Avaliação da qualidade higio-sanitária da carne de frango: pesquisa de Listeria monocytogenes por PCR

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À minha querida avó, aos meus irmãos e à minha

Orientadora Professora Doutora Maria João Fraqueza

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Agradecimentos:

Agradeço a todos aqueles que me ajudaram a realizar o estágio e esta tese de

mestrado integrado.

À minha orientadora, Professora Doutora Maria João Fraqueza pelo imenso

apoio ao longo deste trabalho que foi decisivo para a sua concretização, e

também pela motivação e ânimo que sempre me transmitiu, o rigor e a

sapiência que imprimiu a este trabalho e também pela ajuda em momentos

mais dificeis.

À Lena e à Zezinha, pelo enorme apoio que me deram no laboratório, por tudo

o que me ensinaram, pela grande amizade que sempre senti da parte delas e

que tão bem de mim trataram ao longo destes meses.

Ao Professor Doutor António Salvador Barreto, por ter permitido a realização

deste estágio na secção da tecnologia e por todo o apoio prestado.

A todos os restantes elementos da secção de tecnologia não referidos

anteriormente.

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Indice Geral

Revisão bibliográfica……….. 1

1. Importância da fileira avícola mundial e portuguesa. Perspectivas de futuro………... 1

2. Sistemas de Produção de aves……….. 5

3. Abate e desmancha de frango……… 5

3.1. Período que antecede o abate………..…….. 5

3.1.1. Jejum……….………. 5 3.1.2. Captura………... 6 3.1.3. Transporte………... 7 3.1.4. Repouso e Descarga………. 7 3.2. Abate………. 7 3.2.1. Dependura………... 7 3.2.2. Insensibilização………... 8 3.2.3. Sangria………. 9 3.2.4. Escaldão……….. 10 3.2.5. Depena………. 10

3.2.6. Corte das cabeças e das patas……… 11

3.2.7. Evisceração………. 11

3.2.8. Refrigeração- Arrefecimento rápido das carcaças……… 12

4. Contaminação das carcaças no abate e desmancha………. 13

4.1. Enterobacteriaceae………... 16

4.2. Listeria monocytogenes……….. 17

5. Listeriose nos animais……… 20

6. Listeriose Humana……… 22

6.1. Generalidades………... 22

6.2. Patofisiologia da Listeriose humana……….. 25

7. Epidemiologia……….... 28

8. Controlo da Listeria monocytogenes……….. 33

9. Causas de sucesso da Listeria monocytogenes………. 36

9.1. Modulação pelo Stress: Termotolerância da Listeria monocytogenes 38 9.2. Processamento como agente seleccionador de estirpes virulentas… 41 10. Metodologia de detecção de Listeria monocytogenes………... 41

10.1. Método clássico……… 41

10.2.2. Primers……….. 45

10.2.3. Temperatura………. 47

10.2.4. Extracção de DNA e PCR……….. 47

10.2.5. Estudo dos produtos de PCR………. 52

11. Limites e legislação……… 57

12. Análise de Risco………. 58

Materiais e Métodos……… 60

1. Colheita e selecção das amostras de peitos de frango………... 61

2. Colheita de Amostras do Ambiente Fabril……….. 61

3. Contagem de Enterobacteriaceae ………. 61

4. Pesquisa e Identificação da Listeria monocytogenes……….. 64

5. Contagem de Listeria monocytogenes………. 65

6. API Listeria………... 66

7. Optimização e validação da métodologia molecular de reacção em cadeia da polimerase (PCR) para pesquisa de Listeria monocytogenes………. 66

7.1. Preparação da estirpe de Listeria monocytogenes 4a para as inoculações………. 66

7.2. Preparação das suspensões para serem inoculadas……… 66

7.3. Inoculação das amostras de peito de frango……….... 67

8. Metodologia Molecular baseada na Reacção em cadeia da Polimerase – PCR para pesquisa de Listeria monocytogenes………… 69

8.1. Preparação das amostras………. 69

8.2. Extracção do DNA da Amostra……… 69

8.3. Reacção da Polimerase em Cadeia – PCR……….. 69

Discussão e Apresentação de Resultados………... 71

1. Enterobacteriaceas……….... 71

2. Optimização e validação da metodologia PCR……….. 77

3. Avaliação da segurança de amostras de peitos de frango: Pesquisa e contagem de Listeria monocytogenes .………. 82

Conclusão ………. 86

Perpectivas futuras………. 88

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Indice de Tabelas

Tabela 1: Produção da carne de frango registada entre 2001 e 2005 (adaptado de anuário pecuário, 2006/2007) ……….………... 2 Tabela 2: Frangos de carne abatidos e aprovados para consumo público em

Portugal nos anos de 2006, 2007 e 2008 (adaptado de INE, 2008) 2 Tabela 3: Prevalência de Listeria monocytogenes em animais de produção

de alguns países da União Europeia referente ao ano de 1998. (Adaptado de WHO, 2004)………...………….. 21 Tabela 4: Prevalência de Listeria monocytogenes em frangos em alguns

países da União Europeia (adaptado de EFSA, 2007)…….……….. 22 Tabela 5: Listeria monocytogenes em carcaças de frango e seus derivados,

2006 (Adaptado de EFSA, 2007)……..………..……… 29

Tabela 6: Toxinfecções alimentares de origem alimentar nos EUA (Adaptado

de IFP, 2004)……….………. 32

Tabela 7: Valores limites de detecção de ufc de Listeria monocytogenes por PCR ou por metodologias baseadas em PCR, em diferentes matrizes alimentares. ...……….…. 51 Tabela 8: Concentração de Enterobacteriaceae nas amostras de peitos de

frango…………..…... 71 Tabela 9: Resultado dos PCR das amostras de frango inoculadas

artificialmente para determinação da sensibilidade da metodologia

acoplada a PCR……….……… 77

Tabela 10: Resultados da contagem e pesquisa de Listeria monocytogenes em carne de peitos de frangos………

82

Tabela 11: Concentração de Listeria monocytogenes em diferentes apresentações de carne de frango……….……

Indice de Figuras

Figura 1: Gráfico que mostra a evolução da balança de pagamentos no sector da carne das aves, em volume (adaptado de Lima, 2008)... 3 Figura 2: Dependura de frangos no início da linha de abate ……….. 8 Figura 3: Sangria manual de produção extensiva (“frangos do campo”) ... 9 Figura 4: Carcaças de frango após o corte da cabeça pela articulação

occipito – atlóideia e das patas ao nível do tarso. ………... 11 Figura 5: Evisceração manual de de produção extensiva (“Frangos do

campo”)……… 12

Figura 6: Manifestações neuróligicas associadas à listeriose em ovinos (Adaptado de Vazquez – Boland et al., 2001)………..…….. 20 Figura 7: Possíveis evoluções da infecção por Listeria monocytogenes

após ingestão de alimentos contaminados (Adaptado de Vazquez-Boland et al., 2001). …………..………. 23 Figura 8: Listeria monocytogenes no interior da célula do hospedeiro

(Parmer, 2004)……… 26

Figura 9: Gráfico com a incidência de Listeriose humana nos países com aumentos estatisticamente significativos no intervalo de tempo de 1999 a 2006 (adaptado de Denny & McLauchlin, 2008)………..…. 31 Figura 10: Incidência de Listeriose humana por grupo etário (Adaptado de

Denny & McLauchlin, 2008)………. 31 Figura 11: Ciclo de vida de um fago quando infecta a sua espécies

bacteriana alvo (adaptado de Hagens, 2008)………..……... 36 Figura 12: Exemplo da reacção da polimerase em cadeia – PCR (adaptado

de Vierstraete, 1999)………..……. 44 Figura 13: Eventos iniciais de um PCR: desnaturação da dupla cadeia de

DNA e hibridação dos primers (adaptado de Vierstraete,

1999)………..… 44

Figura 14: Estudo dos produtos de PCR através de electroforese em gel (adaptado de Vierstraete, 1999)……..……….. 52 Figura 15: Métodos de detecção de fluorescência aplicados à metodologia

de PCR em tempo real (Adaptado de

ix

espectro que mais significativamente contribuem para diferenciar as cinco espécies de Listeria estão realçadas a cinzento (adaptado de Rebuffo et al., 2006)………..…. 57 Figura 17: Esquema da metodologia microbiológica para contagem de

Enterobacteriaceae em alimentos (adaptado da ISO 21528-2:

2004)……….. 63

Figura 18: Diagrama do método ISO 11290:1 para identificação de Listeria

monocytogenes em alimentos………..………. 64

Figura 19: Diagrama do método ISO 11290:2 para contagem de Listeria

monocytogenes em alimentos. ………..…... 65

Figura 20: Diagrama da obtenção da suspensão bacteriana de Listeria monocytogenes em BHI para posteriores inoculações e da confirmação das ufc/ml dessa mesma suspensão………. 67 Figura 21: Esquema do protocolo de inoculações para determinação da

sensibilidade da metodologia PCR. ………... 69 Figura 22: Gráfico com os valores de log ufc/g médios por bando em peitos

de frango……… 72

Figura 23: Gráfico com os valores médios de Enterobacteriaceae em log ufc/g nos diferentes dias de colheita de amostras de peitos de

frango………. 73

Figura 24: Valores médios de teor de Enterobacteriaceae (log ufc/g) em peitos de frango provenientes de três tipos de produção…………. 73 Figura 25: Gráfico com os valores médios do teor de Enterobacteriacea (log

ufc/g) em peitos de frango provenientes de produção extensiva

(Frango do campo)……….. 74

Figura 26: Gráfico com os valores médios do teor de Enterobacteriacea (log ufc/g) em peitos de frango provenientes de produção biológica….. 75 Figura 27 : Gráfico com os valores médios do teor de Enterobacteriacea

(log ufc/g) em peitos de frango provenientes de produção intensiva (Frango do campo)……….. 76 Figura 28: Ensaio 1, PCR das amostras de peitos de Frango em que foram

inoculadas concentrações crescentes de ufc/g e submetidas a vinte e quatro horas em meio Fraser ½ a 30ºC, quarenta e oito horas a 37ºC em meio de Fraser I e zero horas de incuçação correspondentes ao ensaio número um e onde se podem observar as bandas características de Listeria monocytoges nas bandas 9, 10, 11………...

Figura 29: Ensaio 2, PCR das amostras de peitos de Frango em que foram inoculadas concentrações crescentes de ufc/g, onde se podem observar as bandas características de Listeria monocytoges nas amostras 7, 9, 10, 11, 12, 13 3 14……….... 79 Figura 30: PCR das amostras de peitos de Frango em que foram inoculadas

concentrações crescentes de ufc/g e submetidas a 24 horas de incuçação a 30ºC em meio Fraser ½ correspondentes ao ensaio número dois e onde se podem observar as bandas características de Listeria monocytoges……….. 80