UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA CURSO DE GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
Geovana Rosa
Avaliação imuno-histoquímica de p53, Ki-67 e CD105 em Adenoma pleomórfico e Carcinoma ex-adenoma pleomórfico
Florianópolis 2020
Geovana Rosa
Avaliação imuno-histoquímica de p53, Ki-67 e CD105 em Adenoma pleomórfico e Carcinoma ex-adenoma pleomórfico
Trabalho de Conclusão do Curso de Graduação em Odontologia do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Santa Catarina como requisito para a obtenção do título de Cirurgiã Dentista
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Elena Riet Correa Rivero Coorientadora:Prof.ª Dr.ª Angélica Reinheimer
Florianópolis 2020
Geovana Rosa
Avaliação imuno-histoquímica de p53, Ki-67 e CD105 em Adenoma pleomórfico e Carcinoma ex-adenoma pleomórfico
Este Trabalho Conclusão de Curso foi julgado adequado para obtenção do Título de “Cirurgiã-dentista” e aprovado em sua forma final pelo Curso de Graduação em Odontologia.
Florianópolis, 24 de julho de 2020.
________________________ Prof.ª Gláucia Santos Zimmermann, Dra.
Coordenadora do Curso
Banca Examinadora:
________________________ Prof.ª Elena Riet Correa Rivero, Dra.
Orientadora
Universidade Federal de Santa Catarina
________________________ Prof. Rogério de Oliveira Gondak, Dr.
Avaliador
Universidade Federal de Santa Catarina
________________________ Prof.ª Ana Guadalupe Gama Cuellar, Me.
Avaliadora
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, gostaria de agradecer a Deus, por me dar o dom da vida e saúde para que eu batalhasse durante esses cinco anos de graduação e corresse atrás dos meus sonhos. Sou grata por sua generosidade em colocar pessoas maravilhosas no meu caminho, que de uma maneira ou outra tornaram essa caminhada mais leve.
Aos meus pais, Dalva e Valmiré. Vocês não mediram esforços para que eu chegasse até aqui e são meu exemplo de amor e dedicação. Obrigada por tudo que fazem por mim. Essa conquista também é de vocês.
Aos meus irmãos, Géssica e Gerson. Obrigada por acreditarem em mim e me apoiarem sempre. Amo muito vocês!
Ao meu noivo, Murilo, agradeço por todo o companheirismo e por entender a minha ausência em alguns momentos. Você sempre me incentivou e consolou nas horas em que achei que não conseguiria. Obrigada por dividir a vida comigo. Amo você!
A minha orientadora, Elena Rivero, por aceitar o convite de me orientar e por todos os ensinamentos transmitidos. Desde o primeiro dia de aula que tive com você passei a admirar toda a sua dedicação e carinho com a profissão, o qual despertou o meu interesse em trabalhar com você. Muito obrigada!
A minha coorientadora, Angélica Reinheimer, por toda a paciência e incentivo e por compartilhar comigo todo o seu conhecimento. Você sempre me ajudou em todos os momentos que precisei e foi essencial para a realização deste trabalho. Quero que saibas que te admiro muito, és um exemplo de professora. Sou profundamente grata por ter tido a oportunidade de trabalhar com você.
A todos os meus colegas e amigos da turma 15.2, em especial à Gabriella, Gabriele,
Pedro, Rangel, Mariana e Guilherme. Sentirei muito a falta de vocês. Tenho certeza que
serão ótimos profissionais.
Ao Laboratório de Patologia bucal, por ter me acolhido nos últimos anos da graduação. Aprendi muito com os professores e alunos da pós-graduação. Em especial, a técnica
Gilmara. Lembrarei de você com muito carinho. Obrigada por me ensinar e por ouvir meus
desabafos e anseios.
A Universidade Federal de Santa Catarina, instituição que me formará cirurgiã-dentista, que me ensinou além de conhecimentos técnicos, o poder da empatia.
Por fim, a todos os servidores, demais professores e pacientes, que de alguma forma contribuíram para a minha formação.
RESUMO
As neoplasias de glândulas salivares (NGS) são lesões de difícil diagnóstico e de etiopatogênese incompletamente elucidada. Para auxiliar no entendimento dos processos envolvidos na progressão dessas neoplasias, aspectos moleculares precisam ser desvendados. Durante a progressão das neoplasias, alguns eventos são essenciais, como a proliferação celular e a angiogênese, e esses fatores podem ser avaliados através da análise da expressão das proteínas Ki-67 e CD105. Em conjunto com esses marcadores, a proteína supressora tumoral, p53, que se encontra superexpressa na maioria dos cânceres humanos pode ser um indicativo de agressividade tumoral. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar de forma quantitativa, a expressão imuno-histoquímica das proteínas p53, Ki-67 e CD105 em Adenoma pleomórfico (AP), Adenoma pleomórfico recidivado (APR) e Carcinoma ex-adenoma pleomórfico (CEAP). Para isso, foram utilizados 10 casos de AP, 05 de APR e 07 de CEAP. Como controle de tecido não neoplásico foram incluídas 06 amostras de glândula salivar normal (GN). Os resultados demonstraram que a expressão dos marcadores foi maior nos casos de CEAP quando comparado com as outras neoplasias e GN (p<0,05). A proteína p53 mostrou diferença significativa entre os grupos AP e CEAP (p=0,04) e CEAP e GN (p=0,01). A mesma tendência foi observada para Ki-67 e CD105 entre esses mesmos grupos (p<0,05). Concluiu-se que a análise da expressão dos marcadores p53, Ki-67 e CD105 pode ser útil para o entendimento do processo de progressão tumoral nas neoplasias avaliadas, uma vez que mostraram resultados discrepantes entre neoplasias benignas e malignas de glândulas salivares, o que pode sugerir que sejam utilizados como recursos auxiliares no diagnóstico dessas neoplasias.
Palavras-chave: Neoplasias de glândulas salivares. Imuno-histoquímica. Proteína supressora
ABSTRACT
Salivary gland neoplasms (NGS) are lesions that are difficult to diagnose and their etiopathogenesis has not been fully elucidated. In order to improve the understanding of carcinogenesis process involved in the progression of these neoplasms, molecular aspects need to be evaluated. During the progression of neoplasms, some events are essential, such as cell proliferation and angiogenesis, and these factors can be evaluated by analyzing the expression of the Ki-67 and CD105 proteins. In conjunction with these markers, the tumor suppressor protein, p53, which is overexpressed in most human cancers, can be indicative of tumor aggressiveness. Therefore, the aim of this study was to evaluate the immunohistochemical expression of p53, Ki-67 and CD105 proteins in pleomorphic adenoma (AP), recurrent pleomorphic adenoma (APR) and carcinoma ex-pleomorphic adenoma (CEAP). The sample was composed by 10 cases of AP, 05 of APR and 07 of CEAP. As a control of non-neoplastic tissue, 06 samples of normal salivary gland (NG) were included. The results showed that the expression of the markers was higher in the cases of CEAP when compared with the other neoplasms and GN (p<0.05). The p53 protein showed a significant difference between the AP and CEAP groups (p=0.04) and CEAP and GN (p=0.01). The same trend was observed for Ki-67 and CD105 between these same groups (p<0.05). It was concluded that the analysis of the expression of p53, Ki-67 and CD105 markers can be useful for understanding the process of tumor progression in the neoplasms evaluated, since they showed discrepant results between benign and malignant neoplasms of salivary glands, suggesting that they could be used as auxiliary resources in the diagnosis of these neoplasms.
Keywords: Salivary gland neoplasms. Immunohistochemistry. P53 tumor suppressor protein.
CD105 antigen. Ki-67 Antigen.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Expressão imuno-histoquímica de p53 nos grupos GN, AP, APR e CEAP...40 Figura 2 – Expressão imuno-histoquímica de Ki-67 nos grupos GN, AP, APR e CEAP...41 Figura 3 – Expressão imuno-histoquímica de CD105 nos grupos GN, AP, APR e CEAP...42 Figura 4 – Comparação entre a expressão dos anticorpos p53, Ki-67 e CD105 nos grupos avaliados...43
LISTA DE QUADROS
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Descrição dos anticorpos utilizados... 37 Tabela 2 – Dados clínicos das neoplasias estudadas...39 Tabela 3 – Porcentagem média de células marcadas para p53 e Ki-67 e média dos vasos positivos para CD105 nos grupos avaliados (GN, AP, APR, CEAP)...43
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ALK Quinase do tipo receptor de ativina AP Adenoma pleomórfico
APR Adenoma pleomórfico recidivado
ATPS Do inglês: “aminopropyltriethoxysilane” - aminossilano CAI Carcinoma amplamente invasivo
CD105 Proteína transmembranar expressa em células endoteliais CEAP Carcinoma ex-adenoma pleomórfico
CI Carcinoma intracapsular
CMI Carcinoma minimamente invasivo DAB Diaminobenzidina
DNA Ácido desoxirribonucleico GN Glândula salivar normal GP Glândula parótida HE Hematoxilina e eosina HU Hospital Universitário
Ki-67Proteína associada a proliferação celular LPB Laboratório de Patologia Bucal
MDM2 Do inglês: “Murine Doble Minute 2” NGS Neoplasia de glândulas salivares OMS Organização Mundial da Saúde
PBS Do inglês: “Phosphate buffer saline” - Tampão fosfato-salino p53 Proteína supressora de tumor
SAP Serviço de Anatomia Patológica
TGFβ Fator de crescimento transformador beta
Tp53 Gene responsável pela composição da proteína p53 UFSC Universidade Federal de Santa Catarina
LISTA DE SÍMBOLOS < Menor = Igual ± Desvio-padrão % Porcento ® Marca registrada ºC Grau Celsius β Beta H2O2 Peróxido de hidrogênio mm Milímetro µm Micrômetro mL Mililitro M Molar mM Milimolar pH Potencial hidrogeniônico
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 15
2 REVISÃO DE LITERATURA ... 17
2.1 ADENOMA PLEOMÓRFICO ... 20
2.2 CARCINOMA EX-ADENOMA PLEOMÓRFICO... 24
2.3 MARCADORES BIOLÓGICOS NAS NEOPLASIAS DE GLÂNDULAS SALIVARES ... 28 2.3.1 Proteína p53 ... 28 2.3.2 Proteína Ki-67 ... 30 2.3.3 Proteína CD105 ... 31 3 OBJETIVOS ... 34 3.1 OBJETIVO GERAL ... 34 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 34 4 METODOLOGIA ... 35 4.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO ... 35
4.2 ASPECTOS ÉTICOS E LEGAIS ... 35
4.3 SELEÇÃO DAS AMOSTRAS ... 35
4.4 LEVANTAMENTO DOS DADOS CLÍNICOS ... 36
4.5 PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS... 36
4.6 AVALIAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA ... 37
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 38
5 RESULTADOS ... 39
5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA... 39
5.2 ANÁLISE QUANTITATIVA DA IMUNOEXPRESSÃO DOS ANTICORPOS UTILIZADOS ... 40
5.2.1 P53 ... 40
5.2.2 Ki-67 ... 40
5.2.4 Correlação de Spearman ... 44
6 DISCUSSÃO ... 45
7 CONCLUSÃO ... 51
REFERÊNCIAS ... 52
APÊNDICE A – Dados clínicos complementares ... 62
ANEXO A – Ata de apresentação do Trabalho de Conclusão do Curso ... 63
1 INTRODUÇÃO
As neoplasias de glândulas salivares (NGS) são raras e representam menos de 1% de todos os tumores e cerca de 3% a 5% de todas as neoplasias de cabeça e pescoço com uma incidência de 1,2 e 1,3 casos para cada 100.000 habitantes (SAGHRAVANIAN; GHAZI; SABA, 2013; SPEIGHT; BARRETT, 2020). Diante de todos os tecidos do corpo humano, possivelmente as glândulas salivares originam um grupo histológico mais heterogêneo de neoplasias com diversas características morfológicas (BUSSARI et al., 2018).
O Adenoma pleomórfico (AP) é considerado a neoplasia benigna mais comum das glândulas salivares. Possui uma predileção pelo sexo feminino, é mais frequente entre a quarta e sexta década de vida e afeta principalmente a glândula parótida (GP) (OMISAKIN; AJIKE; AYUBA, 2017; PASSI et al., 2017). Apresenta uma alta diversidade histopatológica, com variabilidade estrutural e arquitetônica (QUEIROZ et al., 2014).
Alguns casos de AP tendem a recidivar, sendo considerados mais agressivos (TAKEDA, 1999). O aparecimento de recidivas pode estar associado a ressecção incompleta do AP, rompimento da pseudo-cápsula e presença de lesões satélites (ORITA et al., 2010; PASSI et al., 2017; STENNERT et al., 2004). Outros estudos também correlacionaram a idade do paciente, margem de ressecção, agressividade dos tumores e tipo de estroma mixoide em AP (MOUZALI et al., 2019; SUH et al., 2009).
Embora o Adenoma pleomórfico recidivado (APR) seja considerado uma neoplasia benigna, devido a sua agressividade está mais sujeito a transformação maligna e, portanto, se faz necessário um acompanhamento do paciente a longo prazo (LEVERSTEIN et al., 1997; PASSI et al., 2017). Quando ocorre transformação maligna, a neoplasia passa a ser chamada de Carcinoma ex-adenoma pleomórfico (CEAP). É definido como uma neoplasia epitelial /mioepitelial que se desenvolve a partir de um AP (EL-NAGGAR et al., 2017). Outros dois tumores mistos podem surgir a partir do AP: carcinossarcoma e AP metastático (LEWIS; OLSEN; SEBO, 2001).
Histologicamente, o CEAP deve apresentar um componente benigno e um componente maligno, ou seja, áreas de AP associado a um carcinoma/adenocarcinoma ou somente o carcinoma, porém com histórico de um AP prévio no local (LEWIS; OLSEN; SEBO, 2001; ZBÄREN et al., 2008). Com base na invasão da cápsula do AP, o carcinoma pode ser classificado como intracapsular (CI), minimamente invasivo (CMI) (<1,5mm) e amplamente
invasivo (CAI) (>1,5mm), sendo este último associado a um prognóstico ruim (YE et al., 2016). Metástases podem ocorrer e afetam os linfonodos, ossos e pulmões (MAG et al., 2010).
A patogênese do CEAP é controversa, pois os tumores podem ser malignos desde o princípio ou apenas ocorrer uma transformação carcinomatosa na neoplasia benigna (MARTÍNEZ-RODAS et al., 2016). Pesquisas recentes sugerem que a progressão do carcinoma ocorre por diferentes mutações gênicas (FAUR et al., 2015; TARAKJI; KUJAN; NASSANI, 2010). O índice de proliferação celular, a angiogênese associada a essas lesões e o potencial de agressividade tumoral, podem representar valiosas ferramentas na diferenciação entre AP, APR e CEAP, auxiliando dessa forma no diagnóstico dessas lesões.
A proteína supressora de tumor, p53, codificada pelo gene Tp53, está envolvida na regulação do ciclo celular. Este gene é muito suscetível a mutações, que fazem com que a p53 perca a sua atividade supressora tumoral (MATT; HOFMANN, 2016). Estudos tem correlacionado a expressão de p53 com a alteração na diferenciação celular, agressividade e progressão das NGS (ALVES et al., 2004; ELABD; MERONI; BLATTNER, 2016).
A atividade proliferativa das células, que acompanha o desenvolvimento das neoplasias pode ser estimada através da expressão nuclear de Ki-67. Essa proteína está presente em todas as fases ativas do ciclo celular (G2, S, G1 e mitose), mas está ausente nas células em repouso (G0) (SUZZI et al., 2005). A sua expressão indica que as células estão se multiplicando e isso é considerado mecanismo essencial na oncogênese (TADBIR et al., 2012). Estudos tem mostrado que a expressão de Ki-67 está relacionada a agressividade tumoral e pior prognóstico em neoplasias malignas de glândula salivar (BEN-IZHAK; AKRISH; NAGLER, 2008; LUUKKAA et al., 2006).
Outro biomarcador que é estudado no contexto da invasão e progressão tumoral é o CD105, expresso nas células endoteliais dos vasos sanguíneos, sendo, portanto, associado a angiogênese (DUFF et al., 2003). Um aumento da angiogênese, e consequentemente da expressão de CD105 tem sido observada em vários tipos de câncer, e tem sido considerado um indicador de prognóstico e relacionado a maior ocorrência de metástases (KYZAS; AGNANTIS; STEFANOU, 2006).
Afim de contribuir com o conhecimento relacionado a progressão do AP para CEAP, o objetivo desse estudo foi avaliar a expressão imuno-histoquímica das proteínas p53, Ki-67 e CD105 em AP, APR e CEAP, visto que, até o momento, são escassos os trabalhos que associam a expressão destes marcadores aos diferentes estágios que ocorrem no processo de malignização.
2 REVISÃO DE LITERATURA
As glândulas salivares são glândulas exócrinas que possuem a função de secretar saliva para o meio bucal. Podem ser classificadas em glândulas salivares maiores, que compreende a parótida, submandibular e sublingual, e glândulas salivares menores que correspondem às localizadas intraoralmente (WU et al., 2016). Cada glândula é formada por ácinos, que podem ser serosos, mucosos ou mistos, e ductos, intercalados, estriados e excretores (OMITOLA; IYOGUN, 2018).
As NGS podem ser classificadas como benignas, que tem como característica principal possuir um crescimento lento e indolor, ou malignas, as quais apresentam comportamento clínico variável, desde um comportamento indolente, a um crescimento rápido e agressivo, associado a uma baixa expectativa de vida (VASCONCELOS et al., 2015).
As NGS são raras, representam menos de 1% de todos os tumores e cerca de 3% a 5% de todas as neoplasias de cabeça e pescoço com uma incidência de 1,2 e 1,3 casos para cada 100.000 habitantes (SAGHRAVANIAN; GHAZI; SABA, 2013; SPEIGHT; BARRETT, 2020). Em ordem decrescente quanto ao local afetado, a GP é a mais acometida, em aproximadamente 70% dos casos, seguida de glândulas salivares menores (20%), glândula submandibular (10%) e glândula sublingual com menos de 1%. As neoplasias benignas são mais frequentes, correspondem 54% a 79% dos casos e afetam mais as glândulas parótidas e submandibulares. Já as malignas correspondem a 21% a 46% dos casos e a GP também é mais acometida (EVESON et al., 2005; SPEIGHT; BARRETT, 2020).
Lukšić et al. (2012) em uma análise retrospectiva realizada na Croácia com 779 pacientes tratados com NGS, verificaram que 64,2% das neoplasias eram benignas e 35,8% malignas. O local afetado mais comum foi a GP com 65,3%, seguida pelas glândulas salivares menores com 27,2% e pela glândula submandibular com 6,6%. Alguns estudos corroboram com esses resultados (ARAYA et al., 2015; DA CRUZ PEREZ et al., 2004) e embora sejam de países diferentes possuem muita semelhança entre si. Logo, sugerem que neoplasias benignas de glândulas salivares são mais frequentes do que neoplasias malignas em todo o mundo (ARAYA et al., 2015).
Uma grande variedade de neoplasias benignas e malignas pode se desenvolver em glândulas salivares, pois derivam-se de células acinares, ductais e mioepiteliais, resultando em tipos histológicos diversos, muitas vezes de histogênese incerta (LEIVO, 2006; MARUYA et al., 2004).
Ainda que controversa, a histogênese das NGS consiste em três possíveis teorias: Teoria de Célula-tronco reserva (stem-cell), Teoria Bicelular de células reservas semipluripotenciais e Teoria Multicelular, sendo que a primeira diz que apenas uma célula pluripotencial conseguiria dar origem a todas as neoplasias. A segunda em que apenas as células indiferenciadas dos ductos intercalados e células basais dos ductos excretores dariam origem e a terceira onde cada célula da estrutura túbulo-acinar daria origem a diversos tipos histológicos de neoplasia, sendo essa a teoria mais aceita atualmente (HENSON; ALBORRES-SAAVEDRA,2001).
Devido à grande variabilidade histológica, o diagnóstico das NGS representa um desafio, mesmo para os patologistas mais experientes (BUSSARI et al., 2018). A avaliação morfológica, através de coloração com hematoxilina e eosina (HE), nem sempre é o suficiente para determinar o diagnóstico correto. Normalmente faz-se uso da técnica auxiliar de imuno-histoquímica, que através da ligação antígeno-anticorpo, mostra-se mais específica na determinação da origem celular das neoplasias. Esta técnica é considerada simples, e com adequada sensibilidade, mesmo a níveis baixos de antígenos (JORDAN et al., 2002).
Em 2017, a Organização Mundial da Saúde (OMS) divulgou a nova classificação das NGS, que compreende mais de trinta tipos (EL-NAGGAR et al., 2017). No quadro 1 estão listadas as NGS benignas e malignas.
Quadro 1 - Classificação das neoplasias benignas e malignas conforme a OMS.
Neoplasias de Glândulas Salivares
Benignos Malignos
Adenoma pleomórfico Carcinoma mucoepidermoide Mioepitelioma Carcinoma adenoide cístico Adenoma de células basais Carcinoma de células acinares
Tumor de Warthin Adenocarcinoma polimorfo Oncocitoma Carcinoma de células claras Linfoadenoma Adenocarcinoma de células basais
Cistadenoma Carcinoma intraductal
Sialodenoma papilífero Adenocarcinoma, sem outras especificações
Papilomas ductais Carcinoma do ducto salivar
Adenoma sebáceo Carcinoma Mioepitelial
Adenoma canalicular e outros Adenomas ductais
Carcinoma epitelial-mioepitelial
- Carcinoma ex-adenoma pleomórfico
- Carcinoma secretor
- Adenocarcinoma sebáceo
- Carcinossarcoma
-
Carcinoma pouco diferenciado Carcinoma indiferenciado Carcinoma neuroendócrino de células
grandes
Carcinoma neuroendócrino de pequenas células
- Carcinoma linfoepitelial
- Carcinoma de células escamosas
- Carcinoma Oncocítico
- Potencial maligno incerto:
- Sialoblastoma
2.1 ADENOMA PLEOMÓRFICO
O AP é considerado a neoplasia benigna mais comum das glândulas salivares. Representa aproximadamente 60%-73% de todas as neoplasias que acometem as glândulas salivares (KAUL et al., 2017; PASSI et al., 2017). Através de um estudo retrospectivo realizado na China, que avaliou 7190 pacientes, foi possível identificar o AP sendo a neoplasia benigna mais comum, representando 65,79% dos casos. Sua incidência foi seguida pelo Tumor de Warthin, o qual corresponde 20,13% das neoplasias benignas encontradas (GAO et al., 2016). Esses achados são compatíveis com outros levantamentos publicados na literatura (DA CRUZ PEREZ et al., 2004; LUKŠIĆ et al., 2012).
O local mais afetado por essa neoplasia é a GP (84%), mais precisamente no lóbulo superficial. No entanto, glândulas submandibulares (8%), sublinguais (1%) e salivares menores (6,4%) também podem ser afetadas (OMISAKIN; AJIKE; AYUBA, 2017). Quando acomete as glândulas salivares menores a região mais frequente é na união do palato duro com o palato mole (devido à maior concentração de glândulas salivares), lábios, língua e mucosa jugal (GORDÓN-NÚÑEZ et al., 2008; QUEIROZ et al., 2014). Pode ser encontrado também em outras regiões da cavidade oral, porém com menor frequência, como palato mole, gengiva, amígdalas, úvula, faringe, assoalho bucal, área retromolar e cavidade nasal. Raramente pode vir afetar a laringe, traqueia e epiglote (GEETHA et al., 2015; PASSI et al., 2017).
Clinicamente, o AP pode ser descrito como uma lesão nodular unilateral, de crescimento lento, com consistência firme a palpação, superfície lisa, com margens bem delimitadas e na grande maioria dos casos é indolor. Possui a característica de não se aderir aos tecidos circundantes, exceto quando o sítio afetado é o palato duro. De modo geral, não ocorre ulceração na mucosa. Porém, quando há trauma, ulcerações secundárias podem aparecer (GORDÓN-NÚÑEZ et al., 2008; QUEIROZ et al., 2014).
Como descrito anteriormente, possui um crescimento lento e assintomático. Porém, por vezes esse crescimento passa a ser rápido, podendo causar paralisia do nervo facial e hemorragia intra-tumoral, representando, nesses casos, uma possível transformação maligna (GEDLICKA et al., 2010; PASSI et al., 2017; QUEIROZ et al., 2014). Sintomas como dispneia, disfagia, obstrução aguda das vias áreas e apneia obstrutiva do sono podem ser encontrados nos casos onde o palato é a sede do tumor (PASSI et al., 2017).
Os APs acometem qualquer faixa etária, entretanto, casos entre a 4ª e 6ª década de vida são mais frequentes. Possui uma predileção pelo sexo feminino com uma proporção entre
homens e mulheres de 2:3 (PASSI et al., 2017). Existem estudos na literatura mostrando que a idade pode variar de 15 a 84 anos, com uma média de 39,5 anos (NEVES; LIMA; SOBRAL, 2007).
Araya et al. (2015) realizaram um estudo retrospectivo com o objetivo de determinar a prevalência e a incidência das NGS diagnosticadas entre os anos 2000 e 2011 na Província de Valparaíso, no Chile. A amostra do estudo foi de 279 neoplasias, sendo a GP mais acometida e o AP a neoplasia benigna mais comum (53,8%). A maioria dos AP foram encontrados em mulheres (91 dos 150 tumores), com razão entre homens e mulheres de 1:1,41. Um estudo realizado no Brasil também obteve como resultado o AP como neoplasia benigna mais comum (54,2%) em uma amostra de 496 neoplasias. A maioria dos pacientes eram mulheres com uma faixa etária entre 40 e 50 anos (ITO et al., 2005).
O AP, também chamado de tumor misto, apresenta uma alta diversidade histopatológica, com variabilidade estrutural e arquitetônica. Sua descrição microscópica no ano de 1874, já evidenciava uma variedade nos tipos de células, sendo essa uma das principais características dessa neoplasia. Essa variedade de células pode ser observada em vários APs, bem como em diversas partes de um mesmo AP (QUEIROZ et al., 2014; TIAGO et al., 2003). O diagnóstico do AP deve ser realizado por meio de uma biópsia incisional, seguido de um estudo histopatológico para confirmação do mesmo (SILVA et al., 2007). O AP pode apresentar uma grande variabilidade histológica. As células neoplásicas são constituídas por células epiteliais e mioepiteliais, as quais podem ter morfologia poligonal, fusiformes ou estreladas, por vezes dispostas em paliçada, formando estruturas semelhantes a ductos, ou ainda arranjadas em ninhos, ilhas, lençóis ou cordões entrelaçados. O estroma de tecido conjuntivo pode apresentar aspecto mixoide, condroide, osteoide ou hialino. A proporção entre células neoplásicas e estroma é altamente variável no AP. Alguns tumores são mais celularizados enquanto outros são formados basicamente por estroma. Áreas de metaplasia escamosa com formação de ceratina também podem ser observadas junto as células neoplásicas. O AP é um tumor encapsulado, entretanto, a cápsula pode estar incompleta e apresentar espessura variável (KAWAHARA et al., 2002; NEVES; LIMA; SOBRAL, 2007; PASSI et al., 2017).
O tratamento de escolha para o AP é a ressecção cirúrgica, que por vezes pode ser realizada através de uma enucleação, parotidectomia total ou parotidectomia superficial (DHIR; DAVID; DHADUTI, 2014). Uma parotidectomia total trata-se da remoção total da glândula, lateral e medial ao nervo facial. Já na parotidectomia superficial se remove porção da GP, lateralmente ao nervo facial, com preservação deste (BITTAR et al., 2016).
Antes da década de 1940, o tratamento mais utilizado era a enucleação, onde se removia o conteúdo do tumor e deixava-se parte ou toda a cápsula no leito cirúrgico. Desse modo, a ressecção era insatisfatória (devido à falta de conhecimento sobre a relação GP e nervo facial) resultando em altas taxas de recidiva do tumor, cerca de 20 a 45% (SHEHATA, 2010; STENNERT et al., 2001).
Através da dissecção do tronco principal do nervo facial, foi possível, em 1950, ser realizada a parotidectomia superficial com preservação do nervo facial. A parotidectomia total ou superficial, com preservação do nervo facial, é o atual tratamento de escolha para neoplasias benignas que acometem a parótida e apresenta taxa de recidiva menor que 2% (ANDREASEN et al., 2016; ESPINOSA et al., 2018; GUPTE et al., 2014).
Certas complicações podem ocorrer quando essas condutas terapêuticas são realizadas. Uma delas é a paralisiado nervo facial e o aparecimento da Síndrome de Frey. A chance de ocorrer a paralisia é maior em parotidectomias totais (47%) seguido de parotidectomias superficiais (17%) e parotidectomias superficiais parciais (10%) (TIAGO et al., 2003; WITT, 2002).
Embora o AP seja uma neoplasia benigna, em alguns casos pode haver uma recidiva do tumor passando a se chamar de Adenoma pleomórfico recidivado (APR) (TAKEDA, 1999). Na maioria dos casos o mais correto seria dizer residual, visto que muitos pacientes não ficaram livres da doença, mas sim progrediram para um estágio clinicamente indetectável (WITTEKINDT et al., 2007).
O aparecimento de recidivas pode estar associado a ressecção incompleta do AP, rompimento da pseudo-cápsula e presença de lesões satélites (ORITA et al., 2010; PASSI et al., 2017; STENNERT et al., 2004). O rompimento da pseudo-cápsula acaba deixando células tumorais no leito cirúrgico e com isso tem-se a formação de nódulos, que podem ser classificados como uninodular ou isolado e multinodular ou múltiplos nódulos. Podem ser vistos na cicatriz deixada pela primeira intervenção cirúrgica e ultrapassam os limites da glândula acometida (BRADLEY, 2001; LEVERSTEIN et al., 1997). Em geral, os múltiplos nódulos são mais encontrados na literatura. Em uma série de 108 pacientes submetidos a 134 operações, 111 casos possuíam lesões multinodulares (WITTEKINDT et al., 2007). Já em outro estudo todos os casos (total de 29) de APR foram multinodulares (SOARES; ALTEMANI; DE ARAÚJO, 2011).
Suh et al. (2009) correlacionaram a idade do paciente, a margem de ressecção e a agressividade dos tumores com as recidivas. Através das pesquisas chegaram à conclusão de
que pacientes mais jovens com AP correm mais riscos de desenvolver recidivas, e possuir uma margem de ressecção livre de doença muitas vezes não significa cura, uma vez que, 21,4% dos pacientes apresentaram recidiva mesmo sendo confirmada margem de ressecção livre. Além disso, perceberam que após cada recorrência que os pacientes apresentavam, os tumores ficavam mais agressivos pois, o espaço de tempo até a próxima recidiva reduziu. O tempo médio para a primeira recorrência foi de 51,4 meses e para a segunda 27,5 meses. Outro estudo obteve como resultado 10,1 anos até a primeira recorrência e 7,3 anos entre a primeira e a segunda. Ademais, pacientes que tiveram mais de uma recorrência (31% dos pacientes) possuem um alto risco para desenvolver recorrências subsequentes (LASKAWI; SCHOTT; SCHRÖDER, 1998).
Tanto AP quanto APR possuem o mesmo arranjo histológico, isto é, são compostos por células epiteliais e mioepiteliais inseridos em estromas variados. O componente celular pode apresentar grande diversidade morfológica. Sendo assim, na tentativa de determinar características histomorfológicas em casos de APR, uma pesquisa realizada em 2011 encontrou células plasmocitoides/hialinas, poligonais, fusiformes, claras e sebáceas nos casos estudados (SOARES; ALTEMANI; DE ARAÚJO, 2011).
Alguns artigos ainda apontam como uma possível causa para o aparecimento de recidivas o tipo de estroma mixoide em AP. Isso pode estar associado a falta de encapsulamento em algumas regiões do tumor, que consequentemente acaba levando a fusão com tecido glandular normal e por apresentar uma extensão maior dessas áreas do que os outros subtipos de estromas (MOUZALI et al., 2019; STENNERT et al., 2001, 2004).
Em duas séries de APR o sítio acometido de maior ocorrência foi a GP seguida pela glândula submandibular. A idade média dos pacientes era de 43 e 50 anos e o sexo feminino prevaleceu (SOARES; ALTEMANI; DE ARAÚJO, 2011; STENNERT et al., 2004).
As opções de tratamento para APR são controversas, dado que as chances de recidivas podem variar de 10% a 63%. Contudo, apenas o acompanhamento dos pacientes, principalmente os mais idosos, parotidectomia superficial e total, ressecção localizada do tumor são algumas das opções de tratamento para as lesões recidivantes (SOARES et al., 2009; WITTEKINDT et al., 2007). Para as neoplasias na parótida, alguns autores ainda apontam como eficaz uma parotidectomia total associada a ressecção do tecido adiposo periparotídeo com a preservação do nervo facial (STENNERT et al., 2004).
Qualquer discussão relacionada a conduta terapêutica deve levar em consideração dois pontos importantes: como evitar e como tratar. Para evitar uma possível recidiva, a primeira
intervenção cirúrgica realizada no paciente com AP é mandatória, logo a enucleação ainda continua sendo evitada. Dados de uma pesquisa revelaram que 83% das neoplasias com recidivas tiveram como primeira opção de intervenção, a enucleação (LASKAWI; SCHOTT; SCHRÖDER, 1998). Já para a escolha do tratamento fatores primordiais devem ser analisados. Dentre eles a natureza da cirurgia anterior, o uso de exame de imagem, como a ressonância magnética, para saber a extensão e localização do tumor, se o nervo facial foi afetado, idade e saúde geral do paciente (LEVERSTEIN et al., 1997).
As complicações pós-operatórias citadas para AP também estão presentes em APR. Danos ao nervo facial são maiores, de 15% a 30%, em uma segunda intervenção cirúrgica devido à presença de fibroses, aderências do nervo ao tumor recidivado e uma possível alteração da anatomia (LEVERSTEIN et al., 1997; WITTEKINDT et al., 2007).
O APR está mais sujeito a transformação maligna. Vários casos de CEAP decorrentes de APR já foram descritos na literatura (MARIANO et al., 2016; SOARES; ALTEMANI; DE ARAÚJO, 2011).
2.2 CARCINOMA EX-ADENOMA PLEOMÓRFICO
O conceito de CEAP segundo a OMS, é de uma neoplasia epitelial/mioepitelial que se desenvolve a partir de um AP (EL-NAGGAR et al., 2017). Além do CEAP, outros dois tumores mistos podem se originar a partir do AP: carcinossarcoma (tumor maligno misto verdadeiro) e AP metastático, sendo que a primeira malignidade descrita é a mais comum e as outras duas são raras (LEWIS; OLSEN; SEBO, 2001; YE et al., 2016).
Mesmo sendo considerado mais comum, o CEAP representa apenas 3,6% das NGS (variação de 0,9% a 14%) e 12% das neoplasias malignas que acometem as glândulas salivares (variação de 2,8% a 42,4%) (EL-NAGGAR et al., 2017).
De acordo com os dados da OMS essa neoplasia acomete principalmente pacientes do sexo feminino, entre a sexta e sétima décadas de vida (EL-NAGGAR et al., 2017). Com relação a prevalência por gênero, duas séries com número amostral elevado, trouxeram o sexo masculino como o mais prevalente (HU et al., 2016; YE et al., 2016).
A GP (81,7%), seguida da submandibular (18%) e sublingual (0,3%) são os sítios mais acometidos (MAG et al., 2010). No entanto, as glândulas salivares menores (localizadas na região vestibular, labial, palato, mucosa jugal e área retromolar) também são afetadas pelo CEAP (HU et al., 2016; YE et al., 2016).
A patogênese do CEAP é controversa, pois os tumores podem ser malignos desde o princípio ou apenas ocorrer uma transformação carcinomatosa no tumor benigno (MARTÍNEZ-RODAS et al., 2016). Embora haja relato de uma taxa de 60% para incidência de CEAP em pacientes sem registros prévio de um tumor pré-existente (GERUGHTY et al., 1969), a hipótese de origem a partir de um tumor pré-existente é a mais aceita atualmente, baseada principalmente na história clinica de lesão prévia e na idade média de surgimento dos tumores, que ocorrem em décadas mais avançadas de vida em relação aos tumores benignos (KATABI et al., 2010).
De maneira geral, a doença é assintomática nos estágios iniciais e a maioria dos pacientes apresentam apenas uma massa pré-existente que evolui lentamente por anos e que passa a crescer rapidamente. Quando há infiltração em tecidos adjacentes, esse aumento de volume pode vir acompanhado de dor, paralisia facial, trismo e ulcerações em pele e tecidos (MARTÍNEZ-RODAS et al., 2016; YE et al., 2016; ZBÄREN et al., 2008).
Hu et al. (2016) encontraram em 361 casos de CEAP, a predominância dos sintomas: dor, dormência, paralisia do nervo facial, ulceração e sangramento, obstrução nasal e trismo. Cerca de 39 pacientes relataram crecimento rápido recente de uma massa que estava presente a mais de um ano.
O diagnóstico definitivo do CEAP ocorre através de um estudo histológico e deve apresentar um componente benigno e um componente maligno, ou seja, áreas de AP associado a um carcinoma ou somente o carcinoma, porém com histórico de um AP prévio no local. Há dificuldades para se obter um correto diagnóstico, pois o carcinoma pode vir a substituir completamente o AP ou deixar o AP limitado por áreas hialinizadas (LEWIS; OLSEN; SEBO, 2001; ZBÄREN et al., 2008).
Diversos fenótipos carcinomatosos se desevolvem no CEAP. Os mais frequentes são adenocarcinoma sem outras especificações e carcinoma do ducto salivar (DI PALMA, 2013; SPEIGHT; BARRETT, 2020). Em contrapartida, Hu et al. (2016) encontraram adenocarcinoma sem outra especificação e carcinoma mioepitelial sendo os mais comuns. Outros subtipos histológicos são encontrados, dentre eles o carcinoma mioepitelial, carcinoma mucoepidermoide, carcinoma adenoide cístico, carcinoma basocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma oncocítico, cistadenocarcinoma papilar, carcinoma epitelial-mioepitelial, carcinoma de células claras e carcinoma de células acinares (YE et al., 2016).
Os diversos subtipos histológicos ainda podem ser classificados como neoplasias de alto e baixo grau. Sendo que a de alto apresenta frequentes atipias citológicas e mitoses e na de baixo grau, as atipiais e mitoses são quase imperceptíveis (ROSA et al., 1996).
Estima-se que apenas 6,2% de todos os AP sofram transformação maligna e os fatores de risco incluem idade avançada, grande extensão de lesão, neoplasia com longa duração, origem na glândula submandibular e ausência de tratamento (FERREIRA et al., 2014; HARADA, 2000; LEWIS; OLSEN; SEBO, 2001; TOBÓN-ARROYAVE et al., 2009).
Tanto células epitelais ductais quanto mioepiteliais do AP podem sofrer transformação maligna. Raramente transformações com dupla diferenciação epitelial/mioepitelial ou somente mioepitelial acontecem. Cerca de 75% dos casos o carcinoma possui origem nas células epitelais ductais (ALTEMANI et al., 2005).
Uma vez que as células epiteliais ductais passam por um processo de transformação maligna, ocorre uma sequência de etapas que se assemelham ao carcinoma de mama. Inicialmente, as células do carcinoma substituem a camada epitelial ductal interna e deixam a camada mioepitelial intacta. Em seguida, essa camada mioepitelial é destruída e ocorre a invasão da matriz no AP. Na última etapa as células do carcinoma se estendem então a área extracapsular (CHEUK; CHAN, 2007).
O CEAP recebe uma classificação com base na invasão do componente maligno em relação a cápsula do AP. São considerados carcinomas intracapsulares (CI) aqueles que ficam confinados a cápsula do AP, logo não são invasivos. Até 1,5mm de invasão extracapsular são chamados carcinomas minimamente invasivos (CMI) e se a invasão se estender além de 1,5mm carcinomas amplamente invasivos (CAI) (YE et al., 2016).
Entretanto, a nova classificação da OMS de 2017 passou a considerar CMI como uma extensão < 4 e até 6mm além do AP, porém, esses valores são considerados apenas preliminares e novas pesquisas devem ser realizadas para a sua validação. Essa mudança ocorreu, pois é preciso diferenciar um CMI de CAI, visto que, os CI e CMI possuem prognósticos semelhantes. Alguns autores ainda consideram essa classificação deficiente quando se trata de diagnóstico, sendo que a principal característica para definir uma lesão invasiva deve ser a evidência histológica de infiltração destrutiva nos tecidos moles além das margens do tumor (SPEIGHT; BARRETT, 2020).
Os CI e CMI podem ser considerados como neoplasias de baixo grau e na maioria dos casos apresentam comportamento pouco agressivo sem maiores intercorrências. No entanto, mesmo sendo considerados de baixo grau e sem risco a vida, alguns estudos encontraram
metástases e mortes associados a casos de CI e CMI, mostrando que esses tumores também podem se tornar agressivos (FELIX et al., 2002; YE et al., 2016).
Já os CAI são naturalmente mais agressivos e considerados como de alto grau, visto que metástases e o óbito em decorrência da lesão são frequentemente relacionadas a esse grau de invasão (SOARES et al., 2007a; YE et al., 2016). A maioria das metástases afetam os linfonodos, ossos e pulmões. A presença de metásteses, locais ou a distância, ocorrem em aproximadamente 70% dos casos, resultando em uma taxa de sobrevida de 5 anos, em 25 a 65% dos casos (EL-NAGGAR et al., 2017; MAG et al., 2010). Em resumo, os CI e CMI possuem um bom prognóstico e mostram taxas de sobrevida mais altas quando comparado com o CAI, que está associado a um pior prognóstico (LEWIS; OLSEN; SEBO, 2001; YE et al., 2016).
Ye et al. (2016) encontraram como fatores de risco significativos para a sobrevida dos pacientes com CEAP, o estágio clínico, tamanho do tumor, recorrência, metástase regional e a distância, invasividade e subtipo histológico. Em contrapartida, sexo dos pacientes, localização do tumor e modalidade de tratamento não tiveram influência nas taxas de sobrevida. Ainda que o subtipo histológico possua relevância, o indicador prognóstico mais importante é o grau de invasão que ocorre na cápsula do AP (CABANÉ T et al., 2014).
Histologicamente, nos casos de CMI são encontradas características mais próximas de um AP do que de um carcinoma. Todavia, existem céulas malignas dentro dos ductos presentes em AP. Nesses ductos é possível observar necroses, além da citologia atípica, hipercelularidade e hialinização (DEROCHE; HOSCHAR; HUNT, 2008; DI PALMA, 2013).
Em CAI o componente benigno pode vir a apresentar em sua histologia alterações degenerativas (fibrose, calcificações distróficas, necrose e hemorragia) com características intermediárias entre células malignas e células do AP. O componente maligno possui pronunciado pleomorfismo nuclear com aumento no número de mitoses e invasões perineural, capsular e vascular bem como infiltração nos tecidos adjacentes (DI PALMA, 2013).
A principal modalidade de tratamento é a excisão cirúrgica da lesão. Para as neoplasias que afetam a parótida, alguns autores recomendam a parotidectomia total com o objetivo de remover o tumor e os gânglios linfáticos intraparotídeos. Para neoplasias de alto grau, deve-se realizar esvaziamento cervial, quando houver metástase regional, em associação com radioterapia pós-operatória nos casos com margem comprometida e invasão perineural. A união de radioterapia e quimioterapia são apenas para os pacientes com doença disseminada (LEWIS; OLSEN; SEBO, 2001; LÜERS et al., 2009). Na série de Ye et al. (2016) pacientes tratados com radioterapia e cirurgia apresentaram menores taxas de recorrência local. Nos casos de CI, por
não haver invasão da cápsula, o tratamento cirúrgico pode vir a ser igual a de um AP (LEWIS; OLSEN; SEBO, 2001).
2.3 MARCADORES BIOLÓGICOS NAS NEOPLASIAS DE GLÂNDULAS SALIVARES
As NGS, tanto benignas quanto malignas, possuem uma grande diversidade histológica e citoarquitetural. Portanto, é essencial compreender os aspectos moleculares dessas neoplasias, o que interfere diretamente no seu diagnóstico, tratamento e prognóstico. A avaliação de diferentes marcadores biológicos através da análise imuno-histoquímica pode vir a contribuir na previsão do comportamento clínico das neoplasias e auxiliar no entendimento dos padrões de invasão e progressão tumoral, bem como, no diagnóstico e na diferenciação dos tipos de neoplasias (ALAIZARI et al., 2015; CHEUK; CHAN, 2007; SPEIGHT; BARRETT, 2020). Os marcadores descritos a seguir podem auxiliam neste entendimento.
2.3.1 Proteína p53
O gene Tp53 é o responsável pela codificação de uma fosfoproteína nuclear formada por 393 aminoácidos, chamada p53. A p53 é a principal proteína supressora tumoral, conhecida como a “guardiã do genoma” humano (BOEHME; BLATTNER, 2009; GEDLICKA et al., 2010).
Essa proteína está envolvida em diversos processos fisiológicos e possui fundamental ação na transcrição de genes envolvidos no controle do ciclo celular, indução de morte celular, senescência e regulação do metabolismo celular. Além disso, controla o reparo de possíveis danos ao DNA (ELABD; MERONI; BLATTNER, 2016).
A proteína MDM2 é o regulador mais importante da p53 e pode vir a desempenhar sua função de três modos diferentes. Um desses modos é inibindo a atividade transcricional da p53 e os outros dois é controlando sua localização subcelular (promovendo a exportação de p53 do núcleo para o citoplasma) e modulando sua estabilidade proteica (ELABD; MERONI; BLATTNER, 2016). Diante disso, na ausência de estresse celular, a p53 fica ligada a proteína MDM2, sendo inibida e rapidamente degradada. As poucas moléculas restantes de p53 são mantidas inativas (AL-RAWI; OMER; KAWAS, 2010; BOEHME; BLATTNER, 2009).
No entanto, em resposta ao estresse celular, que pode ocorrer através de fontes intrínsecas (subprodutos metabólicos, como espécies reativas de oxigênio) e extrínsecas (luz
ultravioleta, radiação ionizante e exposição a agentes genotóxicos, como drogas quimioterapêuticas), acontecem danos ao DNA. Nessas condições, a proteína p53 é rapidamente ativada, interrompendo o ciclo celular entre a fase G1 e S, atuando na regulação da proliferação celular, seja bloqueando o ciclo celular ou promovendo a apoptose. Caso o reparo no DNA não aconteça, a apoptose é induzida, removendo assim as células não funcionais ou alteradas (AL-RAWI; OMER; KAWAS, 2010; KÄRJÄ et al., 1997; LIM et al., 2003; MATT; HOFMANN, 2016). Por vezes, a tentativa de corrigir o dano no DNA fracassa e a mutação no gene acontece (GEDLICKA et al., 2010).
As mutações no gene Tp53 possuem papel crucial na patogênese e desenvolvimento de diversos tipos de cânceres no corpo humano (SOARES; ALTEMANI; DE ARAÚJO, 2011). Ademais, o produto do gene mutado é a codificação da proteína p53 com meia-vida mais longa, chamada de p53 mutante, que fica acumulada no núcleo das células e com isso, é detectável por reações de imuno-histoquímica. O que não acontece quando essa proteína está desempenhando adequadamente suas funções, visto que, possui uma meia-vida curta, sendo denominada de p53 selvagem (FAUR et al., 2015; KAMIO, 1996).
Muitos autores apontam que a superexpressão dessa proteína pode estar relacionada ao estágio avançado da doença, disseminação metastática e transição de lesões displásicas para carcinoma (KAMIO, 1996). Em carcinomas de mama, cólon e bexiga a p53 mutante está associada a comportamento biológico mais agressivo e redução na sobrevida dos pacientes (SOUZA et al., 2005). A superexpressão de p53 também é encontrada nas NGS (LI et al., 1997; MATIZONKAS-ANTONIO et al., 2005).
Alguns estudos já relacionaram a expressão desse marcador a agressividade e progressão das NGS, principalmente relacionada a transformação maligna de AP em CEAP (ALVES et al., 2004; ELABD; MERONI; BLATTNER, 2016). Além disso, esse marcador tem sido considerado útil na discriminação entre neoplasias benignas e malignas das glândulas salivares (AL-RAWI; OMER; KAWAS, 2010).
Um estudo realizado em 2010 avaliou a expressão de p53 em 29 casos de AP abrangendo tecido glandular normal e em 27 casos de CEAP. Para os casos de glândula salivar normal a expressão de p53 apresentou marcação nuclear negativa ou muito sutil; para o AP e CEAP a marcação nuclear variou de moderada a intensa, sendo positiva em 75,9% e 44,4% dos casos, respectivamente (TARAKJI; KUJAN; NASSANI, 2010).
Outro estudo encontrou a expressão da proteína p53 em 41% dos CEAP, todavia a amostra era de apenas 73 casos. As séries com um número amostral maior relatadas na literatura
apontam que a expressão positiva de p53 para AP varia de 3% a 41% e de 50% a 75% para o CEAP (LEWIS; OLSEN; SEBO, 2001).
2.3.2 Proteína Ki-67
O Ki-67 é uma proteína codificada por um gene localizado no cromossomo 10q25, e está presente no núcleo de células em fase de replicação. Desse modo, está envolvido na regulação do ciclo celular, tanto em condições fisiológicas como patológicas, e é um dos marcadores de proliferação celular mais utilizados (FAUR et al., 2015; LAZZARO; CLEVELAND, 2000; SCHOLZEN; GERDES, 2000).
A proliferação celular é um processo complexo que resulta no aumento do número de células (ARISAWA et al., 1999). Nas células eucarióticas os estágios do ciclo celular são divididos em duas etapas: a interfase e a mitose. Na interfase ocorre o crescimento celular e a duplicação do DNA, sendo dividida em 3 etapas: G1 ("Gap 1"), caracterizada pela transcrição gênica e tradução, levando à síntese de proteínas necessárias para a síntese de DNA; S: fase de síntese, no qual ocorre a duplicação do DNA celular; e G2 ("Gap 2"), intervalo após a síntese de DNA, durante o qual a célula se prepara para a divisão. A mitose é etapa na qual a célula divide seu DNA duplicado (prófase, metáfase, anáfase e telófase) e o citoplasma (citocinese) para formar duas novas células. Apenas a etapa de mitose pode ser identificada morfologicamente em cortes histológicos, enquanto que as outras fases podem ser identificadas com o auxílio da imuno-histoquímica e utilização de anticorpos monoclonais para antígenos expressos durante a proliferação celular (SUZZI et al., 2005). As células em repouso, fora do ciclo celular encontram-se em uma fase chamada G0, na qual podem permanecer por tempo indeterminado (ARISAWA et al., 1999).
Os marcadores de proliferação celular são classificados em três grupos: marcadores de fração de crescimento, marcadores de fases específicas do ciclo celular e marcadores de tempo do ciclo celular, sendo que Ki-67 contempla o primeiro grupo mencionado e com isso está presente em todas as fases ativas do ciclo celular, possuindo meia-vida de 1 – 1,5h, e está ausente na fase G0 (SCHOLZEN; GERDES, 2000; SUZZI et al., 2005).
Em muitos estudos, a atividade proliferativa identificada pela proteína Ki-67 demonstrou ser um importante fator prognóstico em vários tipos de câncer. Nas NGS a superexpressão desse marcador associa-se a um prognóstico ruim (BEN-IZHAK; AKRISH;
NAGLER, 2008). Além disso, a expressão de Ki-67 também tem sido útil como indicador da malignidade e agressividade nas NGS (LUUKKAA et al., 2006; SPEIGHT; BARRETT, 2020). Com o objetivo de investigar a atividade proliferativa das células tumorais utilizando o anticorpo anti-Ki-67, um estudo realizado em 2007 selecionou dez casos de CEAP e de AP. Através da análise imuno-histoquímica, pequenos focos de células coradas positivamente em AP (menos de 1% do total de células tumorais) foram encontrados. O componente maligno do CEAP apresentou maior índice proliferativo do que o componente benigno (MATSUBAYASHI; YOSHIHARA, 2007).
Há autores na literatura que avaliaram a expressão do marcador Ki-67 nas NGS e tecido glandular normal, também abordadas neste trabalho. De maneira geral, os resultados mostram que a proliferação celular em glândula salivar normal é inexpressiva (AOKI et al., 2004). Em AP, APR e CEAP a expressão de Ki-67 é maior e apresenta valores ainda mais elevados nos casos de CEAP, indicando que a proliferação celular é mais acentuada nas neoplasias malignas (DÍAZ et al., 2019; MARIANO et al., 2015; SOARES et al., 2009).
2.3.3 Proteína CD105
A angiogênese, pode ser definida como o crescimento e desenvolvimento de novos vasos sanguíneos a partir de outros pré-existentes. Eventos fisiológicos (embriogênese, crescimento e reprodução) e patológicos (reparo tecidual, inflamação crônica, neoplasias e metástases) estão associados a neoformação vascular (COHEN, 2002; FREITAS et al., 2005b; SCHIMMING et al., 2004).
Existem formas de estimar a neoformação vascular nos tecidos, e uma delas é através da identificação de biomarcadores angiogênicos. O mais conhecido deles é o CD105, também conhecido como endoglina, uma glicoproteína transmembrana homodimérica de peso molecular 180-KDa, codificada pelo gene CD105, localizado no cromossomo 9q34. Pode ser expressa por sua forma longa (L-CD105) e curta (S-CD105) (DUFF et al., 2003).
A principal fonte de CD105 são as células endoteliais ativas dos vasos sanguíneos, todavia outras células também podem expressar em menor número, como as células do músculo liso vascular, fibroblastos e macrófagos (DUFF et al., 2003; ZIJLMANS et al., 2009).
A expressão de CD105 ocorre preferencialmente nos vasos recém-formados durante o processo de angiogênese tumoral e é minimamente expressa nos vasos pré-existentes. Sendo
assim, é considerado um poderoso marcador de neovascularização em diversas neoplasias (FONSATTI et al., 2003; HEIL et al., 2006; MINHAJAT et al., 2006).
Além de desempenhar papel importante na angiogênese, a proteína CD105 participa de eventos moleculares considerados vitais para o crescimento e metástase tumoral, como a proliferação, diferenciação, migração e adesão celular (YU et al., 2018).
Os mecanismos celulares envolvidos na angiogênese são regulados por fatores pró e antiangiogênicos e seus receptores. Entre os fatores pró-angiogênicos, destaca-se o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), que é sintetizado e secretado principalmente por fibroblastos e macrófagos (VASCONCELOS et al., 2011). O VEGF estimula a produção de enzimas proteolíticas que passam a remodelar os componentes da matriz extracelular para a angiogênese (GUPTA; QIN, 2003).
A atuação do CD105 também está associada a receptores presentes nas moléculas do fator de crescimento transformador beta (TGFβ), que além de estimular a expressão de VEGF, a proliferação de fibroblastos e células musculares lisas, é secretado pelas células endoteliais e tem a função de estabilizar os vasos recém-formados através das proteínas da matriz extracelular (CARMELIET, 2003; VASCONCELOS et al., 2011). O TGFβ1 e TGFβ3 possuem alta afinidade com a endoglina e modulam a resposta do TGFβ em diversos tipos de células (BALZA et al., 2001). Já o TGFβ1 isolado inibe a atividade angiogênica, no entanto, quando ligado ao receptor CD105 fica com baixas dosagens e com efeitos pró-angiogênicos (LI et al., 2001).
Mecanismos de proliferação, migração endotelial e transcrição de genes pró-angiogênicos podem ser mediados pela via TGFβ/ALK1. O CD105 é essencial para ativação dessa via, pois a superexpressão de ALK1 nas células endoteliais causa uma diminuição da adesão e proliferação celular. A ativação da via TGFβ/ALK5 induz a quiescência endotelial e promove o aumento da expressão de genes envolvidos na maturação dos vasos (LEBRIN et al., 2004).
O uso do anticorpo anti-CD105 é muito utilizado para a mensuração da densidade microvascular, sendo por isso alvo de pesquisas em muitos tumores com o objetivo de compreender melhor os mecanismos envolvidos na progressão dessas lesões (TANIGAWA et al., 1997). Ademais, o aumento da neovascularização tem sido observado em vários tipos de câncer e alguns autores já apontaram que a expressão aumentada de CD105 está associada a um prognóstico ruim e a maior ocorrência de metástases (KYZAS; AGNANTIS; STEFANOU, 2006; NETTO et al., 2008).
Utilizando o anticorpo anti-CD105, estudos mostram que não há expressão em glândula salivar normal (TADBIR et al., 2012). Já nos casos de AP e APR é detectada a presença de neovasos com marcação positiva (SOARES et al., 2009). E nos casos de CEAP, nos seus diferentes estágios de invasão, é comum observar aumento significativo da angiogênese, com maior imunorreatividade para este marcador (SOARES et al., 2007b).
O aumento significativo da angiogênese em neoplasias malignas quando comparadas com neoplasias benignas das glândulas salivares, já foi relatada em outros estudos, indicando que a angiogênese reflete a invasão e agressividade nas neoplasias das glândulas salivares (CARDOSO et al., 2009; TADBIR et al., 2012).
É de grande importância compreender os mecanismos que envolvem a angiogênese e sua aplicabilidade no diagnóstico e prognóstico, bem como em novas formas terapêuticas. De fato, a terapia antiangiogênica vem sendo considerada uma das modalidades mais promissoras de tratamento para o câncer como uma alternativa ou complemento do tratamento convencional (DUFF et al., 2003; VASCONCELOS et al., 2011). Ademais, alguns autores especulam que essa terapia poderia ser indicada como tratamento para uma das neoplasias benignas das glândulas salivares, o Adenoma pleomórfico recidivado. Porém, mais estudos são recomendados para verificar essa hipótese (SOARES et al., 2009).
Baseado na revisão de literatura acima, justifica-se realizar um estudo envolvendo essas neoplasias (AP, APR, CEAP) e proteínas (p53, Ki-67, CD105), tendo em vista que, as NGS apresentam alta diversidade histopatológica, etiopatogênese incompletamente elucidada, são lesões de difícil diagnóstico, possuem condutas terapêuticas controversas e prognóstico desfavorável. Desse modo, toda descoberta é válida para um melhor entendimento do comportamento clínico dessas neoplasias.
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a expressão imuno-histoquímica das proteínas p53, Ki-67 e CD105 em AP, APR e CEAP, a fim de compreender o processo de progressão tumoral.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Correlacionar o padrão de expressão imuno-histoquímico das proteínas p53, Ki-67 e CD105 com os respectivos dados clínico-patológicos em AP, APR, CEAP e glândula salivar normal (GN);
• Determinar o índice proliferativo, através da análise da expressão de Ki-67 nas amostras estudadas;
• Determinar a angiogênese através da expressão de CD105 nas amostras estudadas; • Determinar o potencial de agressividade tumoral através da expressão de p53 nas
amostras estudadas;
4 METODOLOGIA
4.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO
O estudo realizado é de natureza básica, observacional descritivo retrospectivo.
4.2 ASPECTOS ÉTICOS E LEGAIS
O projeto de pesquisa foi submetido à apreciação pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), do Comitê Avaliador do Hospital Universitário Polydoro Ernani de São Thiago (HU-UFSC), recebendo parecer favorável à execução da pesquisa, sob os números de registro: CAAE: 57274016.2.0000.0121, número do parecer: 1.657.413.
4.3 SELEÇÃO DAS AMOSTRAS
Realizou-se um levantamento de todos os casos de NGS com base nos laudos histopatológicos do Laboratório de Patologia Bucal da UFSC (LPB-UFSC), e do Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Universitário (SAP/HU-UFSC). Todos os casos foram reavaliados e classificados de acordo com os critérios estabelecidos pela OMS (EL-NAGGAR et al., 2017).
Após a coleta de dados inicial, foram selecionados para estudo os casos de AP, APR e CEAP. Como critérios de inclusão, as fichas de biópsia deveriam estar adequadamente preenchidas, assim como os laudos correspondentes. Além disso, foram utilizadas amostras onde o material biológico estava devidamente fixado e apresentando material suficiente para análise sem exaurir a amostra. Deste modo, foram excluídos da amostra todos os casos que não preencheram esses requisitos.
Também foram incluídas no estudo amostras de glândula salivar normal (GN). Estas provenientes de biópsias realizadas para investigação da Síndrome de Sjögren ou mucocele, mas que tiveram diagnóstico final de glândula salivar com características usuais, livres de inflamação.
Após a seleção dos casos a amostra do estudo ficou constituída por: dez casos de AP, cinco casos de APR, sete casos de CEAP, além de seis casos de GN.
4.4 LEVANTAMENTO DOS DADOS CLÍNICOS
A verificação dos dados clínicos das amostras selecionadas foi realizada através da análise das fichas de biópsia arquivadas no LPB-UFSC e nos prontuários do HU-UFSC. Foram coletados dados relativos à idade do paciente, sexo, bem como a localização da lesão e tempo de evolução.
4.5 PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS
Os espécimes selecionados neste estudo foram submetidos à técnica de imuno-histoquímica, utilizando os anticorpos para detecção dos antígenos CD105, Ki-67 e p53. Os procedimentos laboratoriais foram realizados no LPB-UFSC, seguindo o protocolo padronizado pelo mesmo: cortes teciduais seriados de 3µm de espessura, montados sobre lâminas preparadas com solução de ATPS (3-aminopropyltriethoxysilene; Sigma-Aldrich, São Paulo, SP, Brasil) a 5% em acetona, foram desparafinizados em xilol e hidratados com passagens sucessivas em soluções decrescentes de etanol. Previamente à incubação com os anticorpos primários, com o objetivo de bloquear a atividade endógena da peroxidase, as lâminas foram incubadas em 40 ml de PBS (Phosphate-Buffered Saline) + 40 ml de álcool metílico + 20 ml de Peróxido de Hidrogênio (H2O2) durante 20 minutos, seguida por solução de peróxido de hidrogênio 3% (90 ml de álcool metílico + 10 ml de H2O2), durante 10 minutos. Posteriormente, as lâminas foram lavadas em água destilada e imersas em solução tampão citrato 0,01M em pH 6,0 por 40 minutos em banho-maria à temperatura de 96ºC com o objetivo de reativar os sítios antigênicos. Após lavagem em água destilada, as lâminas foram imersas em solução salina tampão fosfato (PBS) 10mM, pH 7,2-7,4 (Sigma Chemical CO, St. Louis, MO, USA). A incubação primária foi obtida adicionando os anticorpos primários previamente diluídos (tabela 1), sobre os cortes teciduais e as lâminas foram mantidas em câmara úmida por 18 horas. Após esse período foi realizada dupla lavagem dos cortes em tampão PBS por 5 minutos cada, à temperatura ambiente, seguida da incubação com anticorpo secundário anti-IgG biotinilado conjugado com um polímero de peroxidase (Kit Envision+/HRP, Dupla ligação coelho/camundongo, DAKO® Dinamarca) pronto para uso, durante uma hora em câmara úmida à temperatura ambiente. Passado o período de incubação, as amostras foram lavadas por duas vezes em PBS por 5 minutos cada, à temperatura ambiente.
A revelação da reação imuno-histoquímica foi realizada com solução cromógena contendo 0,03% de 3,3’-diaminobenzindina (DAB) previamente diluída em tampão imidazol pH 7,2 e peróxido de hidrogênio a 0,3% (DAKO® Dinamarca), incubado por 3-5 minutos. A contra coloração foi obtida pela imersão das lâminas em hematoxilina de Harris por 2,5 minutos. Por fim, foram realizados os processos de desidratação em etanol, diafanização em xilol e montagem definitiva das lâminas com Entellan® (MERCK, Darmstadt, Germany). O controle negativo para cada caso foi obtido pela abolição do anticorpo primário nas reações. O controle positivo e as informações dos anticorpos estão descritos na Tabela 1.
Tabela 1 – Descrição dos anticorpos utilizados
Anticorpo Origem Fabricante Diluição Controle Positivo Anti-p53 Monoclonal de camundongo Sigma-Aldrich 1:300 Carcinoma epidermoide de boca Anti-Ki-67 Monoclonal
de coelho Biocare Medical 1:400
Carcinoma epidermoide de boca Anti-CD105 Monoclonal de camundongo Santa Cruz Biotechnology 1:1000 Carcinoma epidermoide de boca 4.6 AVALIAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA
A avaliação das reações foi realizada com o software NIH ImageJ 1.52a (National Institute of Health, Maryland, EUA) a partir de imagens capturadas com câmera fotográfica (Bel Engineering, Eurekam 3.0, Milão, Itália) acoplada a microscópio de luz (Axiostar Plus, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha), com magnitude de 400x. As imagens foram obtidas em regiões de hot spot.
Para o anticorpo CD105, a marcação foi avaliada por meio da contagem individual dos neovasos em 5 a 10 campos consecutivos para cada caso, e foi registrada a média de vasos positivos em cada grupo de casos.
A imunorreatividade de p53 e Ki-67 foi analisada por marcações positivas no núcleo das células epiteliais/mioepiteliais, contando-se o número de células positivas em relação ao número de células totais, em 5 a 10 campos consecutivos, contendo no mínimo 1000 células. O resultado compreende a média dos valores obtidos nos campos avaliados. Foram consideradas positivas as células que tiveram marcação acastanhada do núcleo.
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Após aplicação do teste de normalidade Shapiro-Wilk e a constatação da distribuição não normal dos dados avaliados, optou-se pela realização do teste não paramétrico de Kruskal-Wallis para comparar a expressão de cada anticorpo (p53, Ki-67 e CD105), com os grupos de casos (AP, APR, CEAP, GN). Para comparações múltiplas entre os grupos foi utilizado o teste de Mann-Whitney. A correlação entre a marcação das proteínas em estudo foi feita por meio da correlação de Spearman. O nível de significância foi estabelecido em p < 0,05.
5 RESULTADOS
5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
Esta pesquisa foi composta por 10 casos de AP, 5 casos de APR, 7 casos de CEAP e 6 casos de GN. Na tabela 2, encontram-se os dados descritivos referente a sexo, idade, localização anatômica e tempo de evolução dos casos que estavam disponíveis nos prontuários e fichas de biópsia, os quais estão mais detalhados no Apêndice 1.
Tabela 2 - Dados clínicos das neoplasias estudadas
Dados clínicos GN N=6 AP N=10 APR N=5 CEAP N=7 Sexo Masculino 2 (33,33%) 4 (40%) 2 (40%) 3 (42,8%) Feminino 4 (66,7%) 6 (60%) 3 (60%) 4 (57,2%) Idade (média±DP)
43,5 anos 38,7 anos 56,2 anos 58,8 anos ±16,90 anos ±15,44 anos ±20,35 anos ±17,91 anos
Localização anatômica
Parótida 1 (16,67%) 3 (30%) 4 (80%) 3 (42,8%)
Submandibular 0 2 (20%) 1 (20%) 2 (28,6%)
Palato 0 2 (20%) 0 0
Fundo de sulco posterior 0 1 (10%) 0 0
Lábio superior 0 1 (10%) 0 1 (14,3%) Lábio inferior 3 (50%) 0 0 0 Mucosa Jugal 0 1 (10%) 0 1 (14,3%) Assoalho da boca 2 (33,33%) 0 0 0 Tempo de evolução - 5,0 12,2 17,25 (anos±DP) ±3,69 ±10,70 ±10,81
GN- Glândula salivar normal, AP- Adenoma pleomórfico, APR – Adenoma pleomórfico recidivado, CEAP- Carcinoma ex-adenoma pleomórfico, DP – Desvio Padrão
5.2 ANÁLISE QUANTITATIVA DA IMUNOEXPRESSÃO DOS ANTICORPOS UTILIZADOS
5.2.1 P53
A expressão de p53 foi observada pela coloração castanha dos núcleos (Figura 1), sendo esta crescente do grupo de GN, para AP, APR e CEAP (Tabela 3). Foi observada diferença estatisticamente significativa entre AP e CEAP (p=0,040) e CEAP e GN (p=0,010) (Figura 4A).
Figura 1 – Expressão imuno-histoquímica de p53 nos grupos GN- Glândula salivar normal, AP- Adenoma
pleomórfico, APR- Adenoma pleomórfico recidivado, CEAP- Carcinoma ex-adenoma pleomórfico
5.2.2 Ki-67
A imuno-expressão de Ki-67 foi observada pela coloração castanha dos núcleos (Figura 2), sendo esta menor no grupo de GN e maior no grupo de CEAP (Tabela 3). Quando comparado os grupos de casos, houve diferença significante (p<0,05) entre AP e CEAP
(p=0,005), AP e GN (p=0,001), APR e CEAP (p=0,007), APR e GN (p=0,028) e CEAP e GN (p=0,003) (Figura 4B).
Figura 2 – Expressão imuno-histoquímica de Ki-67 nos grupos GN- Glândula salivar normal, AP- Adenoma
pleomórfico, APR- Adenoma pleomórfico recidivado, CEAP- Carcinoma ex-adenoma pleomórfico
5.2.3 CD105
A imuno-expressão de CD105, aferida através da marcação de neovasos (Figura 3), também foi menor em GN e maior em CEAP (Tabela 3). Os grupos que apresentaram diferença significante (p<0,05) foram AP e APR (p=0,037), AP e CEAP (p=0,011), AP e GN (p=0,009), APR e GN (p=0,006) e CEAP e GN (p=0,004) (Figura 4C).
Figura 3 – Expressão imuno-histoquímica de CD105 nos grupos GN- Glândula salivar normal, AP- Adenoma
