Proteômica PG Havt

Proteômica

Uma nova abordagem de pesquisa

Dr. Bruno Anderson Matias da Rocha

Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular

Universidade Federal do Ceará

Introdução

 PROTEins expressed by genOME

 1994: Siena 2-D Electrophoresis meeting.  1997: Publicações(Sciense e Nature).

 Projeto Genoma Humano

 Complexidade dos processos biológicos.  Replicação/Transcrição/Tradução.

 Tecnologia Proteômica

 2-DE

 Espectrometria de Massa  Bioinformática

Eletroforese Bidimensional

Mapeamento Protéico

 Histórico

 Tiselius (50 Anos)

 Separação de Proteínas Séricas (Smithies e Poulik, 1967)  O´Farrel (1975)

 1ª Dimensão: Ponto Isoelétrico

 Focalização Isoelétrica

 Anfólitos Carreadores

 Gradiente de pH imobilizados

 2ª Dimensão: Massa Molecular

Conceitos básicos- eletroforese

Refere-se a migração de moléculas carregadas sob a ação de um campo elétrico,

 Trabalho pioneiro de Arne Tiselius (1937).

 Prêmio Nobel de 1948,

 Normalmente utiliza-se a

poliacrilamida como suporte para o estudo de proteínas.

Preparo da Amostra - Coleta

 Extração



Vegetal

Animal



Tecidual ou celular (sub-celular)

 Amostras de mamíferos



Biópsia

Preparo da Amostra - Preservação

 Refrigeração (-80°C, -20°C, 4°C, 8°C e 20 °C)

Nitrogênio líquido

Isopentano

 Tamponamento (PBS)

 Prevenção de proteólise

Inibidores de Proteases

Preparo da Amostra - Extração

 Sensibilidade térmica

 Processos de extração

 Ação de Hidrolases

 Heterogeneidade

 Proteínas de Membranas

Preparo da Amostra – Lise Celular

 Maceração

 Congelamento

 Soluções hiperosmóticas

 Choque térmico

 Sonicação

 Ultracentrifugação

 Detergentes

Revelação

 Commassie

Coomassie Blue

Coomassie R250

Colloidal Coomassie

 Prata

 Fluorescentes

Cy Dyes

Sypro Ruby

SDS-PAGE

Redução Alquilação

Digestões Enzimáticas

 Gel ou solução

 Descoloração e lavagem

 Redução (DTT) e Alquilação (Iodoacetamida)

 Enzimas

 Tripsina: K e R

 Quimotripsina: Y, F e W  Termolisina: L e F

 Lys-C, Glu-C, Asp-N, SV8

Seqüênciamento de De novo de

Proteínas

800 1200 1600 2000 2400 28000 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1494.77 1656.99 1332.43 1819.15 1476.66 1639.47 1170.50 1981.53 1801.56 1314.18 1007.60 1152.83 1963.74 990.03

Espectrometria de Massas

J. J. Thomson (1856 - 1940) Cambridge University

Cambridge, Great Britain

Desenvolveu o primeiro espectrômetro de massas.

Thomson realizou os primeiros experimentos que

permitiram uma melhor compreensão sobre a estrutura dos átomos. Seu primeiro modelo de “espectrômetro de massas” fez uso de tubos sob vácuo parcial, denominados de “tubos de raios catódicos”, com os quais mediu a

deflexão de um feixe de elétrons (produzidos através de descargas elétricas) em um campo magnético, tendo determinado a razão massa/carga (m/z) de um elétron.

MALDI – Matrix-assisted laser

desorption/ionization

EM-MALDI-TOF

São produzidos íons monocarregados (z=1), que resultam em espectros mais simples e limpos, ótimo para análises de amostras puras

Não apresenta limitação quanto ao peso molecular capaz de determinar

Tolerância a presença de sais na ordem de mM.

EM-ESI-Q

São produzidos íons multicarregados

(z=1,2,3....n). O número de íons produzidos depende da quantidade de grupamentos

ionizáveis da molécula. Para um composto puro, são observados vários picos com massas

diferentes que correspondem a mesma molécula, o que torna difícil o uso da técnica para amostras complexas.

Permite a análise de íons de alto PM (m/z 6000), mas tem sua faixa limitada a 70kDa.

Interferencia pela preseça de sais

Fácil apadptação a técnicas separativas: LC, HPLC

Ionização mais suave permite análise (estrutural e cinética) de compostos estabilizados por uniões covalentes. Interações: proteína-proteína,

m/z Abu n d an cia re lativa % 800 1200 1600 2000 2400 2800 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1494.77 1656.99 1332.43 1819.15 1476.66 1639.47 1170.50 1981.53 1801.56 1314.18 1007.60 1152.83 1963.74 990.03 m/z Abu n d an cia re lativa % m/z Abu n d an cia re lativa % 800 1200 1600 2000 2400 2800 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1494.77 1656.99 1332.43 1819.15 1476.66 1639.47 1170.50 1981.53 1801.56 1314.18 1007.60 1152.83 1963.74 990.03 800 1200 1600 2000 2400 2800 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1494.77 1656.99 1332.43 1819.15 1476.66 1639.47 1170.50 1981.53 1801.56 1314.18 1007.60 1152.83 1963.74 990.03 [M-H] -[M+H₂O-H]

-MALDI

Métodos

livres de

gel

 ICAT

 SILAC

 iTRAQ

Modificações Pós-traducionais

 Bloqueio do N-terminal



Degradação de Edman

 Fosforilação, Glicosilações e formação de

pontes dissulfeto

 Serina e Treonina



Glicanos S e T ligados

Glicosilações Protéicas

Biochimica et Biophysica Acta xx (2005) xxx–xxx

881 1199 1517 1835 2153 2471 Mass (m/z) 0 2.8E+4 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % Int en sit y 1007.94 1258.34 1096.10 1420.45 933.79 1582.73 1744.86 1037.26 1500.61 1338.73 1176.42 1907.63 1217.08 1375.79 1663.62 1130.93 1517.31 1403.21 2029.96 1825.15 2395.24 2193.28 2068.31 2311.39 1975.80 1815.15 1977.8 2029.9 1968.6 2395.1 2069.3 8 X m/z Abun da ncia re la tiv a %

Análisis por EM-UV-MALDI-TOF no modo linear positivo de oligossacarídeos do

domínio C-terminal da cruzipaína,

COOH OH HO GA 2,5-Dihydroxybenzoic acid [M+Na]+

Análisis por EM-UV-MALDI-TOF en modo lineal negativo de los oligosacáridos liberados del dominio C-terminal de la cruzipaína

m/z A b u n d a n cia r elativ a % 800 1200 1600 2000 2400 28000 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1494.77 1656.99 1332.43 1819.15 1476.66 1639.47 1170.50 1981.53 1801.56 1314.18 1007.60 _1152.83 1963.74 990.03 m/z A b u n d a n cia r elativ a % m/z A b u n d a n cia r elativ a % 800 1200 1600 2000 2400 28000 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1494.77 1656.99 1332.43 1819.15 1476.66 1639.47 1170.50 1981.53 1801.56 1314.18 1007.60 _1152.83 1963.74 990.03 800 1200 1600 2000 2400 28000 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1494.77 1656.99 1332.43 1819.15 1476.66 1639.47 1170.50 1981.53 1801.56 1314.18 1007.60 _1152.83 1963.74 990.03 N H N nor-Ho nor-Harmane [M-H] -[M+H₂O-H]

-Análisis por EM-UV-MALDI-TOF no modo linear negativo de oligossacarídeos do

domínio C-terminal da cruzipaína,

Harman o

229-248

229-248 + PO4

íons repórter: íons que aparecem por CID ou PSD a partir de um

fosfopeptídeo e que são indícios que este peptídeo esta fosforilado.

Análise de sítios de fosforilação por fragmentação

Localização e quantificação de fosfoproteínas

ProQ-Diamond

Proteínas fosforiladas

Sypro Ruby Proteínas totais

Superposição de colorações para proteínas totais (Sypro Ruby,

vermelho)

fosfoproteínas (ProQ Diamond, azul)

glicoproteínas (proQ Emerald, verde)

Pontes dissulfeto

Problema

 Diagnóstico diferencial de duas doenças

inflamatórias (Bowel Disease)



Doença de Crohn

Colite ulcerativa

 Marcadores



Proteína C-reativa

iTRAQ

Proteômica do câncer

Representatividade e viabilidade de tumores

Análise diferencial da expressão

Seleção de Tumores

Câncer de Mama

A presença de receptores de progesterona (PR) em câncer de mama positivo para receptores de estrógeno está associada a um bom prognóstico e indica uma boa resposta dos tumores à tamoxifeno.

Tumores ER+/PR- respondem fracamente ao tratamento.

Tamoxifeno é

um Modulador Seletivo do Receptor de Estrógeno oral que é utilizado no tratamento do câncer de mama

Estudos proteômicos estão dedicados ao exame dos tipos mais primários de tumores humanos devido a elevada heterogeneidade.

Microdissecção e captura à laser foi utilizada para isolar células tumorais

Foi desenvolvida uma estratégia de analisar pequenas quantidades de lisados protéicos.

Células ER +

Câncer de Mama

A análise do padrão diferenciado de expressão de proteínas revela entre outros em tumores ER+/PR+ versus ER+/PR- :

Redução – citocromo b5 e transgelina

Aumento - CRABP-II, ciclofilina A, neudesina, e hemoglobina

Explicação para a suscetibilidade diferencial ao fármaco como um resultado da perda de regulação do metabolismo do citocromo b5. SELDI-TOF MS mostrou que um alto nível de ubiquitina citosólica e um baixo nível de cadeia leve da ferritina estão associados com o bom prognóstico no câncer de mama.

Conclusão

 A análise proteômica pode ser utilizada para

determinar o envolvimento de proteínas em

diversas patologias;

 Pode estabelecer candidatos protéicos como

biomarcadores de doenças;

 Permitir o desenvolvimento de métodos de

diagnóstico rápido e eficiente.

Obrigado

[email protected]

www.biomol-lab.org

investigate the several physiological adaptations induced by exercise stimuli

molecular mechanisms underlying metabolic pathways and muscular and

cardiovascular adaptation to exercise