrico (FeCl3) é um reagente químico ácido de coloração castanho escuro que vem se tornando um método comum para investigação de mecanismo trombóticos em camundongos [46]. Trata-se de um modelo de trombose simples e bem utilizado por ser um modelo sensível a drogas anticoagulantes e antiplaquetárias [47]. O modelo consiste na aplicação um papel filtro no tamanho de 1mm2 saturado com cloreto férrico e colocar sobre a artéria deixando por alguns minutos. A concentração do reagente pode variar entre 10 e 50% [46].
Em 1990, uma solução de cloreto férrico foi aplicada na artéria carótida exposta de ratos para induzir a trombose oclusiva [48]. Em 1998, o modelo de trombose arterial causada pelo cloreto férrico foi adaptado para camundongos no estudo da deficiência do inibidor do ativador do plasminogênio (PAI-1) [49]. Este modelo também foi adaptado mudando a concentração e o tempo de exposição do cloreto no vaso venoso para causar trombose da veia cava [50, 51]. A lesão ocorre porque o cloreto férrico é capaz de penetrar na parede vascular, e causar desnudamento das células endoteliais expondo o subendotélio e as fibras de colágeno, e ativando a cascata de coagulação sanguínea, consequentemente formando o trombo [52].
Fator de crescimento transformante – β
O fator de crescimento transformante – β (TGF-β) é a citocina, responsável por regular a proliferação e a diferenciação de células e a produção de matriz extracelular [53]. Muitos tipos de células como macrófagos, células endoteliais, células de musculo liso e plaquetas
produzem o TGF-β [54]. A diminuição ou o aumento da concentração desta citocina no organismo está relacionado com o aparecimento muitas doenças. [53].
Na aterosclerose, o TGF- β inibe a proliferação das células musculares lisas, estimula a secreção do colágeno estabilizando as placas de ateroma [55]. Após a injúria vascular, ele age na proliferação das células musculares lisas, na síntese de matriz extracelular e diminui a atividade das metaloproteinases (MMPs), contribuindo para a reestenose do vaso sanguíneo [55].
Metaloproteinases da Matriz extracelular
As metaloproteinases (MMPs) constituem uma família de enzimas proteolíticas secretadas por células de músculo liso, células endoteliais, monócitos e macrófagos. São reguladas por sinais inflamatórios, capazes de degradar componentes de matriz extracelular como o colágeno, elastina, fibronectina e proteoglicanos mediando o remodelamento vascular [56, 57].
As MMPs são inibidas pelas TIMPs (reguladores teciduais de metaloproteinases), regulando assim sua atividade. Quando ocorre um desequilíbrio entre a atividade destas duas moléculas, ocorre um aumento da atividade das MMPs, causando um degradação excessiva da matriz extracelular, levando a alterações que podem estar associadas ao desenvolvimento de doenças. Nas doenças cardiovasculares sua função está associada principalmente com o avanço e ruptura das placas de ateromas pela degradação da capa fibrosa [56]. As MMPs participam também do remodelamento vascular degradando e reorganizando a matriz extracelular [58].
Elas estão também envolvidas com o início da angiogênese, pois ao degradar a matriz extracelular permitem que as células endoteliais migrem e formem novos vasos. Além do mais, sua atividade também pode liberar citocinas relacionadas à matriz extracelular e a angiogênese, como o TGF-b [59].
OBJETIVO GERAL
Analisar a ação das CPE no remodelamento vascular e na resolução do trombo arterial e venoso, em camundongos ateroscleróticos submetidos à lesão por cloreto férrico da artéria carótida ou da veia jugular.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Estudar o efeito das CPE injetadas como terapia celular no tempo de oclusão do vaso arterial e venoso, medido pelo tempo formação do trombo após a lesão induzida por cloreto férrico;
Analisar a migração das CPE injetadas para o local da lesão;
Analisar a influência da CPE no tamanho do trombo arterial e venoso;
Analisar a influência das CPE na formação da camada neointima arterial e venoso em diferentes tempos após a lesão;
Determinar a concentração de TGF-β circulante no plasma dos animais após a lesão arterial;
Estudar a atividade de gelatinases, nos vasos lesionados em animais tratados com à terapia celular de CPE ou não.
MATERIAIS E METODOS
Isolamento das Células Mononucleares de medula óssea de camundongo
As células mononucleares foram isoladas de medula óssea dos camundongos machos C57BL/6 com aproximadamente 25g +/- 2g. Os animais foram sacrificados por aprofundamento de anestesia com ketamina (100mg/kg). O fêmur, a tíbia e o úmero foram isolados e as epífises dos ossos cortadas permitindo a perfusão da medula óssea (meio DMEM com 10% soro fetal bovino (SFB) e 2% de Penicilina/Estreptomicina- Nutricell). Centrifugou-se o aspirado de medula (10 minutos a 300 xg), após foi feito o isolamento das células mononucleares totais com gradiente de Ficoll- Plaque PLUS (GE Healthcare), centrifugando por 38 min a 300xg, e em seguida as células foram contadas em câmara de Neubauer e cultivadas como descrita a seguir.
Cultura das Células mononucleares e Proliferação celular
Após o isolamento com Ficoll das células monoculares uma concentração de 106cél/ml foram plaqueadas em garrafas de 25 cm² coberta com gelatina (Sigma) 2% e cultivadas em meio EGM-2 (LONZA) suplementado com o kit para cultura de células endoteliais (LONZA) e 10% de SFB. Trocou-se o meio das células a cada 2 dias, e para os experimentos utilizou-se as células da 5a a 15a passagem. O meio EGM-2 diferencia as células mononucleares em células CPE.
Citometria de fluxo
A expressão dos marcadores de superfície das células obtidas de medula óssea e cultivadas em meio EGM-2, foi analisada por citometria de fluxo no FACScalibur (BD Biociences, Franklin Lakes, NJ/USA) usando anticorpo anti mouse CD34 – FITC (eBioscience, San Diego, CA –USA), rat anti – mouse Prominina-PE (CD 133) ( eBiocience, San Diego, CA – USA) e rat anti-VEGFR2, conjugado com Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Carlsbad, Ca/USA). Para a leitura foram obtidos 50.000 eventos.
Imunohistoquimica das células
As CPE cultivadas em meio EGM-2, após a 5a passagem foram plaqueadas em placas de 24 well em lamínulas, quando estavam aderidas foi feita a imunohistoquimica para a caracterização da expressão dos marcadores expressos pelas células. Foram utilizados os
anticorpos rat anti-mouse CD 31 (Invitrogen), rat anti mouse CD 34 (eBioscience) e o rat anti-mouse FlK1 (VEGFR2- eBiocience), característicos de células progenitoras endoteliais. Os anticorpos foram diluídos conforme instruções do fabricante, e após incubados por pelo menos 2 horas, lavou-se para retirar o excesso de anticorpo e incubou-se com o anticorpo secundário anti-rat FITC (eBiocience) por 45 minutos. Em seguidas as amostras foram lavadas e os núcleos corados com DAPI por 15 minutos. As lâminas foram montadas e examinou-se em microscópio Olympus BX600. As imagens foram feitas com câmera Olympus Optical U-ULH.
Camundongos
Foram utilizados camundongos machos selvagens da linhagem C57BL/6 para a cultura celular e camundongos machos deficientes no receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDL -/-) da linhagem B6.12957- Ldlrtm1 para os experimentos com a trombose arterial e venosa adquiridos do CEMIB/UNICAMP, os animais foram mantidos no biotério do Departamento de Biologia Celular e Estrutural da UNICAMP sob a responsabilidade da Profa. Dra. Cristina Pontes Vicente. Este trabalho foi aprovado pelo comitê de ética da UNICAMP (CEUA no 3504-1).
Dieta hiperlipídica
Os camundongos LDL -/- foram alimentados com dieta hiperlipídica durante quatro semanas. De acordo com o fabricante (Pragsoluções biociências) a ração é composta por 18% de proteína, 22% de gordura total, e 45% carboidratos.
Produto Quantidade % Amido de milho 20,87 Caseína 14 Amido dextrinizado 10 Sacarose 10 Óleo de soja 4 Celulose microcristalina 5
Mix mineral AIN 93G 3,5
Mix vitaminas AIN 93 1
L-cistina 0,18
Cloreto de colina 0,25
Banha 31,2
Tabela 1: Composição da dieta hiperlipídica fornecida aos animais LDL -/- durante quatro semanas
Esta dieta leva ao aumento do colesterol nestes animais, e à formação de placas de aterosclerose, mimetizando os riscos a que a população está exposta.
Quantificação dos níveis de colesterol, triglicerídeos e glicose do plasma sanguíneo. Para medir os níveis de colesterol e triglicerídeos, utilizou-se o soro obtido do sangue dos camundongos LDL -/-, coletado da veia cava dos camundongos, após jejum de 12 horas. Estes foram dosados através do método enzimático em Espectofotômetro. Utilizando-se os kits Bioclin para colesterol e triglicerídeos (Bioclin – MG/Brasil). Os testes foram realizados após os camundongos serem alimentados 4 semanas com dieta normal, ou com a dieta hiperlipídica. Para os testes utilizou-se cubetas, sendo uma delas B (branco- sem amostra), outra P (padrão do Kit), e para as amostras feitas em duplicata. Em cada cubeta foi adicionado 1 ml do reativo de trabalho, na cubeta P adicionou 10 µl do padrão, para as amostras adicionou-se 10 µl do soro, e o branco continha apenas o reagente de trabalho. Incubou-se por 5 min em banho maria à 37o C, e em seguida foram lidas no Espectofotômetro a 505nm, com o aparelho zerado com o branco. Utilizou-se um n=5 animais por grupo.
A glicose foi medida do sangue dos camundongos, após 12 horas de jejum, utilizando-se o glicosímetro e as fitas (Accu-Chek). A glicoutilizando-se foi medidas 2 vezes, antes do inicio da
dieta hiperlipídica, e após 4 semanas de dieta. Para a coleta do sangue foi feito um pequeno corte com bisturi na cauda do camundongo.
Modelo da Trombose Arterial
Os camundongos pesando 25g com 8 semanas de idade foram anestesiados com 16 mg/kg de xilazina e 100 mg/kg de ketamina. Após uma incisão na cervical média e após isolar a artéria carótida comum esquerda (Figura 6, A e B), foi provocada a trombose química. Colocou-se sobre a artéria um papel de 1mm² (Whatmann 3MM) previamente preparado com 15% cloreto férrico, por 2 minutos (Figura 6 C), após este tempo o papel foi removido e o vaso lavado com PBS para evitar lesões em locais indesejados. Então foi posicionada uma sonda de ultrassom pra medir o fluxo sanguíneo (Figura 6, D) [46]. Foi utilizado um n=6 camundongos por grupo.
Para a preparação do papel com cloreto férrico a 15%, cortou-se papeis filtro no tamanho de 1 mm² estes foram embebidos em uma solução de 15% de cloreto férrico por 24h. Após este tempo estes papeis foram secos em estufa por uma 1h, e usados para provocar a lesão arterial.
Figura 6 Modelo de lesão arterial: (A e B) Isolamento da artéria carótida comum, (C) indução da trombose arterial com papel saturado com cloreto férrico, (D) posicionamento da sonda de ultrassom para medição do fluxo sanguíneo.
Modelo da Trombose Venosa
Os camundongos pesando 25g com cerca de 8 semanas foram anestesiados como descrito anteriormente, e em seguida fez-se uma incisão média cervical para isolar a veia jugular esquerda (Figura 7, A). Depois de isolada colocou-se o papel de cloreto férrico 8% previamente preparado (Figura 7, B), por 1min 30s, e em seguida o papel foi removido e a
veia lavada com PBS para evitar lesões em locais indesejados. Foi posicionada uma sonda de ultrassom pra medir o fluxo sanguíneo (Figura 7, C) [46].
Para a preparação dos papéis filtro, estes foram cortados com 1mm2 embebidos em uma solução de cloreto férrico 8%, por 24h. Após este tempo colocou-se os papéis em estufa por uma 1h, e utilizando-os para provocar uma lesão química na veia jugular esquerda.
Figura 7 Modelo de lesão venosa (A) Isolamento da veia jugular esquerda, (B) indução da trombose venosa com papel saturado com cloreto férrico a 8%, (D) posicionamento da sonda de ultrassom para medição do fluxo sanguíneo.
Tratamento da trombose arterial com CPE
As CPE foram administradas pela veia da cauda, 15 minutos antes e 24 horas depois da indução da lesão arterial por cloreto férrico, sendo injetados 1 x 106 células/injeção. Os animais foram sacrificados imediatamente, 3 dias, 7 dias ou 14 dias após a lesão da artéria com cloreto férrico (Figura 8). Os animais do grupo controle foram sacrificados nos mesmo tempo após a lesão arterial por cloreto férrico, e não houve nenhum tipo de injeção. Foram utilizadas n=6 para cada grupo testado, todos os animais foram alimentados com a dieta hiperlipidíca.
Figura 8. Divisão dos grupos de camundongos submetidos a trombose arterial.
Tratamento da trombose venosa com CPE
Para os animais do grupo de trombose venosa, as CPE (106 células/injeção) foram administradas pela veia da cauda, 15 minutos antes e 24 horas após a indução da lesão venosa por cloreto férrico. Os animais foram sacrificados imediatamente, 3 dias e 7 dias após a lesão (Figura 9). Animais do grupo controle foram eutanasiados com os mesmo tempo após a lesão e não receberam injeção (Figura 9). Foram utilizados n=6 para cada grupo testado. Todos animais utilizados foram alimentados com a dieta rica em lipídios.
Figura 9. Divisão dos grupos de camundongos submetidos à trombose venosa.
Análise do tempo de trombose venosa e arterial
Após a lesão arterial ou venosa por cloreto férrico como descrito previamente foi posicionada uma sonda de ultrasson (Transonic Flowprobe MAO 5 PBS) no local, e o fluxo sanguíneo registrado pelo programa DATAQ (Transonic System TS 420). Para o tempo de oclusão foi utilizada uma medida do tempo entre o fluxo inicial e o tempo onde o fluxo parou por oclusão do vaso pela formação do trombo promovido pela lesão. Foi medido o tempo de oclusão nos animais controle, com lesão arterial ou venosa e sem injeção de CPE, e em camundongos injetados com 1x106 de CPE, 15 minutos antes da lesão arterial ou venosa, para verificar se as CPE influenciam no tempo de formação do trombo.
Análise Histológica
As artérias carótidas e as veias jugulares foram coletadas e embebidas em OCT (Tissue Tek Optimal Cutting temperature compound, Torrance – USA), e armazenados no biofreezer a -80o C. Em seguida foram feitos cortes transversais de 8 µm de espessura em
criostato, com 20 lâminas de cada vaso com 5 cortes por lâmina, também armazenados em biofreezer a -80o C. Os cortes foram descongelados e as lâminas 1, 5, 10, 15 e a 20 foram coradas com hematoxilina-eosina. As lâminas foram montadas com Cytoseal 60 (Richard Allan Scientific) e examinadas em microscópio Olympus BX600. As imagem foram feitas com câmera Olympus Optical U-ULH e analisadas com o programa ImageJ. Para a área de trombo foi escolhido o corte com maior obstrução ao longo do vaso, e a área do trombo foi calculada pela subtração da área ocluída do vaso pela área total do vaso delimitada pela lâmina elástica.
Cortes histológicos de artérias de animais alimentados tanto com dieta normal, quanto rica em lipídios, foram submetidos à coloração por oil red O (Sigma). Esta coloração marca os lipídios em vermelho, evidenciando assim sua presença e das placas formadas nos vasos observados, tendo em vista que, camundongos LDL -/- alimentados com uma dieta hiperlipidica tendem a formar placas de aterosclerose na parede das artérias.
Migração das CPE marcadas com PKH26
Grupos de animais nos tempos 0, 3 e 7 dias com trombose arterial ou venosa receberam injeções de células marcadas com PKH-26 GL (Sigma, St. Louis, MO) de acordo com a fabricante. Estas células apresentam uma fluorescência amarelo alaranjada em sua membrana plasmática. Os animais que receberam essas células foram sacrificados imediatamente, ou foram mantidos por 3 ou 7 dias após a lesão arterial ou venosa. Após os animais serem sacrificados as artérias ou veias foram coletadas, incluídas em OCT e foram feitos cortes transversais de 8 µm ao longo do vaso. A análise da presença das células foi feita com o programa ImageJ e as imagens obtidas em microscópio Zeiss Observer Z.1 (Zeiss, Alemanha). Utilizou-se 3 animais em cada grupo.
Zimografia In situ
Os cortes de 8 µm armazenados no biofreezer foram descongelados e incubados em uma solução de 1 mg/ml de DQ-gelatina (Invitrogen) marcada com fluoresceína em tampão para a detecção da atividade de gelatinases (Tris 0,5M, NaCl 1,5M, CaCl2 50mM em pH7,6)
durante 2 horas em câmera úmida escura, em temperatura ambiente. Os cortes foram examinadas em microscópio de fluorescência (Observer Z.1, Zeiss, Oberkochen, Germany) na magnitude de 200x para a artéria e 300x para a veia (Axio Vision 4.8 Software). A atividade proteolítica foi detectada por um aumento da intensidade de fluorescência devido à atividade
gelatinolítica, e a intensidade de fluorescência nos diferentes cortes foi quantificada no programa Image J (NIH).
ELISA
A determinação de TGF-β do plasma dos camundongos foi feita pelo método de ELISA. Para obtenção do plasma, o sangue foi coletado da veia da cava com 10% de citrato de sódio 3,8% e o plasma separado por centrifugação. O TGF-β foi quantificado utilizando o kit (cat n. CHC1683 – Invitrogen, EUA) .
Análise Estatística
A significância estatística foi determinada através do teste Mann Whitney nos grupos com n>5 e pelo teste t student nos grupos com n≤5, valores de p ≤ 0,05 foram considerados significativos.
RESULTADOS
Caracterização das CPE por citometria de fluxo e imunofluorescência
As células retiradas da medula óssea de camundongos C57BL6 foram cultivadas em meio EGM-2 suplementado com fatores de crescimento e 10% de soro fetal bovino (SFB), e analisadas por citometria de fluxo e imunofluorescência (com pelo menos 5 passagens).
Para a citometria de fluxo utilizou-se os seguintes marcadores CD45, CD34, CD31. Foi observado que 85% das células eram CD45 negativas ou low e quando quantificamos estes marcadores isoladamente pudemos observar que dentre as CD45 low/negativas, 32% apresentavam o marcador CD34, 49% expressavam CD31 e quando analisamos estes marcadores em conjunto observamos que 52% das células expressavam os dois marcadores CD34 e CD31, sendo CD 45 negativas/low (Figura 10). Estes marcadores caracterizam um fenótipo de células endoteliais, como já foi descrito em literatura anteriormente [60].
Figura 10 Citometria de fluxo. Analise da expressão de marcadores das CPE cultivadas em EGM-2 por pelo menos 5 passagens. Valores expressos em % em relação a 50.000 eventos. Todas as células são CD45 low.
A imunofluorescência foi feita usando os seguintes marcadores CD 31 conjugado com FITC (Figura 11, A), CD 34 conjugada com FITC (Figura 11, D) e VEGFR conjugada com FITC (Figura 11, G). Os núcleos foram corados com DAPI (Figura 11, B, E, H e K ). Foi observado que as células marcaram principalmente o CD 31, e mais fracamente o CD 34 e o VEGFR.
Com o cultivo das CPE em meio EGM-2 por pelo menos 5 passagem, elas vão adquirindo um fenótipo mais tardio, aumentando a expressão de CD31, e diminuindo os marcadores iniciais como o CD 34.
Figura 11 Imunofluorescência de CPE da medula óssea de camundongo C57BL6 após 5ª passagem de cultura em meio EGM-2. Com o marcador CD 31(A e C), CD 34 (D e F), e o VEGFR (G e I), os núcleos estão corados com DAPI (B, E, H e K), o branco sem a adição do anticorpo primário (J e L), sobreposição das imagens (C, F, I e L).
Níveis de colesterol, triglicerídeos e glicose do soro sanguíneo
Os níveis de colesterol e triglicerídeos foram analisados nos camundongos deficientes no receptor LDL alimentados durante 4 semanas com a dieta hiperlipídica e outro grupo de camundongos alimentados por 4 semanas com a ração normal. Após este tempo os animais ficaram 12 horas em jejum antes da dosagem. Observou-se um aumento do nível de colesterol do soro dos camundongos alimentados com a dieta hiperlipídica (325 mg/dl ± 18) (Figura 12), em relação aos animais alimentados com ração normal (171 mg/dl ± 4) (Figura 12). As medias foram comparadas pelo test t de student, encontrando P≤0,05 que evidencia uma diferença significativa entre os grupos.
O nível de triglicérides dos animais alimentados com a dieta hiperlipídica também foi maior (214 mg/dl ± 24) em relação aos alimentados com a dieta normal (128 mg/dl ± 8). Pela análise estatística com test t, este aumento foi significativo (P<0,05) (Figura 13).
Camundongos LDL -/- não conseguem metabolizar moléculas de lipoproteínas de baixa densidade, então quando expostos a uma dieta rica em lipídios eles tem os níveis de triglicerídeos e colesterol aumentados. Com uma dieta normal estes animais não apresentam alterações nestes níveis.
Figura 12. Nível do colesterol do soro de camundongos LDL Média do colesterol total de camundongos alimentados com uma dieta normal e alimentados com a dieta hiperlipídica, n=5, valor de P>0,05. Diferença significativa representada por (*).
Figura 13. Nível de triglicerídeos do soro de camundongos LDL. Média do nível de triglicerídeos no soro sanguíneo de camundongos alimentados com a ração normal e de camundongos alimentados com a ração hiperlipídica, n=5, valor de P<0,05. Diferença significativa representado por (*)
O nível de glicose sanguínea foi medido com aparelho de glicose e fita, utilizando-se uma gota de sangue dos camundongos após 12h em jejum. Antes do inicio da alimentação hiperlipídica estes animais tiveram seus níveis de glicose medidos (93 mg/dL ± 11) (Figura 14), e após 4 semanas de alimentação o nível de glicose do sangue destes animais estava significativamente aumentado (105 mg/dL ± 10) (Figura 14)(P<0,05). Contudo este aumento apesar de significativo não corresponde a valores observados em animais pré-diabéticos ou diabéticos.
Figura 14. Nível de glicose do sangue de camundongos LDL -/- . Média do nível de glicose do sangue dos camundongos antes do inicio da alimentação hiperlipídica e após 4 semanas de alimentação, n= 7. Diferença significativa representada por (*), (P<0,05).
Presença de placas de ateroma
Camundongos LDL-/- alimentados por 4 semanas com uma dieta lipídica ou uma dieta normal foram sacrificados e as artérias carótidas coletadas e incluídas em OCT. Foram feitos corte transversais de 8 µm e estes corados com oil red, uma coloração especifica para lipídios. Animais alimentados com a dieta rica em lipídios apresentaram um depósito de lipídios na parede da artéria (Figura 15, A), já os animais alimentados com a dieta normal não apresentaram este acumulo de lipídios na parede do vaso (Figura 15, B).
Os camundongos sem o receptor para o colesterol LDL, quando alimentados com uma dieta rica em lipídios, não conseguem metabolizar as moléculas de LDL, estas moléculas ficam livres no plasma sanguíneo e tendem a ser absorvidas e oxidadas pelas paredes dos vasos formando as placas de ateroma. Quando alimentados com uma dieta normal estes animais não formam placas de ateroma nas paredes das artérias. Na Figura 15, pode-se observar o corte transversal de uma carótida de animal alimentado com a ração hiperlipídica e o corte de uma carótida de um camundongo alimentado com uma ração normal.
Figura 15. Artéria carótida de camundongos LDL -/- coradas com oil red. (A) Cortes transversais da artéria de camundongo alimentado com a dieta hiperlipídica, (B) artéria de camundongo alimentado com ração normal. Barra = 50 μm
Tempo de formação do trombo arterial
A lesão por cloreto férrico a 15% foi provocada na artéria carótida comum e imediatamente após a lesão posicionou-se uma sonda de ultrassom no local para medir o tempo de oclusão da artéria. A oclusão do vaso pela formação do trombo ocorreu em 6 minutos (6,10 ± 1,96) (Figura 16), em animais controle (não injetados). No grupo com a injeção de CPE 15 minutos antes da lesão arterial, o tempo de formação do trombo no vaso sanguíneo aumentou para 14 minutos (14,45 ± 1,53) (Figura 16), as duas médias foram comparadas pelo teste Mann Whitney, encontrando-se P<0,01 o que evidenciou uma diferença significativa entre o grupo controle e o grupo com injeção de CPE. Este dado nos mostra que as CPE influenciam no tempo de formação do trombo arterial com este tipo de lesão.
Figura 16. Tempo de oclusão do vaso arterial em camundongos LDL-/-. Média do tempo
de oclusão da artéria em animais controle e média do tempo da oclusão do vaso em animais que receberam a injeção de CPE 15 minutos antes da lesão, n= 5 em cada grupo. Diferença significativa representada por (*). Valor de P<0,01.
Tempo de formação do trombo venoso
Para medir o tempo de formação do trombo venoso provocou-se a lesão da veia jugular por cloreto férrico a 8%, em seguida posicionou-se no local da lesão uma sonda de ultrassom e mediu-se o tempo de oclusão da veia. Nos animais controle sem injeção a oclusão do vaso levou cerca de 4 minutos (4,03 ± 0,46) (Figura 17), já nos animais que receberam a injeção de CPE 15 minutos antes da lesão, o tempo de oclusão do vaso sanguíneo subiu para 9 minutos (9,31 ± 1,55) (Figura 17). As médias foram comparadas pelo teste Mann Whitney, evidenciando uma diferença significativa entre as duas, sendo encontrado P< 0,01. O tratamento com as CPE aumentou o tempo de formação do trombo venoso.
Figura 17. Tempo de oclusão do vaso venoso em camundongos LDL -/-. Média do tempo de oclusão do vaso venoso, em animais controle, e em animais com a injeção de CPE 15 minutos antes da lesão venosa por cloreto férrico n=5. Diferença significativa representada por (*). Valor de P<0,01.
Área do trombo arterial nos tempos 0, 3, e 7 dias após a lesão nos grupos controle e com a injeção de CPE.
As artérias foram coletadas imediatamente, 3 e 7 dias após a lesão com cloreto férrico, nos grupo controle e nos grupos com injeção de CPE, e embebidas em OCT. Foram feitos cortes histológicos e corados com HE e a porcentagem da área do trombo medida com o programa ImageJ.
O grupo de animais controle imediatamente após a lesão obteve uma média de porcentagem da área de trombo de 95,22 ± 3,22 (Figura 18, A) (Figura 19), no grupo de animais com a injeção de CPE está média foi de 84,11± 11,38(Figura 18, B) (Figura 19). Os grupos fora comparados pelo teste Mann Whitney e não foi encontrado diferença significativa entre os grupos.
Três dias após a indução do trombo arterial a porcentagem da área de oclusão do vaso foi de 71,91± 12,66 (Figura 18, C) (Figura 19) no grupo de animais controle diminuindo para 30,65 ± 7,88 (Figura 18, D) (Figura 19) nos camundongos com a injeção de CPE, os animais que receberam as células apresentaram uma área de trombo 58% menor em relação a animais controle. Os grupos foram comparados pelo teste Mann Mhitney e foi encontrado uma diferença significativa P≤0,05.
A diminuição da porcentagem da área de trombo 3 dias após a lesão nos grupos com a injeção das células foi significativa em relação aos mesmos grupos controle (P≤0,05). As injeções de CPE influenciaram a área do trombo, diminuindo a obstrução do vaso arterial permitindo a passagem do fluxo sanguíneo que pode diminuir o risco de uma isquemia.
Com sete dias após a lesão por cloreto férrico, além da presença de trombo foi observado o crescimento de células musculares lisas que caracteriza a formação da camada neointima, estas duas áreas foram medidas separadamente. A média da porcentagem da área de trombo no grupo de animais controle foi de 33,77±25 (Figura 18, E)(Figura 19), e dos animais com a injeção de CPE a média foi de 15,29± 22,12 (Figura 18, F)(Figura 19). Nos grupos controle e com as CPE neste tempo a diferença entre as médias foi significativa, quando comparados com o teste Mann Whitney (P>0,05). Com 7 dias é observado a diminuição do trombo e o início de crescimento das células de músculo liso que formam a camada neointima. Com 7 dias após a lesão arterial as CPE influenciaram diminuindo a área de trombo.
Figura 18. Cortes transversais das artérias carótida esquerda corados com hematoxilina eosina (HE). (A) Artéria de camundongo LDL-/- imediatamente, (C) 3 dias e (E) 7 dias após a lesão arterial em animais controle. Artérias de camundongos tratados com CPE (B) imediatamente, (D) 3 e (F) 7 dias após a lesão arterial. Barra= 50 μm.
Figura 19. Análise da área de trombo arterial. Porcentagem da área do trombo quantificada como descrita em materiais e métodos. As colunas representam os valores médios de cada grupo e o desvio padrão n =6 . Diferença estatística representada por (*) P≤0,05, teste Mann Whitney.
Área de neointima arterial nos tempos 7 e 14 dias após a lesão nos grupos controle com injeção de CPE
Com 7 dias após a lesão arterial o crescimento da camada neointima é evidente, a porcentagem da área desta camada nos animais do grupo controle foi de 11,17± 5,25 (Figura 20, A) (Figura 21), no grupo que recebeu as injeções de células foi de 18,77± 10,90 (Figura 20, B) (Figura 21). A diferença estatística entre o grupo com injeção de CPE e grupo controle foi comparada pelo teste Mann Whitney, não é significativa , então P>0,05.
Com 14 dias após lesão arterial não pudemos observar mais regiões características de trombose e observamos que a média da porcentagem da camada neointima no grupo de animais controle foi de 84,79± 7,58 (Figura 20, C)(Figura 21) já no grupo com a injeção de CPE ocorre uma significativa diminuição nesta camada para 42,16±14,20 (Figura 20, D)(Figura 21). Os camundongos que receberam a injeção de CPE apresentaram uma área camada neointima 50% menor que os animais controle, as células influenciaram diminuindo a camada neointima. Os grupos foram comparados pelo teste Mann Whitney e a diferença entre eles é significativa (P≤0,05).
* *
Figura 20. Cortes transversais da artéria carótida esquerda de camundongos LDL-/- corados com hematoxilina eosina (HE) (A) 7 dias após a indução da lesão por cloreto férrico em animais controle (B) em animais com injeções de CPE 15 minutos antes e 24h após a lesão. Neste tempo pode se observar o inicio da formação da camada neointima (setas), (C) 14 dias após a lesão nos animais controle e (D) animais com as injeções de células (D). Barra = 50 μm.
Figura 21. Área de neointima. Porcentagem da área da neointima quantificada como descrita em materiais e métodos (teste Mann Whitney). As colunas representam os valores médios de cada grupo e o desvio padrão n =6 . Diferença estatística representada por (*) P≤0,05.
Analise da migração das CPE marcadas com PKH26
Em alguns animais dos grupos que receberam injeções de CPE, as células foram marcadas com PKH26, este é um reagente fluorescente que fica incluído entre os fosfolipídios de membrana, permitindo assim observar se as células migraram para o local da lesão.
Imediatamente após a lesão não foram observadas CPE marcadas com PKH26 no local da lesão nas laminas analisadas (Figura 22, A). Com 3 e com 7 dias após a formação de trombo, observou-se a presença de CPE marcadas no local da lesão na camada adventícia das artérias (Figura 22, D e G). Com 7 dias a o número de CPE foi maior em relação os grupo de 3 dias.
Imediatamente após a lesão arterial as células marcadas com PKH26 estavam na corrente sanguínea, interferindo no tempo de formação do trombo, mas devido ao pouco tempo em que estavam na circulação elas ainda não haviam migrado para os tecidos lesionados. Já com 3 e 7 dias após a lesão as células migraram e penetraram na camada adventícia da artéria.
Figura 22. Analise da migração de CPE. Cortes histológicos das artérias carótidas de camundongos LDL-/- com a injeção de CPE marcadas com PHK26, imediatamente (A), 3 dias (D) e 7 dias (G) após a formação do trombo. Nas setas observa-se a presença de CPE marcadas na camada adventícia. Núcleos foram corados com DAPI (B, E e H), sobreposição das imagens (C, F e I). Barra = 50μm
Analise da atividade gelatinolítica arterial
Foi analisada a atividade de gelatinases ‘in situ’ com o uso de DQ gelatina, este é um substrato fluorogênico usado para detectar metaloproteínases que são gelatinases, cujos principais representantes são as MMP-2 e a MMP-9. Este substrato é composto de por gelatina conjugada com fluorescência (FITC), e onde houver digestão proteolítica, ocorre à emissão da fluorescência verde e a atividade enzimática pode ser medida como um aumento da intensidade de fluorescência. A intensidade da florescência foi medida como programa ImageJ e os grupos comparados com o teste t student.
Como as lâminas elásticas encontradas nas artérias apresentam auto-fluorescência natural, este valor é subtraído do valor encontrado nas artérias incubadas com DQ gelatina. Na figura 23, G, pode se observar corte das artérias sem a adição do substrato.
Os animais do grupo controle sacrificados imediatamente após a lesão arterial apresentaram uma média de atividade gelatinolítica de 414± 70 densidade integrada (Figura 23, A)(Figura 24), e os camundongos que receberam a injeção de CPE a média da atividade foi 498±22 densidade integrada (Figura 23,D) (Figura 24), esta diferença foi comparada pelo teste t student e não foi significativa (P≤0,05). A injeção de CPE não alterou a atividade gelatinolítica imediatamente após a lesão arterial.
Figura 23. Zimografia ‘in situ’ nas artérias de camundongos LDL-/-, imediatamente após a lesão arterial. A zimografia foi realizada nos cortes transversais das artérias carótidas, com o uso de DQ- gelatina conjugada com fluorescência (FITC), (A) artéria do grupo controle, (D) artéria do grupo que recebeu uma injeção de CPE 15 minutos antes da indução da trombose, (G) artéria sem a adição de DQ- gelatina, utilizada para a subtração da fluorescência natural da lâmina elástica. Os núcleos foram corados com DAPI (B, E e H) e as imagens sobrepostas (C, F e I). Barra = 50 μm
Figura 24. Zimografia ‘in situ’ para a detecção de atividade de gelatinases em artérias no tempo zero – análise densidade integrada por ImageJ Média da atividade de gelatinases dos grupos controle e com CPE imediatamente após a lesão arterial, diferença comparada pelo teste t student, não é significativa (P≤0,05). Foi utilizado n=3 animais.
Com 14 dias após a lesão arterial a atividade de gelatinases no grupo controle foi 396±53 densidade integrada (Figura 25, A)(Figura 26), já nos camundongos que receberam as injeções de CPE está atividade foi de 582±73 densidade integrada (Figura 25, D)(Figura 26), esta diferença foi comparada pelo teste t student e foi encontrada uma diferença significativa entre os grupos (P≤0,05) mostrando que com 14 dias a injeção de CPE aumentou a atividade de gelatinases nas artérias com lesão.
Figura 25. Zimografia ‘in situ’ nas artérias de camundongos LDL-/-, 14 dias após a lesão arterial. A zimografia foi realizada nos cortes transversais das artérias carótidas, com o uso de DQ- gelatina conjugada com fluorescência (FITC), (A) artéria do grupo controle, (D) artéria do grupo que recebeu uma injeção de CPE 15 minutos antes e 24h após a indução da trombose, (G) artéria sem a adição de DQ- gelatina, utilizada para a subtração da fluorescência natural da lâmina elástica. Os núcleos foram corados com DAPI (B, E e H), sobreposição das imagens (C, F e I). Barra = 50 μm
Figura 26. Zimografia ‘in situ’ para a detecção de atividade de gelatinases em artérias após 14 dias – análise densidade integrada por ImageJ. Média da atividade de gelatinases dos grupos controle e com CPE 14 dias após a lesão arterial. Diferença estatística comparada pelo teste t student e representada pelo (*) P≤0,05. Foi utilizado n=3.
Área de trombo venoso nos tempo de 0 e 3 dias após lesão venosa nos grupos controle e com a injeção de CPE
A lesão com cloreto férrico a 8% foi feita na veia jugular, os animais foram sacrificados imediatamente após a lesão ou mantidos por 3 dias, nos grupos controle e nos grupos com injeção de CPE, quando completou-se o tempo os vasos sanguíneos foram embebidos em OCT e fez-se cortes histológicos na transversal do vaso de 8 µm de espessura, estes corados com HE e calculou-se a porcentagem da área ocluída do vaso com programa ImageJ.
A média da porcentagem da área de oclusão do vaso do grupo controle imediatamente após a lesão foi de 97,58±2,58 (Figura 27, A)(Figura 28), neste mesmo tempo o grupo que recebeu a injeção de CPE 15 minutos antes da indução do trombo apresentou uma média de porcentagem de área de trombo de 79,38 ± 17,68 (Figura 27, B)(Figura 28). Estes dois grupos foram comparados estatisticamente pelo teste Mann whitney, e apresentaram uma diferença significativa (P<0,05)
