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LETICIA MARIA ZANPHORLIN MURAKAMI
Hsp90 HUMANA: INTERAÇÃO COM A CO-CHAPERONA TOM70 E EFEITO DO CELASTROL NA ESTRUTURA E FUNÇÃO
CAMPINAS 2014
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
LETICIA MARIA ZANPHORLIN MURAKAMI
Hsp90 HUMANA: INTERAÇÃO COM A CO-CHAPERONA TOM70 E EFEITO DO CELASTROL NA ESTRUTURA E FUNÇÃO
ORIENTADOR: PROF. DR. CARLOS HENRIQUE INÁCIO RAMOS
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA POR LETICIA MARIA ZANPHORLIN MURAKAMI, E ORIENTADA PELO PROF.DR. CARLOS HENRIQUE INÁCIO RAMOS
______________________ Assinatura do Orientador
CAMPINAS 2014
TESE DE DOUTORADO APRESENTADA AO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTORA EM CIÊNCIAS
Murakami, Leticia Maria Zanphorlin,
M931h MurHsp90 humana: interação com a co-chaperona Tom70 e efeito do celastrol na estrutura e função / Leticia Maria Zanphorlin Murakami. – Campinas, SP : [s.n.], 2014.
MurOrientador: Carlos Henrique Inácio Ramos.
MurTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química.
Mur1. Chaperona molecular. 2. Proteína de choque térmico 90. 3. Interação proteina-proteína. 4. Celastrol. 5. Co-chaperona TPR. I. Ramos, Carlos Henrique Inácio. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Química. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Human Hsp90: interaction with the co-chaperone Tom70 and effect of
celastrol on the structure and function
Palavras-chave em inglês:
Molecular chaperone Heat shock protein 90 Protein-protein interaction Celastrol
TPR co-chaperone
Área de concentração: Química Orgânica Titulação: Doutora em Ciências
Banca examinadora:
Carlos Henrique Inácio Ramos [Orientador] Ana Paula Canedo Valente
Ana Paula Ulian de Araújo Marco Aurélio Zezzi Arruda Ljubica Tasic
Data de defesa: 02-10-2014
Programa de Pós-Graduação: Química
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
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Dedico esse trabalho, aos
meus amores: meus
pais, meu irmão e meu
marido.
ix
Cada um de nós compõe a sua história
Cada ser em si
Carrega o dom de ser capaz
E ser feliz
Conhecer as manhas
E as manhãs
O sabor das massas
E das maçãs
É preciso amor
Pra poder pulsar
É preciso paz pra poder sorrir
É preciso a chuva para florir
Ando devagar
Porque já tive pressa
E levo esse sorriso
Porque já chorei demais
xi
Primeiramente à Deus, por ter me dado a vida, minha família e por nunca ter
me deixado desistir dessa árdua caminhada.
Ao Prof. Carlos Ramos, pelas infinitas discussões científicas, por acompanhar
esse trabalho tão de perto e por proporcionar uma estrutura tão favorável para
a execução desse trabalho.
Aos Profs que participaram da banca de Qualificação: Prof. Fábio Gozzo,
Prof. Zezzi e Profa. Buba. Obrigada pela valiosa contribuição!
Ao Prof. Fábio Gozzo pela importante contribuição nesse trabalho. Também
um agradecimento à Alana e a Tati pelas boas discussões ao longo do trabalho.
Aos meus queridos Profa Ciça e Prof. David Remeta, por terem me recebido tão
bem nos EUA e por terem me transmitido tanto conhecimento.
Ao Prof. Babis, da Universidade de Rutgers, por ter cedido seu laboratório
para os experimentos de expressão e purificação.
Aos Profs do Instituto de Química – UNICAMP.
A queridíssima Claudia Marteli, responsável pelo lab. de espectroscopia do IQ,
pessoa maravilhosa!!
Ao Prof. Watson, sempre gentil e generoso.
Aos meus Profs de graduação do Departamento de Física da UNESP-Ibilce,
onde eu adquiri toda a base necessária e também fiz grandes amigos.
Ao Prof. Leandro Barbosa do Instituto de Física da USP, pelo entusiasmo e
pelos valiosos ensinamentos em SAXS.
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Aos amigos do laboratório, Ana Luíza, Mari, Vanessa, Ane, David, Josi,
Daniel, Barbara, Claudinha, João. Não posso também me esquecer dos antigos,
Vivi, Yuri e Fernanda.
As instalações do Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais –
CNPEM.
A FAPESP pela bolsa concedida e também à CAPES e ao CNPQ.
As minhas amigas de Rio Preto, Aline, Fer Mastrocola, Dandara, Paulinha,
Livia Faim e Michele.
Aos meus queridos Zu e Érica pela amizade e pelo carinho dedicado.
Aos meus novos colegas de trabalho do CTBE.
Aos meus pais, Branco e Nina, pela vida dedicada aos filhos, por me apoiarem
e incentivarem o tempo todo. AMO VOCÊS!!
Ao meu irmão Lucas, por ser tão querido e amável!
E por fim, um agradecimento especial, ao meu marido Mário Murakami,
cientista e pessoa única! Obrigada pelo incentivo, carinho, paciência, amor,
companheirismo, lealdade e ensinamentos. Enfim, obrigada por fazer parte da
minha vida. Qualquer coisa que eu diga aqui é pouco para lhe agradecer. TE
AMO!
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Nome: Leticia Maria Zanphorlin Murakami Data de nascimento: 28/12/1984
Contatos: telefone: 55-19-3517-5152; 55-19-996548028
Endereço profissional: Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE) incorporado ao Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais - CNPEM. Campinas – SP – Brasil.
e-mail: lmzanfa@yahoo.com.br
1. Experiência Profissional e Acadêmica
2010 – 2014 Doutorado em Química – Instituto de Química/UNICAMP com Doutorado Sanduíche com ênfase em proteínas na Universidade Estadual de Nova Jersey – Rutgers (USA). Orientador: Carlos Henrique Inácio Ramos. Bolsa FAPESP.
2009 – 2009 Estudos de cinética enzimática e especificidade envolvendo uma serino-protease de fungo termofílico. - UNIFESP. Supervisor: Prof. Dr. Luis Juliano Neto.
2008 – 2009 Mestrado em Biofísica Molecular com ênfase em Bioquímica. – UNESP. Orientadores: Prof. Dr. Gustavo O. Bonilla-Rodrigues e Prof Dr Eleni Gomes.Bolsa CAPES.
2006 – 2007 Iniciação Científica envolvendo técnicas espectroscópicas e de microcalorimetria de macromoléculas. - UNESP.
2003 – 2007 Graduação em Física Biológica – UNESP/São José do Rio Preto-SP.
2. Prêmios
2013 - William F. Giauque Memorial Award - The 68TH Calorimetry Conference.
3. Idiomas
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MOTTA, GUACYARA; VERONEZ, CAMILA L.; ANDRADE, SHEILA S.; OLIVEIRA, PAULO S.L.; ARNI, RAGHUVIR K.; CINTRA, ADELIA C.O.; SAMPAIO, SUELY V.; JULIANO, MARIA A.; Juliano, Luiz; MURAKAMI, MÁRIO T.; GOUVEA, IURI E. P-I class metalloproteinase from Bothrops moojeni venom is a post-proline cleaving peptidase with kininogenase activity: Insights into substrate selectivity and kinetic behavior. Biochimica et Biophysica Acta. Proteins and Proteomics, v. 1844, p. 545-552, 2014.
2. DE GIUSEPPE, PRISCILA OLIVEIRA; SOUZA, TATIANA DE ARRUDA CAMPOS BRASIL; SOUZA, FLAVIO HENRIQUE MOREIRA; ZANPHORLIN, LETICIA MARIA; MACHADO, CARLA BOTELHO; WARD, RICHARD JOHN; JORGE, JOAO ATILIO; FURRIEL, ROSA DOS PRAZERES MELO; MURAKAMI, MARIO TYAGO. Structural basis for glucose tolerance in GH1 β-glucosidases. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, v. 70, p. 1631, 2014.
3. RULLER, R.; ALPONTI, J.; DELIBERTO, L. A.; ZANPHORLIN, L. M.; MACHADO, C. B.; WARD, R. J. Concommitant adaptation of a GH11 xylanase by directed evolution to create an alkali-tolerant/thermophilic enzym. Protein Engineering Design and Selection, v. 27, p. 255-262, 2014. 4.ZANPHORLIN, LETÍCIA M.; ALVES, FERNANDA R.; RAMOS, CARLOS H.I. The effect of celastrol, a triterpene with antitumorigenic activity, on conformational and functional aspects of the human 90kDa heat shock protein Hsp90α, a chaperone implicated in the stabilization of the tumor phenotype.. Biochimica et Biophysica Acta. G, General Subjects (Print), v. 1840, p. 3145-3152, 2014.
5. SANTOS, C. R.; HOFFMAM, Z. B.; MARTINS, V. P. D. M.; ZANPHORLIN, L. M.; ASSIS, L. H. D. P.; HONORATO, R. V.; OLIVEIRA, P. S. L. D.; RULLER, R.; MURAKAMI, M. T. Molecular mechanisms associated with xylan degradation by Xanthomonas plant pathogens. The Journal of Biological Chemistry (Print), v. xxx, p. xxx, 2014.
6.ULLAH, A.; SOUZA, T. A. C. B.; ZANPHORLIN, L. M.; MARIUTTI, R. B.; SANTANA, V. S.; MURAKAMI, M. T.; ARNI, R. K. Crystal structure of Jararacussin-I: The highly negatively charged catalytic interface contributes to macromolecular selectivity in snake venom thrombin-like enzymes. Protein Science (Print), v. 22, p. 128-132, 2013.
7. ZANPHORLIN, L.M.; CABRAL, H.; ARANTES, E.; ASSIS, D.; JULIANO, L.; JULIANO, M.A.; DA-SILVA, R.; GOMES, E.; BONILLA-RODRIGUEZ, G.O. Purification and characterization of a new alkaline serine protease from the thermophilic fungus Myceliophthora sp. Process Biochemistry (1991), v. 46, p. 2137-2143, 2011.
8. ZANPHORLIN, LETÍCIA MARIA; FACCHINI, FERNANDA DELL ANTONIO; VASCONCELOS, FILIPE; BONUGLI-SANTOS, RAFAELLA COSTA; RODRIGUES, ANDRÉ; SETTE, LARA DURÃES; GOMES, ELENI; BONILLA-RODRIGUEZ, GUSTAVO ORLANDO. Production, partial characterization, and immobilization in alginate beads of an alkaline protease from a new thermophilic fungus Myceliophthora sp. Journal of Microbiology (Seoul. Print), v. 48, p. 331-336, 2010.
9. MERHEB-DINI, CAROLINA; CABRAL, HAMILTON; LEITE, RODRIGO S. R.; ZANPHORLIN, L. M.; OKAMOTO, DEBORA N.; RODRIGUEZ, GUSTAVO O. BONILLA; JULIANO, LUIZ; ARANTES, ELIANE C.; GOMES, ELENI; DA SILVA, ROBERTO. Biochemical and Functional Characterization of a Metalloprotease from the Thermophilic Fungus. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 57, p. 9210-9217, 2009.
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Chaperonas moleculares e proteínas de choque térmico (Heat shock protein, Hsp) atuam contra a agregação e o enovelamento incorreto de proteínas, que são os agentes causais de doenças neurodegenerativas, como por exemplo, Alzheimer e Parkinson. A Hsp90 é uma das mais importantes chaperonas moleculares, considerada essencial para a viabilidade celular em eucariotos, pois está associada com a maturação de proteínas atuantes na sinalização e ciclo celular. Além disso, foi demonstrado que a Hsp90 está envolvida na estabilização do fenótipo tumoral de diversos tipos de câncer, destacando a sua importância biomédica. A interação com co-chaperonas, proteínas auxiliares das chaperonas, permite que a Hsp90 atue como uma proteína “hub”, ou seja, um ponto central de regulação de diversas proteínas. Muitas dessas co-chaperonas possuem um ou mais domínios do tipo TPR (do inglês, tetratricopeptide repeat) que interagem com o C-terminal da Hsp90. No presente projeto de doutorado, investigamos as características estruturais e termodinâmicas da interação entre o domínio C-terminal da Hsp90 (C-Hsp90) e a co-chaperona TPR Tom70 humana, utilizando técnicas de reação-cruzada acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS), calorimetria de titulação isotérmica (ITC), espalhamento de raios-X à baixos ângulos (SAXS) e modelagem molecular. Os resultados de LC-MS/MS e ITC evidenciaram novas regiões na interação do complexo C-Hsp90/Tom70 que envolve a hélice A7 presente na Tom70 e experimentos de SAXS revelaram a estrutura em baixa resolução das proteínas Hsp90, Tom70 e do complexo C-Hsp90/Tom70. Além disso, investigamos o efeito do celastrol, um composto com potencial atividade anti-câncer, na conformação e na função da Hsp90. Na presença do composto, a Hsp90 sofre um processo de oligomerização e a natureza dos oligômeros foi determinada por ferramentas bioquímicas e biofísicas, tais como espalhamento dinâmico de luz (DLS), cromatografia de exclusão molecular analítica acoplada a espalhamento de luz em multiângulos (SEC-MALS) e eletroforese em gel nativo. Interessantemente, a oligomerização induzida pelo celastrol não afetou a atividade de proteção da Hsp90 contra a agregação protéica e a capacidade de ligação as co-chaperonas com enovelamento tipo TPR. Este é o primeiro trabalho a apontar um possível mecanismo para a ação do celastrol sobre a Hsp90. Coletivamente, nossos resultados e descobertas contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares relacionados à interação entre chaperonas e co-chaperonas, bem como, chaperonas e potenciais ligantes.
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Molecular chaperones and heat shock proteins (Hsp) act against protein aggregation and misfolding, which are the causal agents of neurodegenerative diseases such as Alzheimer and Parkinson. Hsp90 is one of the most important molecular chaperones, considered essential for cell viability in eukaryotes, since it is associated with the maturation of proteins involved in cell cycle and signaling. In addition, it was demonstrated that Hsp90 is implicated in the stabilization of the tumor phenotype of various types of cancer, highlighting its biomedical importance. The interaction with co-chaperones, auxiliary proteins of chaperones, allows that Hsp90 acts as a hub, being a central point for regulation of several other proteins. Many of these co-chaperones have one or more TPR domains that interact with the C-terminus of Hsp90. In this PhD project, we investigated structural and thermodynamic characteristics of the interaction between the C-terminus domain of Hsp90 (C-Hsp90) and the TPR co-chaperone human Tom70, using techniques of cross-linking coupled with mass spectrometry (LC-MS/MS), isothermal titration calorimetry (ITC), small angle X-ray scattering (SAXS) and molecular modeling. The results of LC-MS/MS and ITC revealed new regions involved in the interaction of the C-Hsp90 with Tom70, which encompasses the A7 helix from Tom70, and SAXS experiments unveiled the low resolution structure of the proteins C-Hsp90, Tom70 and the C-Hsp90/Tom70 complex. In addition, we investigated the effect of celastrol, a compound with a potential anti-cancer activity, on the conformation and function of Hsp90. In the presence of celastrol, Hsp90 undergoes oligomerization and the nature of the oligomers was determined by biochemical and biophysical tools such as dynamic light scattering (DLS), size-exclusion chromatography coupled to multi-angle light scattering (SEC-MALS) and native gel electrophoresis. Interestingly, the celastrol-induced oligomerization did not affect the protective activities of Hsp90 against protein aggregation or the capacity to bind TPR co-chaperones. This is the first study to point out a possible mechanism for the action of celastrol on Hsp90. Collectively, our findings contribute to a better understanding of the molecular mechanisms associated to the interaction between chaperones and co-chaperones, as well as chaperones and potential ligands.
xix LISTA DE TABELAS...xxix LISTA DE FIGURAS...xxxi 1. INTRODUÇÃO...1 1.1 Enovelamento protéico...1 1.2 Chaperonas moleculares...6 1.3 Hsp90...10
1.4 Proteínas TPR (Tetratricopeptide repeat)...16
1.5 Terapia para câncer: inibição da Hsp90...22
2. OBJETIVOS...27
2.1 Objetivo Geral...27
2.2 Objetivos Específicos...28
3. MATERIAIS E MÉTODOS...29
3.1 Vetor de expressão e plasmídeos...29
3.2 Transformação de bactérias competentes com vetor de expressão ... .... 29
3.3 Expressão das proteínas ... 30
3.4 Lise das bactérias ... 31
3.5 Purificação das proteínas ... 31
3.6 Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) ... 32
3.7 Dicroísmo circular (CD) ... 32
3.8 Reação cruzada com DSS (crosslinking) ... 34
3.9 Obtenção e preparação dos peptídeos ... 34
xx
3.13 Preparação do celastrol ... 38
3.14 Espalhamento dinâmico de luz (DLS)...38
3.15 Eletroforese em gel de poliacrilamida não desnaturante (gel nativo)39 3.16 Cromatografia de exclusão molecular analítica acoplada aespalhamento de luz em multiângulos (SEC-MALS)...39
3.17 Calorimetria diferencial de varredura (DSC)...40
3.18 Fluorescência diferencial de varredura (DSF)...41
3.19 Atividade de chaperona...42
4. RESULTADOS...43
4.1 Expressão e purificação das proteínas alvos ... 43
4.2 Reação cruzada (crosslinking) acoplada à LC-MS/MS e competição por ITC ... 47
4.3 Modelagem molecular das proteínas e construção do modelo de interação C-Hsp90/Tom70...54
4.4 Estudos em solução das proteínas Tom70 e C-Hsp90 e seu complexo...60
4.5 Interação celastrol/Hsp90...65
4.5.1 Efeito do celastrol no estado oligomérico da Hsp90 humana...65
4.5.2 Efeito do celastrol na estabilidade da Hsp90 e C-Hsp90...72
4.5.3 Efeito do celastrol no mecanismo funcional da Hsp90...79
5. DISCUSSÃO...83
5.1 Produção das proteínas alvos C-Hsp90, Tom70 e Hsp90 ... 83
5.2 Estudos da interação C-Hsp90/Tom70 utilizando reação cruzada acoplada à LC-MS/MS e Modelagem molecular ... 83
xxi
Tom70...86
5.5 Interação C-Hsp90/Tom70 em solução utilizando a técnica de espalhamento de raios-X à baixos ângulos (SAXS)...87
5.6 Um possível mecanismo de importação de proteínas precursoras para a mitocôndria ... 88
5.7 Efeito do celastrol no estado oligomérico da Hsp90 ... 90
5.8 Efeito do celastrol na estabilidade da Hsp90 ... 91
5.9 Efeito do celastrol no mecanismo funcional da Hsp90 ... 93
5.10 Modelo de ação proposto para celastrol/Hsp90 ... 95
6. CONCLUSÕES...97
xxiii
∆G: Variação de energia livre ∆S: Variação de entropia Å: Angstrom (1x10-10 metros) ε: Coeficiente de extinção molar λ: Comprimento de onda
μ: 10-6
17-AAG: 17-N-alilamino-17-demetoxigeldanamicina ADP: Adenosina-5‟-difosfato
Aha1: Proteína ativadora da Hsp90 1 (Activator of Hsp90 ATPase 1) AMP-PNP: Adenil-5-imido difosfato (molécula análoga ao ATP) ATP: Adenosina-5‟-trifosfato
ºC: Unidade de temperatura – graus Celsius CD: Dicroísmo circular (Circular Dichroism)
Cdc37: Proteína ortóloga da p50 em levedura (Cell Division Cycle 37 homologue) Chip: Co-chaperona da Hsp90 e Hsp70 (E3 ubiquitin-protein ligase)
C-Hsp90: Domínio C-terminal da Hsp90
Crp6: Co-chaperona da Hsp90 (Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase)
xxiv
Deg: Grau (degree)
DLS: Espalhamento dinâmico de luz (Dynamic Light Scatterring)
DnaJ: Proteína ortóloga da Hsp40 em bactéria
DSC: Calorimetria diferencial de varredura (Differential Scanning Calorimetry) DSF: Fluorescência diferencial de varredura (Differential Scanning Fluorescence) DSS: Suberato de disuccinimidila (Disuccinimidyl suberate)
DTT: Ditiotreitol (Dithiothreitol)
EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético (Ethylenediaminetetraacetic acid) FKBP51: Proteína homóloga à CYP40
FRET: Transferência de energia por ressonância Foster (Foster Resonance
Energy Transfer)
GIP: Poro de importação da mitocôndria (General Import Pore) GroEL: Proteína ortóloga da Hsp60 em bactéria
GroES: Co-chaperona e proteína ortóloga da Hsp10 em bactéria GRP94: Hsp90 homóloga do retículo endoplasmático
HCl: Ácido clorídrico
Hop: Proteína organizadora das Hsp70-Hsp90 (Hsp70-Hsp90 organizing protein) HSF1: Fator de transcrição de choque térmico 1 (Heat Shock transcription Factor
1)
xxv
Hsp90: Proteína de choque térmico de 90 kDa
Hsp90α: Hsp90 homóloga citosólica induzida por estresse
Hsp90β: Hsp90 homóloga citosólica constitutiva Hsp100: Proteína de choque térmico de 100 kDa HtpG: Hsp90 ortóloga de bactéria
IPTG: Isopropil-3-D-tiogalactopiranosídeo (Isopropyl β-D-1 thiogalactopyranoside) ITC: Calorimetria de titulação isotérmica (Isothermal Titration Calorimetry)
K: Unidade de temperatura – Kelvin Kcal: Quilocaloria
Kd: Constante de dissociação
kDa: QuiloDalton (1,66 x 10-21 g) KCl: Cloreto de potássio
LB: Lubia Bertani
LC-MS/MS: Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (Liquid
Chromatography coupled to Mass Spectrometry)
M: Molar (mol/L) mm: Milímetro
MM: Massa molecular mM: 10-3 molar
xxvi
nM: 10 molar
NaCl: Cloreto de sódio NaF: Fluoreto de sódio nm: Nanômetro (10-9 metros)
p23: Co-chaperona da Hsp90 e proteína ortóloga da Sba em humano PDB: Banco de dados de estrutura de proteínas (Protein Data Bank) PMSF: Fluoreto de fenilmetil sulfonila (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) Ppp5: Co-chaperona da Hsp90 envolvida no ciclo celular
Ppt1p: Proteína ortóloga da Ppp5 em levedura RMN: Ressonância Magnética Nuclear
rpm: Rotações por minuto Rs: Raio de Stokes
SAXS: Espalhamento de raios-X à baixos ângulos (Small angle X-ray Scattering) SDS: Dodecil sulfato de sódio (Sodium Dodecyl Sulfate)
SDS-PAGE: Eletroforese de gel poliacrilamida em condições desnaturantes
(SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
seg: Segundos
SEC-MALS: Cromatografia de exclusão molecular analítica acoplada a espalhamento de luz em multiângulos (Size Exclusion Chromatography – Multi
xxvii
TFE: Etanoltrifluoro (2,2,2-trifluoroethanol)
Tim22: Proteína translocadora da membrana mitocondrial interna de 22 kDa Tim23: Proteína translocadora da membrana mitocondrial interna de 23 kDa Tm: Temperatura média de transição
TOM: Translocase da membrana mitocondrial externa (Translocase of Outer
Mitochondrial Membrane)
Tom5:Proteína translocadora da membrana mitocondrial externa de 5 kDa Tom6: Proteína translocadora da membrana mitocondrial externa de 6 kDa Tom7: Proteína translocadora da membrana mitocondrial externa de 7 kDa Tom20: Proteína translocadora da membrana mitocondrial externa de 20 kDa Tom22: Proteína translocadora da membrana mitocondrial externa de 22 kDa Tom40: Proteína translocadora da membrana mitocondrial externa de 40 kDa Tom70: Proteína translocadora da membrana mitocondrial externa de 70 kDa Tom71: Proteína translocadora da membrana mitocondrial externa de 71 kDa TPR: Tetratricopeptídeo (Tetratricopeptide Repeat)
TRAP1: Hsp90 homóloga da mitocôndria
xxix
Tabela 1: Diferentes grupos de proteínas de choque térmico (Hsp) e suas funções...7 Tabela 2: Parâmetros termodinâmicos da interação C-Hsp90/Tom70 obtidos por ITC na presença e ausência do pepTom70...53 Tabela 3: Distâncias (entre os Cα) das lisinas (K) intramoleculares nos modelos tridimensionais da Tom70 e da C-Hsp90 obtidos por homologia...56 Tabela 4: Distâncias (entre os Cα) das lisinas (K) intermoleculares no modelo de interação C-Hsp90/Tom70 proposto...59 Tabela 5: Valores de Rg e Dmax obtidos por SAXS...61 Tabela 6: Raio hidrodinâmico (nm) do pico mais intenso medido por DLS para Hsp90 inteira e C-Hsp90...67 Tabela 7: Valores da temperatura de transição, Tm, do desenovelamento
térmico monitorado por DSF para Hsp90 e
C-Hsp90...73 Tabela 8: Valores da temperatura de transição, Tm, do desenovelamento
térmico monitorado por DSC para Hsp90 e
xxxi
proteínas...4 Figura 2: Enovelamento protéico assistido pelas chaperonas moleculares...9 Figura 3: Estrutura tridimensional da Hsp90...12 Figura 4: Dinâmica conformacional da Hsp90 no ciclo de atividade chaperona...13 Figura 5: Sítios de modificações pós-traducionais na Hsp90 α e β...15 Figure 6: Motivos TPR da Hop e seus parceiros de interação (peptídeos da Hsp90 e Hsp70)...17 Figura 7: Caminho das proteínas importadas para a mitocôndria...19 Figura 8: Estrutura cristalográfica do monômero da Tom71 citosólica de levedura (PDB código: 3FP3)...20 Figure 9: Estrutura cristalográfica da Tom71 de levedura ligada ao pentapeptídeo MEEVD correspondente ao domínio C-terminal da Hsp90.21 Figura 10: Moléculas inibidoras da Hsp90...23 Figura 11: (a) Estrutura química do celastrol. (b) Susceptibilidade nucleofílica do celastrol...26 Figure 12: SDS-PAGE 12% da purificação das proteínas (a) C-Hsp90; (b) Tom70 e (c) Hsp90:...44 Figura 13: Espectros de dicroísmo circular das proteínas C-Hsp90, Tom70 e Hsp90...45 Figura 14: Experimento de SEC-MALS para determinar a massa molecular da proteína Hsp90 humana...46 Figura 15: (a) Cromatografia de exclusão molecular analítica da C-Hsp90 (linha contínua preta), Tom70 (linha contínua vermelha) e complexo Hsp90/Tom70 (linha contínua azul). (b) SDS-PAGE do complexo C-Hsp90/Tom70 eluído da filtração em gel analítica na ausência (2) e presença (3) do agente cross-linker (DSS)...48
xxxii
(pepC90) e peptídeo da Tom70 (pepTom70) na (a) presença e ausência 150 mM NaF (b) presença e ausência de 150 mM NaF e 30% de TFE...51 Figura 18: Experimentos de competição por ITC...53 Figura 19: (a) Modelagem molecular da Tom70 humana usando como molde a estrutura tridimensional da Tom71 de levedura (PDB código: 3FP3)...55 Figura 20: (a) Modelagem molecular do domínio C-terminal da Hsp90 humana (PDB código: 3Q6N)...57 Figura 21: Modelo de interação proposto para o domínio solúvel da Tom70 e domínio C-terminal da Hsp90 humana...59 Figura 22: Análise por SAXS da C-Hsp90...62 Figura 23: Análise por SAXS da Tom70. ... 63 Figura 24: Análise por SAXS do complexo C-Hsp90/Tom70. ... 64 Figura 25: Intensidade de espalhamento dinâmico de luz em função do tamanho para (a) Hsp90 inteira (b) e C-Hsp90...66 Figura 26: Eletroforese de gel poliacrilamida em condições não desnaturante (gel nativo) da (a) Hsp90 inteira e (b) C-Hsp90 na ausência e presença de diferentes concentrações de celastrol...68 Figura 27: (a) Experimento de SEC-MALS para determinar a massa molecular da proteína C-Hsp90 na presença e ausência do celastrol (razão molar de 1:2)...70 Figura 28: Experimento de SEC-MALS para determinar a massa molecular da proteína C-Hsp90 na presença e ausência do celastrol (razão molar de 1:3)...71 Figura 29: Desenovelamento induzido por temperatura da (a) Hsp90 e (b) C-Hsp90 na ausência e presença do celastrol monitorado por DSF...74
xxxiii
Figura 31: Efeito da concentração de celastrol na temperatura de transição da Hsp90 e C-Hsp90 analisados por DSF e DSC...78 Figura 32: (a) Experimento de SEC-MALS combinado com SDS-PAGE para determinar a massa molecular do complexo C-Hsp90/Tom70 na presença e ausência do celastrol (razão molar de 1:2)...80 Figura 33: Atividade de chaperona da Hsp90...82 Figura 34: Possível mecanismo de importação de proteínas precursoras para a mitocôndria...89 Figura 35: Modo de ação do celastrol na interação com a Hsp90...96
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Enovelamento protéico
A função de uma proteína está relacionada de uma maneira complexa com sua seqüência de aminoácidos, sendo esta funcionalidade definida pela topologia geral da proteína que só é alcançada após o correto enovelamento da cadeia polipeptídica (BORK et al., 1998). Portanto, a estrutura tridimensional da proteína (enovelada) e suas funções não podem ser compreendidas separadamente (RAMOS e FERREIRA, 2005). O mecanismo pelo qual uma proteína se enovela é alvo de estudos há várias décadas, já que este é considerado um dos mais complexos problemas biológicos (DILL et al., 1995; LATTMAN e ROSE, 1993). A questão central ao se entender o enovelamento é prever qual será a estrutura tridimensional ativa da proteína, conhecida como estado nativo, a partir de sua seqüência de aminoácidos. E ainda, elucidar o código físico, ou em outras palavras, as forças intermoleculares que dirigem esse processo (DILL et al., 2007). Algumas propriedades físico-químicas reunidas na seqüência de aminoácidos parecem contribuir para o processo de enovelamento, como por exemplo, ligações de hidrogênio, interações de van der Waals, interações eletrostáticas e hidrofóbicas (DILL et al., 2007). Entretanto, mesmo sendo conhecido que a estrutura tridimensional de uma proteína é definida por sua seqüência de aminoácidos, ainda não se sabe os detalhes de como esta informação é processada. Por estes aspectos, destacamos a importância em se estudar a via de enovelamento de proteínas, sua estabilidade e estrutura (HARTL e HAYER-HARTL, 2009).
Os trabalhos pioneiros de Christian Anfisen e colaboradores entre 1960-1970 (ANFINSEN, 1973; ANFINSEN et al., 1961) tiveram um papel fundamental para o desenvolvimento do estudo do enovelamento protéico. Anfinsen demonstrou que a ribonuclease quando era desnaturada por uréia e na presença de um agente redutor perdia sua atividade catalítica. No entanto, à medida que
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essas substâncias eram removidas, a ribonuclease desnaturada readquiria espontaneamente sua estrutura tridimensional correta, restaurando sua atividade catalítica (ANFINSEN et al., 1961). Anfinsen então, concluiu que a seqüência de aminoácidos da proteína continha toda a informação necessária para definir a sua estrutura tridimensional e, por conseqüência, a sua função biológica (ANFINSEN et al., 1961). Com seus estudos sobre a desnaturação da ribonuclease, Anfinsen estabeleceu a teoria conhecida como “Hipótese Termodinâmica” (ANFINSEN, 1973). Essa teoria afirma que a estrutura tridimensional de uma proteína no seu estado nativo é o menor nível energético da energia livre de Gibbs (mínimo global de energia) de todo o sistema, ou seja, a estrutura nativa é determinada termodinamicamente e depende da seqüência de aminoácidos de sua cadeia e das condições físico-químicas do meio solvente (ANFINSEN, 1973). Com isso, a estabilidade de uma proteína depende da diferença de energia livre entre os estados desenovelado e enovelado, que pode ser expressa, pela energia livre de Gibbs (ΔG=-RTlnK=ΔH-TΔS) (BOLSHETTE et al., 2014; ENGLANDER et al., 2007). Dessa forma, tornou-se evidente que o enovelamento de uma proteína era “independente do caminho”, isto é, não existiria uma trajetória cinética pela qual a proteína tivesse que passar para encontrar a sua forma nativa.
Cyrus Levinthal argumentou ser impossível uma proteína acessar todo o espaço conformacional em busca da mínima energia livre de Gibbs em um tempo relativamente curto (LEVINTHAL, 1968). Para ilustrar essa afirmação, Levinthal supôs que para uma proteína com N aminoácidos que pudessem assumir μ orientações, o número de conformações possíveis distintas para uma proteína seria μN
. Para a estimativa mais simples, considerando que cada aminoácido tenha somente duas possibilidades de orientação, o número de conformações possíveis para um polipeptídeo com 100 aminoácidos seria de 2100, ou seja, aproximadamente, 1030 conformações. Se pelo menos um picosegundo fosse requerido para acessar uma conformação, o tempo necessário para explorar todas as conformações de uma proteína de 100 aminoácidos seria aproximadamente
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2100 picosegundos (3,9 x 1010 anos), ou seja, maior que a idade do universo; o que fez Levinthal concluir que o enovelamento de uma proteína não acontecia pelo teste de todas as possíveis vias(LEVINTHAL, 1968).
Outros modelos foram criados para explicar o processo de enovelamento de proteínas, sendo que hoje se considera que a forma nativa pode não corresponder ao mínimo global de energia, podendo, entretanto se acomodar também em um mínimo local (ONUCHIC e WOLYNES, 2004). Experimentos termodinâmicos demonstraram que o enovelamento de proteínas pode ser descrito por um processo reversível do tipo “dois-estados”, ou seja, ou as moléculas estão no estado nativo, ou no estado desnaturado, não existindo intermediários detectáveis (PRIVALOV e KHECHINASHVILI, 1974). No entanto, existem algumas exceções e com o avanço dos estudos, uma nova perspectiva para o enovelamento de proteínas foi proposta. Essa proposta sugere um cenário onde o perfil energético do processo de enovelamento de uma proteína se assemelha a um funil rugoso (BALDWIN, 1995; SALI et al., 1994).
O conceito de funil e superfície de energia (Figura 1) tem contribuído significantemente para o entendimento teórico e experimental desse complexo processo (BRYNGELSON et al., 1995; LEOPOLD et al., 1992; ONUCHIC et al., 1997; ONUCHIC e WOLYNES, 2004). Nesse modelo, durante o enovelamento, a proteína percorre um espaço de conformações mais amplo no início (representado pelo topo do funil), com alta energia e alta entropia, portanto instável e desenovelada; para a base do funil onde a energia seria a mínima, correspondendo ao estado nativo funcional (Figura 1). Durante esse processo, diferentes rotas podem ser percorridas pela proteína, ou seja, o processo pode ser do tipo liso, representando um enovelamento extremamente rápido do tipo “dois-estados”, ou mais rugoso e lento apresentando mínimos de energia locais relacionados a intermediários e “vales” de baixa energia (BARTLETT e RADFORD, 2009) (Figura 1).
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Figura 1: Funil de energia para o enovelamento e agregação de proteínas. Interações intramoleculares energicamente favoráveis (verde) são estabilizadas em direção ao estado nativo da proteína no mínimo global energético. Conformações energeticamente favoráveis, mas não-nativas resultam em espécies intermediárias (parcialmente enoveladas ou enoveladas incorretamente) que ocupam mínimos locais de energia. Chaperonas moleculares ajudam a promover o enovelamento correto, auxiliando esses intermediários a superarem as barreiras de energia evitando, portanto, interações intermoleculares (vermelho) que podem, por sua vez, resultar em agregação (agregados amorfos, oligômeros ricos em folha-β e fibrilas amilóides). Figura retirada e adaptada de (HARTL e HAYER-HARTL, 2009).
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Geralmente, proteínas que contém mais de 100 aminoácidos (~ 90% de todas as proteínas em uma célula) possuem intermediários na via de enovelamento (HARTL e HAYER-HARTL, 2009; KIM et al., 2013). Essas proteínas têm uma forte tendência a sofrer um colapso hidrofóbico passando a apresentar uma conformação compacta e globular (HARTL e HAYER-HARTL, 2009; KIM et al., 2013). Tal colapso pode levar tanto a formação de estruturas desorganizadas com retenção de grande entropia conformacional, mas ausente de contatos específicos; e/ou intermediários que podem ser estabilizados por interações não-nativas (HARTL e HAYER-HARTL, 2009; KIM et al., 2013). Estados parcialmente enovelados ou enovelados incorretamente são problemáticos, pois podem implicar na formação de agregados insolúveis altamente tóxicos para as células (Figura 1). A agregação de proteínas é conseqüência, principalmente, da exposição dos resíduos de aminoácidos hidrofóbicos, que estão no interior da cadeia polipeptídica (CHITI e DOBSON, 2006). Como no enovelamento intramolecular, a agregação é a associação de duas ou mais moléculas de proteínas não nativas, dirigida por interações hidrofóbicas que, geralmente, resulta em estruturas amorfas (Figura 1). Além disso, a agregação protéica pode levar a formação de espécies ordenadas e fibrilares, chamadas amilóides, as quais possuem estrutura secundária predominantemente do tipo folha-β e altamente estável (EICHNER e RADFORD, 2011; KIM et al., 2013). Embora aparentemente restrita a um conjunto de proteínas, as estruturas fibrilares podem ocorrer em diferentes polipeptídeos independente da seqüência primária. A apomioglobina, por exemplo, uma proteína do tipo globular e altamente estável, pode formar fibrilas amilóides em condições específicas, sugerindo, portanto, que a habilidade de formação de fibrilas é uma característica comum à todas as proteínas (DOBSON, 2003). A formação de fibrilas amilóides envolve freqüentemente, a presença de intermediários oligoméricos, menos estáveis, que são altamente tóxicos às células eucarióticas, podendo resultar em doenças neurodegenerativas, tais como, mal de Alzheimer e
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mal de Parkison (BOLSHETTE et al., 2014). A formação in vivo dos agregados fibrilares é fortemente impedida pela maquinaria de chaperonas moleculares que auxiliam no enovelamento correto utilizando energia a partir do ATP (HARTL et al., 2011; HARTL e HAYER-HARTL, 2009; KIM et al., 2013).
1.2 Chaperonas moleculares
Chaperona molecular é definida como qualquer proteína que é capaz de interagir, estabilizar e ajudar proteínas desenoveladas à adquirirem sua conformação nativa, contudo, sem estar presente na estrutura funcional final dessas proteínas (TIROLI-CEPEDA e RAMOS, 2011; HENDRICK e HARTL, 1993). Chaperonas moleculares são também muitas vezes referenciadas como
heat shock proteins (Hsp), pois em condições de estresse térmico, as células
aumentam os níveis de produção dessa classe de proteínas (BENJAMIN e MCMILLAN, 1998). No entanto, as chaperonas também respondem a outros tipos de estresse, como por exemplo, do tipo oxidativo e muitas delas são expressas constitutivamente (TIROLI-CEPEDA e RAMOS, 2011).
A função biológica das proteínas está diretamente ligada à sua estrutura tridimensional obtida através do processo de enovelamento protéico (RAMOS e FERREIRA, 2005). No enovelamento protéico, assim que uma cadeia polipeptídica deixa o ribossomo, ela deve se enovelar de maneira eficiente garantindo sua funcionalidade no ambiente celular. No caso de proteínas não-enoveladas ou parcialmente não-enoveladas, os resíduos de aminoácidos hidrofóbicos que deveriam ter sido interiorizados na matriz protéica, permanecem acessíveis ao solvente, tornando essas espécies susceptíveis à agregação (RAMOS e FERREIRA, 2005). As chaperonas são capazes de reconhecer as superfícies hidrofóbicas expostas e interagirem com essa região reversivamente, evitando, de modo eficiente, a agregação protéica (HENDRICK e HARTL, 1993). Essas proteínas atuam não somente impedindo a agregação intermolecular, mas também são capazes de prevenir ou reverter o enovelamento incorreto sem
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modificar a estrutura nativa final (BORGES e RAMOS, 2005; FINK, 1999; HENDRICK e HARTL, 1993; TIROLI-CEPEDA e RAMOS, 2011). Além da participação no processo de enovelamento, as chaperonas moleculares atuam como um sistema de controle de qualidade, reconhecendo, mantendo e marcando/enviando proteínas desenoveladas ou incorretamente enoveladas para degradação (PETERSON e BLAGG, 2009; WELCH e BROWN, 1996). Algumas doenças neurodegenerativas como mal de Alzheimer, mal de Parkinson, Huntington e esclerose múltipla são conseqüência do acúmulo de proteínas desenoveladas ou anormais nas células. Chaperonas moleculares, portanto, são alvos promissores para o tratamento dessas doenças (PETERSON e BLAGG, 2009). Há pelo menos cinco famílias principais de chaperonas moleculares, as quais são classificadas de acordo com sua massa molecular: Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60 e smHsp (Tabela 1) (BOLSHETTE et al., 2014; BORGES e RAMOS, 2005; TIROLI-CEPEDA e RAMOS, 2011).
Tabela 1: Diferentes grupos de proteínas de choque térmico (Hsp) e suas funções.
Família ATP Eucariotos Função
Hsp100 + Hsp104 Termotolerância, desagregação protéica
Hsp90 + Hsp90
Tolerância ao estresse, controle do enovelamento, prevenção da agregação protéica, controle da atividade de receptores
hormonais, quinases, entre outras
Hsp70 + Hsp70 Prevenção da agregação protéica, regulação
de proteínas
Hsp60 + TriC Enovelamento de proteínas como actina e
tubulina
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Também são conhecidas como chaperonas as proteínas GroEL (um grupo de chaperonas com peso molecular de aproximadamente de 60 kDa) provenientes de bactérias, e as nomeadas TriC que são originadas de citoplasmas eucarióticos (DUNN et al., 2001; SAIBIL et al., 2013). As proteínas GroEL são as mais estudadas no que diz respeito ao mecanismo de enovelamento protéico. A GroEL trabalha em conjunto com a GroES, um co-fator da família da Hsp100, e possui uma cavidade no interior de sua estrutura que é capaz de seqüestrar cadeias polipeptídicas parcialmente enoveladas via interações hidrofóbicas, promovendo o correto enovelamento (SAIBIL et al., 2013). As proteínas da família das Hsp70 são um componente central das famílias chaperonas e inibem o enovelamento prematuro e agregação protéica se ligando aos polipeptídeos recém-sintetizados no ribossomo, até a formação de sua estrutura final e estável (MAYER, 2013). Além disso, a Hsp70 é uma das chaperonas que participam da translocação de proteínas desenoveladas para membranas intracelulares (MAYER, 2013). A Hsp40 (também conhecida como DnaJ em bactérias), uma co-chaperona da Hsp70, interage de forma transiente com substratos, carregando-os para a Hsp70 (FAN et al., 2003; SUMMERS et al., 2013). A ligação do substrato à Hsp70 e associação da Hsp40, estimula a rápida hidrólise do ATP resultando na captura e retenção do polipeptídeo desenovelado (FAN et al., 2003). As chaperonas da família da Hsp100 atuam na desagregação e enovelamento de proteínas (MAURIZI e XIA, 2004). A Hsp100 em conjunto com a Hsp70 e proteases é capaz de re-solubilizar agregados protéicos (MAURIZI e XIA, 2004). As small chaperonas (smHsp) são, geralmente, proteínas de massa molecular abaixo de 40 kDa e são capazes de bloquear a agregação protéica, além de ajudar a célula a sobreviver sob condições de estresse (GARRIDO et al., 2012).
Na figura a seguir (Figura 2) está esquematizada a atuação das diferentes famílias de chaperonas moleculares na célula.
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Figura 2: Enovelamento protéico assistido pelas chaperonas moleculares.Hsp70 é requerida para o enovelamento de proteínas recém-sintetizadas, translocação mitocondrial e importação/exportação nuclear. Proteínas clientes são transferidas para a Hsp90 sofrendo ativação (incluindo quinases, receptores hormonais, fatores de transcrição). Estresse térmico (HS) e outros tipos de estresses causam enovelamento incorreto e agregação, os quais são impedidos pelas chaperonas Hsp27, Hsp70 e Hsp90. A ligação da geldanamicina (GA) causa liberação da proteína cliente para degradação via proteossoma. Figura retirada e adaptada de (MOSSER e MORIMOTO, 2004).
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1.3 Hsp90
A Hsp90 (Heat shock protein 90) é uma chaperona altamente conservada (BORKOVICH et al., 1989; CSERMELY et al., 1998; DA SILVA e RAMOS, 2012; TAIPALE et al., 2010; YOUNG et al., 2001), encontrada em bactéria e em todos os eucariotos, mas, ainda não identificada em archaea(WEGELE et al., 2004). A Hsp90 é uma chaperona abundante e representa de 1 a 3% do total de proteínas citosólicas em condições fisiológicas (WELCH e FERAMISCO, 1982). A Hsp90 participa da estabilização, ativação e maturação de mais de 200 proteínas, denominadas proteínas clientes (ou substrato), que dependem dela para atingir e/ou manter sua conformação funcional, sendo que, muitas dessas clientes são essenciais para sinalização e transcrição celular além de respostas adaptativas a situações de estresse (DA SILVA e RAMOS, 2012; LI et al., 2011; MAYER e BUKAU, 1999; MCCLELLAN et al., 2007). Devido a Hsp90 ser responsável pela ativação de uma gama de proteínas clientes, essa chaperona evoluiu para formar uma variedade de complexos com co-chaperonas, que por sua vez, regulam o ciclo funcional da Hsp90 (PRODROMOU, 2012). O repertório de proteínas clientes da Hsp90 implica na interação com diferentes co-chaperonas reguladoras e proteínas de sinalização, incluindo as proteínas quinases e fatores de transcrição, que estão envolvidos no controle da proliferação, diferenciação celular e apoptose (DA SILVA e RAMOS, 2012; DIXIT e VERKHIVKER, 2012; ROE et al., 2004). Portanto, a Hsp90 é uma proteína essencial para viabilidade e integridade celular e é tida como um mediador chave da homeostase, função que realiza sendo um facilitador de diversas interações proteína-proteína do tipo transiente e de baixa afinidade (DEZWAAN e FREEMAN, 2008; PRATT et al., 2008). Em contraste com outras chaperonas moleculares, a Hsp90 parece ser relativamente específica em relação à interação com suas clientes, contudo, as bases moleculares dessa especificidade ainda não são bem compreendidas.
Em eucariotos superiores existem quatro isoformas da Hsp90: duas citosólicas, nomeadas de α e β, que são altamente similares (aproximadamente
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85%) (JACKSON, 2013); uma mitocondrial (TRAP1); e uma específica do retículo endoplasmático (GRP94) (DA SILVA e RAMOS, 2012). A isoforma Hsp90α, também conhecida como Hsp90AA1, é induzida em condições de estresse (EUSTACE et al., 2004), enquanto a Hsp90β (Hsp90AB1) é expressa constitutivamente. Além disso, a literatura é rica em relatos, os quais mostram que a Hsp90α está relacionada com alguns tipos de câncer e pode ter ação distinta quando comparada com a Hsp90β (DA SILVA e RAMOS, 2012). Por exemplo, a Hsp90α tem expressão elevada em células cancerosas de cérebro, pele e tireóide (MCDOWELL et al., 2009). A Hsp90α é secretada por uma variedade de células tumorais sendo, portanto, um importante alvo para terapia anti-câncer (LI et al., 2012).
A primeira estrutura cristalina da Hsp90 de levedura complexada com AMP-PNP, molécula análoga ao ATP, revelou a existência de um dímero que consiste em três grandes domínios por monômero (Figura 3) (ALI et al., 2006). O domínio N-terminal possui um sítio de ligação a nucleotídeo altamente conservado e tem aproximadamente 30 kDa (ALI et al., 2006). Neste domínio também está localizado o resíduo de aminoácido glutamato catalítico (Glu33 em levedura) que é requerido para a hidrólise do ATP (PANARETOU et al., 1998). O domínio N-terminal está conectado ao domínio central (de aproximadamente 35 kDa), que é capaz de ligar à proteínas clientes, por uma região desestruturada, altamente carregada (PEARL e PRODROMOU, 2006; STEBBINS et al., 1997). O domínio C-terminal tem aproximadamente 20 kDa e é responsável pela dimerização da Hsp90 (Figura 3) (MINAMI et al., 1994). Na extremidade do C-terminal está localizado o pentapeptídeo MEEVD, altamente conservado na família da Hsp90, que é responsável por mediar interações com proteínas do tipo TPR, como por exemplo, Pp5, Ppt1p, CYP40, Cpr6, FKBP51, Chip, Hop e Tom70(D'ANDREA e REGAN, 2003; PRODROMOU et al., 1999).
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(a)
(b)
(b)
Figura 3: Estrutura tridimensional da Hsp90.As estruturas cristalinas (a) do dímero da Hsp90 ligado ao ATP no estado fechado (Hsp90 de Saccharomyces cerevisiae, PDB código: 2CG9) (esquerda) e na ausência do nucleotídeo no estado aberto (Hsp90 de E. coli, PDB código: 2IOQ) (direita). O domínio N-terminal está representado em laranja, domínio central em verde, e o domínio C-terminal em amarelo. Figura retirada e adaptada de (KIM et al., 2013). (b) Resíduos de aminoácidos da Hsp90 de levedura envolvidos na ligação com o ADP na conformação fechada (PDB código: 1AM1). ADP (azul ciano), moléculas de água (esferas vermelhas) e ligações de hidrogênios (linhas tracejadas em azul), íon Mg2+ (esfera em verde). Figura retirada e adaptada de (MACHAJEWSKI e GAO, 2013).
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O rápido crescimento dos estudos envolvendo estrutura e função da Hsp90 contribuiu significativamente no entendimento da dinâmica conformacional dessa chaperona que funciona em um ciclo dependente de ATP e participação de diferentes estados estruturalmente funcionais(KIM et al., 2013; KRUKENBERG et al., 2011). Essa dinâmica pode ser observada na figura a seguir (Figura 4), onde está esquematizado de maneira simplificada o ciclo de atividades da chaperona Hsp90.
Figura 4: Dinâmica conformacional da Hsp90 no ciclo de atividade chaperona. Nesse ciclo, a ligação de ATP leva a Hsp90 de uma estrutura aberta (quando recebe a proteína cliente) para uma estrutura fechada, com o N-terminal dimerizado. A proteína cliente é conformacionalmente ativada assim que a Hsp90 prossegue no ciclo. A ligação do ADP, após a hidrólise do ATP, causa uma maior compactação da Hsp90 e a liberação do nucleotídeo reinicia o ciclo. Co-fatores como a Cdc37 e a Hop retardam a hidrólise do ATP, enquanto Aha1 é uma ativadora da atividade ATPásica e a p23 é responsável por estabilizar a conformação fechada da Hsp90. Figura retirada e adaptada de (KIM et al., 2013).
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Estudos utilizando a técnica de FRET (do inglês, Foster resonance energy
transfer) têm revelado que nucleotídeos e co-chaperonas (Aha1, p23 e Hop,
Cdc37) modulam a dinâmica conformacional da Hsp90 em tempo real (HESSLING et al., 2009; MICKLER et al., 2009). A Hop (do inglês, Hsp-organizing protein
Hsp70/Hsp90) e a Cdc37 estabilizam a conformação aberta da Hsp90, inibindo a
atividade ATPásica, facilitando assim, a ligação da proteína cliente (PRODROMOU et al., 1999). A Hop, também conhecida como Sti1, é uma co-chaperona responsável por mediar a transferência do substrato do complexo Hsp40-Hsp70 para a Hsp90, enquanto a co-chaperona Cdc37 é um adaptador de proteínas-quinases (CAPLAN et al., 2007). Por outro lado, a p23 é uma co-chaperona que estabiliza a conformação fechada da Hsp90 (MCLAUGHLIN et al., 2006) e o ativador Aha1 se liga ao domínio central da Hsp90 estimulando a atividade ATPásica (MEYER et al., 2004).
A Hsp90 está sujeita a uma variedade de modificações pós-traducionais, incluindo fosforilação, acetilação, S-nitrosilação, oxidação e ubiquitinação que podem afetar a atividade ATPásica dessa chaperona (DA SILVA e RAMOS, 2012; MOLLAPOUR e NECKERS, 2012). As tirosinas Tyr24 em levedura e a Tyr38 em humano foram relatadas como sítios de fosforilação na Hsp90, sendo que, a tirosina-quinase responsável por essa fosforilação foi identificada como Swee (MOLLAPOUR et al., 2010). Outro sítio de fosforilação na Hsp90 conhecido é a treonina Thr22 em levedura e a Thr36 em humano que são sítios dependentes da atividade da caseína quinase II (MOLLAPOUR et al., 2011). A fosforilação de resíduos específicos na Hsp90 pode influenciar a associação com proteínas clientes devido, principalmente, à efeitos diretos ou indiretos na ligação da Hsp90 com co-chaperonas (MOLLAPOUR e NECKERS, 2012).
Outros tipos de modificações pós-traducionais também são capazes de afetar a função da Hsp90. Yu e colaboradores mostraram que acetilação (adição de grupamentos acetila em resíduos de lisina) na Hsp90 desestabilizou a interação com proteínas clientes, como por exemplo, a p53 (YU et al., 2002);
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enquanto que, a S-nitrosilação na cisteína Cys598 da Hsp90 inibiu a atividade ATPásica e diminuiu a habilidade dessa chaperona na ativação das proteínas clientes (MARTINEZ-RUIZ et al., 2005).
A figura a seguir ilustra os principais sítios onde podem ocorrer modificações pós-traducionais na Hsp90 humana (Figura 5).
Figura 5: Sítios de modificações pós-traducionais na Hsp90 α e β. Domínios (N-terminal, central e C-terminal) onde estão localizadas as serinas (S), treoninas (T) e tirosinas (Y) fosforiladas (preto) que sofrem fosforilação por quinases, lisinas (K) acetiladas (lilás), cisteínas (C) S-nitrosiladas (verde) e cisteínas oxidadas (marrom). Figura retirada e adaptada de (MOLLAPOUR e NECKERS, 2012).
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1.4 Proteínas TPR (Tetratricopeptide repeat)
Como já mencionado anteriormente, as proteínas TPR possuem propriedades de enovelamento, modulação e uma ampla especificidade de ligações e com isso, estão envolvidas em uma variedade de processos biológicos tais como, regulação do ciclo celular, controle da transcrição, transporte protéico mitocondrial, neurogênese e enovelamento de proteínas (LI et al., 2009). Desde a primeira descoberta em 1990, mais de 5 mil proteínas do tipo TPR têm sido identificadas por ferramentas de bioinformática (ZEYTUNI e ZARIVACH, 2012). A primeira estrutura tridimensional resolvida de uma proteína TPR foi a fosfatase PP5, a qual revelou um enovelamento do tipo helicoidal (DAS et al., 1998). A TPR é uma região presente em uma gama de proteínas, sendo responsável por mediar interações proteína-proteína formando complexos multi-protéicos (ZEYTUNI e ZARIVACH, 2012). A região consiste de 3-16 repetições em tandem de 34 resíduos de aminoácidos que adotam a estrutura hélice-conector-hélice com outras regiões TPR adjacentes e de forma paralela resultando em uma espiral de hélices-α antiparalelas (Figura 6)(D'ANDREA e REGAN, 2003).
Uma das mais conhecidas interações proteína-proteína mediadas por proteínas do tipo TPR é da interação da Hop com as chaperonas Hsp70 e Hsp90 (SCHEUFLER et al., 2000). A Hop é uma proteína TPR que medeia a associação dessas chaperonas, e possui três motivos TPRs. O domínio TPR1 reconhece, especificamente, o domínio C-terminal da Hsp70 enquanto o domínio TPR2a se liga ao C-terminal da Hsp90 (Figura 6). Ambas chaperonas possuem em sua seqüência primária o motivo EEVD na extremidade do domínio C-terminal (D'ANDREA e REGAN, 2003; ONUOHA et al., 2008). Embora seja bem estabelecido que o motivo MEEVD da Hsp90 corresponde ao principal sítio de reconhecimento na interação com a Hop, estudos recentes têm revelado a presença de contatos adicionais de sítios secundários tanto no domínio C-terminal como no central e N-terminal da Hsp90 (LEE et al., 2012; ONUOHA et al., 2008; SOUTHWORTH e AGARD, 2011).
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(a)
(b)
Figure 6: Motivos TPR da Hop e seus parceiros de interação (peptídeos da Hsp90 e Hsp70).(a) Esquerda: domínio TPR2a da Hop em complexo com o peptídeo MEEVD da Hsp90. Direita: Detalhe da região de interação (PDB código: 1ELR). (b) Esquerda: domínio TPR1 da Hop em complexo com o peptídeo EEVD da Hsp70. Direita: Detalhe da região de interação (PDB código: 1ELW). Figura retirada e adaptada de (ZEYTUNI e ZARIVACH, 2012).
Outra co-chaperona do tipo TPR conhecida por interagir com a Hsp90, é a Tom70, uma proteína pertencente ao complexo TOM (do inglês, Translocase of
the mitochondrial outer membrane), presente na membrana externa da
mitocôndria, organela responsável pela produção de ATP na célula (BRIX et al., 1997; CHACINSKA et al., 2009; RYAN et al., 1997). O complexo TOM contém as
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proteínas receptoras Tom20, Tom22 e Tom70, e o poro de inserção, que é composto pela Tom40 e as pequenas proteínas Tom5, Tom6 e Tom7 (REHLING et al., 2004) (Figura 7). A maioria das proteínas mitocondriais são sintetizadas nos ribossomos e então transportadas até a membrana externa da mitocôndria pelas chaperonas Hsp70 e Hsp90, formando um complexo, precursora/chaperona, que ao chegar até essa organela, é reconhecido pelo domínio citosólico da Tom70 (Figura 7) (FAN e YOUNG, 2011; LI et al., 2009; REHLING et al., 2004). A Tom70 contém um domínio N-terminal transmembranar seguido por um domínio TPR citosólico (REHLING et al., 2004). Com isso, o domínio TPR serve como um sítio de interação para a Hsp70 e Hsp90 e, portanto para complexos multi-chaperonas contendo a proteína precursora (FAN e YOUNG, 2011).
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Figura 7: Caminho das proteínas importadas para a mitocôndria. O complexo TOM contém as proteínas receptoras Tom20, Tom22 e Tom70, e o poro de inserção, que é composto pela Tom40 e as pequenas proteínas Tom5, Tom6 Tom7. A membrana mitocondrial interna (IMM) contém duas translocases, o complexo Tim22 e o complexo Tim23. Muitas proteínas precursoras são entregues ao complexo TOM pelas chaperonas Hsp70 e Hsp90. Figura retirada e adaptada de (REHLING et al., 2004).
O domínio citosólico da Tom70 contém onze motivos TPR que estão agrupados em dois domínios (Figura 8). Os três motivos TPR1, TPR2 e TPR3 no N-terminal formam um encaixe para a interação com o peptídeo EEVD das chaperonas Hsp70/Hsp90 (Figura 8a), já o domínio C-terminal da Tom70 contém um bolsão de ligação à proteína precursora (FAN e YOUNG, 2011; LI et al., 2009) (Figura 8b). Em relação à estrutura tridimensional da Tom70, ainda existem
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algumas controvérsias, resultados de difração de raios-X revelaram que a Tom70 de levedura apresenta estrutura dimérica (WU e SHA, 2006), enquanto que experimentos de SAXS e ultracentrifugação analítica mostraram que essa mesma proteína é um monômero em solução (MILLS et al., 2009). Outros trabalhos ainda relataram a estrutura cristalina da Tom71 (isoforma) de levedura monomérica (LI et al., 2009; LI et al., 2010).
(a) (b)
Figura 8: Estrutura cristalográfica do monômero da Tom71 citosólica de levedura (PDB código: 3FP3). (a) Os domínios N- e C- terminal estão destacados em azul e verde, respectivamente. As regiões TPR (1-11) estão identificadas. (b) No N-terminal da Tom71 está localizado o sítio de ligação para as chaperonas Hsp70 e Hsp90. Os diferentes tons de vermelho indicam o grau de conservação (vermelho escuro – regiões conservadas) na família Tom70/71. Figura adaptada e retirada de (LI et al., 2009).
Sobre a interação da Tom70/71 com a chaperona Hsp90, estudos prévios mostraram que a região da hélice A7 (TPR 3) da Tom71 de levedura apresentou considerável mudança de conformação quando ligado ao pentapeptídeo MEEVD da Hsp90, sofrendo uma rotação de 20 º após a ligação, o que gerou significativo
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rearranjo dos domínios N- e C-terminal (Figura 9). Muitos dos resíduos de aminoácidos da Tom71 de levedura envolvidos na mediação dessas mudanças conformacionais conseqüente à ligação do MEEVD são conservados nas famílias de Tom70/71(LI et al., 2009).
Figure 9: Estrutura cristalográfica da Tom71 de levedura ligada ao pentapeptídeo MEEVD correspondente ao domínio C-terminal da Hsp90. Em verde: estrutura da Tom71 na ausência do peptídeo MEEVD (laranja) (PDB código: 3FP3); Em roxo: estrutura da Tom71 na presença do peptídeo MEEVD (PDB código: 3FP2). Figura retirada e adaptada de (LI et al., 2009).
Mais recentemente, resultados de nosso grupo de pesquisa juntamente com outros colaboradores mostraram que o estado oligomérico funcional do domínio citosólico da Tom70 humana é monomérico (FAN et al., 2010) e que a estequiometria da interação com o domínio C-terminal da Hsp90 (C-Hsp90) é um monômero de Tom70 para um dímero de C-Hsp90 (GAVA et al., 2011). No entanto, ainda é necessário um conhecimento detalhado, em termos estruturais,
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das regiões envolvidas na interação do complexo Hsp90/Tom70 para um melhor entendimento sobre a importação de proteínas precursoras para a mitocôndria.
1.5 Terapia para câncer: inibição da Hsp90
A chaperona Hsp90 estabiliza e mantém a conformação de diversas proteínas mutadas e aberrantes, que normalmente formariam agregados e levariam a apoptose, o que é uma vantagem para a sobrevivência de células tumorais (GAVA, 2009; KIM et al., 2013). Devido à isso, a Hsp90 representa um importante alvo terapêutico, uma vez que, sua inibição pode causar regressão em tumores malignos (DA SILVA e RAMOS, 2012; SOLIT e CHIOSIS, 2008). De fato, essa chaperona é altamente expressa em vários tipos de células tumorais, provavelmente, devido ao estresse causado no microambiente celular (DA SILVA e RAMOS, 2012). Diversos compostos naturais parecem ter efeito sobre Hsp90 e têm sido sistematicamente usados em testes clínicos que já estão em diversas fases (GAVA, 2009). Por exemplo, a geldanamicina (origem Streptomyces
hygroscopicus) (Figura 10) se liga ao domínio N-terminal da Hsp90 competindo
com o sítio de ligação do ATP e, conseqüentemente, leva as proteínas clientes à degradação via ubiquitinação (WHITESELL et al., 1994). Por outro lado, outros compostos como a novobiocina (origem Humicola fuscoatra) (Figura 10), a cisplatina, e galato-3-epigalocatequina (EGCG) inibem a função da Hsp90 ligando-se ao domínio C-terminal (Figura 10) (DONNELLY e BLAGG, 2008). Parece ser contra intuitivo inibir uma importante chaperona como a Hsp90, já que essa é uma proteína necessária para a viabilidade e integridade celular. Entretanto, drogas utilizadas para a regressão do câncer, como por exemplo, a 17-AAG, que são capazes de inibir a Hsp90, são bem toleradas por pacientes (SAUSVILLE et al., 2003). Isso porque, provavelmente, a Hsp90 encontrada em células tumorais possui maior afinidade pelo composto, quando comparada a Hsp90 proveniente de células normais (CHIOSIS et al., 2001; SAUSVILLE et al., 2003). Kamal e colaboradores mostraram que a Hsp90 de células cancerosas tem afinidade cerca
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de 100 vezes maior ao composto 17-AAG quando comparada a Hsp90 de células normais (KAMAL et al., 2003). Isso, provavelmente ocorre, pois a Hsp90 de células normais estaria na forma livre, enquanto a Hsp90 derivada de células malignas estaria formando complexos protéicos e teria maior atividade ATPásica (KAMAL et al., 2003). Diante desses fatos, a descoberta de novos inibidores para a Hsp90 é de suma importância, podendo gerar informações relevantes no campo medicinal.
(a)
(b)
Figura 10: Moléculas inibidoras da Hsp90.(a) Moléculas que se ligam ao domínio N-terminal da Hsp90. (b) Moléculas que se ligam ao domínio C-N-terminal da Hsp90. Figura retirada e adaptada de (JACKSON, 2013).
