UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
TAILA DOS SANTOS ALVES
EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DA RESISTÊNCIA A
ANTIMICROBIANOS E FATORES DE VIRULÊNCIA EM
Escherichia coli ISOLADAS DE DÍPTEROS MUSCOIDES EM
PROPRIEDADE LEITEIRA
CAMPINAS 2017
EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DA RESISTÊNCIA A
ANTIMICROBIANOS E FATORES DE VIRULÊNCIA EM
Escherichia coli ISOLADAS DE DÍPTEROS MUSCOIDES EM
PROPRIEDADE LEITEIRA
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestra em Biologia Animal na Área de Relações Antrópicas, Meio Ambiente e Parasitologia.
Orientador: PROF. DR. DOMINGOS DA SILVA LEITE
CAMPINAS 2017
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA TAILA DOS SANTOS ALVES E ORIENTADA PELO PROF. DR. DOMINGOS DA SILVA LEITE.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Domingos da Silva Leite (orientador)
Profa. Dra. Cristina Elisa Alvarez Martinez
Dra. Monique Ribeiro Tiba Casas
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
oportunidades, incentivo, confiança, apoio e presença sempre.
Ao Prof. Dr. Márcio Garcia Ribeiro e ao Dr. Gustavo Henrique Batista Lara pela disposição e auxílio na obtenção das amostras.
À bióloga Ma. Mirtis Maria Giaciani Ferraz pelo auxílio e ensinamentos.
À Profa. Dra. Patrícia Jacqueline Thyssen e a Ma. Natane de Cássia Sibon Purgato pela identificação das amostras de dípteros.
À Dra. Amanda Keller Siqueira pelo incentivo, disposição, ajuda e ensinamentos.
Ao Prof. Dr. José Luiz Proença Módena, Profa. Dra. Cristina Elisa Alvarez Martinez e Profa. Dra. Patrícia Jacqueline Thyssen pela participação e sugestões no Exame de Qualificação. À Dra. Jéssica Wildgrube Bertol pela amizade e apoio.
Profa. Dra. Maria Silvia Viccari Gatti e ao Prof. Dr. Tomomasa Yano pelo apoio e disposição. Ao Prof. Dr. Wanderley Dias da Silveira e ao Dr. Renato Pariz Maluta pelo auxílio na técnica de Pulsed-Field Gel Electrophoresis.
À Profa. Dra. Ana Lúcia da Costa Darini, Profa. Dra. Maria Silvia Viccari Gatti e a Dra. Monique Ribeiro Tiba Casas pelo exame prévio da dissertação.
À Profa. Dra. Cristina Elisa Alvarez Martinez, Dra. Monique Ribeiro Tiba Casas, Profa. Dra. Fabiana Fantinatti-Garboggini e Prof. Dr. Tomomasa Yano por terem aceitado participar da banca examinadora.
À Jéssica Gurgel, Taís Baruel Vieira e Guilherme Borelli por toda a ajuda e amizade, e à Meghi Nogueira de Souza, Luisa de Pontes Ribeiro e Ma. Carolina Lambertini pela amizade e companheirismo.
A CAPES pela concessão da bolsa de mestrado e a FAPESP pelo apoio financeiro. À minha família pela compreensão e apoio.
O ambiente rural propicia o desenvolvimento de espécies de dípteros muscoides que podem atuar como vetores mecânicos de vários patógenos. Dada a possibilidade de veiculação de bactérias resistentes por meio de moscas, o presente estudo buscou caracterizar a resistência a antimicrobianos em Escherichia coli isoladas de dípteros muscoides coletados em propriedades leiteiras, assim como a presença de genes de virulência relacionados à colibacilose bovina. Musca domestica foi a espécie de díptero muscoide mais abundante nas duas propriedades estudadas. As cepas de E. coli provenientes das duas propriedades apresentaram diferenças quanto às frequências de resistência aos antimicrobianos testados por disco difusão e exibiram frequências baixas ou nulas dos genes de fatores de virulência. A alta frequência (72%) do grupo filogenético B1 entre as cepas multirresistentes (resistência ≥ a 3 classes de antimicrobianos), aliada a ausência de relação entre presença de multirresistência e fatores de virulência (p>0,05), indica que a resistência antimicrobiana está associada às bactérias comensais. A análise de perfil clonal das cepas multirresistentes, realizada por
Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE), mostrou ampla diversidade genômica, de modo
que, moscas diferentes podem veicular cepas com perfis genômicos diferentes, porém com os mesmos genes de resistência antimicrobiana e/ou integron e que uma única mosca pode veicular tanto cepas quanto clones com genes de resistência distintos. Moscas distintas apresentaram integron de classe 1 com o mesmo arranjo genético identificado na análise do sequenciamento. Uma vez que as moscas veiculam cepas de E. coli com perfis multirresistentes diversos, é possível afirmar que dípteros muscoides contribuem para a disseminação de genes de resistência a antimicrobianos no ambiente.
Rural environment facilitates muscoid diptera development that can act as mechanical vectors of several pathogens. Given that flies can carry resistant bacteria, this study aimed to characterize antimicrobial resistance in Escherichia coli isolated from muscoid diptera collected in dairy farms, as well as the presence of virulence factors genes related to bovine colibacillosis. Musca domestica was the most collected species in the two studied farms. Escherichia coli strains from the two farms showed differences in antimicrobial resistance
frequencies tested by disk diffusion and showed low or no frequency to virulence factor genes. The high frequency (72%) of phylogenetic group B1 among multidrug resistance strains (resistant ≥ 3 classes), combined with the lack of relationship between the multidrug resistance and virulence factors (p>0.05), suggest that the antimicrobial resistance is associated with the commensal bacteria. The clonal profile analysis of the multiresistant strains, performed by Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE), showed wide genomic diversity, so that different flies may carry unrelated strains, but with the same antimicrobial resistance genes and/or integron and, a single fly may carry strains and clones with distinct resistance genes. Different flies presented class 1 integron with the same gene arrangement identified by sequencing analyze. It is possible to affirm that flies contribute to the spread of antimicrobial resistance genes in the environment, once they carry strains of E. coli with diverse multiresistant profiles.
Figura 1. Região do município de Botucatu-SP, onde estão localizadas as duas propriedades leiteiras estudadas (denominadas A e B), quanto à resistência antimicrobiana em E. coli provenientes de dípteros muscoides... 33
Figura 2. Estrutura do integron de classe 1. A região cinza representa o sítio de inserção dos cassetes gênicos relacionados à resistência antimicrobiana. Reproduzido de Lèvesque et al. (1995). ... 39
Figura 3. Frequência relativa de E. coli resistentes* a cada um dos antimicrobianos testados. Visualização dos diferentes perfis dos isolados nas duas propriedades leiteiras (A e B). ... 47
Figura 4. Escherichia coli positiva para o teste de aproximação de disco. O alargamento do halo de inibição (seta no topo) e o surgimento da “zona fantasma” (seta embaixo) indica a produção de ESBL (β-lactamase de espectro estendido). ... 48
Figura 5. Padrão de digestão enzimática de AluI obtido no ensaio de RFLP da região variável do integron de classe 1 (5’CS-3’CS) de E. coli isoladas de moscas. ... 51
Figura 6. Desenho esquemático da sequência obtida a partir da amplificação dos iniciadores 5’CS e 3’CS. ... 52
Figura 7. Desenho esquemático do integron de classe 1 presente em cepas de E. coli isoladas de dípteros muscoides. ... 52
Figura 8. Dendrograma obtido pela técnica de PFGE a partir da digestão enzimática com
XbaI do DNA cromossômico de E. coli isoladas de dípteros muscoides coletados em
propriedades leiteiras da região de Botucatu, SP (2015) e os respectivos genes de resistência e grupos filogenéticos. Padrão gerado por UPGMA, utilizando coeficiente de Dice com
tolerância e otimização de 1%. ... 55
Figura 9. Eletroforese em gel de agarose 0,8% dos plasmídeos extraídos pelo método de lise alcalina, correspondentes às cepas de E. coli transconjugantes (A) e doadoras (B)... 57
Tabela 1. Iniciadores utilizados para a detecção dos fatores de virulência, genes de resistência e integrons em isolados de E. coli provenientes de dípteros muscoides. ... 36
Tabela 2. Iniciadores utilizados no esquema proposto por Clermont et al. (2000) e as combinações de resultados possíveis. ... 37
Tabela 3. Iniciadores relacionados a estruturas de integrons de classe 1 utilizados para a conclusão das sequências de isolados de E. coli provenientes de dípteros muscoides. ... 38
Tabela 4. Insetos coletados em duas propriedades da região de Botucatu, SP (2015) organizados por amostra. Espécies e quantidades. ... 43
Tabela 5. Espécies e abundância de espécies de dípteros muscoides coletados em duas propriedades leiteiras da região de Botucatu, SP (2015). ... 44
Tabela 6. Frequência relativa de E. coli resistentes* isoladas da superfície externa de dípteros muscoides em duas propriedades leiteiras da região de Botucatu, SP (2015). ... 47
Tabela 7. Dados referentes ao perfil de resistência*, presença de plasmídeos e grupos filogenéticos das cepas de E. coli multirresistentes isoladas de dípteros muscoides em propriedades leiteiras da região de Botucatu, SP (2015). ... 49
Tabela 8. Cepas de E. coli selecionadas para a avaliação do perfil clonal organizadas de acordo com o perfil fenotípico de resistência antimicrobiana. ... 53
Tabela 9. Perfil de resistência fenotípica* e genotípica das cepas E. coli doadoras e transconjugantes(t) obtidas no ensaio de conjugação. ... 58
Tabela 10. Resultados para os genes de resistência a partir de DNA plasmidial extraído por lise alcalina nas cepas de E. coli doadoras e transconjugantes, obtidos por PCR. ... 59
1.1. BOVINOCULTURA ... 14
1.1.1. Uso de antimicrobianos na bovinocultura ... 15
1.2. DÍPTEROS MUSCOIDES ... 16
1.2.1. Ecologia e biologia das moscas de importância pecuária ... 17
1.2.2. Vetores de bactérias ... 18
1.3. Escherichia coli ... 21
1.4. RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA ... 23
1.4.1. Elementos genéticos móveis ... 24
1.4.2. Disseminação no ambiente e implicações ... 26
II – Objetivos ... 29
2.2. Específico: ... 30
III - Material e Métodos ... 31
3.1. Áreas de coleta ... 32
3.2. Obtenção das amostras ... 32
3.3. Isolamento e identificação de E. coli... 33
3.4. Caracterização fenotípica da sensibilidade aos antimicrobianos ... 34
3.4.1. Sensibilidade microbiana (antibiograma) ... 34
3.4.2. Produção de ESBLs – Método da aproximação de disco ... 34
3.5. PCR para a pesquisa dos genes de virulência, resistência e integrons ... 35
3.5.1. Extração do DNA (método do choque térmico) ... 35
3.5.2. PCR ... 35
3.6. Presença de plasmídeos ... 37
3.7. Classificação filogenética de E. coli... 37
3.8. Caracterização dos integrons por Restriction Fragment – Length Polymorphism (RFLP) e sequenciamento ... 38
3.9. Perfil clonal das cepas resistentes ... 39
3.10. Ensaio de conjugação ... 39
3.11. Análise estatística ... 40
IV - Resultados ... 41
4.1. Coleta dos insetos e isolamento de E. coli ... 42
4.2. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos ... 45
4.6. Caracterização dos integrons por Restriction Fragment – Length Polymorphism
(RFLP) ... 51
4.7. Sequenciamento da região variável do integron de classe 1 ... 51
4.8. Perfil clonal ... 53
4.9. Conjugação ... 56
V - Discussão ... 60
VI – Conclusões ... 68
VII - Referências Bibliográficas ... 70
VIII – Apêndices ... 86
APÊNDICE A – Resultado do ensaio de disco aproximação para a dectação fenotípica de ESBL em cepas de E. coli doadoras e transconjugantes obtidas após conjugação. ... 87
APÊNDICE B – Antibiograma da cepa transconjugante MA17d. Colônias hipermutantes no interior do halo de inibição de sulfametazol/trimetoprim (SUT). ... 88
IX – Anexos ... 89
ANEXO A – Declaração sobre bioética e biossegurança. ... 90
ANEXO B – Declaração sobre a não infringência da lei nº 9610/98 e do direito autoral de qualquer editora ... 91
1.1. BOVINOCULTURA
Os bovinos estão entre as primeiras espécies domesticadas na Europa. Estudos arqueológicos têm apontado indícios das atividades de criação desde o período Neolítico (Serjeantson, 2011), com o objetivo de exploração do poder de tração dos animais e produção de leite (Ebersbach, 2010). A divisão da criação para diferentes finalidades, como para a obtenção de carne ou leite, data do século XIX (Ebersbach e Schibler, 2003).
Atualmente, cerca de 150 milhões de produtores movimentam o mercado econômico mundial de leite, sendo a Índia o maior produtor mundial e o Brasil o sexto (FAO, 2016). No Brasil, segundo o último censo agropecuário realizado em 2006, a criação de bovinos com aptidão leiteira esteve presente em 25% dos estabelecimentos (IBGE, 2009; Brasil, 2014), ganhando destaque na economia e na geração de empregos (Zoccal et al., 2008).
Os sistemas de produção incluem as formas de criação e manejo do gado leiteiro e são classificados em extensivo, semi-intensivo e intensivo, de acordo com a produtividade do rebanho e o grau técnico empregado (Embrapa, 2016).
Nos sistemas extensivos os animais são criados soltos no pasto com suplementação alimentar apenas de sal comum, apresentando menor nível de aplicação tecnológica, instalações simples e baixa produtividade. Já nos sistemas semi-intensivos, o gado é manejado em semiconfinamento, recebendo suplementação alimentar a pasto com sal enriquecido, silagem de milho, sorgo ou capim, geralmente durante a estação seca. Os sistemas intensivos são destinados à criação de bovinos com elevada produção leiteira que permanecem confinados constantemente em estábulos. Tais sistemas empregam maiores níveis de tecnologia, dietas com altos valores nutricionais e mão de obra especializada (Assis et al., 2005; Sarcinelli et al., 2007; Brasil, 2015).
Em sistemas extensivos e semi-intensivos em que a principal fonte de alimento é o pasto, práticas de rodízio de pastagens são importantes para manter a qualidade das plantas forrageiras e o controle de parasitos que apresentam algum estágio do ciclo de vida dependente do solo (Florião, 2013). A prática consiste na divisão do pasto em piquetes que são pastejados alternadamente de modo que haja um período de descanso (Martha Júnior et al., 2003).
Adicionalmente, práticas de manejo que visam o monitoramento da sanidade animal são fundamentais para a manutenção da produtividade dos rebanhos leiteiros (Florião, 2013). Nesse sentido, inclui-se o uso terapêutico e profilático de antimicrobianos e o controle
populacional de artrópodes – insetos e ácaros (Bogard e Stobberingh, 2000; Rutz e Geden, 2010).
1.1.1. Uso de antimicrobianos na bovinocultura
A utilização de antimicrobianos na pecuária é destinada a fins terapêuticos, profiláticos e como promotores de crescimento (Ventola, 2015).
Nas propriedades leiteiras, a principal razão para a administração de antimicrobianos consiste no tratamento e prevenção da mastite bovina (Pol e Ruegg, 2007), uma vez que várias espécies de bactérias, tais como Streptococcus agalactiae, Staphylococcus
aureus e Mycoplasma spp. (contagiosos), Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalactiae
subsp. dysgalactiae, Escherichia coli e Klebsiella spp. (ambientais), entre outros, são capazes de infectar as glândulas mamárias das vacas e produzir enfermidade (Oliver e Murinda, 2012).
O tratamento terapêutico é destinado aos animais com manifestações clínicas de mastite, enquanto o profilático às vacas em período não lactante (seco), e por esse motivo popularmente conhecido como “terapia da vaca seca” (Oliver e Murinda, 2012). Ambas as intervenções são administradas principalmente por via intramamária, mas outras vias também podem ser utilizadas (Royster e Wagner, 2015).
Além disso, o tratamento com antimicrobianos faz-se necessário em bezerros com menos de trinta dias de vida que apresentam quadro de diarreia com sinais sistêmicos, uma vez que independente do agente infeccioso (bactérias, vírus ou protozoários), há aumento do crescimento bacteriano de coliformes, podendo evoluir para bacteremia e endotoxemia (Constable, 2009).
Nesse contexto, a administração de antimicrobianos principalmente em doses subterapêuticas é fonte de constantes debates, pois, apesar de resultar em benefícios como o aumento da produtividade, redução de patógenos, menor ocorrência de doenças, de morbidade e mortalidade, gera resíduos de antimicrobianos nos alimentos que podem contribuir para a seleção de resistência antimicrobiana em patógenos de humanos, devido à ingestão de carne, leite e derivados. Além disso, a prática colabora para a seleção de resistência em micro-organismos comensais constituintes da microbiota intestinal de animais saudáveis, que podem atuar como reservatórios de genes de resistência e na disseminação a outros comensais e patógenos (Bogard e Stobberingh, 2000; Oliver et al., 2011; Ventola, 2015).
A presença de bactérias comensais resistentes a antimicrobianos parece estar relacionada à idade dos animais, de forma que animais mais jovens apresentariam maior quantidade de bactérias resistentes quando comparados aos mais velhos. Nesse sentido,
Khachatryan et al. (2004) buscaram relacionar idade e resistência antimicrobiana em bovinos leiteiros, comprovando, experimentalmente, o pressuposto, e sugerindo que o fenômeno pode estar associado à dieta já que bezerros que receberam leite apresentaram maior frequência de cepas resistentes. Este evento pode ser explicado pela associação entre genes de resistência e genes vantajosos para o metabolismo nutricional das bactérias, no mesmo plasmídeo, como adesinas e sideróforos. Desse modo, cepas resistentes podem persistir mesmo na ausência de pressões seletivas (Khachatryan et al., 2004).
1.2. DÍPTEROS MUSCOIDES
A ordem Diptera apresenta mais de 150 mil espécies de moscas e mosquitos que possuem um par de asas anteriores funcionais e o par de asas posteriores modificados em halteres, sendo esta a principal sinapomorfia que a distingue das demais ordens da Classe Insecta (Yeates et al., 2007), de modo que, compreende-se por dípteros muscoides os insetos popularmente conhecidos como moscas, pertencentes a divisão Schizophora da infraordem Muscomorpha (McAlpine, 1981 apud Borges, 2006). Nesse contexto, as famílias Calliphoridae, Sarcophagidae, Muscidae, Faniidae e Anthomyiidae destacam-se devido à sinantropia e a importância médico-sanitário que apresentam (Linhares, 1979).
Povolný (1971) definiu sinantropia como um fenômeno ecológico baseado na biocenose, ou seja, a coabitação interativa de espécies diferentes no mesmo ambiente, de modo que a antropobiocenose acontece quando ambientes modificados pelo homem, através das habitações humanas e dos animais domésticos, permitem a biocenose, sendo os animais sinantrópicos componentes espontâneos. Analogamente, dípteros simbovinos são aqueles que se relacionam com a antropobiocenose através das excretas de ruminantes domésticos (Povolný, 1971).
A sinantropia em dípteros muscoides é comum (Linhares, 1979). Diferentes espécies apresentam maior ou menor grau de dependência da associação com o homem de acordo com as exigências tróficas e ecológicas, sendo fezes e matéria orgânica em decomposição as principais fontes alimentares de moscas sinantrópicas adultas (Povolný, 1971). Por esse motivo, o ambiente rural, assim como o urbano, demonstra-se propício ao desenvolvimento dessas espécies de moscas.
Dentre as espécies de importância pecuária destacam-se Musca domestica (Linnaeus, 1758), Stomoxys calcitrans (Linnaeus, 1758) e Haematobia irritans (Linnaeus, 1758), tanto pela possibilidade de veiculação mecânica e biológica de patógenos, quanto pelo estresse e consequente perda de peso que ocasionam aos bovinos devido ao hábito
hematófago de S. calcitrans e H. irritans (Brito et al., 2008), expondo o gado a micro-organismos patogênicos e implicando na redução do leite produzido (Rutz e Geden, 2010).
1.2.1. Ecologia e biologia das moscas de importância pecuária
O esterco eliminado pelo gado constitui em criadouros para várias espécies de moscas e outros artrópodes como besouros, vespas e formigas (Marchiori, 1997; Marchiori et al., 2001). No entanto, algumas espécies como M. domestica, apresentam comportamento comunicativo, isto é, a circulação entre ambientes microbiologicamente contaminados (fezes e matéria orgânica em decomposição) e imediações humanas (fontes de alimentos) (Povolny, 1971).
Musca domestica é cosmopolita e estreitamente associada à antrobiocenose, sendo
troficamente adaptada a alimentos e lixo humano, mas mantém a coprofagia em algumas situações. Possuem alta capacidade de voo chegando a alcançar cerca de 22 km de distância a partir do ponto de origem, o que aliado ao comportamento comunicativo marcante da espécie, permite sua classificação como importante vetor mecânico de uma extensa lista de patógenos que inclui vírus, bactérias, fungos, protozoários e ovos de helmintos (Greenberg e Povolný, 1971; Greenberg 1971; Linhares, 1979). Indivíduos dessa espécie vivem de 15 a 70 dias e a fêmea ovipõe em média 120 ovos, sendo que o ciclo de vida apresenta duração de 10 a 14 dias a depender das condições climáticas (temperatura e umidade) (Brito et al., 2008).
Stomoxys calcitrans são moscas simbovinas de hábito alimentar hematófago,
ativas durante a manhã e no final da tarde, atacam preferencialmente bovinos, mas, ocasionalmente realizam repasto sanguíneo em outros animais incluindo o homem. A fêmea ovipõe 40 a 80 ovos a cada postura e o desenvolvimento das larvas ocorre em matéria orgânica em decomposição fermentada e úmida, e o ciclo de vida consiste em 30 dias quando em estações de temperaturas elevadas. As fêmeas vivem em média 17 dias e os machos 26 dias (Greenberg, 1973).
Haematobia irritans também são moscas simbovinas hematófagas. As fêmeas
vivem em média 20 dias e ovipõem cerca de 20 ovos entre a massa fecal de bovinos e o solo, sendo que o ciclo apresenta duração de 10 a 15 dias. Permanecem durante a maior parte do tempo sobre o hospedeiro bovino, mas o repasto sanguíneo em outros mamíferos como equinos, ovinos e caninos também pode ocorrer (Brito et al., 2005).
1.2.2. Vetores de bactérias
A relação de dípteros muscoides com excrementos de animais possibilita a veiculação de bactérias entéricas (Cadavid-Sanchez, 2015). Desde antes da década de 1970 o tema vem sendo abordado em trabalhos discutidos por Greenberg (1973) que buscaram relacionar surtos de diarreia aguda, causada por Salmonella, Shigella e E. coli, com a proliferação de moscas. Além disso, foi elaborado o danger index com o propósito de representar numericamente a importância sanitária de moscas, levando em consideração a frequência de visitação a ambientes contaminados e a sinantropia (Linhares, 1979).
Entre os anos 1940 e 2000, as bactérias representaram uma porcentagem significativa (54,3% incluindo Rickettsia) dos patógenos envolvidos nas Doenças Infecciosas Emergentes (EID, do inglês Emerging Infectious Diseases), sendo que 22,8% das EID foram relacionadas a insetos vetores (Jones et al., 2008).
Nas últimas décadas, diversos trabalhos têm sido conduzidos a fim de investigar o papel das moscas na veiculação de bactérias patogênicas, assim como a disseminação que desempenham no ambiente. Em razão do comportamento comunicativo de M. domestica ser bem estabelecido (Povolny, 1971), grande parte das pesquisas buscaram demonstrar o papel dessa espécie na epidemiologia de doenças infecciosas.
Entre os trabalhos mais notáveis está o de Fontedar et al. (1992) que buscaram quantificar e caracterizar o perfil microbiano (bactérias, fungos e protozoários) de
M.domestica coletadas em ambiente hospitalar, na Índia, e encontraram que tais moscas são
mais propensas a veicular bactérias potencialmente patogênicas, quando em comparação com o grupo controle.
Em 1999, Moriya et al., investigaram as origens de um surto de infecções por
E. coli produtora de verotoxina (VTEC) do sorogrupo O157:H7 em uma escola infantil da
zona rural do Japão. Neste trabalho os autores conseguiram encontrar uma forte relação clonal entre as cepas de E. coli isoladas de M. domestica coletadas na região e as envolvidas no surto. Ao constatarem que as moscas vinham de uma fazenda próxima, sugeriram, pela primeira vez, que a contaminação poderia ter acontecido dado o contato das moscas com os alimentos ingeridos pelas crianças.
Complementando os estudos de Moriya et al. (1999), Kobayashi et al. (1999) buscaram verificar a via de transmissão de E. coli O157:H7. Para isso, alimentaram as moscas com bactérias e concluíram que a liberação de E. coli O157:H7 viáveis era possível até três dias após a ingestão, apontando que a disseminação de bactérias poderia ocorrer não somente pelo contato com superfícies contaminadas, em que as moscas atuariam como vetores
mecânicos, mas também através das excretas e regurgitados, em uma relação mais próxima a vetores biológicos.
Desse modo, três vias de transmissão de patógenos por moscas têm sido consideradas: transporte e contato através do exoesqueleto, deposição de fezes e regurgitação (Rahuma et al. 2005).
Alam e Zurek (2004) buscaram isolar E. coli O157:H7 a partir de moscas coletadas em vários ambientes de fazenda de gado bovino e apontaram que M. domestica poderia transportá-las no interior da fazenda e possivelmente a fazendas vizinhas e ambiente urbano. Posteriormente, Ahmad et al. (2007) elaboraram experimentos a fim de testar a transmissão de E. coli O157:H7 presente em M. domestica a bezerros, concluindo que a transmissão era possível.
No Brasil, poucos estudos com essa temática têm sido conduzidos. Destacam-se os trabalhos de Paraluppi et al. (1996) que pretendiam isolar bactérias patogênicas de moscas coletadas em feiras livres, associando-as a contaminações de alimentos a venda; Moraes et al. (2004) que buscaram relacionar isolados de vacas com mastite com os obtidos de
S. calcitrans; Castro et al. (2007, 2008a, 2008b) que apresentaram dados referentes à
microbiota de S. calcitrans com isolados de enterobactérias (patogênicas e não patogênicas),
Pseudomonas, Staphylococcus e Enterococcus; Kappel et al. (2013) que pesquisaram
bactérias presentes na superfície externa de insetos alados (moscas, besouros, borboletas, etc) coletados em ambiente hospitalar; Almeida et al. (2014) que procuraram isolar e determinar o perfil de sensibilidade antimicrobiana de E. coli, Salmonella spp. e Sthaphylococcus spp. de moscas coletadas em fazendas.
Apesar de muito ser conhecido sobre o papel das moscas como vetores de bactérias patogênicas, poucas pesquisas abordaram a atuação de moscas na disseminação da resistência antimicrobiana no ambiente, sendo que até o momento não há referências de tais estudos no Brasil.
Marshall et al. (1990) foram os primeiros a hipotetizar que as moscas em conjunto com aerossóis e outros animais, poderiam representar uma via de disseminação de genes de resistência a antimicrobianos entre os animais de uma fazenda, quando buscaram entender as condições naturais que contribuíam para a disseminação de bactérias e plasmídeos no ambiente. Adicionalmente, a presença de moscas transportando bactérias resistentes em outros ambientes, como o hospitalar, pode significar condições sanitárias precárias, além de contribuir para a disseminação de resistência e de patógenos dentro do hospital, do hospital para a comunidade e da comunidade para o hospital (Rahuma et al. 2005).
O cultivo de bactérias patogênicas resistentes a antimicrobianos, realizado a partir de moscas coletadas em restaurantes por Macovei e Zurek (2006), colabora para a hipótese que relaciona a incidência de moscas com eventos de diarreia, o que, aliado à presença de elementos genéticos móveis ligados a genes de resistência nessas cepas, indica que
M. domestica – alvo do estudo – pode constituir em uma via de disseminação de genes
também nesses ambientes.
Em 2010, Rybaríková et al. (2010), ao pesquisarem resistência antimicrobiana em isolados de moscas simbovinas e de bezerros, hipotetizaram que as cepas resistentes presentes nas moscas seriam originárias dos bezerros, uma vez que ambas apresentaram o mesmo perfil de resistência (fenotípico e genotípico) e clonal, sugerindo que as moscas ao terem contato com os bezerros adquiririam bactérias resistentes e disseminariam clones pelo ambiente, comprovando a hipótese de Marshall et al. (1990).
Da mesma forma, Usui et al. (2013, 2015) encontraram clones de E. coli com o mesmo perfil de resistência antimicrobiana em moscas e em fezes de bezerros e posteriormente sugeriram que as moscas podem atuar na disseminação de genes de resistência não só no interior de fazendas mas também entre fazendas. Além disso, cepas resistentes de
E.coli presentes em moscas também poderiam ser transmitidas à comunidade (Blaak et al.,
2014).
Nesse contexto, os animais de produção constituiriam em reservatórios de cepas bacterianas portadoras de resistência a antimicrobianos, e os insetos sinantrópicos, principalmente as moscas, atuariam como agentes dispersores de bactérias resistentes e, consequentemente, dos genes que portam, de modo que, a disseminação do meio rural para o urbano seria plausível (Zurek e Ghosh, 2014).
Solà-Ginés et al. (2015), ao pesquisarem resistência antimicrobiana em E. coli isoladas de moscas coletadas em granjas de frangos, discutem que o estudo das bactérias obtidas por essa via fornecem informações sobre a microbiota dos animais, mas que também moscas podem atuar introduzindo bactérias portadoras de genes de resistência e virulência colaborando para que ocorra a colonização dos animais com elementos genéticos diferentes daqueles já existentes.
Recentemente, Schaumburg et al. (2016) realizaram um levantamento da resistência em bactérias veiculadas por moscas em áreas rurais e urbanas da cidade de Münster na Alemanha e compararam com isolados de humanos. Frente à elevada similaridade dos isolados, sugeriram que haveria uma fonte comum ou transmissão de bactérias das
moscas aos humanos. Ressaltaram, porém, que os dados desse estudo não foram suficientes para indicar a fonte da resistência e o sentido da transmissão.
1.3. Escherichia coli
Escherichia coli é constituinte da microbiota entérica humana e animal. Apesar de
algumas linhagens estarem relacionadas a doenças intestinais e extraintestinais (Clermont et al., 2000), a maioria não é considerada patogênica (Madigan et al., 2010). As linhagens patogênicas são divididas em grupos (patotipos), de acordo com as doenças ou toxinas que produzem: E. coli entero-hemorrágica (EHEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli
enteropatogênica (EPEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC),
E. coli que adere difusamente (DAEC) e E. coli extraintestinais (ExPEC) (Kaper et al., 2004). Escherichia coli entero-hemorrágica (EHEC) é classicamente caracterizada pela
presença de verotoxinas (também denominadas toxinas Shiga-like), codificadas pelos genes
vt1 e/ou vt2, e pela lesão attaching and effacing (A/E), produto da expressão de genes
localizados na ilha de patogenicidade denominada locus of enterocyte effacement (LEE), na qual se destaca o gene eae, que promove a expressão da intimina, responsável pela adesão e indução da lesão no tecido intestinal do hospedeiro. As E. coli produtoras de verotoxina (VTEC) podem ser consideradas um subgrupo de EHEC, pois apresentam apenas vt1 e/ou vt2. Ruminantes, principalmente bovinos saudáveis, são considerados reservatórios de EHEC, e infecções em humanos produzem Síndrome Hemolítica Urêmica (HUS) e colite hemorrágica (HC) (Nataro e Kaper, 1998; Kaper et al., 2004; Piérard et al., 2012).
Já E. coli enterotoxigênica (ETEC) apresenta dois grupos de enterotoxinas, as enterotoxinas termolábeis (LTs) e as termoestáveis (STs), e podem causar diarreia em humanos ou animais dependendo dos fatores de colonização que expressam – CFAs, em humanos e K88 ou K99, em animais (Kaper et al., 2004).
Cepas de E. coli enteropatogênica (EPEC) são caracterizadas pela produção da lesão A/E devido a expressão dos genes contidos na ilha de patogenicidade LEE e são ligadas a quadros de diarreia infantil aguda, muitas vezes fatal. São denominadas EPEC típicas as cepas que possuem plasmídeo EAF (fator de aderência de EPEC) (Kaper et al., 2004).
Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC) e Shigella spp. são estreitamente
relacionadas chegando a ser indistinguíveis a nível de espécies, de forma que alguns poucos testes bioquímicos as diferenciam. Porém, ambas apresentam os mesmos fatores de virulência essenciais, responsáveis pela penetração das células do epitélio intestinal e apoptose de macrófagos infectados, gerando colite inflamatória (Kaper et al. 2004).
Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) não apresenta secreção de
enterotoxinas LT e ST e são caracterizadas por um padrão especial de agregação das células semelhante a pilhas de tijolos. Podem apresentar citotoxinas e enterotoxinas ShET1, Pic, EAST1, Pet e fatores de colonização AAFs. Também são relacionadas à diarreia principalmente em crianças (Nataro e Kaper, 1998; Kaper et al., 2004).
Escherichia coli que adere difusamente (DAEC) possuem padrão de adesão
difuso, envolvendo o fator de colonização F1845 na maioria dos casos. Geralmente estão envolvidas em episódios diarreicos em crianças de um a cinco anos de idade (Nataro e Kaper, 1998; Kaper et al., 2004).
As E. coli extraintestinais (ExPEC) são aquelas envolvidas em infecções não intestinais. Compreendem as E. coli uropatogênicas (UPEC), que causam infecção no trato urinário; E. coli associadas a meningite/sepse (MNEC) que são a principal causa de meningite em recém nascidos e E. coli patogênica para aves (APEC), responsável por infecções respiratórias, pericardite e sepse em aves (Kaper et al., 2004).
A microbiota é resultante de milhões de anos de coevolução entre micro-organismos e o hospedeiro, podendo ser considerada uma relação mutualística, dada a participação em processos fisiológicos dos hospedeiros que em contrapartida fornecem nichos e nutrientes necessários à sobrevivência microbiana. No trato gastrintestinal humano a microbiota contribui para a prevenção da colonização por patógenos, na produção de vitaminas e auxilia na digestão, além de fazer parte de mecanismos regulatórios do sistema imune do hospedeiro e do desenvolvimento do tecido linfoide associado ao intestino (Kamada et al., 2013b).
Bactérias comensais e patogênicas ocupam nichos ecológicos intestinais semelhantes, de modo que o equilíbrio populacional da microbiota permite a prevenção da colonização e proliferação de patógenos e patobiontes. Por outro lado, a barreira epitelial do hospedeiro é fundamental para impedir a disseminação das bactérias comensais pelo organismo, o que resultaria em choque séptico letal (Kamada et al., 2013a). Porém, Marshall et al. (2009) sugeriram que a definição de micro-organismos comensais ou patogênicos pode ser relativa, estando associada à condição física do hospedeiro.
Atualmente, são admitidos sete grupos filogenéticos para E. coli (A, B1, B2, C, D, E, F) e um pertencente à Escherichia clado I (Clermont et al., 2013), estando os grupos A e B1 associados às cepas comensais (Clermont et al., 2000), porém não há correspondência entre os grupos filogenéticos e os patogênicos (Croxen et al., 2013).
Cepas de E. coli provenientes de animais de produção frequentemente apresentam multirresistência a antimicrobianos que pode ser disseminada para a comunidade (Vieira et al., 2011). Nesse contexto, Verdier et al. (2012) discutiram o papel de E. coli comensal como reservatório de genes codificadores de resistência a antimicrobianos, assim como a possibilidade de transferência, e sugeriram que cepas provenientes de animais saudáveis poderiam constituir em ferramenta de monitoramento.
1.4. RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA
O grupo dos β-lactâmicos está entre os antimicrobianos mais empregados para o tratamento de diversas infecções em humanos e outros animais. Atua interferindo na síntese da parede celular bacteriana, sendo a resistência conferida à produção da enzima β-lactamase que promove a hidrólise do anel β-lactâmico (Aminov e Mackie, 2007). Entre essas enzimas, as β-lactamases de espectro estendido (ESBLs) têm sido frequentemente estudadas (Pereira et al., 2003) e são definidas pela capacidade de hidrolisar penicilinas, cefalosporinas de terceira geração e monobactam sendo inibidas pelo ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam (Shah et al., 2004; Perez et al., 2007).
O isolamento de cepas de E. coli produtoras de β-lactamases em animais e alimentos de origem animal é frequente, sendo o grupo CTX-M o mais encontrado (Paterson e Bonomo, 2005; Lee et al., 2010). Adicionalmente, o isolamento de cepas de E. coli e
Klebsiella produtoras de ESBLs tem sido documentado em casos de infecções hospitalares
(Bonnedahl et al., 2009) e em amostras de E. coli isoladas de fezes bovinas, suínas e de aves (Horton et al., 2011).
Segundo Garcia-Alvarez et al. (2012), a descoberta de cepas de E. coli produtoras de ESBLs provenientes de fazendas de animais de produção contribuiu para a associação entre o genótipo presente em E. coli isoladas de infecções animais com amostras diagnosticadas em humanos. A capacidade de disseminação das ESBLs está relacionada à localização em elementos genéticos móveis, porém as vias de transmissão parecem ser mais complexas do que o suposto, e os dados referentes aos reservatórios na comunidade ainda são escassos, devido à dispersão de genes de β-lactamases no ambiente ser pouco conhecida (Lachmayr et al. 2009). Assim, a melhor compreensão da complexidade dos processos envolvidos na disseminação da resistência a antimicrobianos poderia conduzir a um melhor controle (O’Brien, 2002).
As fluorquinonolonas, derivadas das quinolonas, também são amplamente usadas, atuam nas topoisomerases DNA girase e topoisomerase IV impedindo a replicação, de modo
que a resistência mais comum consiste na mutação dos genes, promovendo a substituição de aminoácidos nas subunidades Gyr (A e/ou B) da DNA girase e ParC ou ParE na topoisomerase IV, cuja região geralmente mutada é denominada Região Determinante de Resistência à Quinolona (QRDR, do inglês Quinolone-Resistance-Determining Region) (Jacoby, 2005).
Outros mecanismos de resistência a quinolonas como as bombas de efluxo, proteção do sítio-alvo e alteração dos antimicrobianos envolvem a participação de genes localizados em plasmídeos (Bolon, 2011). As bombas de efluxo proteicas QepA e OqxAB, codificadas pelos genes qepA e oqxAB, promovem a expulsão de fluorquinolonas para fora da célula bacteriana (Hernández et al., 2011). Já as proteínas Qnr protegem as topoisomerases da atividade das quinolonas, sendo que até o momento, cinco famílias Qnr são conhecidas (genes
qnrA, qnrB, qnrS, qnrC e qnrD) (Hernández et al., 2011). Quanto ao mecanismo de alteração
do antimicrobiano é descrita a inativação enzimática de fluorquinolonas por uma variante da acetiltransferase AAC(6’)-Ib (Jacoby et al., 2014).
As tetraciclinas correspondem à outra classe de antimicrobianos com ação em vários micro-organismos (de bactérias gram-positivas e gram-negativas a protozoários). Atuam inibindo a síntese proteica ao impedir a ligação do RNA transportador ao ribossomo, de modo que a maioria dos genes que promovem resistência expressam sistemas de efluxo e o restante uma proteína que protege o ribossomo (Chopra e Roberts, 2001).
1.4.1. Elementos genéticos móveis
De acordo com Frost et al. (2005) “elementos genéticos móveis são segmentos de DNA que codificam enzimas e outras proteínas que medeiam o movimento do DNA dentro do genoma (mobilidade intracelular) ou entre células bacterianas (mobilidade intercelular)”.
Os movimentos intracelulares correspondem a eventos de recombinação no genoma realizados por transposons, que podem se integrar a fagos e plasmídeos, podendo ou não ser transferidos a outras células através dos mecanismos de transferência horizontal (HGT, do inglês horizontal gene transfer) (Frost et al., 2005).
Entre os movimentos intercelulares estão os mecanismos de transferência horizontal de genes: transformação, transdução e conjugação. A transformação necessita de bactérias naturalmente competentes para ocorrer; a transdução ocorre de maneira independente da célula bacteriana, uma vez que consiste no empacotamento acidental de DNA bacteriano no capsídeo do bacteriófago, que ao infectar novas células o transfere; a conjugação também é um sistema independente, pois necessita da presença de um plasmídeo
conjugativo ou de elementos conjugativos integrados ao cromossomo como os transposons conjugativos (Frost et al., 2005).
Desse modo, é possível distinguir três elementos genéticos de importância para a disseminação de resistência a antimicrobianos – plasmídeos, integrons e transposons (Stokes e Gillings, 2011).
Por definição, plasmídeos são elementos genéticos extracromossomais, capazes de autorreplicação e que não carregam genes essenciais para o metabolismo bacteriano (Carattoli, 2009). Podem ser classificados de acordo com os grupos de incompatibilidade (Inc), com base no fato que plasmídeos com o mesmo sistema de replicação são incompatíves e, portanto, não se propagam na mesma célula (Carattoli, 2009).
Nos plasmídeos dois conjuntos de genes são necessários para a conjugação, os genes de mobilidade (MOB) e do complexo de formação do par de acoplamento (MPF) associado a membrana, que produz um sistema de secreção tipo IV (T4SS), de modo que plasmídeos conjugativos são aqueles que apresentam complexo MPF próprio. Os plasmídeos mobilizáveis possuem MOB, mas não apresentam MPF e podem utilizá-lo de outros elementos genéticos presentes na célula bacteriana a fim de realizar conjugação, enquanto os não mobilizáveis não possuem nenhum dos dois conjuntos de genes (MOB e MPF) (Smillie et al., 2010).
Os plasmídeos geralmente apresentam genes de resistência a antimicrobianos o que, aliado à conjugação e a possibilidade de agregação de outros elementos genéticos (integrons e transposons), demonstra o papel significativo que desempenham na disseminação dessa resistência (Carattoli, 2013).
Os integrons foram descritos pela primeira vez por Stokes e Hall (1989). São elementos genéticos que promovem a integração de cassetes gênicos através de recombinação sítio-específica e são constituídos pelo gene da integrase (enzima que atua na integração do cassete gênico), um sítio de recombinação e o promotor (Koczura et al., 2013; Ravi et al., 2014). Podem ser divididos em dois grupos, os integrons de resistência e os superintegrons (Fluit e Schmitz, 2004).
Integrons de resistência não são naturalmente móveis, pois a integrase atua apenas na movimentação dos cassetes gênicos, porém, frequentemente estão associados a sequências de inserção, transposons e plasmídeos conjugativos que garantem a mobilidade e disseminação dos cassetes de resistência a antimicrobianos. São classificados em classes de acordo com a similaridade genética da integrase (gene intI), sendo que até o momento cinco
classes são conhecidas (classe 1, 2, 3, 4 e 5). Os integrons de classe 1 são os mais comuns e os de classe 4 e 5 presentes em Vibrio spp. (Mazel, 2006; Ravi et al., 2014).
Os superintegrons localizam-se no cromossomo bacteriano e são grandes, uma vez que possuem mais de 20 cassetes gênicos com funções variadas (Fluit e Schmitz, 2004; Mazel, 2006).
A estrutura clássica dos integrons de classe 1, no sentido 5’ a 3’ da sequência, compreende a integrase (intI1), o sítio de recombinação (attI), os cassetes gênicos com seus respectivos sítos de recombinação (attC) e uma região 3’ conservada apresentando os genes
qacΔE e sul1, que conferem resistência a quaternário de amônio e sulfonamidas,
respectivamente (Mazel, 2006). No entanto, integrons de classe 1 não usuais apresentam o gene sul3 na região 3’ conservada (Sáenz et al., 2010).
Acredita-se que os integrons de classe 1 tenham surgido a partir da captura do integron de classe 1 cromossomal de betaproteobactérias ambientais, por um transposon da família Tn402, evento que tem favorecido a disseminação de genes de resistência no ambiente e possibilitado o uso dessa classe de integron como indicativo de poluição gerada pela atividade humana (Gillings et al., 2015).
Já os transposons são caracterizados por um fragmento de DNA com duas sequências de inserção nas extremidades (Mazel, 2006), sendo que um grupo particular de transposons apresenta capacidade de conjugação (transposons conjugativos). Tais transposons apresentam características de transposons clássicos e de bacteriófagos. Semelhante a transposons clássicos, transposons conjugativos excisam e integram ao DNA de plasmídeos conjugativos quando apresentam forma circular fechada e são transferidos por conjugação, apesar de não se replicarem. Por outro lado, apresentam características de excisão e integração semelhante a fagos temperados (Salyers et al., 1995).
1.4.2. Disseminação no ambiente e implicações
Resultados obtidos em análise retrospectiva, quanto à susceptibilidade antimicrobiana em E. coli indicaram que a seleção de mecanismos de resistência estaria temporalmente relacionada ao uso de antimicrobianos na medicina humana e veterinária (Tadesse et al., 2012).
Nesse sentido, Marshall et al. (2009) ressaltaram que o uso de antimicrobianos na pecuária, inclusive como aditivo na alimentação, tem contribuído para a seleção de genes de resistência em bactérias comensais, localizados em elementos móveis como transposons e plasmídeos. Isso merece atenção especial, pois indica a possibilidade de transferência gênica
entre bactérias provenientes de diferentes animais, as associadas aos humanos ou entre comensais e patógenos. Dessa forma, o estudo da resistência antimicrobiana em bactérias não patogênicas é fundamental para a melhor compreensão da distribuição ambiental dos genes, dada a possibilidade de transferência a bactérias patogênicas (Lachmayr et al., 2009).
Devido ao contato que algumas espécies de dípteros muscoides estabelecem com as fezes de bovinos, torna-se notável a possibilidade de veiculação de bactérias resistentes a antimicrobianos, fato que contribui para a alocação das moscas nas rotas de disseminação de resistência antimicrobiana (Rybaríková et al., 2010). Isto, aliado à distribuição de E. coli em hospedeiros animais ou humanos e no ambiente, e à versatilidade patógeno/comensal da espécie, permite que estudos direcionados à abordagem de cepas comensais como reservatórios genéticos, assim como a contribuição com a emergência de fatores de virulência e resistência sejam conduzidos (Tenaillon et al., 2010). Além disso, trabalhos desenvolvidos com E. coli podem contribuir para a orientação de estudos em outras bactérias do mesmo nicho (O’Brien, 2002).
No ambiente, a participação das moscas na disseminação geralmente não é considerada, sendo associada a alimentos de origem animal, pelo contato direto com animais ou através de rotas ambientais (Costa et al., 2013), que geralmente incluem os animais domésticos, seus excrementos e os vegetais cultivados, de modo que um fator importante para a dispersão de bactérias resistentes pode ser a aplicação de esterco como fertilizante (Khachatourians, 1998; Marshall et al., 2009; Costa et al., 2013). Isto, aliado ao emprego de antimicrobianos na pecuária, colocaria as fazendas como fontes de genes e de bactérias resistentes a antimicrobianos, de modo que entender a contribuição da prática agropecuária para a disponibilização de genes de resistência no ambiente é essencial (Wichmann et al., 2014). No entanto, apesar de vários estudos terem como tema a resistência antimicrobiana no ambiente, análises mais abrangentes sobre os elementos genéticos e o perfil clonal das cepas presentes na disseminação são secundárias (Novais et al., 2013).
Considerando que a ecologia de genes de resistência antimicrobiana e de virulência no ambiente não é bem compreendida (Macovei e Zurek, 2006), a abordagem de dípteros muscoides como vetores mecânicos de bactérias resistentes a antimicrobianos contribuiria para o desenvolvimento de estudos mais completos sobre a disseminação da resistência antimicrobiana, não só em termos epidemiológicos clássicos como também moleculares, uma vez que a relação de dípteros muscoides com fezes de bovinos possibilita a veiculação de bactérias da microbiota intestinal desses animais.
A possibilidade de classificação de E. coli em comensais ou em potenciais patógenos permite que estudos sobre resistência antimicrobiana e fatores de virulência relacionados a esses grupos sejam conduzidos, uma vez que E. coli não patogênica pode significar um importante reservatório de genes de resistência antimicrobiana, sendo a proximidade entre o ambiente animal e humano um provável fator para a troca de genes entre bactérias de origens distintas (Liebana et al., 2006).
Assim, estudos de resistência antimicrobiana em isolados animais são fundamentais para a melhor compreensão do papel dos hospedeiros, e das espécies ecologicamente associadas a eles, nos processos de disseminação e de eventos de transferência horizontal dos genes de resistência a antimicrobianos entre cepas comensais e patogênicas. Nesse sentido, este projeto propõe o isolamento, identificação e a caracterização fenotípica e genotípica da resistência de E. coli isoladas de dípteros muscoides em propriedade rural leiteira; a detecção de fatores de virulência relacionados à colibacilose bovina e a avaliação da capacidade de disseminação dos genes de resistência através da presença de plasmídeos, ensaios de conjugação e perfil clonal das cepas isoladas.
2.1. Objetivo Geral: Caracterizar a resistência fenotípica e genotípica a antimicrobianos e fatores de virulência em E. coli isoladas de dípteros muscoides presentes em propriedade leiteira.
2.2. Específicos:
1. Isolar e identificar cepas de E. coli em amostras de dípteros muscoides e determinar o perfil de sensibilidade fenotípica dos isolados frente aos principais antimicrobianos administrados em terapia veterinária e humana, assim como a produção fenotípica de ESBLs;
2. Identificar por PCR os principais genes de resistência, integrons e fatores de virulência associados à colibacilose em bovinos;
3. Verificar a presença de plasmídeos nas cepas resistentes;
4. Caracterizar os integrons por Restriction Fragment- Length Polymorphism (RFLP) e sequenciamento
5. Verificar a possibilidade de transferência dos integrons e genes de resistência através de ensaios de conjugação;
6. Determinar por PCR os grupos filogenéticos das cepas resistentes;
7. Avaliar o perfil clonal das cepas resistentes através de Pulsed Field Gel
3.1. Áreas de coleta
A coleta das moscas foi realizada com a colaboração do Prof. Dr. Márcio Garcia Ribeiro - Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública (DHVSP) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) - UNESP, Botucatu-SP, em dois estabelecimentos rurais, aqui designados por A e B, localizados na região de Botucatu – SP, com sistema semi-intensivo de produção leiteira (Figura 1).
A propriedade A caracteriza-se pela produção de leite destinada à comercialização, apresentando maior densidade de animais (número de animais por área), com sistema de rotação de pastagem e ordenha mecânica realizada duas vezes ao dia. Os animais são mantidos em sistema de semiconfinamento e os bezerros são separados de acordo com a idade. A suplementação alimentar é realizada no estábulo com ração e feno.
A propriedade B apresenta produção de leite para autoconsumo e criação de gado de corte, sendo que para a realização do presente trabalho apenas o gado leiteiro foi contabilizado. A propriedade apresenta menor densidade de animais devido a maior área destinada à pastagem, com ordenha manual realizada uma vez ao dia. A suplementação alimentar é realizada no estábulo com ração, feno e silagem de milho.
As propriedades distam aproximadamente 35 km.
3.2. Obtenção das amostras
As moscas foram coletadas utilizando puçá entomológico previamente desinfetado com solução de hipoclorito de sódio a 10% por 30 minutos, a fim de evitar a interferência de contaminantes presentes anteriormente no equipamento. Foi dada preferência às moscas que estavam mais próximas aos animais em lactação (vacas e bezerros). As coletas foram realizadas em junho de 2015, durante o período da manhã por duas horas (7h30 às 9h30 na propriedade A e das 10h às 12h na propriedade B) com tentativas a cada 3 minutos, em média.
As moscas obtidas em cada captura foram transferidas para tubos tipo falcon estéreis e inativadas por congelamento a -10 ºC por 30 minutos.
Figura 1. Região do município de Botucatu-SP, onde estão localizadas as duas propriedades leiteiras estudadas (denominadas A e B), quanto à resistência antimicrobiana em E. coli provenientes de dípteros muscoides.
Fonte: Elaborado com Google Maps (https://maps.google.com.br/)
3.3. Isolamento e identificação de E. coli
Aos tubos contendo as moscas foram adicionados 2 mL de caldo EC (Escherichia coli). Os tubos foram incubados a 37 ºC por 24 horas e posteriormente, as culturas foram semeadas em meio ágar MacConkey, com e sem a adição de ampicilina (50 μg/mL), e incubadas a 37 ºC por 24 horas. As moscas foram removidas do meio líquido, lavadas com álcool 70 °GL e mantidas sob refrigeração, também em álcool 70 °GL, para posterior identificação das espécies.
Cinco colônias típicas de E. coli cultivadas em ágar MacConkey com adição de ampicilina foram selecionadas por meio das características morfológicas das colônias e da diferenciação bioquímica a partir das seguintes provas: fermentação de glicose, produção de gás, urease, L-triptofanase, produção de ácido sulfídrico, lisina descarboxilase, motilidade, indol e citrato. Para a realização das provas foi utilizado o conjunto de meios EPM/MILi/Citrato (Toledo et al., 1982 a, b).
As cepas foram estocadas em meio semissólido (ágar nutriente 1,15%; caldo nutritivo 0,4%) e congeladas (Caldo BHI - Brain Heart Infusion; 20% glicerol).
A identificação das espécies de dípteros foi realizada com a colaboração da Profa. Dra. Patrícia Jacqueline Thyssen - Departamento de Biologia Animal, Instituto de Biologia – UNICAMP.
3.4. Caracterização fenotípica da sensibilidade aos antimicrobianos 3.4.1. Sensibilidade microbiana (antibiograma)
O perfil de sensibilidade microbiana foi realizado mediante a técnica de difusão com discos (Bauer et al., 1966; CLSI, 2012), frente aos antimicrobianos: ampicilina (10 g), amoxicilina/ácido clavulânico (30 g), cefalexina (30 g), cefoperazona sódica (75 g), ceftiofur (30 g), ceftriaxona (30 g), cloranfenicol (30 g), enrofloxacina (5 g), ciprofloxacina (5 g) gentamicina (10 g), sulfametoxazol/trimetoprim (25 g) e tetraciclina (30 g) (Ribeiro, 2008; Winn Jr. et al., 2008). Como controle de sensibilidade foi utilizada a linhagem de E. coli ATCC 25922 e a interpretação dos resultados de acordo com o disposto pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2012).
A técnica consiste no preparo de uma suspensão bacteriana na escala 0,5 de Mc Farland em solução de NaCl 0,15 M estéril, a partir de colônias com características idênticas, isoladas em meio ágar triptona de soja (TSA). Posteriormente, a suspensão de cada amostra foi espalhada na superfície de placas contendo ágar Mueller Hinton com auxílio de swabs estéreis. Em seguida, os discos correspondentes aos antimicrobianos a serem testados foram aplicados sobre o meio, obedecendo a uma distância mínima de 20 mm entre os discos e incubados a 37 °C por 24 horas. As cepas que apresentaram perfil intermediário foram consideradas resistentes.
3.4.2. Produção de ESBLs – Método da aproximação de disco
A detecção de ESBL foi realizada conforme o método de aproximação de discos (Jarlier et al.,1988), utilizando discos de aztreonam (30 g), ceftriaxona (30 g), cefotaxima (30g), ceftazidima (30 g) e amoxicilina/ácido clavulânico (30 μg). Para a execução da técnica foram escolhidos os isolados de E. coli que apresentaram perfil resistente, no antibiograma, aos β-lactâmicos (cefalosporinas) de terceira geração empregando os mesmos procedimentos do item anterior. Os discos de aztreonam, ceftriaxona, cefotaxima e ceftazidima foram dispostos a 20 mm do disco de amoxicilina/ácido clavulânico ao centro. Considera-se o resultado positivo quando há alargamento do halo de inibição ou surgimento
de uma faixa de inibição entre os halos de amoxicilina/ácido clavulânico e os antimicrobianos testados, conhecida como “zona fantasma”.
3.5. PCR para a pesquisa dos genes de virulência, resistência e integrons 3.5.1. Extração do DNA (método do choque térmico)
O método baseado em Chapman et al. (2001) consistiu na fervura por 10 minutos da suspensão bacteriana, preparada a partir do crescimento confluente obtido em placas de TSA em 200 L de água ultrapura estéril, seguido de congelamento a -10 °C por 30 minutos. Após o descongelamento (temperatura ambiente) as amostras foram centrifugadas a 12.000 rpm (9.676,8 g) (centrífuga Sorvall® MC12) por 5 minutos e o sobrenadante transferido para um novo tubo.
3.5.2. PCR
A detecção dos genes de interesse (Tabela 1) foi realizada pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), primeiramente utilizando pool de DNA de cinco amostras1. Em cada reação foram adicionados 1,5 U Taq polimerase, 1,5 L de Tampão 10X para PCR, 200 M de dNTP, 2 mM de MgCl2, 0,5 µL dos iniciadores em concentrações ótimas, água ultrapura estéril qsp., em um volume final de 15 μL e 2 L de DNA bacteriano obtido por choque térmico. Cerca de 5 µL dos produtos da PCR adicionados de 1-2 µL de tampão de amostra (azul de bromofenol 0,25%; sacarose em água 40% w/v) foram submetidos à eletroforese em gel de agarose em tampão TAE 1X (Tris 2 M; Ácido acético 0,04 M; EDTA 0,01 M em pH 8,0) a 100 V e 200 mA por 50 minutos. Posteriormente, o gel foi incubado em solução de Brometo de Etídeo a 1 g/mL por 10 minutos e visualizado em transiluminador de luz UV e as imagens foram capturadas e fotografadas com o sistema Image Master® VDS (Pharmacia Biotech).
A programação das PCRs (termociclador Techne TC-312) foi realizada da seguinte forma: desnaturação inicial a 94ºC por cinco minutos, 30 ciclos (94ºC por 45 segundos, temperatura de anelamento por 45 segundos, 72ºC por 45 segundos) e extensão final a 72ºC por sete minutos.
1
Tabela 1. Iniciadores utilizados para a detecção dos fatores de virulência, genes de resistência e integrons em isolados de E. coli provenientes de dípteros muscoides.
Iniciador Produto Sequência (5’-3’) T* pb** Ref.
Fatores de virulência
eae intimina GACCCGGCACAAGCATAAGG
CCACCTGCAGCAACAAGAGC 63 ºC 384
Yu e Kaper, 1992
vt1 verotoxina AAGTTGCAGCTCTCTTTGAATA
TGCAAACAAATTATCCCCTGAG 50 ºC 364 Ojeniyi et al.,
1994
vt2 verotoxina GGGCAGTTATTTTGCTGTGGA
GTATCTGCCTGAAGCGTAA 50 ºC 386
hlyA hemolisina AACAAGGATAAGCACTGTTCTGGCT ACCATATAAGCGGTCATCCCGTCA 63 ºC 1177 Yamamoto et
al., 1995 K99 fator de colonização TATTATCTTAGGTGGTATGG GGTATCCTTTAGCAGCAGTATTTC 50 ºC 314 Franck et al., 1998 LTII toxina termolábil AGATATAATGATGGATATGTATC TAACCCTCGAAATAAATCTC 48 °C 300 Schultsz et al., 1994 STa toxina termoestável TCCGTGAAACAACATGACGG ATAACATCCAGCACAGGCAG 48 °C 244 So e McCarty, 1980 β-lactâmicos
ampC AmpC β-lactamases*** CCCCGCTTATAGAGCAACAA TCAATGGTCGACTTCACACC 61 °C 634 Féria et al.,
2002
blaTEM ESBL TGCTTAATCAGTGAGGCACC TCGGGGAAATGTCGCG 61 °C 972
Cao et al., 2002 blaSHV ESBL TTATCTCCCTGTTTAGCCACC GATTTGCTGATTTCGCTCGG 61 °C 795 blaCTX-M ESBL CGATGTGCAGTACCAGTAA TTAGTGACCAGAATCAGCGG 60 °C 585 Batchelor et al., 2005
blaCMY-4 AmpC
β-lactamases**** GATTCCTTGGACTCTTCAG TAAAACCAGGTTCCCAGATAGC 56 ºC 1800 Stapleton et al., 1999 Quinolonas
gyrA mutação DNA
girase TACACCGGTCAACATTGAGG TTAATGATTGCCGCCGTCGG 64 ºC 648 Oram e Fisher, 1992 parC Mutação topoisomerase IV AAACCTGTTCAGCGCCGCATT GTGGTGCCGTTAAGCAAA 55 ºC 395 Vila et al., 1996 Tetraciclina
tetA sistema efluxo GTAATTCTGAGCACTGTCGC
CTGTCCTGGACAACATTGCTT 62 °C 937 Guardabassi et al., 2000 Integrons intI1 integrase classe 1 GGGTCAAGGATCTGGATTTCG ACATGGGTGTAAATCATCGTC 62 ºC 483 Mazel et al., 2000 5’CS 3’CS região dos cassetes GGCATCCAAGCAGCAAG AAGCAGACTTGACCTGA 60 ºC V § Lévesque et al., 1995 intI2 integrase classe 2 CACGGATATGCGACAAAAAGGT GTAGCAAACGAGTGACGAAATG 62 ºC 788 Mazel et al., 2000 attI2-F orfX-R região dos cassetes GACGGCATGCACGATTTGTA GATGCCATCGCAAGTACGAG 58 ºC V § Machado et al., 2005
T*: Temperatura de anelamento; pb**: tamanho do produto em pares de bases; Ref.: Referência; ***: gene cromossomal; ****: gene plasmidial; V§: variável; ESBL: β-lactamase de espectro estendido
3.6. Presença de plasmídeos
A extração de DNA plasmidial foi realizada pelo método de lise alcalina (Birnboim e Doly, 1979) nas cepas que apresentaram multirresistência (perfil fenotípico resistente a três ou mais classes de antimicrobianos) (Magiorakos et al., 2012). Os plasmídeos foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 0,8% em tampão TBE (Tris 0,89 M; ácido bórico 0,89 M; EDTA 0,25 M em pH 8,0) a 50 V e 100 mA durante 2 horas. Posteriormente o gel foi visualizado e fotografado conforme o item 3.5.2. Como controles da extração foram utilizadas as cepas de E. coli DH10B com um plasmídeo inserido (positivo), J53 (negativo) e V517.
3.7. Classificação filogenética de E. coli
As cepas que apresentaram multirresistência foram atribuídas aos grupos filogenéticos A, B1, B2 e D de acordo com o esquema de PCR multiplex elaborado por Clermont et al. (2000). As reações foram realizadas de acordo com o exposto no item 3.5.2., utilizando 1 L de mix contendo os três pares de iniciadores nas mesmas concentrações e programação dos ciclos de acordo com o proposto no trabalho citado. As cepas alocadas nos grupos A e B1 são consideradas comensais e nos grupos B2 e D patogênicas.
Dados referentes aos iniciadores e a interpretação dos resultados estão expostos na Tabela 2.
Tabela 2. Iniciadores utilizados no esquema proposto por Clermont et al. (2000) e as combinações de resultados possíveis.
Iniciador Sequência (5’-3’) pb* Cepas
controles** Combinações/Grupos
ChuA GACGAACCAACGGTCAGGAT
TGCCGCCAGTACCAAAGACA 279 O157:H7 - - - + + +
YjaA TGAAGTGTCAGGAGACGCTG ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC 211 K12C600 - + - + + -
TspE4C2 GAGTAATGTCGGGGCATTCA CGCGCCAACAAAGTATTACG 152 2348/69 - - + - + +
A A B1 B2 B2 D
