Praticas de Microbiologia2011-1

Olga M artins M arques (ProfaUFPE - DEQ)

M aria Alice Gomes de Andrade Lima (ProfaUFPE-DEQ) M aria de Los Angeles Peres Palha (Profa UFPE - DEQ)

Sonia Ma Souza Cavalcante de Albuquerque (Profa UFPE -DEQ)

Recife - Pernambuco

2011

Apresentação

A inexist ência de um t ext o de prát icas de Micro bio lo gia Geral adapt ado às no ssas co ndiçõ es do no sso labo rat ó rio , e dest inado ao s curso s superio res de Engenharia Química, Química Indust rial e o ut ro s, no s mo t ivaram à realização dest e ma nual. Os experiment o s fo ram selecio nado s de mo do a englo bar a maio ria do s assunt o s co nt ido s no pro grama referent es à primeira unidade do curso e po dem ser facilment e efet uado s em labo rat ó rio s de recurso s limit ado s.

Cada experiment o , po derá ser efet uado p o r um grupo de do is o u mais aluno s. Muit as vezes o experiment o po de ser dividido ent re vário s grupo s da classe, sendo que cada grupo deve fazer o experiment o numa det erminada co ndição . Nest e caso , o inst rut o r dever fazer uma discussão a posteiori e glo bal do pro blema apresent ado .

PRÁTICA N



1: NORMAS DE CONDUTA

 Co nscient izar o s aluno s at ravés do co nheciment o das no rmas co ndut as co mo pro ceder durant e sua permanência no labo rat ó rio de micro bio lo gia

INTRODUÇÃO

:

Inúmeras infecçõ es po dem est ar asso ciadas ao s t rabalho s co m micro -o rganismo s em labo rat ó rio s de micro bio lo gia. Muit as vezes t ais infecçõ es po dem result ar na mo rt e do indivíduo . Ao co nt rário do s acident es envo lvendo subst âncias químicas e fo go , o nde a causa e o efeit o são pro nt ament e id ent ificado s, é muit o difícil, na maio ria das vezes, det erminar se a mo lést ia infeccio sa fo i co nt raída no labo rat ó rio . O indivíduo po de ficar enfermo po r muit o s dias o u semanas apó s o co nt agio , sem fazer asso ciação . É part icularment e difícil fazer t al t ipo de asso ciação co m do enças que são freqüent es na co munidade, t ais co mo t uberculo se, hepat it e e febre t ifó ide.

A experiência t em demo nst rado que a ino cuidade do t rabalho de pesquisa co m micro -o rganismo s perigo so s depende das bo as prát icas de labo rat ó rio , da dispo nibilidade e uso de equipament o s de segurança da inst alação , do funcio nament o do lo cal das pesquisas e de uma o rganização eficient e.

Dest a fo rma para evit ar co nt aminação , exist e a necessidade de aplicação das bo as prát icas de labo rat ó rio , o micro bio lo gist a deve est ar seguro de que seus t écnico s cult ivam e empregam est as prát icas.

As regras enumeradas a seguir co nst it uem a base das prát icas seguras de labo rat ó rio . Em muit o s labo rat ó rio s est as no rmas po dem ser est abelecidas co mo regulament o de t rabalho .

NORM AS DE CONDUTA NO LABORATÓRIO DE M ICROBIOLOGIA  Os a r tigos de uso pessoa l devem ser gua r da dos em loca is a pr opr ia dos,

nunca na ba nca da do la bor a t ór io;  Ma nter ca belos compr idos pr esos;

 Nã o beber , nã o fa zer higiene buca l ou ma quia gem, nã o b a r bea r -se, nã o fuma r , nã o r oer a s unha s;

 Nã o tr a ba lha r com ca lça dos a ber tos, ou seja , use sa pa tos que pr oteja m int eir a ment e os pés; dur a nt e a r ot ina de t r a ba lho,

 O pr ofissiona l dever á utiliza r r oupa s a pr opr ia da s a o tr a ba lho desenvolvido, como por exemplo, a vent a is, ja lecos com ma nga compr ida (se necessá r io) e out r os unifor mes a fins;

 La va r a s mã os a ntes e a pós a jor na da de tr a ba lho;

 Após uso, os ja lecos devem ser coloca dos em sa co plá sticos, sepa r a dos do ma t er ia l de uso pessoa l;

 Qua ndo do uso de luva s, ev ita r a br ir por ta s e a tender telefone;

 S e houver fer ida na mã o ou no pulso, medida s a diciona is devem ser consider a da s. C onsult e o chefe do la bor a t ór io;

 Nã o se a limenta r ou conduzir a limentos pa r a o inter ior do la bor a tór io de a ná lise;

 No la bor a tór io de a ná l ise, nã o fa zer r efeições ou pr epa r a r a limentos,  Nunca pipeta r com a boca . Usa r , sempr e que possível, pipeta dor es

a ut omá t icos e per a s de bor r a cha ;

 Cuida do com a for ma çã o de a er ossóis e r espingos (a gita dor es, ultr a -som, cent r ífuga );

 Após a ma nipula çã o de ma ter ia l conta mina do, despr eza r , a dequa da mente, em soluçã o desinfet a nt e ou r ecipient e pa r a a ut ocla va çã o;

 As ba nca da s de tr a ba lho dever ã o ser desinfeta da s a ntes e depois da r otina de t r a ba lho;

 Em ca so de a cidente, desconta mina r utiliza ndo á lcool a 70%, á lcool ioda do ou soluçã o de hipoclor it o de sódio (á gua sa nit á r ia ) a 0, 5% pr epa r a do r ecent ement e (má ximo dois dia s), dependendo do t ipo de ma t er ia l biológico;  Evita r tr a ba lha r sozinho no la bor a tór io;

 A Dir eçã o da Unida de é r esponsá vel por : a ssegur a r uma infr a -est r utur a mínima indispensá vel, per mit indo o seguiment o dest a s nor ma s. Nã o se pode la va r a s mã os na fa lt a de á gua cor r ent e, por exemplo. S e est a est r ut ur a fa lt a por a lguma r a zã o, ca be a Dir eçã o suspender a s a t ivida des que envolva m r isco de ma nipula çã o;

 O chefe do la bor a tór io é r esponsá vel por : a ) esta belecer uma or dena çã o e r ot ina em r ela çã o a o ma t er ia l per igoso; b) pr ovidencia r t r eina ment o a dequa do dos inicia nt es no la bor a t ór io; c) super visiona r o cumpr iment o da s nor ma s de biossegur a nça ;

 Ca da membr o do la bor a tór io, a pós r ecebimento da s instr uções de biossegur a nça do la bor a t ór io, é r esponsá vel pelo seu cumpr iment o.

PRÁTICA N



2: MATERIAIS E EQUIPAMENTOS DE

LABORATÓRIOS DE MICROBIOLOGIA

OBJETIVOS:

 Discriminar as funçõ es e/o u aplicaçõ es  Limpar

 Aco ndicio nar

1. FUNÇÕES E/OU APLICAÇÕES DO MATERIAL D O

LABORATÓRIO DE MICRO BIOLOGIA

1.1. Material Permanente

a. Autoclave - câmara de vapo r co m parede dupla, equipada co m dispo sit ivo s que permit em o enchiment o da câmara co m vapo r sat urado e sua manut enção em det erminadas t emperat ura e pressão po r quaisquer perío do s de t empo . O aut o clave é um equipament o indispensável ao labo rat ó rio de micro bio lo gia na est erilização de meio s de cult ura, água, so luçõ es e cult uras de despejo .

Figura 01: Aut o clave Vert ical

M odo de Operação: ligar o aparelho à rede elét rica. Apó s a co lo cação do mat erial dent ro do cest o de ino x, a t ampa é fechada e a t o rneira de remo ção de ar o u vapo r é deixada abert a para remo ver t o do o ar. Quando t o do o ar fo r remo vido , deixe que um fluxo de vapo r fluent e persist a po r cerca de 5 minut o s, ant es de fech ar a t o rneira. A part ir de ent ão a pressão int ernament e irá aument ar e chegar à pressão de

est erilização usada, que é de 15 lb/po l2, o u 1at m, o u 1 kgf/cm2, co rrespo ndendo a uma t emperat ura de 1210C. O t empo de expo sição do mat erial no int erio r dest e equipa ment o irá depender do vo lume de líquido a ser est erilizado . Para pequeno s vo lumes, at é 3 lit ro s, po dem ser est erilizado s durant e 20 a 30 minut o s a uma pressão de 15 lb/po l2. Co m relação a maio res vo lumes, será necessária, uma expo sição mais pro lo ngada. Qua ndo a t emperat ura requerida para a est erilização é alcançada, deve -se co meçar a co nt ar o t empo , usando um reló gio de labo rat ó rio (co m alarme). Deco rrido o t empo desliga -se o aparelho da co rrent e elét rica e mant ém-se a aut o clave e a t o rneira de ar e vapo r fechado s, at é o manô met ro vo lt ar ao po nt o zero , po is quando a pressão da aut o clave é aliviada rapidament e, o s líquido s dent ro do s t ubo s e frasco s fervem vio lent ament e, fazendo co m que o s t ampõ es sejam arremessado s para fo ra do s mesmo s. Co ncluída a est eriliz ação , abre-se a t o rneira de vapo r; em seguida a t ampa do aut o clave é levant ada.

b. Centrífuga: equipamento utilizado para separar os sólidos dos líquidos. A centrifugação permite a separação de substâncias com diferente massa molecular, baseando-se na sua densidade, ao ser aplicada uma força centrífuga. No Laboratório de microbiologia pode ser utilizado para separar microrganismos, proteínas, membranas celulares (insolúveis em água) e citoplasma (solvente celular aquoso) após ruptura de células, etc.

Figura 02: Cent rífuga

c. Estufas de Esterilização (Fornos de Pasteur) - est eriliza a seco t o da vidraria co nvenie nt ement e aco ndicio nada, a t emperat ura de 170 ºC po r 2 ho ras o u a 200o C po r 1 ho ras.

Figura 03: Est ufa de Est erilização

d. Espectrofotômetro – são usados para medir a radiação absorvida ou transmitida por uma solução a um comprimento de onda definido. Nesse equipamento a

absorbância ou transmitância é efetuada por medida da cor ou turvação das amostras.

Figura 04 : Espect ro fo t ô met ro s

e. Refrigerador ut ilizado na co nservação de cult uras de micro -o rganim-o s s-o b baixa t emperat ura, diminuind-o -o t emp-o de geraçã-o

f. Estufa Incubadora (estufa bacteriológica) - favo rece o cresciment o de micro rganismo s pela incubação na t emperat ura adequada.

Incubação = manut enção do meio semeado em det erminadas co ndiçõ es para pro mo ver o desenvo lviment o do s micro rganismo s.

(a) ( b) Figura 05: Est ufa Incubado ra de bancada (a); est ufa BOD (b)

f. M esa Incubadora (Shaker) - favo rece o cresciment o de micro rganismo s aeró bio s, p ela disso lução do o xigênio no meio , at ravés da agit ação da mesa, em mo viment o s ro t at ó rio s.

Figura 06: Mesa Incubado r a co m Agit ação Orbit al

g. Cabine de fluxo laminar - câmara assépt ica, do t ada de exaust o r e lâmpada fluo rescent e, sendo ut ilizada em repiques de micro rganismo s

h. B iorreator (Fermentador) - equipament o o nde o co rrem as ferment açõ es, po dendo ser do t ado de sist emas de agit ação , aeração , refrigeração .

Figura 08 : Ferment ado r es

1.2. Vidraria

a. Tubo de ensaio (tubo de cultura) - utilizado no cultivo de microrganismos em pequeno volume de meio e na conservação de culturas puras de micro-organismos. Os tubos de ensaio podem também ser usados para efetuar reações químicas de pequena escala com pequenas quantidades de reagentes de cada vez.

(a) (b) (c)

b. Placa de Petri - facilit a o iso lament o de micro rganismo s devido à grande superfície de cresciment o que apresent a, po ssibilit ando o apareciment o de co lô nias separadas.

Colônia = aglo merado de células em meio só lido , geralment e o riginadas de uma única célula pro genit o ra.

( a) (b) Figura 10: Placa de P et ri(a); Placa co m diversas co lô nias de micro -o rganism-o s (b)

c. Pipeta - para diluir preparaçõ es diversas e ino cular cult uras líquidas

Inoc ula r = in se rir, in tro d u zir

Inóculo (ou semente) = co ncent ração de células suficient es para cult ivar uma de meio co m bo m rendiment o

Figura 11 :Pipet as graduadas(a); Pipet ado r mo no canal

d. Pipeta Pasteur (micropipeta) - é um t ubo de vidro o u plást ico espichado em capilar, ut ilizada para t ranspo rt ar pequeno s vo lumes de líquido

( a) ( b)

Figura 12:Pipet as Past eur de plást ico (a) ;Pipet as Past eur de vidro (b) e.Alça Esfregaço (Alça de Drigalsky) - ideal para esfregaço em aplicações microbiológicas. A Superfície polida não danifica o meio de cultura distribuído na placa. Pode ser fabricado em polipropileno ou a part ir de um t ubo de vidro ,

do brada em ângulo ret o e depo is em 45 º C na chama. É ut ilizada para espalhar micro rganismo s em meio de cult ura só lido .

( a) ( b)

Figura 13: Alça de Drigalsky de plást ico (a) e de vidro (b) .

f. B alão de fundo chato - ut ilizado geralment e para guardar meio s de cult ura.

g. Frasco de Erlenmeyer - ut ilizado para pro pagação celular de micro rganismo s em meio líquido so b agit ação em mesa agit ado ra. h. Fernbach - idem

( a) ( b) ( c )

Figura 14: balão (a) ;Frasco s de Erlenmeyer (b); Fernbach (c) .

i. Lâmina - para examinar micro rganismo s ao micro scó pio s

Lâmina Escavada - po ssui uma o u duas depressõ es po ssibilit ando o bservar a mo bilidade de micro rganismo s suspenso s numa go t a de líquido (Ensaio em go t a pendent e)

j. Lamínula - ut ilizada para reco brir preparaçõ es micro scó picas “in vivo

( a) ( b) Figura 15: Lâminas e lamínulas (a);Lâmina escavada (b).

1.3.Materiais utilizados em titul ações, d estilações, preparações de solução e de meios de cultura - Bequer, bast ão de vidro , buret a, funil, pro vet a, balão vo lumét rico , co ndensado r dent re o ut ro s.

1.4. Diversos

a. Lápis dermatográfico - ut ilizado para escrever em superfície de vidro

b. Algodão bruto (ou cardado) - serve para pro t eger o mat erial est erilizado , do co nt at o co m o ar ambient e.

c. Cabo de K olle - feit o co m mat erial iso lant e, adapt ado em t rês fo rmas (círculo , ele, agulha). Serve de supo rt e para um fio de plat ina o u uma liga níquel-cro mo , sendo ut ilizado em ino culação de micro rganismo s.

Figura 16: Cabo de K ol l e e al ç as de pl at i na

2. DESINFECÇÃO a. Desinfecção do ar:

A desinfecção do ar no labo rat ó rio de micro bio lo gia é feit a at ravés da vapo rização de uma so luç ão de hipo clo rit o de só dio a 1% o u

perio dicament e co m a vapo rização de uma so lução de fo rmalina (fo rmo l a 40%). Salient a -se, no ent ant o , que a so lução de fo rmalina não po de ser usada para a desinfecção de ambient es o cupado s.

As câmaras assépt icas são est erilizada pelo uso de lâmpadas de luz ult ravio let a.

b. Desinfecção da bancada:

Ant es da realização de um det erminado t rabalho de micro bio lo gia, a bancada deve ser limpa co m uma so lução det ergent e seguida de uma so lução alco ó lica a 70%.

c. Desinfecção da vidraria:

- vidraria contam inada - deverá ser inicialment e est erilizada em aut o clave para que t o da flo ra present e seja dest ruída e, em seguida lavada co m uma so lu ção det ergent e o u sabão neut ro ;

- vidraria sem contam inação - idem ao ant erio r, po rém sem necessidade de aut o clavação .

Observação: não é co st ume se ut ilizar so lução sulfo crô mica na lavagem do s mat eriais do labo rat ó rio de micro bio lo gia, uma vez que est a so lução co nt ém cro mo que é um met al que po de int o xicar as células vivas e t ambém po r ser de difícil remo ção no mat erial

3. ACONDICIONAMENTO

a. Placas de Petri - embrulhadas co m papel, geralment e fo rmando co njunt o de 3 unidades. A quant idade depende da n ecessidade do t rabalho .

b. Pipetas - o bt ura-se as bo quilhas co m mecha de algo dão (1cm) para filt rar o ar so prado e para pro t eger o o perado r durant e a manipulação ; em seguida são enro ladas uma a uma co m papel, ano t ando a capacidade de cada uma.

c. Tubos d e ensaio, balões de fundo chato, Erlenmeyers, fernbachs - são preparado s int ro duzindo -se um t ampão de algo dão cardado na bo ca do recipient e. Esse t ampão deve ser feit o , enro lando o algo dão no sent ido da fibra em quant idade suficient e para facilit ar o manus eio , ist o é, não deve ser nem muit o apert ado , nem muit o fro uxo .

d. Lâminas - mergulhadas em so lução alco ó lica, ficam apt as a serem ut ilizadas a qualquer mo ment o , evit ando paralelament e que sejam arranhadas.

ATENÇÃO: To da vidraria ut ilizada no labo rat ó rio de micro bio lo gia ant es de ser preparada para est erilização deverá est ar limpa e seca.

PRÁTICA 3: TÉCNICAS DE PRÁTICAS ASSÉPTICAS E

DIFERENCIAÇÃO DE MICRO -ORGANISMOS

OBJETIVOS:

 Aprender t écnicas de prát icas ass épt icas

 Avaliar a presença de micro -o rganismo s em ambient es diverso s  Diferenciar macro sco picament e fungo s, leveduras, bact érias

INTRODUÇÃO

O ho mem no seu meio ambient e co nvive co m inúmeras fo rmas de vida. Os micro rga nismo s o cupam lugar de dest aque t ant o pelo s benefício s co mo pelo s malefício s que pro po rcio nam ao ho mem, sendo enco nt rado s na nat ureza em abundância e variedade de fo rmas. Para que o s mesmo s sejam cult ivado s art ificialment e é necessário co nhecer suas exigências nut ricio nais e suas co ndiçõ es físicas de cresciment o , t rabalhar co m mat erial est erilizado e o b edecer às no rmas de prát ica assépt ica.

Dependendo da finalidade da o peração , o s micro -o rganimo s po dem ser cult ivado s em: lâminas, placas, t ubo s, balõ es, fra sco s de Fernbach o u recipient es de maio r capacidade. O cult ivo em lâmina é ut ilizado quando se deseja aco mpanhar micro sco picament e o cresciment o e repro dução de um micro rganismo . Emprega -se o cult ivo em placas quando se quer iso lar espécies micro bianas dis t int as, devido à ext ensa área de superfície que apresent a. Po rém, devido à pequena quant idade de meio em expo sição ao ar, co m freqüência o co rre ressecament o e/o u apareciment o de co nt aminaçõ es.

Cult ivando o s micro rganismo s em t ubo s, há facilidade de manipulação das cult uras, além da vant agem de eco no mizar meio e espaço físico . Para se o bt er grandes vo lumes de cult ura, o micro rganismo é cult ivado inicialment e em balõ es, frasco s de Fernbach, para depo is ser t ransferido para recipient e maio r, cuja capacidade é função da necessidade do t rabalho .

NORMAS DE PRÁTICA ASSÉPTICA

1. Não t rabalhar em co rrent e de ar, nem ambient e agit ado pelo acúmulo de pesso as;

2. Não falar nem respirar em frent e ao recipient e abert o co nt endo mat erial de est udo ;

3. Abrir o recipient e inclinado junt o à chama, o nde o ar est á rarefeit o de fo rmas vivas;

4. Ret irar o t ampão de algo dão co m o dedo mínimo e a palma da mão sem t o car na bo ca do recipient e e sem enco st ar o t ampão em lugar algum;

5. Flambar a bo ca do recipient e sempre que fo r i niciar uma ino culação , para que uma co rrent e de ar quent e seja fo rmada de dent ro para fo ra; 6. Int ro duzir o mais rápido po ssível a alça o u pipet a sem t o car nas

paredes do recipient e;

7. Ao t erminar a ino culação , flambar a bo ca do recipient e e ajust ar o t ampão , co nservando o mat erial ao abrigo da po eira e umidade.

PROCEDIMENTO PRÁTICO  Limpar a bancada;

 Marcar t o do mat erial (placa e t ubo s), especificando o t ipo de meio e a fo nt e da ino culação ;

 Fundir do is meio s de cult ura diferent es (po r exemplo AN e CZ);  Dist ribuir o s meio s em placas de Pet ri e t ubo s (inclinar);

 Esperar so lidificar;

 Fazer ino culaçõ es nas superfícies do s meio s dist ribuído s em placas; - Incubar na t emperat ura ambient e po r 2 a 5 dias, não esquecendo de guardar placas sem ino cular, uma de cada m eio ut ilizado para co nt ro le da est erilização e da eficácia da t écnica ut ilizada.

FONTES: água po luída, ferment o de padaria, ar, gargant a, mão s, cabelo , suo r et c.

DIFERENCIAÇÃO MACROSCÓPICA DOS MICRORGANISMOS

Os micro -o rganimo s crescem e repro duzem qua ndo cult ivado s e ino culado s adequadament e. Po demo s fazer avaliação do s grupo s ao s quais eles pert encem, po r o bservaçõ es das caract eríst icas das co lô nias no s meio s em que eles fo ram cult ivado s. O cresciment o em meio líquido po de ser evidenciado pela t urvaçã o , pela fo rmação de pequena massa de célula que flo t am (velo ) o u po r sediment ação das células. Em placas de Pet ri est uda -se o cresciment o do s micro rganismo s em meio só lido , o bservando -se o apareciment o de co lô nias cujo s aspect o s macro scó pico s auxiliam na d iferenciação de grupo s micro biano s.

I) Descrição de colônias em placas de Petri:

Apó s o perío do de incubação pré -est abelecido as co lô nias de micro -o rganismo s cult ivado s em placas de Pet ri po dem ser descrit as de aco rdo co m o s seguint es crit ério s:

a. forma:

Circular

R

Irregular Filament o sa

Figura 17: Fo rmas de co lô nias de micro rganismo s

b. quanto à dimensão

- As co lô nias de fungo s são geralment e grandes e filament o sas, algumas vezes o cupam t o da a placa o nde est ão cult ivadas.

- As co lô nias de leveduras são médias e leit o sas, enquant o as de bact érias são meno res e brilhant es sendo algumas t ão pequenas que se deno minam punt ifo rmes.

c. quanto à cromogênese

- Co r do pigment o : banca, bege, alaranjada, azul, co lo rida et c - Presença de pigment o so lú vel o u inso lúvel no meio

d. superfície

plana ,elevada, co nvexa, lisa, rugo sa, seca, brilhant e, t ranslúcida, o paca, pregueada, pulverulent a

II) Descrição da cultura em caldo nutriente

O cresciment o em caldo de cult ura po de apresent ar -se so b diferent es fo rmas.

a. turbidez: mais o u meno s acent uada

b.

c.

PRÁTICA N



4: MEIOS DE CULTURA

OBJETIVOS:

 Preparar meio s de cult ura de uso s em prát icas micro bio ló gicas  Dist ribuir co nvenient ement e, est erilizar em aut o clave

INTRODUÇÃO :

Meio s de cult ura são asso ciaçõ es de subst âncias que permit em o cult ivo do s micro rganismo s fo ra do seu meio nat ural.

Nas preparaçõ es do s meio s de cult ura t o do s o s nut rient es devem ser disso lvido s em água para que po ssam ser abso rvido s pelas células micro bianas.

No s labo rat ó rio s geralment e ut iliza -se água dest ilada no preparo dest es meio s, no ent ant o nas unidades indust riais co st uma -se ut ilizar água de rio s o u po ço s. A água deve t er bo a o rigem e co mpo sição química co nst ant e; quando necessário , deve ser devidament e t rat ada.

Co mo co nst it uint es básico s do s meio s de cult ura, além da água, po de-se especificar: as fo nt es de carbo no , as fo nt es de nit ro gênio , o s sais. Em meio s de cult ura so lidificado s, além dest es co mpo nent es deve -se int ro duzir agar, gelat ina o u sílica gel co m a função específica de so lificar esses meio s.

NORMAS DE PREPARAÇÃO :

 Pesagem dos componentes: o s diverso s co mpo nent es do s meio s de cult ura po dem ser pesado s separadament e, o u co nsecut ivament e num único recipient e (Béquer). Para quant idades inferio res a 1g ut iliza -se uma balança analít ica (semi-analít ica).

O agar -agar geralment e é pesado separadament e, sendo o valo r da pesagem em função da quant idade do meio a ser dist ribuído no s recipient es. Ut iliza -se de 10 a 20g dest e agent e so lidificant e em pó para cada lit ro de so lução nut rient e.

 Solubilização dos componentes: adicio nar o s nut rient es previament e pesado s a um Béquer co nt endo água dest ilada em quant idade suficient e para disso lvê -lo s. Os ext rat o s de carne e de leveduras po dem ser aquecido s ligeirament e para facilit ar a so lubilização . Deve-se evit ar o uso de fo go diret o e pro lo ngado para não haver queima do mat erial e co nsequent e escureciment o do meio .

O agar não é so lúvel a frio , devendo se necessário ser so lubilizado em um banho -maria o u em aut o clave a vapo r fluent e.

 Ajuste do pH nos meios: deve-se deixar resfriar ao máximo o s meio líquido s, ant es de acert ar o pH. No caso do s meio s so lidificado s ajust ar na meno r t emperat ura em que não haja so lidificação .

São empregadas para ajust e do pH so luçõ es de hidró xido de só dio o u ácido clo rídrico a 0,1 N, co nfo rme o caso . Na maio ria do s caso s po de-se verificar o pH at ravés do uso de um papel de t o rnasso l.

Em meio s so lidificado s, o pH ácido só deverá ser ajust ado depo is da est erilização para evit ar a hidró lize do agar quando em t emp erat ura elevada. Nest e caso o pH ácido é ajust ado co m uma so lução est éril de ácido lát ico .

 Clarificação: em alguns caso s há necessidade de clarificação do s meio s que durant e o preparo t o rnam-se t urvo s. A clarifição po de ser feit a simplesment e pelo calo r o u pelo uso de clara o u albumina de o vo , aquecendo em seguida at é ebulição e filt rando -se em gase o u algo dão hidró filo .

 Distribuição, esterilização e conservação: o s meio s de cult ura depo is de preparado s são dist ribuído s em recipient es adequado s (t u bo s, balõ es, Erlenmeyeres), especificando o respect ivo no me o u sigla e a dat a do preparo do s mesmo s. Terminada a dist ribuição , o s t ubo s, balõ es o u Erlenmeyers são arro lhado s co m algo dão o u t ampas met álicas especiais, aco ndicio nado s em cest as e levado s à es t erilização em aut o clave. A t emperat ura e o t empo de expo sição nest e equipament o depende da co mpo sição e da quant idade de meio de cult ura recipient e (vide est erilização ).

Apó s a est erilização , o s meio s são resfriado s espera -se 72 ho ras ant es de usá -lo s o u est o cá-lo s em geladeira, a fim de que se po ssa det ect ar algum t ipo de co nt aminação , o u falha de est erilização .

COMPOSIÇÃO DE MEIOS DE CULTURA

A) MEIOS DE CULTURA PARA ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS AGAR NUTRITIVO (AN)

Ext rat o de carne... . ... . ... . ... . . 3, 0g Pept o na... 5,0g Agar... 20,0g Água dest ilada... 1000ml pH = 6,8 - 7,0

CALDO LACT OSADO

Pept o na... .... ... ... ... ... ... ... 5,0g Ext rat o de carne... 3,0g

Lact o se... 5,0g Água dest ilada...1000ml pH = 6,8 - 7,0

VERDE-BRILHANT E

Pept o na ... 10,0g Lact o se... 10,0g Bile de bo i... 20,0g Verde brilhant e... .. . ... . ... . . 0,0133g Água dest ilada... 1000mL pH = 7,2

Aut o clavar a 115oC po r 15 min. Para adicio nar o verde brilhant e po de-se preparar uma so lução a 0,1% em água dest ilada (0,1g de verde brilhant e em 100mL d e água dest ilada) e dela junt ar 13,3 mL ao meio de cult ura.

Dist ribuir 10mL do caldo em t ubo s grande co m t ubinho s de Duhran.

EOSINA-AZUL DE M ETILENO (M EIO DE LEVINE OU EM B ) Pept o na ... 10,0g

Lact o se... . . .. . ... . ... . ... . ... . ... . . 5, 0g Sacaro se... 5,0g K2HPO4. . . .. . ... . ... . ... . ... . ... . 2,0g Agar... 12-15g Água dest ilada... 1000mL

Dividir em balõ es de 250 mL, 100mL e 200mL de meio . Est erilizar a 120o C po r 20 minut o s. Quando fo r dist ribuir em placas para uso , fundir e adicio nar para cada 100 mL de meio , 1mL de so lução est éril de eo sina (4%) e 1mL de so lução est éril de azul de met ileno (0,65%). As placas po dem ser guardadas po r uma semana em refrigerado r.

SORO DE LARANJA

Tript o na... 10,0g Ext rat o de leved uras... 3,0g Glico se... 4,0g Fo sfat o dipo t ássico ... 15,0g So ro de laranja...200,0ml Água dest ilada... .. ...800,0ml

Preparar o so ro de laranja aquecendo 1 lit ro do suco recém -ext raído , a apro ximadament e 93C. Adicio nar 30g de diat o mácea e mist urar. Filt rar co m sucção at ravés de um funil de Buchner usando papel de filt ro gro sseiro reco ber t o co m o auxílio de filt ração . Refilt rar o s primeiro s mililit ro s. Ajust ar o pH a 5,5 , dist ribuir em recipient es adequado s.

B) MEIOS DE CULTURA PARA ISOLAMENTO DE FUNGOS FILAMENTOSOS E LEVEDURAS

BAT AT A GLICOSE AGAR - BGA

Bat at as descascadas e co rt adas em fat ias ... 300g Água dest ilada... 1000ml

As bat at as devem ser manuseadas co m o mínimo de expo sição ao ar. Aquecer em 500ml de água at é co mplet ament e co zidas. Filt rar at ravés de gase, co mplet ar o vo lume para 1000ml e adicio nar:

Agar ... 15,0g Glico se... 20,0g pH = 6,8 - 7,0

CALDO GLICOSADO

Ext rat o de carne... 3,0g Pept o na... . . ... . ... . ... . ... . ... 5, 0g Glico se...10,0g Água dest ilada...1000ml pH = 6,8 - 7,0

GLICOSE LEVEDURA (GL)

Pept o na ... .. . ... . ... . ... . ... . .. 10,0g Ext rat o de carne... 3,0g NaCl... 5,0g Ext rat o de levedura... 10,0g Glico se... .. . ... . ... . ... . ... . . 10, 0g Agar... 12 -15g Água dest ilada... 1000mL pH 6,9 -7,1

GLICOSE AGAR (GA)

Ext rat o de carne ... 3,0g Pept o na... 5,0g

Glico se... 10,0 Agar... 20,0g Água dest ilada... 1000ml pH = 6,8 - 7,0

CZAPECK (CZ)

NaNO3 (nit rat o de só dio )... 3,0g K2HPO4 (fo sfat o mo no ácido de po t ássio )... 1,0g MgSO4 (sulfat o de magnésio )... 0,5g KCl (clo ret o de po t ássio )... 0,5g FeSO4 (sulfat o ferro so )... 0,01g Sacaro se... 30,0g Agar... 20,0g Água dest ilada...1000ml pH = 6,6

GODOY

Pept o na... 1,0g Caldo -de-cana... 500g Agar... 15g

Junt ar ao caldo -de-cana uma clara de o vo bat ida. Aquecer at é fervura, filt rar co mplet ando o vo lume at é 1000ml. Junt ar a pept o na e o agar.

PRÁTICA N



5: HIGIENE E SANITIZAÇÃO

OBJETIVOS: Avaliar as condições higiênico-sanitárias das mãos de manipuladores de alimentos; de superfícies de bancadas e de utensílios usados no preparo dos alimentos INTRODUÇÃO:

As indústrias e os estabelecimentos que comercializam alimentos devem se preocupar com a manutenção das condições higiênico-sanitária para evitar que doenças sejam transmitidas aos consumidores. As condições higiênico-sanitárias no preparo dos alimentos nem sempre são satisfatórias podendo apresentar contaminação proveniente, principalmente, dos operadores a partir do manuseio constante, da matéria-prima contaminada ou por limpeza deficiente dos equipamentos e utensílios usados no preparo dos alimentos. Dessa forma é importante um controle efetivo das boas prática e avaliação periódica da higiene por meio de testes laboratoriais usando micro-organismos indicadores de contaminação. Nesta prática utilizaremos a

contagem de bactérias, bolores e leveduras como indicadores de contaminação ambiental e dos manipuladores.

MATERIAL:

Swabs: preparados por meio de uma “zaragatoa” (chumaço de algodão esterilizado, montado em haste de madeira): esterilizados em autoclave a 121oC por 15 minutos ou 1 caixa de cotonetes.

Meios de cultura: 500mL de meio Plate Count Agar (PCA) e 500mL de meio CZapeck (CZ) e 500mL de meio Saboraund; 40 tubos pequenos com 9mL de Solução Tampão de Água Salina Peptonada a 0,1% - para diluição da amostra

Placas de Petri Estéreis: 40 placas

Soluções sanitizantes: solução de hipoclorito de sódio a 100-200 mg/L, solução de álcool a 70%, solução de álcool iodado (2% em etanol); NaOH 3%, ácido peracético Locais de coleta: superfícies de táboas e facas fatiadoras de frios, bancadas, pia e mãos dos manipuladores

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL:

I) Prepare 500mL de solução sanitizante de hipoclorito de sódio a 200 mg/L, a partir de uma solução a 10% de cloro livre;

II) Faça a higienização das superfícies e utensílios de acordo com os procedimento a seguir:

A) Higienização dos utensílios ( superfícies de taboas e facas fatiadoras de frios)

1. Retire o excesso de sujidades dos utensílios, 2. Lave com água corrente na temperatura ambiente; 3. Lavar com esponja com detergente;

4. Enxaguar em água corrente até a remoção total do detergente.

5. Em seguida, faça a desinfecção, imergindo numa bacia com uma solução clorada a 200ppm,

6. Aguarde 15minutos; remova e deixar secar naturalmente. B) Higienização de equipamento (fermentador)

1. Limpar manualment e co m us o de espo nja e det ergent e neut ro (co mercial).

2. Realizar limpeza po r circulação co m NaOH 3%, 3. Lavar co m água,

4. Sanit izar co m (ácido peracét ico /peró xido de hidro gênio a 0,3%), 5. Deixar at uar po r 20 minut o s, remo ver

C) Higiene das sup erfícies de trabalho como mesas, bancadas, pias e cubas

1. Proteja suas mãos com auxílio de uma luva de plástica, 2. Remova as sujidades com rodo de pia,

3. Passe uma esponja umedecida com o detergente, 4. Lave a torneira da pia, enxaguando com água 5. Remova todo o detergente com uma flanela úmida, 6. Borrife álcool 70% deixando secar naturalmente D) Higiene das superfícies das mãos 1. Abra a torneira e molhe a mão, antebraço; 2. Coloque o detergente na palma da mão,

3. Lave primeiro a palma da mão e depois o dorso; 4. Lave em seguida os dedos e as unhas;

5. Por último lave o antebraço;

6. Deixe secar naturalmente ou use um papel toalha estéril. 7.

OBS: A utilização de gel alcoólico a 70% ou de solução alcoólica a 70% com 1-3% de glicerina pode substituir a higienização com água e sabão quando as mãos não

estiverem visivelmente sujas. Duração do Procedimento: 20 a 30 segundos

AVALIAÇÃO DA HIGIENEIZAÇÃO:

 Umedecer os swab em solução tampão (água salina peptonada a 0,1%);

 Avaliação da superfície de utensílio antes e após higienização com solução sanitizante: friccionar formando um ângulo de 300 com a superfície teste, vinte vezes na forma de “zigue-zague”, nos sentidos das diagonais, na área de coleta com dimensão (10cmx10cm);

 Avaliação das mãos dos manipuladores antes e após higienização: friccionar o swab na palma da mão e entre os dedos iniciando pelo dedo mínimo e terminado no polegar na forma de “zigue-zague”;

 Transferir cada swab para um tubo de ensaio contendo 10 mL de solução tampão;  A partir de cada swab, preparar diluições sucessivas em tubos com 9ml de diluente

(solução tampão) obtendo as seguintes diluições: 1/101 , 1/102, 1/103.

 Pipetar assepticamente alíquota de 1ml de cada diluição para placas de Petri esterilizadas

 Adicionar, a cada placa, 15-20mL de ágar padrão para contagem, previamente fundido e resfriado à temperatura de 44-46oC;

 Homogeneizar com movimentos suaves, em forma de oito, sucessivamente por duas vezes, e deixar à temperatura ambiente até completa solidificação do ágar;

 Após solidificação, incubar as placas em posição invertida a 35- 37o

C por 48 horas.

RESULTADO: Transcorrido o tempo de incubação, considerar para contagem as placas de mesma diluição que apresentarem de 30 a 300 colônias, multiplicar a média aritmética das contagens pelo respectivo fator de diluição e expressar o resultado em Unidades Formadoras de Colônias/mão (UFC/mão) ou Unidades Formadoras de Colônias /cm2 de superfície (UFC/cm2).

PRÁTICA N



6: ISOLAMENTO DE MICRORGAISMOS

OBJETIVOS:

 Iso lar micro rganismo s t ais co mo : bact érias, fungo s filament o so s e leveduras de ambient es diverso s

 Ident ificar mo rfo lo gicament e as espécies iso ladas

INTRODUÇÃO:

Os micro rganismo s em seus ambient es nat urais ( água, so lo , ar et c) exist em co mo uma po pulação mist a. Para que po ssamo s est udar uma det erminada espécie de micro rganismo nas suas caract eríst icas mo rfo ló gicas e bio químicas individuais é necessário separá -la das diversas espécies co nt idas nessa po pulação , o bt endo uma cult ura pura e é fo rmada po r micro rganismso derivado s de uma única célula o riginal.

O iso lament o de micro rganismo s requer t écnicas adequadas de ino culação dest es micro rganismo s em meio s de cult ura adequado s que po ssibilit em o seu rápido cre sciment o , livre de co nt aminaçõ es.

Para o cult ivo , em co ndiçõ es labo rat o riais, de micro rganismo s é necessário o co nheciment o de suas exigências nut rit ivas e das co ndiçõ es físicas requeridas. Ext ensas pesquisas det erminaram exigências nut rit ivas de muit as espécies de micro rganismo s e est a info rmação result o u no desenvo lviment o de numero so s meio s de cult ura. Po r causa da grande variedade das necessidades nut rit ivas do s micro rganismo s há, t ambém, grandes diferenças na co mpo sição do s meio s ut ilizado s. Do mesmo mo do , exist em amplas variaçõ es no que se refere ao ambient e físico que favo rece seu cresciment o . Alguns micro rganismo s, po r exemplo crescem abaixo de 0C; o ut ro s exigem t emperat ura acima de 45C e po dem desenvo lver -se at é mesmo a 70C. cert as bact érias necessit am do o xigênio at mo sférico ; o ut ras são indiferent es o u inibidas pelo o xigênio .

MÉT ODOS DE ISOLAMENT O DE CULT URAS PURAS

 Técnica de sementeira em superfície e de esgotamento do inóculo:

- Co m o uso de uma alça de plat ina, co lo ca -se uma po rção de espécime na superfície de um meio de cult ura co m ágar.

- Espalhar a amo st ra de lado a lado , na superfície da placa , t racando linhas de aco rdo co m as figuras 1 e 2 , de mo do que as bact érias individuais se separem umas das o ut ras.

- Incubar as placas na t emperat ura adequada

- Examinar as placas que apresent arem co lô nias iso ladas

- Selecio nar uma co lô nia caract eríst ica da espécie est udada e ano t ar seus aspect o s macro scó pico s, t ais co mo : t amanho , fo rma, co nsist ência, co r da co lô nia e de s eu reverso , se há pigment o so lúvel et c.

- Transferir co m a ajuda de uma alça de plat ina, mat erial da co lô nia esco lhida para um t ubo co nt endo meio inclinado e incubar à t emperat ura e t empo adequado s.

- Examinar as caract eríst icas do micro ganismo at ravés de observações microscópicas “in vivo” e “in vitro” com colorações específicas ut ilizando para isso um micro scó pio ó t ico lumino so .

Técnica da placa derramada (pour -plate): O princípio da t écnica é o da diluição do mat erial em t ubo s de agar liquefeit o .

- Transfere-se uma alça de plat ina da suspensão o riginal para o t ubo A (agar fundido ). O t ubo é ro lado ent re as mão s, permit indo a mist ura co mplet a do inó culo co m o meio . Transferências similares são efet uadas do t ubo A para o B e, dest e, para o C.

- Os co nt eúdo s de cada t ubo são derramado s em placas separada - Incubar as placas na t emperat ura e perío do de t empo adequado s - Examinar as placas que apresent arem co lô nias iso ladas

- Selecio nar uma co lô nia caract eríst ica da espécie est udada e ano t ar seus aspect o s macro scó pico s, t ais co mo : t amanho , fo rma,

co nsist ência, co r da co lô nia e de seu reverso , se há pigment o so lúvel et c.

- Transferir co m a ajuda de uma alça de plat ina, mat erial da co lô nia esco lhida para um t ubo co nt endo meio inclinado e incubar à t emperat ura e t empo adequado s.

- Examinar as caract eríst icas do micro ganismo at ravés de observações microscópicas “in vivo” e “in vitro” com colorações específicas ut ilizando para isso um micro scó pio ó t ico lumino so .

3- Técnica das diluições sucessivas: se o micro rganismo suspeit o , numa po pulação mist a, est á present e em número maio r do que o ut ro s germes ele po de ser o bt ido em cu lt ura pura po r meio de uma série de diluiçõ es em meio s apro priado s.

- Transfere-se 1ml o u 1g do mat erial a ser examinado para um frasco de Erlenmeyer co nt endo 99ml de água est éril. Ho mo gen eiza-se permit indo a mist ura co mplet a do inó culo co m a água. A part ir daí, t ransfere-se 1ml para um t ubo co m 9ml de água est éril, agit a -se e repet e a o peração para o s t ubo s rest ant es, o bt endo -se assim uma série de diluiçõ es decimais. De cada t ubo t ransferir para duas placas est éreis, amo st ra de 1ml, depo is adicio nar a cada placa cerca de 15 ml de meio fundido e resfriado a 45oC. Apó s est e pro cediment o incubar as placas na t emperat ur a e perío do de t empo adequado s e ent ão e xaminar as placas que apresent arem co lô nias iso ladas.

Maio res det alhes so bre est a t écnica est ão no esquema apresent ado na Figura 19 .

FIGURA 19 - Esquema de diluição da t écnica das diluiçõ es sucessivas. Visando facilit ar o ent endiment o e t reinar o aluno s nas t écnicas de iso lament o acima referidas, fo ram selecio nadas de algumas t écnicas so bre bact érias, bo lo res e leveduras. Est as t écnicas deveram ser

realizadas em grupo de t rês aluno s e realizadas num perío do de 1 a 2 semanas.

ISOLAMENTO DE Streptomyces sp. DO SOLO

M ATERIAL

Amo st ra de t erra seca

Erlenmeyer co m 99 ml de á gua est éril

4 t ubo s de ensaio co nt endo cada um 9 ml de água est éril 1 balão co m meio de Czapeck (CZ)

Placas de Pet ri est erilizadas Tubo s de ensaio co m meio Cz Placa co m meio AVP

TÉCNICA

1o DIA - Pesar um grama de t erra e suspender no Erlenmeyer que co nt ém água est éril. Agit ar para o bt er uma suspensão do s micro rganismo s exist ent es.

Transferir co m pipet a est éril, 1 ml da suspensão para um do s t ubo s de água est éril; agit ar bem e dest e t ubo ret irar 1ml e t ransferir para o ut ro t ubo co m água e assim sucessiva ment e sendo realizada uma série de diluiçõ es 10- 2, 10- 3, 10- 4,10- 5,10- 6. De cada t ubo t ransferir para duas placas est éreis, amo st ra de 1ml, depo is adicio nar a cada placa cerca de 15 ml de meio de CZ fundido e resfriado a 45oC.

Agit ar para ho mo genizar. Esperar o meio so lidificar em repo uso po r mais o u meno s 3 minut o s, invert er as placas e incubar à t emperat ura ambient e durant e 5 a 7 dias.

2o DIA - Observar as co lô nias que cresceram e esco lher co lô nias t ípicas de Streptom yces: pequenas, secas, de co res variadas. Na esco lha da co lô nia devem ser ano t ado s aspect o s macro scó pico s, t ais co mo : t amanho , co r, fo rma, bo rdo s, caract eríst icas da superfície da co lô nia, brilho , presença de pigment o so lúvel. Transferir co m alça de plat ina part e da co lô nia para um t ubo co m CZ e para uma placa co m meio de CZ e para uma placa co m AVP, fazendo nest a últ ima uma est ria no cent ro co m auxílio de uma alça em L. Incubar.

3o DIA - Observar o cresciment o no t ubo de cult ura. Test ar a at ividade ant i-micro biana da cepa ut ilizando a placa de AVP que apresent a uma est ria cent ral; ino cular diferent es germes (bact érias, leveduras) fazendo est rias perpendiculares à est ria cent ral, co meçando a 30 mm da est ria cent ral e t erminando junt o à mesma. Fazer placas t est emunha s ino culando apenas as est rias de micro rganismo s -t est es. Incubar as placas a 30oC o u 37oC dependendo da t emperat ura do s micro rganismo s -t est es. 4o DIA - Observar se ho uver inibição e medir (o halo co rrespo ndent e) a

dist ância em milímet ro s do cresciment o do micro rganismo -t es-t e a-t é a es-t ria de S-trep-tomyces.

ISOLAMENTO DE BACILOS ESPORULADOS DO SOLO

M ATERIAL

Amo st ra de t erra seca

1 Erlenmeyer co m 99 ml de água est éril

1 t ubo s de ensaio co nt endo 10ml de caldo glico sado 4 t ubo s de ensaio co nt endo cada um 9 ml de água est éril 1 balão co m meio de Agar Nut rit ivo (AN)

Placas de Pet ri est erilizadas Tubo s de ensaio co m meio AN TÉCNICA

1o DIA - Pesar um grama de t erra e suspender no erlenmeyer que co nt ém água est éril. Agit ar para o bt er uma suspensão do s micro rganismo s exist ent es.

Transferir co m pipet a est éril, 1 ml da suspensão para um t ubo de caldo glico sado . Imergir o t ubo em água fervent e pelo espaço de t empo de 5 minut o s. Resfriar e t ransferir 1 ml do caldo para um t ubo co m 9ml de água est éril, agit ar para ho mo genizar e repet ir a o peração para mais 3 t ubo s. Obt ém -se assim uma série de diluiçõ es decimais 10- 4,10- 5,10- 6. De cada diluição t ransferir para duas placas est éreis, amo st ra de 1ml, depo is adicio nar a cada placa cerca de 15 ml de meio de AN fundido e resfriado a 45oC.

Agit ar para ho mo genizar. Esperar o meio so lidificar em repo uso po r mais o u meno s 3 minut o s, invert er as placas e incubar à t emperat ura ambient e durant e 48 ho ras.

2o DIA - Observar as co lô nias que cresceram e esco l her co lô nias t ípicas de bacilo s espo rulado s: grandes, co m bo rdo s irregulares, de superfície rugo sa. Na enco lha da co lô nia devem ser ano t ado s aspect o s macro scó pico s, t ais co mo : t amanho , co r, fo rma, bo rdo s, brilho , presença de pigment o so lúvel. Transferir co m alça de plat ina part e da co lô nia para um t ubo co m AN e incubar à t emperat ura ambient e.

3o DIA - Observar o cresciment o no t ubo de cult ura em AN. Fazer lâmina “ In vivo ” para o bservar se há mo viment o . Realizar uma co lo ração de Gram e uma de espo ro s.

ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS MESOFÍLICAS DE ÁGUA

M ATERIAL

Amo st ra de água po luída

1 Erlenmeyer co m 99 ml de água est éril

4 t ubo s de ensaio co nt endo cada um 9 ml de água est éril 1 balão co m meio de Agar Nut rit ivo (AN)

Placas de Pet ri est erilizadas Tubo s de ensaio co m meio AN

TÉCNICA

1o DIA - Pesar 1 mL da amo st ra e suspender no Erlenmeyer que co nt ém 99mL de água est éril. Agit ar para o bt er uma suspensão do s micro rganismo s exist ent es.

Transferir co m pipet a est éril, 1 ml da suspensão para um do s t ubo s de água est éril; agit ar bem e dest e t ubo ret irar 1ml e t ransferir para o ut ro t ubo co m água e assim sucessivament e sendo realizada uma série de diluiçõ es 10- 3, 10- 4,10- 5,10- 6. De cada diluição t ransferir para duas placas est éreis, amo st ra de 1ml, depo is a dicio nar a cada placa cerca de 15 ml de meio de AN fundido e resfriado a 45oC.

Agit ar para ho mo genizar. Esperar o meio so lidificar em repo uso po r mais o u meno s 3 minut o s, invert er as placas e incubar à t emperat ura ambient e durant e 48 ho ras.

2o DIA - Observar as co lô nias que cresceram e esco lher co lô nias t ípicas de bact érias. Na esco lha da co lô nia devem ser ano t ado s aspect o s macro scó pico s, t ais co mo : t amanho , co r, fo rma, bo rdo s, co nsist ência, caract eríst icas da superfície da co lô nia brilho , presença de pigment o so lúvel. Transferir co m alça de plat ina part e da co lô nia para um t ubo co m AN e incubar à t emperat ura ambient e.

3o DIA - Observar o cresciment o no t ubo de cult ura em AN. Fazer lâmina ïn vivo” para observar se há movimento . Realizar uma co lo ração de Gram e uma de espo ro s.

OBSERVAÇÃO:

ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS MESOFÍLICAS DE

AMOSTRAS DE ALIMENTOS

M ATERIAL

Amo st ra de so rvet e, c arne mo ída, charque, pudim et c 1 Erlenmeyer co m 90 ml de água est éril

4 t ubo s de ensaio co nt endo cada um 9 ml de água est éril 1 balão co m meio de Agar Nut rit ivo (AN)

Placas de Pet ri est erilizadas Tubo s de ensaio co m meio AN

TÉCNICA

1o DIA - Pesar 10g o u pipet ar 10 mL da amo st ra e suspender no Erlenmeyer que co nt ém 90mL de água est éril. Agit ar para o bt er uma suspensão do s micro rganismo s exist ent es.

Transferir co m pipet a est éril, 1 ml da suspensão para um do s t ubo s de água est éril; agit ar bem e dest e t ubo ret irar 1ml e t ransferir para o ut ro t ubo co m água e assim sucessivament e sendo realizada uma série de diluiçõ es 10- 2,10- 3, 10- 4,10- 5,10- 6. De cada diluição t ransferir para duas placas est éreis, amo st ra de 1ml, depo is adicio nar a cada placa cerca de 15 ml de meio de AN fundido e resfriado a 45oC.

repo uso po r mais o u meno s 3 minut o s, invert er as placas e incubar à t emperat ura ambient e durant e 48 ho ras.

2o DIA - Observar as co lô nias que cre sceram e esco lher co lô nias t ípicas de bact érias. Na esco lha da co lô nia devem ser ano t ado s aspect o s macro scó pico s, t ais co mo : t amanho , co r, fo rma, bo rdo s, co nsist ência, caract eríst icas da superfície da co lô nia brilho , presença de pigment o so lúvel. Transfer ir co m alça de plat ina part e da co lô nia para um t ubo co m AN e incubar à t emperat ura ambient e.

3o DIA - Observar o cresciment o no t ubo de cult ura em AN. Fazer lâmina ïn vivo” para observar se há movimento. Realizar uma co lo ração de Gram e uma de espo ro s .

OBSERVAÇÃO:

ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS COLIFORMES

M ATERIAL

Amo st ra de água de banheiro , o u pedaço de queijo co alho o u carne de so l;

Tubo s co m meio de verde -brilhant e-lact o se-bile (VB) Tubo s de ensaio co nt endo caldo lact o sado

1 balão co m meio de Agar Nut rit ivo (AN)

Placas de Pet ri co m meio s diferenciais (EMB o u Endo o uTTC) Tubo s de ensaio co m meio AN

TÉCNICA

1o DIA - Ino cular o t ubo de Verde -brilhant e co m o mat erial a ser pesquisado , incubar a 35oC po r 48 ho ras.

2o DIA - Ino cular o t ubo ferment ado em placas de Pet ri co m meio diferencial seguindo um do s esquemas abaixo .

3o DIA - Observar as co lô nias que cresceram e esco lher co lô nias t ípicas de co lifo rmes. Na esco lha da co lô nia devem ser ano t ado s aspect o s macro scó pico s, t ais co mo : t amanho , co r, fo rma, bo rdo s, co nsist ência, brilho , presença de pigment o so lúvel. Transferir co m alça de plat ina part e da co lô nia para um t ubo co m AN e para um t ubo co m caldo lact o sado (CL) incubar à 35oC.

4o DIA - Observar se o t ubo de caldo lact o sado ferment o u e ent ão se o t ubo t iver dado result ado po sit ivo (presença de bo lha de ar) pro sseguir a análise co m o t ubo de cult ura co m o meio de agar -nut rit ivo (AN). Realizar uma co lo ração de Gram e uma de espo ro s. Ano t ar o s result ado s e co mparar co m a lit erat ura.

OBSERVAÇÃO:

ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DO IOGURTE

MATERIAL

Uma amo st ra de Io gurt e nat ural

Placa de Pet ri co m meio de Agar -glico se-levedura (GL) Tubo s de ensaio co m meio de leit e desengo rdurado

Tubo s de ensaio co m meio de A gar -glico se-levedura (GL)

TÉCNICA

1o DIA - Fundir e resfriar o meio de cult ura; em seguida dist ribuir em placas de Pet ri. Quando o meio so lidificar fazer est rias co m o mat erial pesquisado na superfície de cada uma das placas. Cada aluno deverá realiza r a t écnica de esgo t ament o ut ilizando apenas uma placa, segundo o desenho abaixo :

o u ent ão , co m uma alça em L fazer est rias paralelas a part ir da go t a depo sit ada na primeira placa e co nt inuando em mais duas placas do mesmo meio , segundo o esquema abaixo :

Agit ar para ho mo genizar. Esperar o meio so lidificar em repo uso po r mais o u meno s 3 minut o s, invert er as placas e incubar em co ndiçõ es anaeró bicas o u so b t ensão de CO2 (po r exemplo , ut ilizando uma lat a cuidado sament e no fundo da lat a e a seguir fechar bem, po r um perío do de 48 a 72 ho ras.

2o DIA - Observar as co lô nias que cresceram e esco lher co lô nias dist int as.

Na esco lha da co lô nia devem ser ano t ado s aspect o s macro scó pico s, t ais co mo : t amanho , co r, fo rma, bo rdo s , co nsist ência, brilho , presença de pigment o so lúvel. Transferir co m alça de plat ina part e da co lô nia para um t ubo co m meio de GL e para um t ubo co m meio de leit e (o qual po de co nt er um co rant e indicado r). Incubar.

3o DIA - Observar o se há co agulação no t ubo co m meio de leit e.

Verificar se há cresciment o no t ubo de GL e realizar uma co lo ração de Gram. Incubar. Co mparar co m o s dado s o bt ido s na prát ica co m o s fo rnecido s pela lit erat ura.

OBSERVAÇÃO:

ISOLAMENTO DE BOLORES DO SOLO

MATERIAL

Uma amo st ra de t erra seca

Um Erlenmeyer co m 99 ml de água est éril 4 t ubo s co m 9 ml de água est éril

Um balão co m meio de Czapeck (CZ) fundido 8 placas de Pet ri est éreis

4 t ubo s e quat ro placas co m meio de Czapeck

TÉCNICA

1o DIA - Pesar um grama de t erra e suspender no Erlenmeyer que co nt ém água est éril. Agit ar para o bt er uma suspensão do s micro rganismo s exist ent es.

Transferir co m pipet a est éril, 1 ml da suspensão para um do s t ubo s de água est éril; agit ar bem e dest e t ubo ret irar 1ml e t ransferir para o ut ro t ubo co m água e assim sucessivament e sendo realizada uma série de diluiçõ es 10- 2, 10- 3, 10- 4,10- 5,10- 6. De cada t ubo t ransferir para duas placas est éreis, amo st ra de 1ml, depo is adicio nar a cada placa cerca de 15 ml de meio de CZ fundido e resfriado a 45oC.

Agit ar para ho mo genizar e incubar à t emperat ura ambient e durant e 5 a 7 dias.

2o DIA - ( 5 a 7 dias depo is) Observar as co lô nias que cresceram e esco lher co lô nias t ípicas de bo lo res: filament o sas, grandes, de co res variadas.

macro scó pico s, t ais co mo : t amanho , co r, fo rma, bo rdo s, co nsist ência, brilho , presença de pigment o so lúvel. Transferir co m alça de plat ina part e da co lô nia para um t ubo co m CZ e para uma placa co m meio de CZ. Incubar.

3o DIA - Observar o cresciment o da co lô nia gigant e na placa e a part ir da cult ura crescida no t ubo , preparar um cult ivo em câmara úmida. Incubar

4o DIA - Observar a lâmina ao micro scó pio para det erminar t ipo s de hifas, t ipo de espo ro s assexuado s, e se po ssível a classe e o gênero do fungo em est udo

OBSERVAÇÃO:

ISOLAMENTO DE BOLORES DO MATERIAL MOFADO

MATERIAL

Uma amo st ra de pão , queijo , frut a o u o ut ro mat erial mo fado

Placa de Pet ri co m meio de Czapeck (CZ) e Bat at a -glico se-agar (BGA) Tubo s de ensaio co m meio de CZ e BGA

1o DIA - Fundir e resfriar o s meio s de BGA e CZ; em seguida acidificar co m ácido lát ico a pH 3,5. Dist ribuir em placas de Pet ri. Esperar so lidificar. Co m o auxílio de uma alça em agulha incubar mat erial mo fado no cent ro de cada um do s meio s co nt ido s em placas. Incubar à t emperat ura ambient e d urant e 5 dias.

2o DIA - ( 5 a 7 dias depo is) Observar as co lô nias que cresceram e esco lher co lô nias t ípicas de bo lo res: filament o sas, grandes, de co res variadas.

Na enco lha da co lô nia devem ser ano t ado s aspect o s macro scó pico s, t ais co mo : t amanho , co r , fo rma, bo rdo s, co nsist ência, brilho , presença de pigment o so lúvel. Transferir co m alça de plat ina part e da co lô nia para um t ubo co m CZ e para uma placa co m meio de CZ. Incubar.

3o DIA - Observar o cresciment o da co lô nia gigant e na placa e a part ir da cult ura crescida no t ubo , preparar um cult ivo em câmara úmida. Incubar

4o DIA - Observar a lâmina ao micro scó pio para det erminar t ipo s de hifas, t ipo de espo ro s assexuado s, e se po ssível a classe e o gênero do fungo em est udo

OBSERVAÇÃO:

ISOLAMENTO DE FUNGOS DO AÇÚCAR CRISTAL

MATERIAL

Açúcar crist al

Erlenmeyer co m 99 ml de água est éril

Balão co m bat at a -glico se-agar (BGA) acidificado a pH 3,5 Balão co m meio de Czapeck (CZ)

Placas de Pet ri est éreis

Tubo s de ensaio co m BGA e CZ

TÉCNICA

1o DIA - Pesar 11g de açúcar e t ransferir para o Erlenmeyer co m água est éril, agit ando bem para disso lver.

Transferir po rçõ es de 1 e 2 ml para placas de Pet ri.

Os meio s de c ult ura CZ e BGA devem ser fundido s, refriado s a 45oC e em seguida acidificado s co m ácido lát ico a pH 3,5. Adicio nar o s meio s de cult ura às placas. Deixar esfriar para so lidificar (2 a 3minut o s) e incubar à t emperat ura ambient e durant e 5 a 7 dias.

2o DIA - (5 a 7 dias depo is) Observar as co lô nias que cresceram e

esco lher co lô nias t ípicas de bo lo res: filament o sas, grandes, de co res variadas.

Na enco lha da co lô nia devem ser ano t ado s aspect o s macro scó pico s, t ais co mo : t amanho , co r, fo rma, bo rdo s, co nsist ência, brilho , presença de pigment o so lúvel. Transferir co m alça de plat ina part e da co lô nia para um t ubo co m CZ e para uma placa co m meio de CZ. Incubar.

3o DIA - Observar o cresciment o da co lô nia gigant e na placa e a part ir da cult ura crescida no t ubo , preparar um cult ivo em câmara úmida. Incubar

4o DIA - Observar a lâmina ao micro scó pio para det erminar t ipo s de hifas, t ipo de espo ro s assexuado s, e se po ssível a classe e o gênero do fungo em est udo .

OBSERVAÇÃO:

ISOLAMENTO DE LEVEDURAS DE FRUTA

MATERIAL

Frut a (uva, maçã, abacaxi, mamão , cajá et c.) Erlenmeyer co m 50 ml de caldo glico sado (CG) Meio de glico se -agar (GA)

Ácido lát ico

Placas de Pet ri est éreis Tubo s de ensaio est éreis

Tubo s de ensaio para ferment ação co m caldo glico sado

TÉCNICA

1o DIA - Acidificar o caldo glico sado co m ácido lát ico a pH 3,5.

Co rt ar a frut a co m casca e macerar co m ajuda de uma faca. Tranferir para o Erlenmeyer co m o meio acidificado , agit ar e incubar à t emperat ura ambient e, durant e 48 a 72 ho ras.

2o DIA - Adicio nar o meio s de cult ura às placas. Deixar esfriar em repo uso para so lidificar. Co m uma alça de plat ina, depo sit ar uma go t a do caldo na superfície do meio co nt ido na placa de Pet ri e fazer est rias po r esgo t ament o seguindo o esquema abaixo :

o u ent ão , co m uma alça em L fazer est rias paralelas a part ir da go t a depo sit ada na primeira placa e co nt inuando em mais duas placas do mesmo meio , segundo o esquema a seguir:

Incubar à t emperat ura ambient e po r 48 ho ras.

3o DIA - Observar as co lô nias que cresceram e esco lher co lô nias t ípicas de leveduras.

Na enco lha da co lô nia devem ser ano t ado s aspect o s macr o scó pico s, t ais co mo : t amanho , co r, fo rma, bo rdo s, co nsist ência, brilho , presença de pigment o so lúvel. Transferir co m alça de plat ina part e da co lô nia para um t ubo co m GA e para um t ubo co m meio de CG. Incubar.

4o DIA - Analisar o cresciment o no t ubo co m caldo glico sado e o bservar se a levedura é ferment at iva. Realizar uma observação “in vivo” e com coloração simples. Anotar os aspect o s micro scó pico s do micro rganismo em est udo , t ais co mo : t ipo de repro dução (fissão , gemulação , espo rulação ), presença de grânulo s, de vacúo lo s.

OBSERVAÇÃO:

ISOLAMENTO DE LEVEDURAS DE CALDO -DE-CANA

MATERIAL

Caldo de cana ferment ado (24ho ras) Meio de glico se -agar (GA)

4 Placas d e Pet ri est éreis Tubo s de ensaio est éreis

Tubo s de ensaio para ferment ação co m caldo glico sado

TÉCNICA

1o DIA - Adicio nar o meio s de cult ura às placas. Deixar esfriar em repo uso para so lidificar. Co m uma alça de plat ina, depo sit ar uma go t a do caldo na superfície do meio co nt ido na placa de Pet ri e fazer est rias po r esgo t ament o seguindo um do s esquemas abaixo :

2o DIA - Observar as co lô nias que cresceram e esco lher c o lô nias t ípicas de leveduras.

Na enco lha da co lô nia devem ser ano t ado s aspect o s macro scó pico s, t ais co mo : t amanho , co r, fo rma, bo rdo s, co nsist ência, brilho , presença de pigment o so lúvel. Transferir co m alça de plat ina part e da co lô nia para um t ubo co m GA e para um t ubo co m meio de CG. Incubar.

3o DIA - Analisar o cresciment o no t ubo co m caldo glico sado e o bservar se a levedura é ferment at iva. Realizar uma observação “in vivo” e com coloração simples. Anotar os aspect o s micro scó pico s do micro rganismo em est udo , t ais co mo : t ipo de repro dução (fissão , gemulação , espo rulação ), presença de grânulo s, de vacúo lo s.

OBSERVAÇÃO:

PRÁTICA N



7: MICROSCÓPIOS

 Dist inguir o s diverso s co mpo nent es de um micro scó pio ó t ico co mpo st o

 Fo calizar “in vivo ”: células de leveduras em suspensão , micro rganismo s (algas, pro t o zo ário s e bact érias mó veis em água)

COMPONENT ES DE UM MICROSCÓPIO ÓT ICO COM POST O:

1 = lente ocular

2 = lentes objetivas e revólver 3 = platina 4 = charriot 5 = parafuso macrométrico 6 = parafuso micrométrico 7 = diafragma no condensador 8 = condensador 9 = botão do condensador 10 = dois parafusos centralizadores do condensador 11 = fonte de luz 12 = controle de iluminação 13 = diafragma de campo (alavanca no lado esquerdo do microscópio)

14 = dois parafusos de ajuste da lâmpada (esquerdo e direito) 15 = focalizadora da lâmpada (alavanca no lado direito do microscópio - não visível na fotografia)

FIGURA 20: Microscópio óptico composto