Avaliação da formação de biofilme por cepas de Salmonella spp. Isoladas de
linguiça frescal
Evaluation of the biofilm formation by strains of Salmonella spp. Isolated from
fresh sausage
DOI:10.34117/bjdv6n8-019
Recebimento dos originais: 08/07/2020 Aceitação para publicação: 05/08/2020
Laura Brenner Colling
Médica Veterinária formada na Universidade Federal de Pelotas Instituição: Universidade Federal de Pelotas – UFPel
Endereço: Avenida Eliseu Maciel, Campus Universitário, S/N - Capão do Leão – RS, Brasil E-mail: lbcolling@gmail.com
João Pedro Mello Silva
Discente do curso de Medicina Veterinária da Universidade Federal de Pelotas Instituição: Universidade Federal de Pelotas – UFPel
Endereço: Avenida Eliseu Maciel, Campus Universitário, S/N - Capão do Leão – RS, Brasil E-mail: jptam97@gmail.com
Gabriele Benatto Delgado
Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Veterinária da Universidade Federal de Pelotas Instituição: Universidade Federal de Pelotas – UFPel
Endereço: Avenida Eliseu Maciel, Campus Universitário, S/N - Capão do Leão – RS, Brasil E-mail: gabriele_delgado@hotmail.com
Flávia Aleixo Vasconcellos
Doutora pelo Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas Instituição: Universidade Federal de Pelotas – UFPel
Endereço: Avenida Eliseu Maciel, Campus Universitário, S/N - Capão do Leão – RS, Brasil E-mail: aleixo.fv@gmail.com
Samuel Rodrigues Félix
Doutor pelo Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas Instituição: Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia
Endereço: Avenida Leonel de Moura Brizola 2501, Bairro Pedra Branca, Bagé, RS, Brasil E-mail: samuelrf@gmail.com
Eduarda Hallal Duval
Docente da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal de Pelotas Instituição: Universidade Federal de Pelotas – UFPel
Rita de Cássia Conceição
Docente da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal de Pelotas Instituição: Universidade Federal de Pelotas – UFPel
Endereço: Avenida Eliseu Maciel, Campus Universitário, S/N - Capão do Leão – RS, Brasil E-mail: ritinhaconceicao@hotmail.com
Éverton Fagonde da Silva
Docente da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal de Pelotas Instituição: Universidade Federal de Pelotas – UFPel
Endereço: Avenida Eliseu Maciel, Campus Universitário, S/N - Capão do Leão – RS, Brasil E-mail: fagondee@gmail.com
RESUMO
Biofilmes são ecossistemas complexos. Eles consistem em um ponto de contaminação constante, causando grandes problemas para as indústrias alimentícias. As salmonelas são consideradas como um dos principais agentes patogênicos de produtos alimentares. Produtos cárneos em geral, são comumente implicados com a transmissão desse patógeno aos suscetíveis. Devido a essa importância, este estudo objetivou avaliar a formação de biofilme por cepas de Salmonella spp. nas temperaturas de 25°C e 37°C. Foram avaliadas 9 cepas, as quais foram isoladas, previamente, de linguiça frescal oriundas de diferentes marcas adquiridas no comércio da região de Pelotas-RS. A quantificação foi realizada utilizando um espectofotômetro de placas de microtitulação. Todas as cepas quando testadas a 25°C mostraram-se incapazes de formar biofilmes. Por outro lado, quando testadas a 37 °C, 33,33% (n=3) foram capazes de formar biofilme. Bactérias formadoras de biofilme são um ponto de contaminação constante e um potencial problema para as indústrias alimentícias e para a saúde pública, por isso os procedimentos de limpeza nas superfícies de equipamentos e utensílios devem ser rigorosos a fim de diminuir o risco de transmissão do agente aos alimentos.
Palavras-chave: Salmonelose, saúde pública, produtos cárneos, inspeção de carnes.
ABSTRACT
Biofilm are complexes ecosystem. They consist in a constant contamination point, causing great problems to the food industry. Salmonella spp. can be considered one of the main pathogen of food products. Meat products in general, are commonly involved with the transmission of this pathogen to susceptible animals. Due to this importance, this study aimed to evaluate the biofilm formation by strains of Salmonella spp. at temperatures of 25 ° C and 37 ° C. Nine strains were evaluated, which were previously isolated from fresh sausages from different brands acquired in the Pelotas- RS region. Quantification was performed using a microtiter plate spectrophotometer. All strains when tested at 25 ° C were unable to form biofilms. On the other hand, when tested at 37 ° C, 33.33% (n = 3) were able to form biofilm. Biofilm-forming bacteria are a point of constant contamination and a potential problem for the food industries and public health, so cleaning procedures on the surfaces of equipment and utensils must be rigorous in order to reduce the risk of transmission of the agent to foods.
1 INTRODUÇÃO
As salmonelas são os mais importantes patógenos bacterianos zoonóticos de origem alimentar dos seres humanos [1]. Produtos cárneos em geral, principalmente os oriundos de aves e suínos, são comumente implicados na transmissão das salmonelas aos humanos, as quais podem ser isoladas durante o abate dos animais [9,11]. As salmonelas são bactérias que podem formar biofilmes. Os biofilmes são ecossistemas complexos, formados por células sesseis, podendo ser tanto mono como multiespécie. Essas células produzem expolissacarídeos que auxiliam na sua adesão em superfícies [4]. Biofilme consiste em um ponto de contaminação constante, causando grandes problemas para as indústrias alimentícias. Após a formação do ecossistema, começa a ocorrer liberação de células de micro-organismos patogênicos e/ou deteriorantes, causando assim, comprometimento da qualidade microbiológica dos produtos [6].
No Brasil, durante o abate dos animais e no processamento das carnes, a legislação vigente prevê que sejam utilizadas ferramentas de controle das operações e do pessoal visando a diminuição de perigos microbiológicos em todas as etapas de obtenção desses produtos, garantindo assim a aptidão destes para o consumo humano [5]. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a formação de biofilme por cepas de Salmonella spp. isoladas de linguiça frescal de carne suína e de aves, em duas temperaturas de crescimento.
2 MATERIAIS E MÉTODOS
As cepas de Salmonella spp. utilizadas neste estudo foram isoladas de linguiças frescais compostas por carne suína e de aves, de diferentes marcas, as quais foram adquiridas no comércio de Pelotas-RS. Para a determinação de que as cepas isoladas possuíam capacidade de produção de biofilme, as incubações foram realizadas em placas de poliestireno para microtitulação (Nunclon, Nunc, Roskilde, Denmark), conforme a técnica descrita anteriormente [7]. Foram pipetados 200 µL de caldo Tryptic Soy Broth (TSB) em cada poço da placa de microtitulação e adicionados 20 µL de culturas overnight em TSB de cada cepa padronizada em espectrofotômetro a 600 nm para valores entre 0,8 e 0,9 de densidade óptica (DO). Poços com 200 µL de caldo TSB, sem cultura bacteriana, foram utilizados como controle negativo. Logo após, a tampa foi colocada sobre a placa e incubada durante 48 horas a 25 °C e 37 °C sem agitação. Durante o tempo de incubação, os biofilmes formaram-se sobre a superfície das cavidades, nas tampas. Para quantificar a formação de biofilmes,
ambiente por mais 30 minutos. O corante que permaneceu ligado ao biofilme foi extraído com ácido acético glacial 30% (200 µL). A DO de cada poço foi medida utilizando um espectofotômetro de placas de microtitulação. As cepas foram classificadas como: não formadora de biofilme, fracamente formadora de biofilme, moderadamente formadora biofilme ou fortemente formadora de biofilme, de acordo com os procedimentos descritos anteriormente [12]. O ponto de corte (DOc) foi definido como três desvios padrões acima da média das DO dos controles e a classificação foi determinada conforme mostrado a seguir [3]: (1) DO ≤ DOc = não formadora; (2) DOc < DO ≤ (2x DOc) = fraca formadora; (3) (2x DOc) < DO ≤ (4x DOc) = moderada formadora; (4) (4x DOc) < DO = forte formadora.
3 RESULTADOS
Neste estudo, quando os isolados foram avaliados a 37 °C encontrou-se três (33,33%) cepas formadoras de biofilme (Figura 1). Quando os isolados foram testados a 25°C, nenhuma das cepas de Salmonella spp. avaliadas foram capazes de formar biofilme (Figura 2).
Figura 1. Capacidade de formação de biofilme de isolados de Salmonella em linguiça frescal em cultivo a 37 °C. Onde: - as caixas representam o primeiro e terceiro quartil; - as linhas centrais das caixas representam o valor mediano; - barras dentro das caixas representam o desvio padrão (DP); - os marcadores (losangos) representam a média das DO. As linhas representam ponto de corte para formação fraca (pontilhada), moderada (tracejada) e forte (alternada), de biofilme.
Figura 2. Capacidade de formação de biofilme de isolados de Salmonella em linguiça frescal em cultivo a 25 °C. Onde: - as caixas representam o primeiro e terceiro quartil; - as linhas centrais das caixas representam o valor mediano; - barras dentro das caixas representam o desvio padrão (DP); - os marcadores (losangos) representam a média das DO. A linha pontilhada representa o ponto de corte para formação fraca de biofilme.
4 DISCUSSÃO
Nas condições deste estudo, foi possível demonstrar que cepas de Salmonella isoladas de linguiça frescal foram capazes de formar biofilme em placas de poliestireno, mimetizando um tipo de superfície industrial. Do total, 33,3% (n=3) dos isolados de Salmonella spp. foram capazes de formar biofilme, quando avaliados a 37 °C e incapazes quando avaliados a 25°C. Em um estudo realizado anteriormente [10], foram avaliadas 20 cepas isoladas de produtos cárneos, encontrando formação de biofilme em apenas 2 (10%), quando testadas a 37 °C. A diferença na prevalência de cepas formadoras de biofilme entre os estudos não é considerável e pode ser atribuída a fonte original de isolamento, visto que no presente estudo os isolados foram de carnes processadas, que tem mais chances de ser expostas a biofilme no maquinário industrial.
Em outros estudos, não é incomum encontrar porcentagens bem mais elevadas de isolados formadores de biofilme. Desenvolvendo um estudo similar em Botucatu [11], os autores encontraram 65,5% e 44,8% de isolados de Salmonella spp. formadores de biofilme a 35 °C e 28 °C, respectivamente. Da mesma forma, em um estudo realizado fora do Brasil, incluindo diversos cenários diferentes, os autores encontraram 93% e 90% de cepas formadoras de biofilme a 37 °C e 22 °C, respectivamente [14].
antimicrobianos [2]. Além disso, a formação de biofilme pelas salmonelas em estabelecimentos de processamento de carne representa um risco potencial de contaminação dos produtos [15]. Alguns desinfetantes amplamente utilizados nos estabelecimentos são incapazes de erradicar completamente os biofilmes formados por esses patógenos de origem alimentar, devido principalmente aos aspectos estruturais do biofilme e de substâncias poliméricas extracelulares bacterianas [15]. Dessa forma, os procedimentos de limpeza nas superfícies de equipamentos e utensílios devem ser rigorosos a fim de diminuir o risco de transmissão do agente aos alimentos em todas as etapas dos fluxogramas de produção.
Neste estudo, realizamos a caracterização preliminar de isolados de Salmonella, os quais foram isolados de linguiça frescal, quanto a capacidade de produzir biofilme em superfície e em condições de temperatura que mimetizam situações encontradas nos estabelecimentos produtores de matéria-prima e derivados cárneos. Estudos posteriores serão necessários para ampliar a caracterização desses isolados, como a formação de biofilme em outras superfícies [2] e outras condições de incubação [8], além de verificar o perfil de resistência frente aos principais agentes químicos sanitizantes utilizados na indústria [10,15], antes da expedição dos produtos.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a CAPES, CNPq e a FAPERGS pelas bolsas de estudo e pelos demais auxílios financeiros para a execução deste trabalho.
REFERÊNCIAS
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