RESPOSTA DE PBMC FRENTE AO

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLANDIA CENTRODE CIÉNCIAS BIonIIEDICAs

CURSODE CIENCIAS BIOLOGICAS

RESPOSTA DE PBMC FRENTE AO

ESTRESSE

EM

PACIENTES CORONARIANOS SUBMETIDOS

A

TRATAMENTO CLÍNICO NO

HC-UFU DE

UBERLANDIA, MINAS GERAIS.

RONALDO ALVES

MonografIa

apresentada à coordenação

do curso

de

Ciências Biológicas,

da

Universidade Federal

de

Uberlândia,

_{para a}

obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas.

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CURSODE CIENCIAS BIOLOGICAS

RESPOSTA DE PBMC FRENTE

Ao

ESTRESSE

EM

PACIENTES CORONARIANOS SUBMETIDOS

A

TRA

TAMENTo

CLINICO

No

HC-UFU DE

UBERLÃNDIA, MINAS

GERAIS.

RONALDO ALVES

ORIENTADOR: Prof. Dr.ERNESTOAKIO TAKETOMI

Monografia

apresentada à coordenação

do curso

de

Ciências Biológicas,

da

Universidade Federal de Uberlândia,

_{para a obtenção}

do grau

de

Bacharel em Ciências Biológicas.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLANDIA CENTRODE CIENCIAS BIONIEDICAS

CURSODE CIENCIAS BIOLOGICAS

RESPOSTA DE PBMC FRENTE AO

ESTRESSE

EM

PACIENTES CORONARIANOS SUBMETIDOS

A

TRATAMENTO CLÍNICO NO

HC-UFU DE

UBERLANDIA, MINAS

GERAIS.

RONALDO ALVES

, / .

APROVADA PELA BANCA EXAMINADORAEM O“!

/º

ºf

Irªí/Nota

IQ

90

Prof. Dr. Ernesto AkioTaketomi Orientador

Profª Drª. Maria Aparecida de

Souza

Prof. MS. Jair Pereira da Cunha Jr.

Uberlândia, '

A

Dens,

_por

me abençoare me inspirar,

por

permitir a minha existência e iluminar sempre os

menspassos na diretriz do hem. Aquele qne senrbre nos carrega nos braços nas travessias mais

difíceis de nossa vida.

A

minha querida mãe, Rnth Rodrignes Alves, pelo amor, pelo apoio moral, pelo exemplo de

lata, trabalho, perseverança, disciplina, dinamismo e libertação. Agnelo _ane em sens hraeos temos de _amorme envolve de _alegria,pag, sentimento de luta e de _esperanea.

Ao

doee aconchego

ane sempre enlagaomen ser.

Ao

men Pai, Sebastião Custódio Alves, pelos cuidados na fase de criança e adoleseêneia,pelo

exenÇJlo de trabalho, honestidade e responsabilidade;pelo amore carinho _anetem

por

mim e_qne,

mesmo distante se

faz

_presenteem menspensamentos

A

mens irmãos, Alair, Aparecida, Anália, Vilson, Laércio e Geraldo, minhas ennhadas e

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Ernesto Akio Taketomi, pela orientação,

acesso e

oportunidade

de

ingresso no laboratório, pela confiança

e presença

durante

todas as etapas

da

pesquisa.

A MS. Mônica C. Sopelete, pela amizade, extrema

dedicação,

competência

e

profissionalismo, que vão além do muito

_que

lhe compete. Por todo o

seu

auxílio

_e

sugestões,

os

quais

contribuíram fundamentalmente

_para

a realização

deste

trabalho

A _{Dra. Deise Aparecida}

_de

_{Oliveira Silva, pela amizade, por}

todas as sugestões e

observações que

fez com relação ao experimentos os

quais

foram de

_grande

valia na resolução

de

vários problemas.

A Dra. Maria _{Aparecida de Souza, pela co-orientação,}

_{atenção e}

disponibilidade

dispensada

nos momentos

necessário e

sobretudo pelo profissionalismo

e

amizade.

Ao MS. _{Jair Pereira da Cunha Júnior, pela}

_sua

boa vontade em

ser

meu co-orientador

_e

participar

da

minha avaliação,

e

pela

sua

vontade

de aprender e

pelo

seu

profissionalismo.

Aos funcionários do Laboratório Imunologia, Antônio Tomás (Junião), pela amizade

e

pela

sua

boa disposição em colaborar quando precisei;

e ao

Max pela

sua

atenção.

Aos professores, amigos

e colegas

do laboratório pela convivência agradável.

“Ã

satisfação está

no

esforço

feito

para

alcançar

o

objetivo;

e

não só tê—lo

alcançado”

“Mahatma Gandhi”

“Quando

alguém

tem

força

_para

vencer

a

si

mesmo,

nasceu

_para

grandes empreendimentos”.

“Jean

Baptiste

SUMÁRIO

Páginas

1- INTRODUÇÃO ... 01

1.1— ConceitodeEstresse _...03

1.2- O_{Sistema Imunológico ... 04}

l .3- _{Psiconeuroirnunologia ...} 05

1.4- _{Estresse em Sistema Imunológico ...} 07

1.5- Estressee Sistema Cardivascular ... 07

1.6- _{Proliferação Linfocitária ...} 08

2- OBJETIVOS_... 13

3- MATERIALEMÉTODOS_... 14

3.1- _{Pacientes ...} 14

3.2- _{Grupo Controle ...} 15

3.3- Avaliação _{do Estado Imunológico ...} 15

3.4— Obtenção deCélulas Mononueleares do Sangue Periférico Humano ...16

3.5- Medida da Atividade Funcionalde_{Linfócitos ...} 17

3.5.1 _{Resposta Linfoproliferativa...} 17

3.5.2 Produção de_{Citocinas ...} 18

3.5.3 _{Detecção das Citocinas}IFNy e IL-5 _... 19

3.6 Análise _{Estatística ...} 22

3.7 _{Normas de Biossegurança ...} 22

4- RESULTADOS ... 23

4.1-

_Resposta

Linfoproliferativa _{... 23}

4.2- Cinética

dos

Níveis

de

_{Citocina ... 25}

4.3- Correlação entre os Níveis

de

IFNy

e

os níveis

de

tL—õ_{... 30}

4.4- Relação IFNy/IL—5 _... 32

5- DISCUSSÃO ... 35

45- CONCLUSOES_... 45

7- REF-ERÉNCIAS BIBLIOGRÁFICAS_{... 47}

1. INTRODUÇÃO

Nos últimos

_anos

_{tem ocorrido uma rápida}

_{expansão das pesquisas}

_que enfocam

_as

_{relações existentes entre a}

imunidade, o comportamento

e

o

sistema

neural. Embora

_as

_pesquisas

_{em psiconeuroimunologia sejam relativamente novas,} existem informações

resultantes de observação

clínica

e

experimental, sugerindo

que

a função imune pode

ser alterada

por

processos

psicológicos. Existem também evidências sugerindo

_{que estados}

afetivos

e características de personalidade estão

associados

com diferenças na função imunológica. Assim _sendo, o

sistema

imunológico comporta-se como um elemento

especial dos sistemas

homeostáticos, alvo da interferência neuroendócrina, ativado em

condições

importantes

de quebra

da

_{homeostasia, como por exemplo, numa infecção.} O

sistema

imune

_{parece ser}

modulado não

somente

por mecanismos

de

realimentação mediados

através de

processos

endócrinos

_e

_{neurais, mas também por mecanismos}

de

alimentação

a

partir

de

informações

_{que são}

vivenciadas,

aprendidas e

interferentes no mecanismo imunológico(ADER

et

al,1990).

Vários

estudos

envolvendo condicionamento,

estresse,

fatores

_{psicossociais}

neuroimune (MADDEN&_{FELTEN, 1995).}

Condições ambientais

_{e fatores}

_{psicossociais, tais como multidão, barulho,}

separação

maternal

_precoce

_e

_{aspectos da}

_{manipulação de grupos animais podem} influenciar

_a

imunidade. Em _humanos,

_mudanças

_{em várias medidas da função} imune têm sido

_{relacionadas após eventos estressantes da}

_{vida, como morte}

_de

uma

_{esposa, depressão e}

nível de

_estresse

_em

_{estudantes de}

_medicina

_{durante a}

época de exames

(MADDEN& _{FELTEN, 1995).}

A _{ocorrência de}

_estresse

_{implica num conjunto}

_{de alterações}

_{fisiológicas}

_e

psicológicas

_{que age}

_{influenciando na}

_{manutenção da homeostase}

_{do organismo}

(SELYE, 1956). Uma

_dessas

_{consequências refere-se a sua}

_influência

_sobre

_o

sistema

imunológico

dos

indivíduos, os

_quais

_pela

_{imunossupressão que}

_sofrem ficam _{desprovidos de valiosos mecanismos}

_{de defesa e adaptação}

_(VOLHARDT,

1991; GLASER, KlECOLT—GLASER, _{1994; COHEN} & _{HERBERT, 1996). Este fato}

acarreta

maior vulnerabilidade

_às

_infecções

_e

_{aumento na}

_{predisposição a}

apresentarem determinadas

_patologias (COHEN & _{HERBERT, 1996; MAlER}

_et

_al,

1994; O'LEARY, 1990; BlONDl &ZANNINO, 1997).

A _{vulnerabilidade}

_às

_infecções,

_que

_{por si só constituem uma ocorrência} importante, pode adquirir contornos dramáticos,

_se

considerarmos

_{a sua presença}

em

certas condições

como

as dos

periodos pós-operatórios.

A _cirurgia

_{de revascularização}

_coronariana

_{enquadra-se entre}

_as

_condições em

_que

tais

_{consequências são}

_{particularmente importantes, pois exige}

_que

_o

organismo

seja

submetido

_a

_{procedimentos extremamente}

_{agressivos e}

_{debilitantes,} forçando

_{a responder}

_com

_{todas as suas}

_{possibilidades curativas ou}

_reparadoras

em uma

reação

muito _aguda.

acrescenta—seo

estresse

psicológico, pré—cirúrgico (PIRES

et

al, 1994), visto

ser

o

coração

considerado, no imaginário coletivo, como o órgão

da

vida,

_{aquele que}

mantém o

_ser

vivo ou

_{que decreta a sua}

morte. Temos assim um quadro em

_que

pode—se

reconhecer que

o organismo

está sendo

obrigado

a

existir

_e

funcionar, na maioria

das

_{vezes, em}

_condições

limites.

1.1. CONCEITO DE ESTRESSE

De conformidade com SELYE (1956),

estresse

refere-se

ao conjunto

de

manifestações

fisiológicas

_que

o organismo

apresenta quando

confrontado com um estímulo

_ameaçador.

Ao _{estímulo com propriedade}

_{de desencadear}

_o

_{processo de}

estresse

dá-se

o nome de

estressor.

A

_{característica que}

_confere

_a

_{um estímulo}

_a

propriedade

de

se

tornar

_{estressor é que}

o mesmo

seja ameaçador

ou excitador

para

o organismo. Como enfatiza LlPP _(1996), “o fato

_{que desencadeou}

tal

processo é considerado

um

estressor,

mesmo

_{que seja}

de

natureza

benigna ou

até

mesmo positiva”. A

_concepção

do

estresse, segundo

SELYE, enfatiza os

aspectos

fisiológicos. Isto _{significa que, mesmo}

_sabendo

_dos

_aspectos

_{psicológicos} envolvidos na referida

_reação,

SELYE

_sempre

centrou

_{seu interesse}

_na

_pesquisa

do componente fisiológico da mesma. Coube

_a

LAZARUS

_(apud

_{TAYLOR, 1986)}

esclarecer

como

se

dá

_a

_{participação do}

_sistema

_{psicológico na produção e/ou}

desencadeamento da reação

do

estresse. Segundo

LAZARUS,

_ao

_se

confrontar com um novo estimulo, o indivíduo

efetua

_{uma avaliação primária no sentido}

_de

estabelecer

_se

o mesmo

é

benéfico, neutro ou maléfico em

suas consequências

para

o organismo. Após

_{esta, segue-se}

uma avaliação

secundária

visando“

que

tal estímulo lhe_{impõe. Assim, psicologicamente falando,}

_{a reação de}

_estresse

_e

uma decorrência

das duas

_{avaliações.}

No

_presente

_{estudo, classificamos}

_{os estressores}

_{como biológicos, conforme}

sua

a

natureza

física ou quimica

_e

_{como psicológicos}

_{aqueles de natureza}

_psíquica. E _{definimos como}

_estresse

_biogênlco

_aquele

_{produzido por ou}

originado de,

estressores

biológicos;

e

como

estresse

psicogênico

aquele

produzido por, ou originado de,

estressores

_{psicológicos.}

1.2.

0

SISTEMA IMUNOLÓGICO

O

_sistema

_imunológico

_é

_o

_responsável

_{pela proteção do organismo contra}

a

invasão

_{de agentes}

_{nocivos, tóxicos ou infecciosos, provenientes do meio externo.} Tais

_{agentes, ao}

_{penetrarem nos tecidos ou caírem na corrente}

_sanguínea,

desencadeiam

um conjunto de

_{respostas dos órgãos que}

_{compõe o}

_sistema

_imune, resultando na ativação

de

células

_e

_produção

_{de substâncias}

_{que irão destruir ou} inativar

_{a ação dos}

_mesmos.

_{Apesar de destinado}

_{primariamente}

_{à defesa}

_do

organismo contra

_{a ação de agentes e substâncias estranhas ao}

_mesmo

_(antígenos

não próprios), em

determinadas

_{condições, tais mecanismos}

_de

_{proteção falham,}

podendo

ser

acionados

contra células

_{e substâncias}

_{do próprio organismo}

(antígenos

_{próprios), resultando em um grupo}

_{de doenças chamadas}

_{auto—imunes}

(ABBAS

et

al., 1998; SCROFERNEKER& _{POHLMANN, 1998). Deve—se}

_acrescentar

ainda

_{que, mesmo no cumprimento do}

_seu

_papel

_de

_{proteção do organismo, 0}

sistema

_{imune pode, por}

_sua

_ação,

_{causar danos}

_e

_lesões

_às

_estruturas

_do

organismo, provocando sintomas

_e

_doenças

_{(SCROFERNEKER} & _POHLMANN,

desempenha

importante função

_{nos processos de reparação dos}

tecidos

_{após estes}

sofrerem

lesão

(MAIER

et

al., 1994).

Reconhece-se a

existência de dois tipos

de

imunidade:

_a

inata

_{e a}

_adquirida. A imunidade inata

_é

_{natural ou não—especifica}

_e

_{fornece uma}

_proteção

_{geral contra}

todos

os tipos

de

invasores. Compreende

a

pele,

as secreções ácidas e as

enzimas digestivas (ROSSI, 1994), um conjunto

de

células

_{especializadas}

_(fagócitos,

eosinófilos, células exterminadoras naturais-NK) bem como

certos

tipos

de

moléculas

existentes

no

_sangue

(opsoninas, anafilatoxinas, interferons)

todos

já

presentes

no organismo

desde

o nascimento,

antes

do mesmo

ser

exposto

a

agentes

infecciosos ou tóxicos (ABBAS

et

al., 1998; SCROFERNEKER &

POHLMANN, 1998).

A _{imunidade adquirida}

_{é a que se desenvolve}

_{no organismo}

_{após sua}

exposição

_{aos agentes agressores.}

É _{uma imunidade específica}

_e

_pode

_{ser de}

_dois tipos: imunidade humoral

_{que é}

_{mediada por moléculas do}

_sangue

_denominada

anticorpos

_{e que}

_{respondem pelo reconhecimento específico}

_{e a}

_eliminação

_dos

antígenos;

e

imunidade celular

_{que é}

_{mediada por células altamente}

_{especializadas,}

onde

os linfócitos T_{exercem um papel central (ABBAS}

_et

_{al., 1998).}

1.3. PSICONEUROIMUNOLOGIA

Até

meados

da

década de

60, o

sistema

imune

_era

_{conhecido por}

_ser

autônomo, reativo

_{somente aos antígenos e}

_{auto-regulado. Por}

_{esta época}

iniciaram-se

_as

_pesquisas

relacionando o

sistema

nervoso

ao sistema

imune. O termo psicoimunologia foi _{primeiramente}

_usado

_{por SOLOMON, no livro Emotions,}

nervoso central e, por

_{extensão, dos processo}

psíquicos,

sobre

o

sistema

imunológico(SOLOMON, 1993).

Na

década de

70 estabeleceram—se

_as

_bases

_{científicas que demonstraram}

as

_{interações entre processo}

psíquicos,

sistema

nervoso central

_{e sistema}

imune. Credita—se

_a

ADER _{o pioneirismo da comprovação experimental}

_{das relações}

mente-sistema imune, ao

estabelecer

o _{condicionamento paviloviano da}

_resposta

imune

_{e a}

_criação

_deste

_{novo campo}

_{de saber}

_{multidisciplinar conhecido como}

psiconeuroimunologia (ADER& _{COHEN, 1975).}

O _{desenvolvimento}

_da

_{psiconeuroimunologia significou profundas} modificações na

_compreensão

do

sistema

imunológico. Alguns dos

_aspectos

mais

marcantes nestas

_{modificações dizem respeito}

_{à questão da}

_autonomia

_{e da}

auto-regulação

do mesmo. A idéia

_{de que}

o

sistema

imune

_{era independente}

_em

_seu

funcionamento, isto é, livre

_{e soberano}

_em

_{suas funções defensivas e capazes de}

promover

_{os ajustes necessários para}

si _{próprio sem contar com}

_a

_{intervenção}

_de

outros

sistemas

orgânicos, foi _{substituída pela noção}

_de

_uma

_rede

_interacional formada pelo

sistema

nervoso central

e

o

sistema

psíquico,

sistema

endócrino

_e

sistema

imune,

_segundo

um

_{processo de regulação}

_{mútua (DIENSTFREY, 1990).} Esta mudança de enfoque foi além

da

_{simples mudança do ponto}

_de

_{vista estrutural}

para

o ponto

de

vista funcional. Ela _{rompeu com}

_os

_{dualismos mente-corpo,} organismo-ambiente, _{indivíduo—população (SOLOMON, 1993), implicando}

_a

1.4. ESTRESSE E _{SISTEMA IMUNOLÓGICO}

A

_{demonstração}

_{do envolvimento}

_da

_{mente na}

_regulação

_da

resposta

imune culminou no desenvolvimento

_de

_{um campo}

_{de pesquisa}

_{extremamente fértil, onde}

têm-se destacado os

trabalhos relativos

_a

_{influência do}

_estresse

_sobre

_o

_sistema

imune (GLASER & _{KlECOLT—GLASER, 1994), infecção por vírus}

(SHERlDAN &

DOBBS, 1994), imunodeficiência _{(KEMENY, 1994; SOLOMON}

_et

_{al, 1991),}

_câncer

(LESHAN,1992), _{bem como na aplicação}

_{de técnicas}

_{psicológicas como terapia}

coadjuvante

_{nestas e}

_em

_{outras condições}

_{(SMITH JR., 1989).}

_{Destas pesquisas}

emergiram uma

série de

_{conhecimentos correlacionando}

_{estresse e}

_sistema

_imune.

Deste _modo,

_sabe-se

_{hoje que: a) “um}

_{estressor pode}

_{tanto suprimir como estimular} diferentes

_respostas

_imunes

_ao

_{mesmo animal ou individuo”; b)}

diferentes

estressores

podem

ter

diferentes efeitos

_sobre

_{o mesmo parâmetro imune;}

_{e que}

_há um número de variáveis

_que

_interagem

_para

_{determinar o resultado imunológico da}

administração

de

um

estressar

(MOYlNlHAN

_et

_{al., 1994).}

1.5. ESTRESSE E _{SISTEMA CARDIOVASCULAR}

Desde os

primeiros

_{trabalhos de}

_{SELYE, reconhece—se que o}

_sistema

cardiovascular

e

um dos

_que

_{mais prontamente}

_respondem

_as

_demandas

_impostas

por um

estressor.

_{Aumento na frequência cardiaca, na}

_pressão

_arterial

_e

vasoconstricção

são

alguns dos

bens

_{conhecidos efeitos produzidos pelo}

_estresse

sobre

o

sistema

_{cardiovascular. Os}

_{clássicos trabalhos sobre personalidade}

tipo A

(FRlEDMAN & _ROSEMANN,

_apud

_{DIENSTFREY, 1990), ou}

_{então sobre}

os

ilustram tipicamente

_as

_{afirmações anteriores. Em}

_nosso

_{meio, LIPP}

_e

_ROCHA (1994) correlacionaram

_a

_{existência do}

_estresse

_no

_paciente

_{hipertenso com}

_a

qualidadede

_{vida do mesmo.}

No_campo

_{da doença}

_coronária,

_{diversas abordagens}

_{tem sido utilizadas}

para

evidenciar

_{possiveis correlações entre a}

_mesma

_{e caracteristicas}

_{psicológicas do}

paciente, como o tipo

de personalidade

_{ou o}

_seu

_{perfil psicológico ou ainda}

_seus

estados

emocionais (RIBEIRO

_et

_{al., 1992; ONGARO, 1991; OLIVEIRA, 1995).} Outros tem realçado

a

importância

_{de características}

_{do meio social}

_{e da}

_mudança social como

fatores de

risco

_para

o _{desenvolvimento da mesma (CAMPOS, 1992).} No_entanto,

_{as pesquisas}

_{têm evidenciado o importante papel do}

suporte

social

_{e da}

solidariedade

na

_prevenção

_{e/ou reabilitação do}

_paciente

_{coronário (CAMPOS,}

1992).

1.6. PROLIFERAÇÃO LINFOCITÁRIA

A _ligação

_{dos receptores de}

_membrana

_dos

_{linfócitos com}

_seus

respectivos ligantes

resulta

em uma

_{série de eventos}

_{intracelulares, coletivamente denominados}

de

ativação dos linfócitos T. _{Esta sinalização transmembrãnica}

_causa

_{uma mudança} no comportamente do linfócito _{culminando com}

_a

_ativação

_gênica

_induzindo proliferação

dos

linfócitos, _produção

_de

_anticorpos

_e

_citocinas

_entre

_{outros (ABBAS}

et

al, 1998).

A _{habilidade dos linfócitos em}

_responder

_{in vitro}

_a

_{um ligante em particular}

_é

frequentemente

utilizado

_a

nivel _{clínico ou}

_{de pesquisa}

_{com o objetivo}

_de

_avaliar

_a

capacidade

funcional

dos

linfócitos do

_sangue

_periférico.A _{mais conveniente forma}

vitro_(devido

_{ser de}

fácil _{quantificação}

_e

_{um método}

_{seguro quando}

_comparado

_aos

testes

in vivo),

_{onde os}

linfócitos (T) podem

ser

estimulados

de

maneira controlada

e suas respostas

podem

ser mensuradas adequadamente

(ABBAS

et

al., 1998). As

_respostas

funcionais

dos

linfócitos _podem

_{ser estudadas}

_{mais facilmente}

pelo uso

de

ativadores policlonais,

_que

_se

ligam

aos

complexos do TCR _(receptor

da

célula T),

independente

da

_sua

especificidade, simulando

_a

_{ativação do} complexo do TCR

_quando

_{induzidas pelo}

_{antígeno associado ao}

MHC _(ABBAS

et

al., 1998). Muitos _{ligantes ou mitógenos podem}

_atuar

_{como ativadores policlonais}

_e

estimular

_a

divisão

dos

linfócitos.

Muitas lectinas

_{de plantas}

_{têm sido utilizadas em vários}

_estudos

_{imunológicos}

devido

_seu

_{alto grau}

_de

_{especificidade por}

_{açúcares e}

_{poderem, em alguns}

_casos,

estimular células do

sistema

imune.

_Essas

_podem

_ser

_{classificadas,}

_de

_{acordo com}

a sua capacidade

em

aumentar a síntese de

DNA

e

_{de induzir transformação} blástica em

populações específicas de

linfócitos em: _{mitogênicas, não mitogênicas} ou indiferentes, (KÉRY, 1991).

Desta forma,

_os

mitógenos

_apresentam

origens

_{diversas podendo ser}

oriundos

_{de plantas}

_como

_as

_{lectinas Fito-hemaglutinina (PHA), purificada}

_a

_partir

de Phaseolus

vulgan's na

década

de 60, Concanavalina A _{(Con A) purificada de} Canava/ia ensiformis,

e

PWM _{(Pokeweed mitogen) isolada}

_de

_Phyto/ecoa americana,

de

produtos

bacterianos

(Cowan 1, derivados de Staphylococcus aureus),

de

químicos (PMA, _{Phaorbol myristate}

_{acetate), de antígenos}

_amplamente distribuídos na

natureza

(Cândida albicans

e

toxoide tetânico) ou ainda

_serem

citocinas

_e

_{anticorpos monoclonais contra}

_{receptores de}

_{superfície (anti-CDB ou}

anti—CDZ).

10

antigênica, com

_consequentes

_{modificações morfológicas, modulação fenotípica}

_de

determinantes de

_superfície

_e

_liberação

_de

_citocinas

_e

_{imunoglobulinas (WHISLER}

& _{YATES, 1980). Por outro lado,}

_{contrastando-se}

_com

_a

_{atividade antigênica,}

a

estimulação induzida pela Iectina leva

a

ativação policlonal

das

células imune (WHlSLER & _{YATES, 1980; MILLER}

_et

_{al., 1982).}

_{Observações posteriores}

sugeriram

_que

_as

_{lectinas mitogênicas interagem com TCR}

_de

_{linfócitos T, com}

ambas

_as

cadeias

_a

e

B

e

dessa

_forma, transmitem sinais mitogênicos, levando

_a

ativação policlonal

destas

células (CHILSON

et

al., 1984, LECA

_et

_{al., 1986} CLEVERS

_et

_{al., 1988).}

A PHA

_{e a}

_{Con-A, foram extensivamente}

_estudadas,

_no

_{que concerne aos}

seus

ligantes

_e

seus

efeitos biológicos

sobre

linfócitos.

_Esses

_{mitógenos podem}

_se

ligar

a

diferentes moléculas

de

superfície

das

células T;

dentre elas

_o

_{receptor de}

células T (TCR), (CHILSON & _{KELLY-CHILSON, 1989, LlCASTRO}

_et

_{al., 1993), o}

complexo CDB _(CLEVERS

_et

_{al., 1988), ou mesmo CD2 (LECA}

_et

_{al., 1986) (figura} 1).

Algumas lectinas

_empregadas

_no

_estudo

_{de ativação celular}

_apresentam

seletividade quanto

ao

perfil

de

citocinas induzidas

_e

alem

da

propriedade aglutinante,

_as

lectinas podem também

_apresentar

_{atividades imunomodulatórias}

tais

como

a

indução

_{de síntese e}

_liberação

_de

_{citocinas, estimulação}

_da

_{proliferação}

de

linfócitos

_e

_ativação

_de

_{citoxicidade induzida por células T (LlCASTRO}

_et

_al.,

1993).

O _interferon

_gama

_(lFN-y)

_é

_{uma glicoproteína homodimérica. Ele}

_é

produzido por linfócitos T auxiliar CDZ, TH1, THo

_e

_por

_{quase todos}

_{os linfócitos T}

CD;.

O lFN-y

é

um

_potente

ativador

dos

linfócitos

_{mononucleares e de}

_{neutrófilos,}

TCR

Figura 1. _{Esquema ilustrativo}

_da

_{ligação da lectina fitohemaglutinina}

(PHA)

_{nas cadeias}

alfa _(a)

_{e beta}

(B) do receptor da célula _{T (TCR).}

Fonte: LICASTRO

_et

al., 1993.

1]

células T CD.,+ _{virgens promove}

_a

_{diferenciação}

ao

subgrupo TH1

e

_inibindo

_a

proliferação

de

células THz_(ABBAS

_et

_{al., 1998).}

A lL-5

_é

_{uma citocina homodimérica com aproximadamente 40}

KD, _produzida pela

_{subpopulação}

TH2

dos

_{linfócitos T CD.;+}

_e

_{por mastócitos ativados. A}

principal função da lL-5

é

_{estimular o crescimento}

_e

_{diferenciação}

_dos

eosinófilos

_e

_ativação

dos

_{eosinófilos maduros (ABBAS}

_et

_{al., 1998).}

Desse

modo, devido

_{à sua}

fácil _aplicação,

_as

_lectinas

_{de plantas são}

utilizadas como

ferramentas

_biológicas

_adequadas

_{em várias investigações}

_de

processos

_{imunológicos mediados por células, principalmente na indução}

da

produção

de

citocinas

_{e da}

_{proliferação celular (PEACOCK}

_et

_{al., 1990).}

A

_resposta

_{proliferativa}

_{pode ser mensurada através de}

cultura

de

células do

sangue

total, células

_{mononucleares}

_{ou ainda em cultura}

_{de subpopulações de}

linfócitos. _{Contudo, em muitos}

_casos

_mais

_de

_{um tipo celular}

é

requerido

_para

_uma

dada resposta.

Desta forma,

_os

_{protocolos mais}

_{frequentemente}

_{utilizados nos}

ensaios

_{de proliferação celular utilizam—se}

_de

_células

_{mononucleares}

do

_sangue

periférico(PBMC) (CLEVERS

_et

_{al., 1988).}

Um

_dos

_mais

_{frequentes ensaios de}

_{proliferação}

linfocitária utiliza—se

_de

_uma medida indireta,

_a

_{estimativa da produção}

_de

_DNA,

_para

_avaliação

_da

proliferação. Esta estimativa

_é

_{realizada pela incorporação}

_de

_um

_nucleosideo

radioativo,

a

timidima

_marcada

_{com tritio (ªH-timidina) no DNA}

recém formado no

_processo

de multiplicação ou proliferação celular (KERY, 1991).

A

_resposta

_{proliferativa}

_{a antígenos}

_ou

_a

mitógenos

_{pode ser empregada}

clinicamente a nível

_{de pesquisa}

_em

_diversas

_{anormalidades como}

doenças

infecciosas,

_{neoplasias, stress,}

_cirurgias,

_{shock e doenças}

_autoimunes

13

2. OBJETIVOS

- Avaliar _a

_resposta

_{proliferativa}

_das

_{células mononucleares do}

_sangue

_periférico (PBMC) frente

_a

diferentes

doses

do mitógeno titohemaglutinina (PHA), em

pacientes

coronarianos submetidos

_a

tratamento clínico

_e

_{em indivíduos controles.}

— Caracterizar o perfil de citocinas (TH1/TH2) obtidas

das análises

PBMC

14

3. MATERIALE MÉTODOS

O _projeto foi _{desenvolvido sob prévia}

_{análise e aprovação}

_{pela Comissão} Nacional

de

Ética _em

_Pesquisa

_(CONEP).

3.1. PACIENTES

Foram

_{designadas para}

_{o grupo Clínico, 14 (quatorze)}

_{pacientes atendidos}

no Laboratório

_de

_{Clínica Cardiovascular do Hospital de Clínicas da Universidade} Federal

de

Uberlândia (HC-UFU), Minas _{Gerais, que}

_{após a}

_{primeira consulta,}

tiveram diagnóstico de

_doença

_coronariana

_e

_{indicação para tratamento clínico.}

Para ser

incluído no _{grupo experimental, os}

_{pacientes enguadraram-se}

_nos

seguintes

critérios:

- faixa

_{etária de}

_{30 (trinta) a 60}

_(sessenta)

_anos.

-

ausência

de

_doença

_{concomitante.}

-

resposta

_{ao protocolo}

_{de pesquisa}

_{(anexo II)}

—

assinatura

do termo

de

15

3.2. GRUPO CONTROLE

Foram

_selecionados

13 _{(treze) indivíduos}

_{aparentemente saudáveis, sem}

história

_{pregressa de}

_{coronariopatia,}

_doadores

_de

_sangue

_{do hemocentro do}

Hospital de Clínicas da Universidade Federal

de

Uberlândia _(HC-UFU).

_{Para serem}

admitidos ao estudo, os

_{doadores enquadraram-se nas seguintes}

_condições:

-

doadores

voluntários.

-

sem

sinais de

_doença

_{nos últimos 30 (trinta) dias.}

—

resposta

ao protocolo de

pesquisa

(anexo II)

-

assinatura

do termo de consentimento em participar do

_estudo

_{(anexo I).}

3.3. _{AVALIAÇÃO DO ESTADO IMUNOLÓGICO}

As

_{coletas das amostras}

_de

_{sangue para}

_{avaliação do}

_estado

_imunológico

dos indivíduos foram

_realizadas

_{na mesma oportunidade em que foram colhidos os}

dados para

medir o

_estresse,

ou seja,

após

_{a consulta médica para os indivíduos}

dos

_{grupos experimentais e,}

_{após a}

_coleta

_{de sangue}

_{para os indivíduos do grupo}

controle.

Para

avaliação da

_resposta

_{imune celular,}

_analisou-se

_{a atividade funcional}

de

linfócitos,

_que

_{foram estimulados inespecificamente com o mitógeno}

16

3.4. OBTENÇÃODE CÉLULAS MONONUCLEARES DO SANGUE PERIFÉRICO

HUMANO (PBMC)

Coletou-se

_cerca

de 35 ml

de sangue

_{em uma}

_seringa

_{contendo 5,8} ml de

ácido cítrico-citrato-dextrose (ACD) pH 6,9. O

_sangue

foi _{transferido para um tubo} de prolipropileno de 50 ml _{(Falcon, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes,}

USA),

seguindo-se

à centrifugação a 4059

a

15ºC _por 15 _{minutos (centrífuga 5804}

R-eppendorf, Hamburg, Alemanha)

_{para separar}

o plasma

dos elementos

figurados (hemácias

e

leucócitos). A _{seguir, o}

_sobrenadante

_(plasma) foi retirado

_e

transferido para umtubo

de

15 ml onde adicionou-se _1,2 ml _{de solução}

_de

_cloreto

_de

_{cálcio 0,5}

M

_e

_cloreto

de

_{magnésio 0,78} M _(CaClz / _MgCIz)

e

mantido em banho-maria a _37ºC

para

destibrinar. Após

este

tempo, retirou-se o soro

e

colocou-se novamente o tubo em banho-maria a 56ºC por 30 minutos

_para

_inativação

_{das proteínas}

do Sistema Complemento

presentes

no soro.

Paralelamente, adicionou-se solução salina

_tamponada

com fosfato 0,01M,

pH 7,2 (PBS) estéril, no tubo contendo os elementos figurados,

até

o volume de 40

ml

e após

_{homogeneizar transferiu-se 20} ml

_para

outro tubo

_e

_novamente

acrescentou-se

PBS estéril

até

completar o volume de 35 ml. Em _seguida, adicionou-se gentilmente 9 ml _{de histopaque (d = 1,077) na parte inferior da}

suspensão

celular,

seguindo-se à

centrifugação a 8719 a 15ºC _{por 20 minutos.} Em seguida, o

sobrenadante

(PBS + _plasma) foi

_desprezado

_por

_aspiração

_{com bomba} de vácuo, deixando

cerca de

1,5 cm do

sobrenadante

acima da nuvem celular

(PBMC),

a

qual foi

coletada

_{com pipeta}

_{Pasteur e}

_transferida

_para

_{um tubo,} completando-se com PBS

gelado até

15 ml

_e

_{centrifugou-se a 1509 por 10 minutos}

17

foi

_ressuspenso

_{com 5 ml de meio}

_de

_{cultura RPMI 1640 completo}

(meio RPMI contendo gentamicina

_e

_{soro autólogo a 10%)}

_{e a suspensão}

_{celular mantida em} banho

de

gelo

até

_{a contagem}

_das

_células

_que

_{foi realizada em câmara}

hemocitométrica de Neubauer.

3.5. MEDIDA DA _{ATIVIDADE FUNCIONAL DE LINFÓCITOS}

3.5.1 _{RESPOSTA LINFOPROLIFERATIVA}

A

_resposta

_{proliferativa}

_de

_{linfócitos T a partir}

_das

_{células mononucleares do}

sangue

periférico (PBMC) humano foi _{medida de acordo com a}

_seguinte

_técnica:

acertou-se a concentração de

_{células para} 2 x 106 _{células/ml. Colocou-se 100 ul (2}

x 105 _{células) da}

_suspensão

_{celular em}

_cada

poço

de

uma placa

de

96 _poços

_de

fundo chato (Falcon, Becton Dickinson _{Labware, Franklin Lakes, USA), estéril com} tampa, previamente adicionado de 20 pl de diferentes

_doses

_{(2,0 ug/ml; 0,5 ug/ml}

_e

0,125pg/ml) do mitógeno Fitohemaglutinina _{(PHA), completando—se o volume para} 200 uI/poço com meio _{completo autólogo, ou seja, 80 ul por poço.}

_Cada

_{amostra foi}

analisada

_{em triplicata. Após o plaqueamento, incubou-se em estufa}

_a

_{5% de COZ}

_a

37ºC por 72 horas (3 dias). Após 56

_{horas de}

_{proliferação,}

_as

_{células foram}

pulsadas

(25 pI/poço) com 0,5 “Oi de Timidina _{tritiada [ªH] (New England Nuclear,} Boston, USA) _{por poço}

_{e incubadas}

_{por mais 16 horas. As células foram}

_coletadas

em filtro de fibra de vidro _{(Cambridge Technology, Watertown, USA), por meio de} coletor

de

células (“Cell Harvester”- _{Cambridge Technology;} INC. _PHD).

18

foram adicionados 2 ml _{de líquido}

_de

cintilação, constituido por 1 l de tolueno

(Sunth, Diadema, _{Brasil), Sg}

_de

_{PPO (C15H11N0)}

(“2,5-Diphenyloxazole”)_(Merck, Darmstadt, Alemanha)

_e

_{0,1 g}

_de

_{POPOP (C24H16N202)}

["1,4-Bis (5-phenyl-2-oxazolyl)

_benzena,

_{2,2'-p—phenylene-bis}

(5-phenyloxazole”)] (Merck,Darmstadt, Alemanha) em

cada

_{tubo contendo os filtros oriundos de}

_cada

poço da placa de cultura. Os tubos foram lidos _{em contador B de cintilação líquida (Beckman}

LS_6000, Liquid Scintillation

System,Fullerton,USA) em c.p.m (contagem por minuto) do Laboratório de lmunoparasitologia da

_Faculdade

_{de Medicina do Triângulo Mineiro} (Uberaba-MG). Os resultados foram

_expressos

_{em cpm}

_e

_{em Índice}

_de

Estimulação (l.E.), _{calculado pela fórmula: l.E. = Média da triplicata}

(c.p.m.)

dos

_{poços com}

estímulo/Média da triplicata (c.p.m.) dos poços

sem

estímulo (com

_apenas

_meio

_de

cultura).

3.5.2 _{PRODUÇÃO DE CITOCINAS}

Para

_{a produção de citocinas, utilizou-se}

_{a seguinte}

técnica: Colocou-se 500 ul (1 _{x 10}6 _{células/ml) da}

_suspensão

_celular

(PBMC) em

cada

_{poço de uma placa de}

48 poços, previamente adicionada

_de

100 _{ul do mitógeno PHA em diferentes}

concentrações

(2,0; 0,5

_e

_{0;125 ug/ml), em seguida, adicionou-se 400}

ul

de

_meio completo autólogo completando o volume

_para

1000 pl. Em _seguida,

_a

_{placa foi} levada

_para

_{estufa a 5%}

_de

_C02

_a

_{37ºC por 2, 3}

e

5 _{dias, quando coletou-se, de} poços

independentes,

o

_{sobrenadante, e estocou-se}

_{a -70ºC}

_{até sua}

análise. Os

sobrenadante

foram

_analisados

_{quanto à produção de interferon-gama}

(lFN—y)

e

interleucina-5 (IL-5) _{pela técnica}

_de

_{ELISAde duplo anticorpo}

19

3.5.3 _{DETECÇÃO DAS CITOCINAS IFNJy E} lL-5

De _{umaforma geral,}

_as

_{citocinas lFN-y}

e

IL-5 _foram

_dosadas

_{por meio de um}

ensaio

imunoenzimático _{(ELISA - Enzyme—linked immunosorbent}

assay)

tipo sandwich. O

_teste

_{ELISA tem como princípio}

o _{reconhecimento da formação do} complexo antígeno-anticorpo _{(Ag-Ac). Num primeiro momento, ocorre}

a

interação entre um _{anticorpo especifico (anticorpo}

_de

captura), adicionado a uma placa de 96 poços, com um _{antígeno contido na amostra}

_testada.

_Em

uma

_{segunda etapa,}

ocorre

a

_{identificação do complexo Ag-Ac,}

_{através de}

_um

anticorpo específico ao

antígeno pesquisado,

_{conjugado a uma}

_substância

_{com alta afinidade de ligação a}

enzima

_{que será}

_{adicionada na}

_{fase seguinte}

(anticorpo

_{de detecção).}

Em _{seguida, adiciona-se o}

_substrato

com uma solução cromógena para a visualização dos resultados. O _grau

_de

_{reatividade do}

_{ensaio é analisado}

pela intensidade da coloração

_e

_determinado

_através

_{dos valores de}

_absorbância

em leitor de ELISA_{para microplacas.}

Neste experimento, os

testes

_{foram realizados}

_segundo

_protocolos

recomendados

_{pelo fabricante dos anticorpos (R&D Systems,}

USA) _{com algumas} modificações _{(figura 2). Em resumo, microplacas de poliestireno}

de

alta afinidade com 96 _{poços (Corning} — Laboratory

Sciences

Company, NY., _{USA.), foram}

sensibilizadas

_{(50 uI/poço) com os respectivos anticorpos monoclonais de captura:}

20

ÉAnticorpo de_captura

nti-citocina obrenadantede Acde detecçãoanti-citocina biotinilado

Estreptavidina-Peroxidase

Figura 2. _{Esquema do}

_ensaio

imunoenzimático (ELISA)

_para

determinação

dos

níveis de citocinas (IFN-y

e

IL-5) em

amostras de sobrenadantes

de cultura

de

PBMC. (a): anticorpo monoclonal

de

captura específico

a

citocina; (b): adição da amostra

de sobrenadante;

(c):

após

lavagem,

permanece

a citocina

específica

ligada

ao

Ac de captura; (d): adição do anticorpo de

detecção

biotinilado anti-citocina específico; (e): adição do conjugado estreptavidina-peroxidase (S-P); (f): _{revelação da}

_reação

realizada pela adição do

substrato

enzimático (H202

e

TMB); (g): adição

de

HgSO4 2N.

Em _seguida,

_{as placas}

foram

lavadas

_por 5

_vezes

_{em PBS contendo Tween}

20 (Polyoxyethylene - Sorbitan Monolaurate - SIGMA)

_a

0,05% (PBS-T) e,

subsequentemente, bloqueadas

com 200 uI/poço

de

solução de PBS adicionado de Soroalbumina Bovina (BSA -SIGMA) a 1% _por 1 h, em temperatura ambiente. Após

o bloqueio,

as

placas

foram

submetidas

a cinco ciclos

de

lavagem em PBS—T

_e

seguiu—se

a

adição (50 ul/poço), em duplicata,

dos sobrenadantes de

cultura(PBMC)

21

curvas padrões, em duplicata. utilizando-se para

cada

citocina

_pesquisada.

a respectiva citocina humana recombinante, em diluições

duplas seriadas

em meio

RPMI 1640 mais 10%

de

soro humano AB. A

_{concentração}

inicial

de cada

curva foi

de

10 ng/ml

_para

IFN—y

e de

20 ng/ml

para

IL-5. Após incubação, por 2h a

temperatura ambiente,

as placas

foram novamente

lavadas

por5

_vezes

com PBS-T.

Logo após, adicionou-se 50 _pI/poço

dos

anticorpos poiiclonais

secundários

biotinilados anti-IFN-y

e

anti-lL-5,

nas concentrações

de 0,2 pg/ml

e

0,5 pg/ml,

respectivamente, em PBS-T—BSA 1%. As microplacas foram, novamente,

incubadas

por mais 2h em câmara úmida a temperatura ambiente.

Procedeu-se

a novas lavagens, como anteriormente descrito

e

a adição (50

pI/poço) do conjugado Estreptavidina-Peroxidase (SIGMA - Sigma Chemical CO.,

USA. _{S-5512) na diluição 1:1000 em} PBS-T-BSA 1%, incubando-se

as placas

por

30 minutos

à

temperatura ambiente.

Após a última _lavagem (5X), a reatividade foi _{revelada pela adição de}

substrato

enzimático (50 pl/poço)

de

tetrametilbenzidina (TMB) ( Sigma Chemical

Co., USA), diluído em tampão citrato-fosfato 0,1M, pH 4,5

e

0,03% de H202 . Após

aproximadamente 10 minutos

de

incubação, a

reação

foi _{interrompida pela adição}

de

25 pl em

cada

poço

de

ácido sulfúrico (HZSO4) 2 N. A leitura foi _{realizada em}

leitor

de

microplacas ELISA_(TitertekMultiskan Plus MKIl _- Flow Laboratories, _USA)

em filtro

de

450 nm

_e

570 nm.

Os valores de

absorbância

obtidos

das amostras

dos

sobrenadantes de

cultura de PBMC foram convertidos em ng/ml

de

acordo com a curva padrão,

utilizando-se do software Microplate Manager PC

versão

4.0 (Bio-Rad Laboratories,

Inc., Hercules, CA, USA). Os níveis

de

citocina variaram 0,01

_a

10 ng/ml _para o

22

valores extrapolados acima da curva padrão, foram novamente

testadas

em maiores diluições.

3.8.ANÁLISE ESTATÍSTICA

Para

todos os cálculos

estatísticos

utilizou-se o sotware GraphPad Prism

versão

3.0 (GraphPad Prism Software, Inc).

Utilizou-se o

teste

“t “ _de

_{Student para comparações das}

_médias

_entre

_os

grupos

estudados.

A _correlação

_{de Pearson}

_{avaliou a correlação}

_dos

_níveis

_de

_{lFN-ycom os}

_de

lL-5.

Considerou significativos os

_{resultados menores que}

5% (p < _0,05).

3.9. NORMAS DE BIOSSEGURANÇA

23

4. RESULTADOS

4.1. RESPOSTA LINFOPROLIFERATIVA

A _figura 3 ilustra a

resposta

Iinfoproliferativa

de

células mononucleares do

sangue

periférico (PBMC)

de

8

_pacientes

coronarianos

e

de 7 individuos controles, estimuladas com fitohemaglutinina(PHA)em diferentes

concentrações.

Entre os

pacientes

coronarianos,

as

médias geométricas

da

incorporação de ªH-Timidina,

_pelas

PBMC não

estimuladas

(somente meio

de

cultura) ou

estimuladas com PHA

_{nas concentrações de}

2,0, 0,5

e

0,125 ug/ml foram

respectivamente de 401, 12410, 6649

e

750 cpm (contagem por minuto). Não houve

diferença significativa(p > _{0,05) quando}

_comparados

_com

as

médias geométricas

obtidas

entre

os indivíduos do grupo controle que foram respectivamente de 336,

13610, 10780

e

767 cpm (figura 3A).

Similarmente,

analisando

o índice

de

estimulação (IE), não houve diferença significativa(p > _{0,05) entre}

_as

médias geométricas obtidas de PBMC de

pacientes

Incorporação de

m 5000 *

20000“

15000*

10000“ H-Timidina

(cpm)

N01

|

índice

de

estimulação

(IE)

O L

Pacientes

24

:!

Meio

pHA _(2,0lig/m') PHA_(0,5pig/m')

PHA(0,125 lig/m')

p < 0,05

W

PHA (2,0tig/mi)

W

PHA (0,5 ug/ml)

W

PHA _{(0,125 ug/ml)}

Controles

Figura 3.

_Resposta

Iinfoproliferativa

de

PBMC,

_após

3

_{dias de}

cultivo,

estimuladas

com fitohemaglutinina (PHA)

_{nas concentrações de}

2,0; 0,5

e

0,125 ug/ml ou não estimulados (somente meio

de

cultura) de 8

_pacientes

coronarianos

e

7 indivíduos controles. Os

_{resultados expressos representam}

_{a média da} incorporação

de

3H-timidina_{em cpm (A);}

_{e a}

_{média do índice}

_de

_{estimulação (IE)}

25

ug/ml (1,9) quando comparada

as

médias de índice de estimulação obtidos pelos

indivíduos controles (41,2

e

2,4, respectivamente). Entretanto,

somente para

PBMC

estimuladas

com PHA _na

_{concentração}

_{de 0,5 pglml,}

_observou-se

valores

de

índice

de estimulação signiticativamente menores (p = _{0,0345) entre}

_pacientes

coronarianos (IE = _{17) que nos indivíduos controles (IE} = _{32,7) (tigura 38).}

4.2. CINÉTICA DA PRODUÇÃO DOS NÍVEIS _{DE CITOCINAS}

Para

verificar

os

níveis

de

citocinas (lFN-y

e

IL-5)

secretadas

nos

sobrenadantes de

cultura estimulou-se PBMC

de

14

_pacientes

coronarianos

_e

de 13 indivíduos controles com PHA

_{nas concentrações de}

2,0, 0,5

e

0,125 ug/ml. A cinética da produção

das

citocinas foi

_então

_avaliada

_após

_{2, 3}

_e

5 dias de estimulação com PHA2,0

e

0,5 pg/ml.

Analisando-se os valores de cpm,

constatou-se

que

as

melhores

respostas

Iinfoproliferativas foram obtidas

nas concentrações de

PHA 2,0

e

0,5 ug/ml. Quando

comparou-se os valores

de

IFN-y obtidos nos

sobrenadantes,

inicialmente

verificou-se

que

as

células

estimuladas

com PHA _na

_{concentração de}

0,5 ug/ml não

responderam

satisfatoriamente em relação a PHA _{2,0 ug/ml.} Desta forma, optou-se em realizar

os ensaios

imunoenzimáticos (ELlSAs)

_{para detecção}

de IFN-y

somente

nos

sobrenadantes

oriundos

de

culturas

estimuladas

com PHA _{2,0 pg/ml uma vez}

que

somado a

este

fato, não

_{dispunha-se de reagentes}

suficientes

_para

a realização

26

Conforme

_{pode-se observar}

_{na figura} 4, níveis de IFN-y (ng/ml) foram

detectados

em

todos

os

dias de

cultura.

sendo

_{que valores máximos foram obtidos}

27

100 —

+

PHA(2,0pg/ml)

10 _

+

Meio

É

E)

1 _

S

?-

0,1

-2

'à

0,01 —

Í?

71:

0,001

-0,0001 ! I | | | ]

o 1 2 3 4 5 6

Dias

_após

_{estimulação}

Figura 4. Cinética dos níveis de IFN-y (ng/ml)

detectados

em

sobrenadantes

de

culturas

de

PBMC

_{de pacientes}

coronarianos (linha contínua)

e

indivíduos controles (linha tracejada)

estimuladas

com titohemaglutinina (PHA) na

28

estimulação com PHA na

concentração de

2,0 pg/ml, fato

observado

tanto nos

sobrenadantes de

cultura

de

PBMC

_{de pacientes}

coronarianos como na cultura

de

indivíduos controles.

Houve diferença significativa

entre

a média geométrica dos níveis

de

IFN-y obtida nos grupos de

pacientes

coronarianos

_e

de indivíduos controles

após

2 _(1,7

vesus

3,0 ng/ml; p = _0,0321), 3 _(1,4

_vesus

2,6 ng/ml; p = _0,009)

_e

_{5 (0,5}

_vesus

_2,0

ng/ml; p = _{0,002) dias}

de

_{estimulação com} PHA

a

2,0 _pg/ml.

As médias

dos

níveis

de

IFN-y

detectados

nos

sobrenadantes

de cultura

sem

estimulação (somente meio) foram inferiores

às

obtidas

após

estimulação com PHA,

permanecendo

em níveis

basais

nos 3 dias

de

cultivo

analisados.

A_figura5 demonstra a cinética

dos

níveis de lL-5 _em

sobrenadantes

de cultura

de

PBMC

_{de pacientes}

coronarianos

_e

de indivíduos controles

após

2, 3

e

5 dias

de

estimulação com PHA

_{nas concentrações}

de 2,0

e

0,5 pg/ml. Desta forma,

observou-se

que IL-5 _{pôde também}

_{ser detectada}

nos

sobrenadantes

em todos os dias

de

cultivo, com valores médios máximos ao 3ºdia

após

estimulação com PHA

_a

2,0 pg/ml tanto para

pacientes

coronarianos

_e

indivíduos controles e, com PHA _a

0,5 pg/ml _{para indivíduos controles. Entretanto,}

_{para pacientes}

coronarianos, valor médio máximo

de

IL-5 foi

detectado

no 5º dia

após

estimulação com PHA a 0,5

pg/ml.

Não houve diferença significativa

entre a

média dos níveis

de

lL-5

detectados

nos grupos de

pacientes

coronarianos

_e

de indivíduos controles

aos

2 dias (0,6

verss

0,5 ng/ml; p =

05139),

3 dias (0,7

vesus

0,5 _{ng/ml; p} = _0,4037)

e

5 dias (0,7

29

10 1

1 _{* —+— PHA(2,0}

pglml)

É

+

PHA(0,5pg/ml)

Bu

+Meio

.

&

_0,1 _

“?

='

ª

&

É

0,01

-0,001 | | | I | |

O 1 2 3 4 5 6

Dias

_{após estimulação}

30

cultura de PBMC

_após

_{estimulação com} PHA

_a

0,5 pg/ml,

observou-se

não haver

diferença significativa

entre

os grupos de

pacientes

coronarianos

e

de indivíduos controles

_aos

2

dias

(0,2

vesus

0,2 ng/ml; p =

_0,58%),

3

dias

(0,2

vesus

0,2 ng/ml; p

= _0,5218)

_e

5

dias

(0,2

vesus

0,2 ng/ml; p = _0,9425)

_após

_{estimulação.}

A _{média dos níveis}

de

lL—5

detectados

nos

sobrenadantes

de cultura

sem

estimulação (meio) foram inferiores

aos

determinados nos

sobrenadantes

estimulados em

ambas as concentrações de

PHA _(2,0

_e

0,5 ug/ml),

permanecendo

em níveis

basais

nos 3 dias de cultivo

analisados.

4.3. CORRELAÇÃOENTRE OS NÍVEIS _{DE IFN-fy} E OS NÍVEIS DE IL-5

Analisando-se os

resultados das

médias quanto

aos

níveis

de

IFN-y (figura 4) maiores valores foram obtidos

_após

2 dias

de

estimulação com PHA 2,0 ug/ml.

Contudo para lL-5 (figura 5), os maiores valores foram obtidos com PHA 2,0 pg/ml com 3

_e

5

_{dias após}

estimulação, não havendo diferença significativa entre eles. Desta forma, optou-se correlacionar os níveis de lFN-ya 2,0 pg/ml

após

2

dias

com

os

de

lL-5

_{após a}

_{2,0 pg/ml 3} dias

de

estimulação.

Conforme

observado

na figura 6A, no _grupo

de pacientes

coronarianos não houve correlação (r = —0,2743)

entre

os níveis de lFN-y

e

de IL-5

detectados

_nos

sobrenadantes

de cultura de PBMC, respectivamente,

após

2

_e

3 dias

de

31

A

ª*

_r=—0,2743

7-

p=0,3425

cõª'

E

aS-o

&

rª“

É

3“

'

',

2-.'

1".

_:.

.

_.

0 l i 1 | | | | |

O 1 2 3 4 5 6 7 8

IL-5(ng/m|)

B

14

'

'

_r=-O,1423

12-

p=0,6429

É

10—

33

ª"

>—

.

z'

6"

LI-_

_{4_.,.}

2- ..

(:)—lº. _{| | | |} I | |

IL5

_(ng/ml)

Figura 6. Correlação

entre

os níveis

de

IFN-y (ng/ml)

e

IL-5 (ng/ml)

32

Entretanto, observou—se

_que

4

_{pacientes apresentaram}

_{produção significativa} de IL-5, não ocorrendo o mesmo

entre

os

sobrenadantes de

culturas de indivíduos controles. Alem _{disso, pode}

_ser

_{visto que o nível} médio

de

IFN-y produzidos

pelas

PBMC

_de

indivíduos controles foram

_{superiores aos observados}

no _grupo

de

pacientes

clínicos (figura 6A

e

GB).

4.4 RELAÇÃO IFN—y I IL-5

Não houve diferença significativa (p = _{0,1102) na média geométrica da} relação IFNJy / IL-5 obtida

entre pacientes

coronarianos (2,6)

e

indivíduos controles (5,7).

Apesar

de mostrar

tendência

menor

_{para pacientes}

coronarianos

_e

maior

_para

indivíduos controles, isto _{é, menor valor de} IFN-y em relação a IL-5, foi

observada

somente

em 2

_{pacientes e}

_{em nenhum dos indivíduos controles. Valores} significativos (relação lFN-y / IL—5 > ₁₎ foram

observados

_{em 12}

_pacientes