Mestrado Integrado em Medicina Veterinária
Ciências Veterinárias
Evolução da resposta serológica à vacinação contra o vírus
da doença de Gumboro em frangos de carne
Marco Daniel Ferreira Campelo da Silva
Orientador: Professora Doutora Ana Cláudia Coelho
Coorientador: Dr. Rui Sereno e Melo
UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO
VILA REAL, 2012
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Mestrado Integrado em Medicina Veterinária
Ciências Veterinárias
Evolução da resposta serológica à vacinação contra o vírus
da doença de Gumboro em frangos de carne
Marco Daniel Ferreira Campelo da Silva
Orientador: Professora Doutora Ana Cláudia Coelho
Coorientador: Dr. Rui Sereno e Melo
UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO
VILA REAL, 2012
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Agradecimentos
Ao Magnífico Reitor da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro pelas facilidades concedidas.
À Professora Ana Cláudia Coelho, por ter aceitado ser minha orientadora, por toda a ajuda prestada e disponibilidade demonstrada ao longo da realização deste trabalho.
Ao Dr. Rui Sereno e Melo, por toda a disponibilidade e por ter orientado todo o meu estágio em avicultura industrial, assim como a realização deste trabalho.
Ao corpo Técnico de produção da Empresa Norte Aves - Produção Avícola, Lda®, em especial do Eng. Firmino Loureiro, por me dado a conhecer o seu dia-a-dia como técnicos avículas e partilhando o seu conhecimento, assim como, a paciência demostrada todos os dias para comigo.
Aos Veterinários Oficiais do Matadouro Crizaves - Centro de Abate de Aves, S.A.®, Dr.ª Conceição Sobral, Eng.ª Fátima Cardoso e em especial ao Doutor Eusébio Ferreira, pelo apoio e paciência durante a minha passagem por lá.
À equipe laboratorial da Controlvet®, em especial a Dina, pela paciência e dedicação que dedicaram a mim e a este trabalho.
À direção da empresa Pintobar – Explorações Avículas Lda®, por me terem possibilitado a experiência e conhecimento da incubação artificial de ovos.
Aos amigos que de algum modo me apoiaram ao longo destes anos. Ao quinteto maravilha, pela amizade e cumplicidade durante estes anos, e que se mantenha por muitos e muitos mais. Pires, fico à espero do projeto para o aviário.
À Patrícia, pelo apoio incondicional.
À minha família, por todo apoio e paciência em todas as etapas da minha vida, em especial neste últimos 6 anos. Mãe, desculpa ter escolhido um curso tão longo.
Aos professores e funcionários da Universidade pela partilha de conhecimentos e dedicação aos alunos, nesta caminhada.
À cidade de Vila Real, que tão bem me acolheu.
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Resumo
A doença de Gumboro é provocada por um vírus altamente contagioso, causando altas mortalidades e imunossupressão em frangos em idades jovens. A vacinação tem um papel fundamental para o controlo e prevenção desta doença, sendo vários os tipos de vacinas disponíveis do mercado. A presente dissertação visou determinar a eficácia e a resposta serológica da proteção conferida por uma estirpe vacinal atenuada intermédia quente (estirpe Gm97- Laboratório hipra®), em frangos de carne (n=20), em condições de campo, assim como, verificar a influência de variáveis demográficas. Os resultados sugerem que a estirpe vacinal confere imunidade contra o vírus da doença de Gumboro, 15 a 18 dias após vacinação, sugerindo ainda a existência de uma janela de suscetibilidade à infeção natural entre o dia 19 e 34. Não se verificaram diferenças na transmissão de anticorpos maternos aos pintos associados ao sexo (p≥0,05), nem diferenças no desenvolvimento da imunidade nos diferentes sexos (p≥0,05). Os resultados obtidos sugerem novos estudos sobre a flexibilidade deste tipo de vacinas, no que respeita aos níveis de anticorpos no momento da vacinação.
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Abstract
The Gumboro disease caused by a virus is highly contagious, causing high mortality and immunosuppression in young chickens. Vaccination has an important factor in the control and prevention of this disease, and several types of vaccines are available on the market. This study aimed to determine the effectiveness and response of serological protection conferred by a vaccine strain attenuated intermediate plus (Gm97 strain- Hipra®) in broilers (n=20), under field conditions, as well as to investigate the influence of demographic variables. The results suggest that the vaccine strain confers immunity against the virus of Gumboro disease, 15 to 18 days after vaccination suggesting that exists a window of susceptibility to natural infection between days 19 and 34. There were no differences in transmission of maternal antibodies to sex-linked chicks (p≥0,05), or differences in the development of immunity in different sexes (p≥0,05). The results suggest new studies on the flexibility of this type of vaccine, as regards the antibody titers at time of vaccination.
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Índice
I. Introdução 1
II. Revisão Bibliográfica 2
1. Avicultura Industrial 2
1.1. Da domesticação de uma espécie ao nascimento de um sector
industrial 2 1.2. Avicultura mundial 3 1.3. Avicultura em Portugal 5 2. Doença de Gumboro 6 2.1. Referência histórica 6 2.2. Etiologia 7 2.2.1. Estrutura e genoma 7 2.2.2. Proteínas virais 8 2.2.3. Replicação do vírus 10
2.2.4. Variações antigénicas e de virulência 11
2.2.5. Propriedades químicas 12 2.3. Epidemiologia 13 2.3.1. Espécies suscetíveis 13 2.3.2. Distribuição mundial 13 2.3.3. Transmissão e disseminação 14 2.4. Imunopatogénese 14 2.5. Quadro clínico 18 2.6. Quadro lesional 19 2.6.1. Lesões macroscópicas 19 2.6.2. Lesões microscópicas 20 2.7. Diagnóstico 21 2.7.1. Diagnóstico diferencial 21 2.7.2. Diagnóstico histológico 22 2.7.3. Diagnóstico serológico 22 2.7.4. Diagnóstico virológico 23
vii 2.8. Prevenção e controlo 25 2.8.1. Profilaxia sanitária 25 2.8.2. Vacinação 26 2.9. Saúde Pública 30 2.10. Impacto Económico 30 III. Objetivos 31
IV. Material e Métodos 32
1. Caracterização da exploração 32
2. Biossegurança 33
3. Amostra 33
4. Caracterização do bando 34
5. Técnica de colheita de sangue 35
6. Determinação do título de anticorpos 36
7. Determinação da idade ótima de vacinação 37
8. Delineamento experimental 38
9. Vacinação 38
10. Análise estatística 38
V. Resultados 39
1. Títulos de anticorpos da amostra ao 2º dia de produção 39
2. Previsão da idade ótima de vacinação 39
3. Títulos de anticorpos após vacinação 40
4. Determinação do sexo das aves da amostra 41
5. Comparação das diferenças das médias entre os diferentes dias de recolha 42
6. Comparação do título de anticorpos entre sexos 43
7. Comparação das médias entre grupos com título de anticorpos diferentes no
momento da vacinação. 43
VI. Discussão 44
VII. Considerações finais 48
VIII. Bibliografia 49
viii
Índice de tabelas
Tabela 1 - Classificação taxonómica da galinha doméstica 2 Tabela 2 - Identificação individual e respetivo código 34 Tabela 3 - Tratamentos e profilaxia aplicados ao bando com respetivo princípio ativo,
nome comercial e início de tratamento 35
Tabela 4 - Atividade e respetiva data 38
Tabela 5 - Títulos de anticorpos obtidos pela técnica de ELISA ao 2º dia 39 Tabela 6 - Títulos de anticorpos registados nas sucessivas recolhas e número de
animais serologicamente positivos e negativos 40
Tabela 7 - Identificação do sexo para cada animal 41 Tabela 8 - Diferença das médias dos títulos de anticorpos entre os diferentes dias de
recolha 42
Tabela 9 - Comparação estatística das médias dos títulos de anticorpos entre machos e
fêmeas 43
Tabela 10 - Comparação estatística das médias dos títulos de anticorpos em função dos
ix
Índice de Figuras
Figura 1 - Percentagem de produção dos diferentes tipos de carne no mundo 3
Figura 2 - Produção e consumo dos sete maiores produtores e consumidores mundiais de
carne de aves 4
Figura 3 - Percentagem de aves abatidas e aprovadas para consumo em Portugal no ano
de 2011 5
Figura 4 - Representação esquemática do vírus da doença de Gumboro 8
Figura 5 - Representação esquemática da organização genómica e sua expressão
8
Figura 6 - Análise filogenética geral do vírus da doença Gumboro baseado na região
variável de VP2 11
Figura 7 - Distribuição geográfica das estirpes hipervirulentas do vírus da doença de
Gumboro 13
Figura 8 - Representação esquemática da imunopatogénese do vírus da doença de
Gumboro 17
Figura 9 - Aves com sinais clínicos da doença de Gumboro 19
Figura 10 - Escurecimento e hemorragias petequiais nos músculos peitorais evidenciados
na necrópsia de uma ave com sinais clínicos de doença de Gumboro
19
Figura 11 - A - Bolsa de Fabricius hipertrófica e edematosa evidenciada à necrópsia de
uma ave com sinais clínicos de doença de Gumboro: B – Pormenor da bolsa de Fabricius
hiperémica e edematosa 20
Figura 12 - Vista aérea da exploração 32
Figura 13 - Pormenor da exploração 32
Figura 14 - A - Pormenor da área reservada da amostra. B - Marcação individual dos
animais através de pulseiras coloridas nos membros posteriores 33
Figura 15 - Pormenor da recolha de sangue. A - Punção da veia braquial. B - Recolha do
sangue para o tubo de ensaio 35
Figura 16 - Representação esquemática do procedimento de ELISA realizado neste
estudo segundo o manual de procedimentos do kit BioChek® IBD ELISA – Holanda
37
Figura 17 - Pormenor da vacinação ocular 38
Figura 18- Relatório gerado pelo software da Biochek® para a previsão da idade de
vacinação 39
Figura 19 - Evolução do título de anticorpos da amostra com base nos valores medianos
x
Lista de abreviaturas
FAO Food and Agriculture Organization
OFIVAL National Interprofessional Office for Meat, Livestock and Poultry Farming
ORF Open Reading Frame
Kbp Quilo pares de bases
KDa Quilodaltons
Å ångström
VP Proteína viral
Mabs Anticorpos monoclonais
aa Aminoácidos
OIE Organização Mundial de Saúde Animal
IFN Interferão
IL Interleucina
SPF Specific pathogene free ELISA Ensaio imunoenzimático
VN Neutralização de Vírus
AGID Imunodifusâo em gel de agar
RT- PCR Reação de Polimerização em Cadeia – Transcriptase reversa
HVT Herpesvírus do peru
CV Coeficiente de variação
p Probabilidade
1
CAPÍTULO I.
Introdução
O aparecimento das doenças infeciosas têm um grande impacto na produção avícola, sendo um dos mais importantes fatores para a quebra de performances produtivas na avicultura industrial.
A doença de Gumboro é uma das doenças virais mais importantes na produção avícola. Afeta frangos jovens e o seu carácter altamente contagioso e imunossupressor provoca grandes perdas económicas, tanto direta, devidas as grandes mortalidades, como indiretamente, devido ao seu carácter imunossupressor (Van der Berg et al., 2000).
O vírus causador da doença, género Avibirnavirus, é altamente resistente à inativação, sendo necessárias medidas restritas de higiene e desinfeção. Contudo, estas medidas não são por si só suficientes em zonas de maior prevalência, sendo a vacinação uma importante ferramenta para o controlo e prevenção da doença (Müller et al., 2003).
Existem vários tipos de vacinas no mercado e vários programas de vacinação para cada tipo de produção: reprodutores, poedeiras e frangos de carne. As vacinas vivas atenuadas são amplamente utilizadas na produção de frango de carne (Van Der Berg et al., 2000). Existem múltiplos tipos de vacinas vivas atenuadas dependendo da natureza e do grau de atenuação da estirpe utilizada (Gardin et al., 2011). As vacinas atenuadas intermédias quentes (“plus”) são estirpes com menor grau de atenuação, sendo capazes de penetrar na presença de anticorpos maternos (Gardin et al., 2011).
O objetivo geral deste estudo, realizado no âmbito da dissertação de mestrado integrado em Medicina Veterinária, consiste em investigar o desenvolvimento serológico da imunidade, em frangos de carne, em resposta a uma estirpe vacinal comercial (estirpe Gm97 – Laboratórios Hipra®).
2
Tabela 1 - Classificação taxonómica da galinha doméstica (Fonte: Adaptado de www.itis.gov).
CAPÍTULO II.
Revisão bibliográfica
1 Avicultura Industrial
1.1 Da domesticação de uma espécie ao nascimento de um sector industrial
De acordo com várias evidências, a domesticação da galinha terá surgido há cerca de 8000 anos no sudeste Asiático, sendo que
todas as raças domésticas descendem do mesmo ancestral comum, a raça selvagem “red junglefowl” (espécie Gallus gallus) (Siegel et al., 1992; Yamashita et al., 1994, citados por Jensen, 2006). As características desta raça, desde a fácil adaptação a vários tipos de ambientes, assim como, o potencial de variação genética, ajudaram ao alastramento da sua domesticação a várias partes do mundo (Appleby et al., 2004).
Ao contrário da domesticação da maioria dos mamíferos domésticos, este tipo de animais era mais valorizado para cultos religiosos ou rituais pagãos e para desportos, como a luta de galos (Crawford, 1990; Appleby et al., 2004). Anos mais tarde, os romanos começaram a desenvolver os potenciais desta espécie como animais de quinta, para obtenção de alimento, procurando desenvolver raças, em especial para a produção de ovos, criando assim uma indústria rudimentar que já prestava atenção à criação, hospedagem de animais e controlo de doenças (Appleby et al., 2004). Com a queda do Império Romano, a seleção de raças de produção de alimento diminuiu de intensidade, sendo estes animais mais selecionados para as lutas de galos. Apenas no século XIX, com a abolição das lutas de galos em vários países, foram desenvolvidas novas aptidões destes animais para a produção, surgindo várias novas raças e fundadas várias sociedades de raças por todo o mundo, desde raças de maiores dimensões a raças miniatura, com plumagem e conformação semelhantes às demais, mas com tamanho reduzido (Appleby et al., 2004).
Nas últimas décadas têm surgido animais híbridos, que não são consideradas raças, mas sim estirpes e linhagens dentro da mesma raça (Appleby et al., 2004). Estas estirpes híbridas seguem 2 tipos de desenvolvimento distintos: a produção de ovos e a produção de carne, também denominados de “broilers”, sendo que ambas seguem o mesmo lema: a eficiência, máxima produção para o mínimo consumo de alimento (Appleby et al., 2004).
As aves híbridas para a produção de ovos dividem-se em 2 tipos: as aves híbridas “leves”, derivadas a partir da raça “White Leghorn”, com as fêmeas adultas com peso a rondar
Reino Animalia Filo Chordata Subfilo Vertebrata Classe Aves Ordem Galliformes Família Phasianidae Subfamilia Phasianinae Género Gallus
Espécie Gallus gallus
Subespécie Gallus gallus domesticus
3 Bovinos 22% Suinos 37% Aves 34% Ovinos 5% Outros 2%
Figura 1 – Percentagem de produção dos diferentes tipos de carne no mundo (Fonte: Adaptado de FAO Food Outlook Junho 2011).
os 1500 g e produção de ovos brancos, populares na Europa e EUA e as aves híbridas “médias”, derivadas da raça “Rhode Island Reds”, com peso das fêmeas adultas de cerca de 2000 g e ovos castanhos, mais populares no Reino Unido. As aves híbridas de produção de carne ou “broilers”, foram desenvolvidos a partir de raças “pesadas” como as raças “Cornish” ou “White Plymouth Rock”, caracterizadas pelo rápido crescimento, produção de carne e proporção de carne branca, assim como, uma boa conversão alimentar (Appleby et al., 2004).
Apesar da avicultura como indústria especializada ter dado os primeiros passos na era romana, apenas a partir do século XIX começou a ser desenvolvida. Este desenvolvimento começou por ser lento, surgindo nas últimas décadas grandes avanços científicos e tecnológicos, como a incubação artificial, o entendimento dos requisitos energéticos e produção de dietas balanceadas, redução e eliminação de doenças com base de planos de higiene, desinfeção, vacinação e terapêutica e manipulação ambiental e de fotoperíodo com desenvolvimento de ambientes controlados automatizados (Appleby et al., 2004).
1.2 Avicultura Mundial
O sector avícola é o sector de produção de carne mais dinâmico, registando nas últimas décadas um significativo aumento na produção e consumo mundial. No Oriente Asiático, a falta de abastecimento de carne de porco registada
em 2007 e as crises alimentares, resultaram numa mudança gradual no consumo de carne de porco pela carne de ave. Na Rússia e América Latina, ocorreu um aumento generalizado do consumo de carne, destacando-se a carne de aves. No médio Oriente, o crescimento no consumo foi ainda
mais significativo, pois devido a fatores socioculturais, o consumo de carne de porco é residual (FAO, 2010).
Segundo a FAO (2011), entre 2000 e 2008 ocorreu um aumento de cerca de 35% na produção de carne de aves, registando cerca de 94 milhões de toneladas em 2008, estimando-se que em 2011 tenha chegado aos 98 milhões de toneladas (FAO, 2011).
Cerca de dois terços da produção mundial de carne de aves encontra-se localizada nos 5 maiores produtores. Os Estados Unidos da América (EUA) lideram a lista, sendo o maior produtor mundial, seguindo-se a China, a União Europeia, o Brasil e o México (FAO, 2010). Na União Europeia a lista é liderada pela França, seguida de Reino Unido e posteriormente a Espanha (FAO, 2010).
4
Figura 2 – Produção e consumo dos sete maiores produtores e consumidores mundiais de carne de aves (Fonte: Adaptado de FAO Food Outlook Junho 2011).
Segundo dados fornecidos pela FAO, entre 2006 e 2007, o maior crescimento na produção registou-se na Ucrânia, aumentando cerca de 20%, seguido da Rússia que atingiu os
19% e a Colômbia com 10%, percentagens que se destacam do aumento mundial que foi de cerca de 4%. Na Ucrânia e na Rússia, este aumento da produção veio responder ao maior consumo das suas populações e da necessidade de reduzir a importação de carne de aves (FAO, 2010).
De entre os maiores produtores, o Brasil lidera o ritmo de crescimento de produção, sendo atribuído cerca de 20% do aumento total mundial da produção de carne de aves entre 1999 e 2006, seguindo-se os EUA com 15% e a China com 13% (FAO, 2010). Assim como a produção, o consumo de carne de aves tem vindo a aumentar, fruto de ser económica e por ser mais fácil de cozinhar. Segundo a FAO (2010), em 2008, o consumo de carne de aves aumentou cerca de 4%, sendo que o maior aumento registou-se na Rússia com cerca de 8%, seguido da China e do México, com 6% cada. Em 2008, a China ultrapassou os EUA, sendo o país de maior consumo de carne de aves, registando-se cerca de 18 milhões e 17 milhões de toneladas, respetivamente, seguindo-se a União Europeia (11,5 milhões de toneladas), Brasil (6,6 milhões de toneladas) e Rússia (3,4 milhões de toneladas) (FAO, 2010).
O consumo mundial de carne de aves é de cerca de 14 Kg/habitante/ano, sendo que a média na União Europeia situa-se em cerca dos 24 kg/habitante/ano (FAO, 2010).
A exportação da carne de aves tem vindo a aumentar nos últimos anos, registando cerca de 11% da produção mundial. Os EUA e o Brasil são os maiores exportadores registando, conjuntamente, cerca de 71% das exportações, sendo seguidos pela União Europeia, China e
0 5 10 15 20 25 30 35 E m m ilhõ es de ton el ad as (pe s o d a c arc aç a) Produção Consumo
5 Galinhas 3% Frangos de carne 81% Perus 12% Patos 3% Outras Aves 1%
Figura 3 - Percentagem de aves abatidas e aprovadas para consumo em Portugal no ano de 2011 (Fonte: Adaptado de INE, 2012).
Tailândia. Nas listas dos importadores, a Rússia lidera com cerca de 12%, seguido na China (10%) e do Japão (9%) (FAO, 2011).
A nível Europeu, na lista dos maiores exportadores consta a Holanda, Dinamarca e França, enquanto que, nas importações de carne de aves consta a Áustria, Grécia, Suécia e República Checa (FAO,2010).
A FAO (2010) avança, segundo a National Interprofessional Office for Meat, Livestock
and Poultry Farming (OFIVAL) que de todo o mercado de carne de aves mundial, a carne de
frango representa cerca de 86%.
1.3 Avicultura em Portugal
Em Portugal, a preferência dos consumidores por carne de aves tem vindo a aumentar nos últimos anos, apresentando um consumo de carne de aves de cerca de 29,7 kg/habitante/ano, dos quais 22 Kg dizem respeito ao frango industrial, situando-se muito acima da média europeia (MADRP, 2007).
Uma característica importante na preferência do consumidor pelo produto nacional está associada não só ao desenvolvimento interno do sector, com valores de auto-aprovisionamento de cerca de 95%, mas também ao hábito do consumo do produto em fresco, associado ao baixo preço desta carne em relação às demais e às campanhas em favor das carnes brancas, consideradas melhores para uma alimentação mais saudável (MADRP, 2007).
Segundo o Inquérito à Estrutura das Explorações Agrícolas de 2003, existiam em Portugal 227640 explorações de aves (146009 com frangos de carne e 204756 com poedeiras e reprodutoras), as quais possuíam 35434100 animais, sendo 19251865 para produção de carne. A produção de carne de aves centra-se,
na sua quase totalidade (86,5%) na Beira Litoral e no Ribatejo e Oeste (50% e 36%, respetivamente) (INE, 2007).
A carne de frango representa a maior parte da produção de carne de aves, tendo registado em 2010 uma produção de 253 mil toneladas (INE, 2011), embora tenha diminuído ligeiramente a sua importância relativa no total, entre 1987-91 e 2002-06 (de 84,2% para 80,9%) (INE, 2007). Esta descida resultou do aumento das produções de carne de peru e de pato, tendo contribuído para o aumento de produção destas carnes, não só, a melhoria das
6
condições económicas dos portugueses, como a oferta destes produtos nas grandes superfícies comerciais (INE, 2007).
A organização em sistemas de integração é uma característica marcante deste sector. Assim, com base em contratos estabelecidos com os principais grupos económicos do sector (os quais também estão organizados em sistemas de integração vertical) os produtores obtêm, matéria-prima (pintos do dia), apoio logístico e técnico e canais de escoamento. Os principais grupos económicos do sector possuem um nível de integração vertical que se pode considerar que encerra toda a fileira, incluindo empresas de alimentos compostos, estruturas de abate, transformação e comercialização, estando o mercado concentrado num número diminuto de operadores (MADRP, 2007).
2. Doença de Gumboro
2.1. Referência Histórica
Os primeiros casos de bursite infeciosa surgiram em 1957, relatados por Albert S. Cosgrove em frangos de carne na região de Gumboro, no estado de Delawere, EUA, ficando desde cedo conhecida como a “Doença de Gumboro” (Cosgrove, 1962). Aves até às 5 semanas de idade eram as mais afetadas e caracterizava-se pelo aparecimento de diarreia aquosa, seguida de anorexia, depressão, tremores, severa prostração e morte, exibindo morbilidade de cerca de 10% e mortalidade de 1 a 10%. Na necrópsia evidenciavam-se hemorragias nos músculos da perna e coxa, aumento de muco no lúmen intestinal, danos renais e aumento da bolsa de Fabricius (Cosgrove, 1962).
Devido às lesões tubulares degenerativas encontradas no rim foi designada de “Nefrose Aviária”, sendo apontado como agente causal uma variante do vírus da bronquite infeciosa (estirpe Gray) (Cosgrove, 1962; Lasher e Davis, 1997). Contudo, desde logo foram feitos esforços para determinar qual a verdadeira etiologia desta síndrome. De salientar os trabalhos efetuados por Allen Edgar e Youg Cho que designaram pela primeira vez o termo de “Infectious Bursal Diseases” em 1961 e, o importante contributo de Winterfield, Hitchner e Appleton na compreensão da etiologia e patogenia da doença (Lasher e Davis, 1997). No entanto, só em 1976, Nick, Cursiefen e Becht na Alemanha conseguiram descrever as características estruturais e de crescimento, e concluíram que devido à dupla cadeia de RNA, ao número e tamanho das proteínas que compunham o invólucro e ao ciclo de replicação, o agente causal não poderia ser classificado dentro de grupos já conhecidos, indicando que deveria ser colocado numa nova categoria taxonómica (Nick et al., 1976) surgindo a categoria dos Birnavírus (Dobos et al., 1979).
7
A doença dispersou-se rapidamente em várias regiões dos EUA entre 1960 e 1964, sem que os tratamentos convencionais (antibioterapia, suplementos vitamínicos) apresentassem qualquer resultado (Lasher e Davis, 1997). Entre 1962 e 1971 a doença chegou à Europa, alastrando também a outras regiões do mundo, tais como, Médio Oriente, sul e oeste de África, Índia, Extremo Oriente e Austrália (Van Der Berg et al., 2000).
Em meados dos anos 80, uma nova estirpe viral surgiu na região de Delmarva, nos EUA. Esta nova estirpe era capaz de quebrar a vacinação usada até então, sendo denominada de estirpe variante (McFerran et al., 1980).
Em 1987, foram diagnosticadas na Europa, estirpes hipervirulentas do vírus de Gumboro caracterizada pela severidade dos sinais clínicos e alta mortalidade sendo capaz de quebrar a imunidade materna (Van den Berg et al., 1991).
2.2. Etiologia
O vírus da doença de Gumboro pertence a família Birnaviridae, género Avibirnavirus. A família Birnaviridae foi criada para classificar os vírus com dupla cadeia de RNA (Dobos et al., 1979). Para além do género Avibirnavirus, a família Birnaviridae inclui também o género
Aquabirnavirus (vírus da necrose pancreática infeciosa dos peixes), o género Entomobirnavirus
(vírus X da Drosophila melanogaster) e o género Blosnavirus (vírus dos cabeça-de-cobra, que infeta os peixes cabeças-de-cobra, espécie Channa lucius) (Dobos et al., 1979; Delmas, 2008).
2.2.1. Estrutura e genoma
Quanto à sua estrutura e genoma é um vírus sem invólucro, forma hexagonal com simetria icosaédrica. A simetria do invólucro é composta por 32 capsómeros com diâmetro entre 55 a 65 nm. A estrutura é baseada numa camada simples em rede T=13 composta por subunidades triméricas (Bottcher et al., 1997; Luque et al., 2007). Imagens de microscopia crioeletrónica revelam que a superfície externa é composta por 260 “clusters” triméricos de VP2 e a superfície interna é composta por 200 estruturas triméricas em forma de Y de VP3 (Bottcher et al., 1997).
O genoma contém cerca de 6 kbp e consiste em 2 moléculas de RNA de dupla cadeia designadas de Segmento A e segmento B. O segmento A tem um tamanho compreendido entre 2,9 a 3,4 kbp e contêm duas Open Reading Frame - ORF (sub-região do gene que é sujeita ao processo de transcrição). A ORF mais longa codifica a poliproteína NH2-pVP2-VP4-VP3-COOH (110 kDa), que após um processo co-translacional transforma a poliproteína nas proteínas VP3 e VP4 e um percursor da proteína VP2, a pVP2. A pVP2 é processada por várias clivagens no terminal carboxilo formando a VP2 madura e 4 pequenos péptidos que permanecem associados à partícula viral (Mundt et al., 1995; Da Costa et al., 2002; Delmas,
8
2008; Dubovi, 2011). A OFR mais curta codifica a proteína não estrutural denominada VP5 (17 kDa). O segmento B tem um tamanho de cerca de 2,8 kpb e a ORF codifica a VP1, a RNA polimerase-RNA-dependente (97 kDa) (Da Costa et al., 2002). Em ambos os segmentos genómicos, existem pequenas sequências terminais 3´e 5´ a rodear o genoma alvo de transcrição (Mundt e Muller, 1995).
2.2.2. Proteínas virais
A VP1 é uma RNA polimerase-RNA-dependente, envolvida na replicação e transcrição do vírus. Existe como proteína livre ou como proteína de ligação do genoma (VPg) ligada à
Figura 5 - Representação esquemática da organização genómica e sua expressão. O segmento A contém duas ORF. A ORF1 codifica a poliproteína, que sofre processo co-traslacional formando VP4,
VP3 e pVP2. A pVP2 sofre várias clivagens na terminação carboxilo formando a VP2 madura e 4 pequenos péptidos. A ORF2 codifica a VP5. O segmento B codifica a VP1, uma RNA
polimerase-RNA-dependente (RpRd). Ligadas às terminações 5´do genoma existe a VP1 também denominada VPg (Fonte: Adaptado de Ashraf, 2005).
Figura 4 - Representação esquemática do vírus da doença de Gumboro. À esquerda a representação das proteínas da superfície externa VP2, assim como da superfície interna VP3. A dupla cadeia de RNA contendo na terminação 5´ VP1, também denominada VPg. À direita a estrutura em T=13 da superfície do vírus (Fonte: Adaptado de http://viralzone.expasy.org).
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terminação 5´do RNA (Delmas, 2008; Dubovi, 2011). É responsável pela replicação do RNA viral após infeção celular e síntese do mRNA (Spies et al., 1987). Estudos efetuados por Wei et al. (2006) demostraram que a VP1 poderá ter um papel importante na virulência do vírus (Wei et al., 2006). Pan e seus colaboradores (2007) revelaram uma nova topologia do centro ativo desta polimerase, diferente de outras polimerases de RNA, sugerindo que a VP1 dos birnavírus adquiriu uma mutação de DNA para controlar a sua taxa de crescimento (Pan et al., 2007).
A VP2 é a maior proteína estrutural do vírus da doença de Gumboro, revestindo a superfície exterior do invólucro. Contém os principais determinantes antigénicos de indução dos anticorpos neutralizantes e é responsável pelo tropismo e ligação às células hospedeiras sendo a base de variação antigénica, adaptação a culturas de células e variação na virulência das estirpes (Fahey et al., 1989; Delmas, 2008; Dubovi, 2011). Tem sido descrito o papel da VP2 como indutor da apoptose (Fernandez-Arias et al., 1997). O estudo da estrutura dos trímeros de VP2 a uma resolução de 2,6 Å demonstra 3 regiões distintas dispostas radialmente, designando-se base (B), “shell” (S) e projeção (P). Tanto B como S são provenientes de terminações N- e C- conservadoras do genoma que encripta a VP2, enquanto P é proveniente de uma região central variável do genoma. As moléculas expressas em B e S mantêm-se inalteradas, enquanto as moléculas expressas em P apresentam-se mais variáveis, sendo que as diferenças de aminoácidos entre serótipos e entre as diferentes estirpes do mesmo serótipo se localizam na região P da VP2 (Delmas, 2008; Dubovi, 2011).
A VP3, proteína que reveste a superfície interior do invólucro, contem determinantes antigénicos grupo-específicos e determinantes antigénicos serótipo-específicos (Mahardika e Becht, 1995) que não induzem a atividade de anticorpos neutralizantes (Becht et al., 1988). Esta poliproteína está organizada em duas regiões α-helicoidais, organizadas numa estrutura dimérica (Casanas et al., 2008). Alguns estudos revelam a natureza multifuncional desta proteína, considerando-a a chave para a formação e organização da estrutura do vírus através das interações com a VP1, VP2 e a dupla cadeia de RNA (Tacken et al., 2002; Casanas et al., 2008).
A VP4 é descrita como uma pequena protease viral não estrutural. Esta proteína é responsável pelo processo proteolítico da poliproteína precursora NH2-pVP2-VP4-VP3-COOH, (clivagem-cis) e pela clivagem da pVP2 em VP2 madura (clivagem-trans) (Delmas, 2008; Dubovi, 2011) usando a díade catalítica serina-lisina (Ser-652 e Lys-692) (Birghan et al., 2000). Granzow et al. (1997) demostraram que a VP4 dá origem a microtúbulos específicos (túbulos tipo II) que se acumulam nas células infetadas, mas não são componentes do vírus (Granzow et al., 1997).
A proteína VP5 desempenha o papel de modulador da apoptose e patogénese. É uma proteína de membrana de classe II rica em cisteína semelhante a todas estirpes do serótipo 1
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(Lombardo et al., 2000; Yao e Vakharia, 2001). A expressão da VP5 resulta na alteração da morfologia da célula, no rompimento da membrana celular e na drástica redução da viabilidade celular (Lombardo et al., 2000). Mundt et al. (1997) concluíram que a VP5 não é essencial para a replicação do vírus in vivo (Mundt et al., 1997).
2.2.3. Replicação do vírus
As estirpes de campo do vírus da doença Gumboro infetam e destroem linfócitos B, nomeadamente linfócitos B IgM+ localizados na bolsa de Fabricius ou em outras localizações (Rodenberg et al., 1994; Zhu et al., 2008). Dados recentes demonstraram que o vírus infeta e replica-se em macrófagos (Khatri e Sharma, 2007; Zhu et al., 2008). Adicionalmente, o vírus também consegue replicar-se em fibroblastos embrionários de pintos (CEF), células Vero, células DF-1 (células derivadas da primeira linha linfoblastóide), células LSCC-BK3 (células derivadas da linha linfoblastóide da bolsa) e células DT-40 (linha das células B de galinha induzida pelo vírus da leucose aviaria) (Yamaguchi et al., 1996; Ogawa et al., 1998; Kwon e Kim, 2004; Lin et al., 2007; Terasaki et al., 2008; Zhu et al., 2008). É característico das estirpes patogénicas, em especial das estirpes hipervirulentas, a incapacidade de crescer em cultura de células. No entanto, o vírus consegue adaptar-se às culturas de células por passagens sequenciais não diluídas, tornando-se atenuado (Muller et al., 1986; Zhu et al., 2008).
O primeiro passo na replicação do vírus é a ligação do vírus a recetores específicos na superfície das células hospedeiras. Segundo Ogawa et al. (1998), a ligação do vírus da doença de Gumboro é controlada pela presença na superfície imatura dos linfócitos B IgM+, de um recetor composto por proteína N-glicosídica (Ogawa et al., 1998; Zhu et al., 2008). Posteriormente, Lin et al. (2007) demonstraram que a proteína de choque térmico 90 funciona como componente do complexo recetor do vírus (Lin et al., 2007). Recentemente, Delgui et al. (2009) sugeriram que o vírus usa a integrina α4β1 como recetor de ligação específico em células de aves (Delgui et al., 2009).
Os passos seguintes da replicação do vírus da doença de Gumboro ou dos restantes birnavírus não foram ainda traçados individualmente. O vírus replica-se no citoplasma e cada ciclo de replicação dura cerca de 10-12 horas a 37ºC (Petek et al., 1973). Estudos in vitro demonstram que a RNA polimerase sintetiza o RNA viral por mecanismo de deslizamento de cadeia, assimétrico e semi-conservativo, onde a cadeia que dá origem ao novo vírus tem origem no deslocamento de uma das cadeias originais (Mertens et al., 1982; Spies et al., 1987). Tanto in vivo, como in vitro, o processo de transcrição não necessita de degradação do invólucro (Spies et al., 1987).
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2.2.4. Variações antigénicas e de virulência
Existem dois serótipos diferentes para o vírus da doença de Gumboro: o serótipo 1, patogénico para as galinhas e o serótipo 2 não patogénico mas que foi isolado em galinhas e perus (Jackwood et al., 1984; Ismail et al., 1988; Van Der Berg et al., 2000).
As estirpes virais podem ser caracterizadas, serologicamente, de acordo com a sua virulência: apatogénica, estirpe clássica, atenuada, variante ou hipervirulenta (Van Der Berg et al., 2000).
A estirpe clássica afeta a avicultura desde o primeiro caso relatado em Gumboro. Causa inflamação da bolsa de Fabricius e necrose linfóide severa, provocando mortalidade de cerca de 20 a 30% em galinhas specific pathogen-free (SPF) (Lim et al., 1999).
A estirpe atenuada foi gerada a partir da estirpe clássica e variante em fibrobastos de embriões de galinhas e, por não causarem doença, são usadas nas vacinas vivas (Lim et al., 1999).
O aparecimento da estirpe variante em 1984 nos EUA, foi considerada por Van Der Berg et al. (2000) como o primeiro grande passo na evolução do vírus, em que a nova estirpe infetava animais com níveis de anticorpos capazes de evitar a infeção em circunstâncias normais, caracterizando-se pela não manifestação de sinais clínicos, mas gerando um maior potencial imunossupressor (Van Der Berg et al., 2000). Esta estirpe variante apresentava epítopos neutralizantes modificados em relação à estirpe clássica (Van Der Berg et al., 2000).
O segundo grande passo, segundo o mesmo autor, surgiu com a propagação na Europa em 1987 das estirpes hivervirulentas, em especial em explorações onde as condições sanitárias e de higiene
estavam implementadas. Esta estirpe, mais virulenta, é também capaz de infetar aves protegidas para a estirpe clássica (Van Der Berg et al., 2000), atingindo taxas de mortalidade em galinhas SPF entre 60 a 100% (Lim et al., 1999).
As bases moleculares para estas alterações de virulência e patogenicidade estão localizadas em regiões antigénicas da proteína VP2
Figura 6 - Análise filogenética geral do vírus da doença de Gumboro baseado na região variável de VP2. De notar a semelhança genética das estirpes hivervirulentas com a estirpe clássica 52/70. As estirpes variantes assim como as estirpes atenuadas constituem grupos genéticos distintos (Fonte: Adaptado de Van der Berg et al., 2000).
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(Fahey et al., 1989), sendo esta responsável pela indução da neutralização pelos anticorpos e pela especificidade serotípica (Oppling et al., 1991; Nagarajan and Kibenge, 1997). Tem sido demostrado que anticorpos monoclonais (Mabs) neutralizantes ligam-se a uma zona central variável entre os aminoácidos (aa) 206 e 350 (fragmento AccI-SpeI) da VP2 (Bayliss et al., 1990). Esta região é composta por aa hidrofóbicos circunscritos por duas zonas hidrofílicas denominadas pico A e B (aa 212-224 e 314-324 respetivamente) (Nagarajan e Kibenge, 1997; Berg, 2000). Podem ser identificados ainda dois pequenos picos hidrofílicos mais internos, denominados 1 e 2 (aa 249-254 e 279-290, respetivamente) (Berg et al., 1996). Alterações de aa relacionadas com variações antigénicas são tipicamente encontradas nestes picos (Berg et al., 1996; Nagarajan e Kibenge, 1997).
Tanto as regiões hidrofílicas como a sequência interna de VP2 sofrem alterações quando comparado o serótipo 1 com o serótipo 2 apatogénico (Nagarajan e Kibenge, 1997).
A imunidade contra o vírus da doença de Gumboro depende da presença de anticorpos neutralizantes, sendo essencial o conhecimento preciso das sequências antigénicas responsáveis pela indução dos anticorpos. Assim, painéis de Mabs definem determinados epítopos antigénicos presentes na VP2 (Becht et al., 1988). De 5 Mabs definidos por Snyder et al. (1992) como protetores contra a estirpe clássica até 1985, apenas 2 dos epítopos antigénicos permaneciam inalterados pelas estipes variantes que surgiam nos EUA (Snyder et al., 1992).
As estirpes hipervirulentas do vírus são antigenicamente semelhantes às estirpes clássicas. Apenas uma modificação num epítopo foi descrita com auxílio de Mabs, correspondente a uma mutação na posição 222 do pico A da VP2 (Berg, 2000).
2.2.5. Propriedades químicas
O vírus da doença de Gumboro é muito estável e pode permanecer por longos períodos nas explorações, sobrevivendo às limpezas e desinfeções de rotina. O vírus é sensível ao hidróxido de sódio (Van Der Berg et al., 2000). Estudos comparativos efetuados por Shirai et al. (1994) com hidróxido de sódio a 0,05% demonstraram uma forte inativação do vírus a temperaturas de 40ºC e moderada inativação à temperatura ambiente, para valores de pH iguais ou superiores a 12,9 (Shirai et al., 1994). Compostos iodados e clorados, assim como, aldeídos também são ativos contra a atividade do vírus. Habib et al. (2006) compararam a ação de etilenoimina binária e concluíram que o vírus foi completamente inativado por 0,001 e 0,002 mol/L etilenoimina binária após 36 horas de incubação a 37º C, enquanto que, quando exposto a formalina a 0,1% e 0,2% o vírus foi inativada em 24 horas (Habib et al., 2006).
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Figura 7 – Distribuição geográfica das estirpes hipervirulentas do vírus de Gumboro. A cor preta, apresenta-se os paíapresenta-ses que não apreapresenta-sentam estirpes hipervirulentas mas apreapresenta-senta estirpes imunossupressoras. A cor cinzenta, países que reportaram a presença de estirpes hipervirulentas. A cor branca, países que não reportaram casos (Fonte: Adaptado de Van Der Berg et al, 2000).
2.3. Epidemiologia
2.3.1. Espécies suscetíveis
Apenas as galinhas (espécie Gallus gallus) desenvolvem sinais clínicos pelo serótipo 1 do vírus da doença de Gumboro. O perú (Meleagris gallopavo) pode ser portador assintomático do serótipo 2 e às vezes do serótipo 1, cuja patogenicidade do vírus em perus é pouco conhecida. O pato (Cairina moschata) pode também ser um portador assintomático de serótipo 1. Anticorpos neutralizantes do vírus têm sido detetados em galinha pintada (Numida
meleagris), faisões comuns (Phasianus colchicus) e avestruzes (Struthio camelus). Os
anticorpos neutralizantes ou precipitantes tem sido detetados, entre outras, em várias espécies de patos selvagens, gansos, corvos e pinguins, sugerindo que as aves selvagens podem agir como reservatórios ou vetores (Van Der Berg et al., 2000).
2.3.2. Distribuição mundial
Desde o primeiro caso relatado por Cosgrove em 1962 na região de Delawere, nos EUA, que a doença tem sido relatada por todo o mundo, tendo alastrado nas últimas décadas aos 5 continentes. Desde os primeiros casos registados, a doença estendeu-se nos anos seguintes pela maioria das regiões dos EUA (Lasher e Davis, 1997), registando-se nos anos 70 casos no Canadá, México, Europa, África, Médio Oriente, Ásia e Austrália (Landgraf et al., 1967; Lucio et al., 1972; Ide e Stevenson, 1973; el-Zein et al., 1974; Firth, 1974; Onunkwo, 1975; Van den Berg et al., 1991; Van Der Berg et al., 2000).
As estirpes variantes dominam nos EUA, sendo também diagnosticadas no Canadá e Austrália (Animal Health Australia, 2009).
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As estirpes hipervirulentas, primariamente descritas na Europa, são endémicas na maioria dos países, com exceção dos EUA, Austrália, países do norte da Europa e Nova Zelândia (Animal Health Australia, 2009).
Segundo dados da OIE (Organização Mundial de Saúde Animal, 1995), 95% dos 65 países que responderam a um inquérito efetuado sobre a doença, registaram casos de Gumboro, incluindo a Nova Zelândia, que registou o primeiro caso em 1993 (Van Der Berg et al., 2000). Contudo, devido aos planos de controlo e erradicação não se registam novos casos na Nova Zelândia desde 1998 (Animal Health Australia, 2009).
2.3.3. Transmissão e disseminação
O vírus da doença de Gumboro é altamente contagioso e de uma forma geral, de distribuição ubiquitária. Os bandos infetados excretam o vírus pelas fezes 2 dias após infeção, ou seja, pouco tempo antes do aparecimento dos primeiros sinais clínicos, e podem transmitir o vírus por contato durante 10 a 14 dias (Van der Berg, 2008). A principal via de infeção é a via digestiva, sendo possível também a via respiratória em zonas altamente infetadas (Van Der Berg et al., 2000; Van der Berg, 2008). A transmissão pode ocorrer por contato direto com as fezes ou por contato indireto com matéria inanimada que funciona como vetor, tal como material, vestuário de trabalhadores da exploração ou profissionais do sector (Van Der Berg et al., 2000; Van der Berg, 2008). Devido à grande resistência do vírus, este pode permanecer ativo durante vários meses na água, camas infetadas, alimento ou nas próprias instalações (Van Der Berg et al., 2000). Não existem vetores biológicos ou reservatórios estabelecidos, mas o vírus da doença de Gumboro já foi isolado em mosquitos (Aedes Vexans), ratos e insetos (Alphitobius diaperinus), seres facilmente encontrados em explorações avícolas (Howie e Thorsen, 1981; McAllister et al., 1995; Park et al., 2010). Pagès-Manté et al. (2004) identificaram a capacidade dos cães como vetores, ao demonstrar a excreção do vírus, 2 dias após ingestão de carcaça contaminada com uma estirpe hipervirulenta (Pagès-Manté et al, 2004).
A transmissão vertical da doença ainda não foi documentada, assim como, a contaminação horizontal por contaminação externa dos ovos (Van Der Berg et al., 2000). Assim, a maior fonte de disseminação durante as rotas comerciais dos produtos da avicultura são a circulação de aves vivas e carne de aves. A doença de Gumboro mantém-se da lista da OIE sendo de declaração obrigatória nos países onde ocorre (Van Der Berg et al., 2000).
2.4. Imunopatogénese
Normalmente, o vírus afeta frangos com cerca de 3 a 6 semanas de idade e causa doença clínica, enquanto que, em aves de idade inferior, a doença é essencialmente
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subclínica. O grau de infeção resulta da espécie, idade e raça das aves, via de inoculação e presença ou ausência de anticorpos neutralizantes (Moody et al., 2000). O período de incubação é relativamente curto: cerca de dois a três dias (Van Der Berg et al., 2000).
Em condições naturais, a via mais comum de infeção é a digestiva (Sharma et al., 2000), no entanto, em áreas altamente infetadas também ocorre infeção por inalação de aerossóis (Van der Berg, 2008). Após transmissão digestiva, o vírus é transferido do intestino para outros órgãos por células fagocitárias, tais como macrófagos. Estudos de imunofluorescência detetaram o vírus quatro horas após inoculação digestiva, nos macrófagos do tecido linfóide associados ao intestino (GALT). Nesta fase ocorre uma primeira viremia. Cinco horas após a infeção, os antigénios virais são detetados no fígado sofrendo processo de fagocitose pelos macrófagos residentes (células de Kupffer) (Muller et al., 2003). O vírus atinge a bolsa de Fabricius via sanguínea, onde ocorre uma extensa replicação viral, levando à extensa destruição das células linfóides da região cortical e medular dos folículos (Sharma et al., 2000), sendo que a maioria dos folículos é positiva ao vírus, 13 horas após inoculação, segundo ensaios imunohistoquímicos realizados por Tanimura e Sharma (1997). O processo de destruição celular pode ser acentuado pela apoptose de células vizinhas livres de vírus (Sharma et al., 2000).
Cerca de 16 horas após inoculação, ocorre uma segunda e pronunciada viremia com replicação secundária noutros órgãos contendo linfócitos B imaturos, como baço, timo, amígdalas cecais e glândulas de Hardarian caminhando assim, para o aparecimento da doença e suas consequências (Muller et al., 1979).
Os linfócitos T são resistentes à infeção pelo vírus. Contudo, o timo sofre uma atrofia marcada e extensa apoptose dos timócitos durante a fase aguda. No entanto, não há evidências de que o vírus se replique nas células tímicas, e uns dias após a infeção, o timo retoma ao estado normal (Sharma et al., 2000).
Durante a fase aguda, ocorre uma drástica infiltração de linfócitos T em redor dos locais de replicação, que são detetados 1 dia após a infeção e permanecem até pelo menos 12 semanas. No entanto, os antigénios virais desaparecem após 3 semanas. Estudos de análise de citometria de fluxo de suspensão de células da bolsa de Fabricius, medidos em intervalos de tempo após a exposição ao vírus da doença de Gumboro demonstram que, ao dia 7, 65% das células da bolsa são linfócitos T e que 7% contém na superfície expressão de IgM. Também notaram uma proporção igual de CD4+ e CD8+ nos primeiros 7 dias, mas que após este período as CD8+ tornaram-se predominantes (Sharma et al., 2000).
Ao fim de 5 semanas após a infeção, começam a surgir sinais de recuperação da bolsa de Fabricius. Os folículos começam a diferenciar linfócitos B IgM+, sendo que na 7ª semana,
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40% do folículo da bolsa está repovoado com linfócitos e à 12ª semana, a morfologia na bolsa retorna ao estado pré-infeção (Sharma et al., 2000).
Rautenschlein, et al. (2002), apresentaram resultados que sugerem que, através de aves com comprometimento de funcionalidade dos linfócitos T por timotomia e tratamento com ciclosporina A, os linfócitos T que atuam na bolsa de Fabricius, limitam a replicação viral na fase aguda da doença, mas promovem um maior dano celular e atrasam a recuperação dos tecidos, possivelmente, devido à libertação de citoquinas e efeitos citotóxicos (Rautenschlein et al., 2002). Estudos feitos por Sharma et al. (2000) demonstraram que os linfócitos T da bolsa de Fabricius têm uma elevada expressão do Complexo Maior de Histocompatibilidade tipo II e recetores IL-2. Concluíram também que as células da bolsa de Fabricius apresentaram elevada expressão de citoquinas como o Interferão-Y (IFN-γ) e fator interleucina 6 (IL-6) e os linfócitos T inibem uma resposta mitogénica normal (Sharma et al., 2000).
A infeção pelo vírus da doença de Gumboro resulta, inevitavelmente em imunossupressão. Este efeito imunossupressor depende da idade das aves, sendo notório, quando as aves são afetadas nas primeiras 2 a 3 semanas de vida, apesar de os sinais clínicos serem menos notórios ou ausentes (Allan et al., 1972).
O efeito imunossupressor também depende da estirpe viral, assim como, existem algumas variações entre estirpes das aves (Aricibasi et al., 2010).
A imunossupressão leva à queda das “performances” produtivas, com aumento de incidência de infeções secundárias, diminuição da conversão alimentar, diminuição da resposta às vacinas e aumento de rejeição de carcaças no matadouro. Apesar da imunossupressão causada pelo vírus da doença de Gumboro estar bem documentada, os mecanismos ainda não são totalmente conhecidos. Tanto a imunidade celular, como a imunidade humoral, estão afetadas (Sharma et al., 2000).
A redução do número de linfócitos B na bolsa de Fabricius devido à infeção viral é a maior causa de imunossupressão. O efeito lítico da replicação do vírus, assim como, a necrose e apoptose associadas são encontrados maioritariamente na bolsa de Fabricius, mas também nas amígdalas cecais e baço (Okoye e Uzoukwu, 1990; Sharma et al., 2000), levando a uma redução dos linfócitos B IgM+ (Sharma et al., 2000; Petkov et al., 2009). Apenas a resposta humoral primária fica afetada, a resposta secundária permanece intacta (Sharma et al., 2000). No entanto, esta deficiência da atividade humoral é restabelecida. Sharma et al. (2000) demostraram a evolução da resposta imunitária (produção de anticorpos) contra Brucella
abortus e toxóide tetânico em galinhas infetadas com o vírus da doença de Gumboro,
apresentando níveis de anticorpos normais ao fim de 12 e 17 semanas respetivamente, assim como, uma recuperação da morfologia normal dos folículos. A supressão da função destas
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células pode ser causada por dano nos linfócitos T helper ou noutras células envolvidas na resposta imune (Ashraf, 2005).
Os linfócitos T não são afetados pela replicação do vírus, no entanto, têm efeito modulador na patogénese, com a invasão da bolsa de Fabricius por CD4+ e CD8+ limitando a replicação do vírus na bolsa de Fabricius durante a fase aguda, 5 dias após a infeção, promovendo dano no tecido bursal e atraso na recuperação através do efeito citotóxico das citoquinas (Aricibasi et al., 2010). No entanto, tem sido questionado o efeito da doença sobre a resposta imunitária celular, pois existe uma maior suscetibilidade a certas doenças e falhas vacinais que envolvem a imunidade celular (Sharma e Lee, 1983). Contudo, estes efeitos são leves e transitórios e o comprometimento permanente é raro (Sharma e Lee, 1983). Os estudos
in vitro demostraram um comprometimento da proliferação mitogénica dos linfócitos T (Lam,
1991; Sharma et al., 2000). São afetados os linfócitos T circulantes e esplénicos. A inibição mitogénica começa 3 a 5 dias após a infeção (Sharma et al., 2000). A inibição mitogénica no baço é mediada por macrófagos (Sharma et al., 2000). Devido às lesões necróticas no timo, existe uma diminuição dos linfócitos circulantes (Sharma e Lee, 1983). As células esplénicas expostas ao vírus expressam IFN-γ. Tendo em conta que os linfócitos T são os principais produtores de IFN-γ (Sharma et al., 2000), estes contribuem para a formação da sintase do óxido nítrico II (NOS II) pelos macrófagos. A NOS II permite a produção de óxido nitroso que acredita-se ser responsável pela diminuição da resposta mitogénica dos linfócitos T no baço (Schatt e Skinner, 2008).
O vírus da doença de Gumboro não tem qualquer refeito sobre a atividade dos linfócitos Natural Killer (NK) (Sharma e Lee, 1983).
Figura 8 - Representação esquemática da imunopatogénese do vírus da doença de Gumboro (Fonte: Adaptado de Sharma et al., 2000).
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O vírus replica-se em macrófagos. Não é claro, contudo, o seu papel na resposta imunitária (Schatt e Skinner, 2008). Macrófagos isolados da bolsa de Fabricius e do baço de aves afetadas expressam interleucinas pró inflamatórias IL-6, IL-1β, e IL-8. Também ocorre expressão de IFN tipo 1 assim como NOS II (Sharma et al., 2000; Khatri et al., 2005; Schatt e Skinner, 2008; Aricibasi et al., 2010).
Um dos processos responsáveis pela destruição celular e consequente imunossupressão é a apoptose ou morte celular programada. A apoptose ocorre em vários órgãos como timo, baço e bolsa de Fabricius. O vírus induz apoptose em linfócitos periféricos da bolsa de Fabricius nas galinhas, embriões de galinhas, fibroblastos de embriões de galinhas e células Vero (Vasconcelos e Lam, 1994, 1995; Tham e Moon, 1996). As proteínas virais VP2 e VP5 têm um papel importante neste processo (Fernandez-Arias et al., 1997; Berg, 2000). No entanto, existem evidências de processos de apoptose em células antigénio-negativo, indicando que existem mediadores inflamatórios envolvidos no processo (Tanimura e Sharma, 1997; Berg, 2000).
2.5. Quadro clínico
O período de incubação é muito curto, geralmente, 2 a 3 dias e a infeção, geralmente, dura 5 a 7 dias.
A severidade dos sinais clínicos depende da idade, raça e do nível de anticorpos maternos, assim como, da estirpe do vírus que afeta as aves. Assim, o quadro clínico pode variar de exploração para exploração, região, país ou continente.
Esquematicamente, distinguem-se três principais formas clínicas (Van Der Berg et al., 2000):
Forma clássica: descrita desde os anos 60, causada pela estirpe clássica do vírus da doença de Gumboro. Apresenta baixa mortalidade (1 a 2%) mas alta morbilidade. A doença é muitas vezes subclínica, ocorrendo após o declínio do nível de anticorpos (Van Der Berg et al., 2000).
Forma imunossupressiva: principalmente descrita nos EUA, é causada principalmente pela estirpe variante, apresenta resistência à neutralização de anticorpos que eram eficazes contra a estirpe clássica (Van Der Berg et al., 2000), não causando tantos sinais clínicos mas causando elevada imunossupressão e rápida atrofia da bolsa de Fabricius (Nagarajan e Kibenge, 1997). Ocorre aumento da mortalidade, principalmente pelo aparecimento de infeções secundárias oportunistas (Van Der Berg et al., 2000).
Forma aguda: primariamente descrita na Europa e Ásia, é principalmente causada pela estirpe hipervirulenta, caracterizada pelo aparecimento de um quadro clínico agudo e progressivo, com elevada percentagem de mortalidade, sendo cerca de 50 a 60% em
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poedeiras e 25 a 30% em frangos de carne, causando perto de 100% de mortalidade em galinhas SPF (Van Der Berg et al., 2000).
Na fase aguda, os animais encontram-se esgotados, prostrados, penas eriçadas e sujas com uratos, com diarreia aquosa e esbranquiçada, e hemorragias nos músculos peitorais e coxas. Nos casos mais graves, as aves apresentam-se desidratadas e na fase terminal com temperatura baixa, ocorrendo posteriormente a morte (Van Der Berg et al., 2000).
A mortalidade começa a aumentar ao 3º
dia, atingindo o pico ao 4º dia e depois desce rapidamente. As aves que resistem à doença tornam-se assintomáticas, 5 a 7 dias após a infeção (Berg, 2000; Van Der Berg et al., 2000).
2.6. Quando Lesional
2.6.1. Lesões macroscópicas
As carcaças das aves afetadas com a doença de Gumboro estão desidratadas, ocorrendo um escurecimento dos músculos peitorais. Hemorragias petequiais observam-se na coxa e músculos peitorais e ocasionalmente
na mucosa do proventrículo, provavelmente devido a problemas de coagulação (Van Der Berg et al., 2000: Van Der Berg, 2008). A desidratação causa aumento do muco intestinal e alterações renais, como hipertrofia e esbranquiçamento do rim contendo depósitos de uratos (Van Der Berg et al., 2000), que provavelmente ocorre devido a um bloqueio dos ureteres devido a alterações na bolsa de Fabricius. O fígado
pode apresentar hepatomegalia e enfartes periféricos. Também pode ocorrer esplenomegalia (Van Der Berg, 2008).
Figura 9 - Aves com sinais clínicos da doença de Gumboro. As aves apresentam-se esgotadas, prostradas com penas eriçadas, levando à morte (Fotografia gentilmente cedida pelo Eng. Firmino Loureiro).
Figura 10 – Escurecimento e hemorragias petequiais nos músculos peitorais evidenciados na necrópsia de uma ave com sinais clínicos de doença de Gumboro (fotografia gentilmente cedida pelo Eng. Firmino Loureiro)
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A bolsa de Fabricius é a mais afetada, pois é o órgão alvo de replicação viral. Durante a fase de infeção esta apresenta-se hipertrófica, hiperémica e edematosa. Nos casos mais severos existe uma maior infeção
da membrana mucosa e a
formação de um transudado seroso, originando uma cor
amarelada na superfície da bolsa. Ao 5º dia após infeção, a bolsa retoma ao tamanho inicial, e ao 8º dia apresenta-se atrofiada, com cerca de 1/3 do tamanho normal (Van Der Berg et al., 2000).
As estirpes hipervirulentas causam lesões mais severas nas amígdalas cecais, timo, baço e medula óssea, e uma grande diminuição do índice de massa tímica, comparando com as estirpes de virulência moderada. No entanto, as alterações na bolsa são similares. Tem vindo a ser demonstrado que a virulência das estirpes de campo está correlacionada com as alterações nos órgãos linfóides exceto a bolsa de Fabricius, sugerindo que a virulência das estirpes esteja correlacionada com a distribuição do vírus nesses órgãos (Ashraf, 2005
).
2.6.2. Lesões microscópicas
As lesões histopatológicas ocorrem na bolsa de Fabricius, baço, timo e amígdalas cecais. O primeiro sinal de infeção ocorre na bolsa de Fabricius e é o órgão mais afetado. Cerca de 36 horas após infeção ocorre degeneração da região medular, caracterizada por núcleos em picnose e acumulação de gotículas lipídicas no citoplasma e necrose individual de linfócitos (Cheville, 1967). Adjacentes a estes linfócitos encontram-se macrófagos, contendo no seu interior restos de núcleos picnóticos e detritos celulares de linfócitos (Cheville, 1967).
Passadas 48 horas após infeção, a zona medular dos folículos afetados encontra-se desprovida de pequenos linfócitos, sendo substituídos por heterófilos, detritos picnóticos e células reticuloepiteliais hipertrofiadas (Cheville, 1967).
Pelo 3º e 4º dia, todos os folículos são afetados. O severo edema, hiperemia e a marcada acumulação de heterófilos é responsável pela hipertrofia da bolsa. À medida que a resposta inflamatória diminui, formam-se cavidades quísticas nas zonas medulares. Ocorre necrose e fagocitose dos heterófilos e fibroplastia do tecido de conectividade interfolicular
Figura 11 – A - Bolsa de Fabricius hipertrófica e edematosa evidenciada à necrópsia de uma ave com sinais clínicos de doença de Gumboro: B – Pormenor da bolsa de Fabricius hiperémica e edematosa (Fotografia gentilmente cedida pelo Eng. Firmino Loureiro).
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(Cheville, 1967; Ashraf, 2005
)
. Posteriormente, ocorre proliferação de uma camada epitelial com produção de estruturas glandulares de células de epitélio colunar contendo glóbulos de mucina (Cheville, 1967).O baço apresenta hiperplasia das células reticuloendoteliais adjacentes à bainha das artérias adenóides durante a fase inicial da infeção. A necrose linfóide ocorre em simultâneo nos funículos germinais e na bainha das artérias adenóides ao 3º dia pós infeção. O baço recupera rapidamente, sem grandes danos nos folículos germinativos (Cheville, 1967; Ashraf, 2005
).
As alterações no timo e amígdalas cecais aparecem rapidamente. No timo ocorre moderada a severa necrose linfóide e hiperplasia dos componentes reticulares e epiteliais na área medular ao 4º dia. Os danos são menores que os encontrados na bolsa de Fabricius e ao 12º dia após infeção a população cortical de linfócitos aproxima-se do normal (Cheville, 1967; Ashraf, 2005
).
2.7. Diagnóstico
No diagnóstico da doença de Gumboro, deve-se ter em consideração o historial do bando e das explorações, os sinais clínicos e as lesões provocadas. As aves com menos de 3 semanas, não apresentam sinais clínicos de doença, e aves com 3 a 6 semanas apresentam os sinais anteriormente descritos, sendo a severidade dos sinais dependente de vários fatores. A necrópsia é essencial para o diagnóstico, visualizando-se as lesões macroscópicas, principalmente alterações na bolsa de Fabricius. A colheita de órgãos para outros meios de diagnóstico pode auxiliar a um melhor diagnóstico, nomeadamente, em casos de doença subaguda (Van Der Berg et al., 2000).
2.7.1. Diagnóstico diferencial
O diagnóstico clínico da forma aguda da doença de Gumboro é baseado na evolução da doença, nomeadamente, na curva de mortalidade com um pico ao 4º dia e recuperação a partir do 5º dia, e a observação dos sinais clínicos e lesões post mortem especialmente na bolsa de Fabricius (Van Der Berg et al., 2000).
Em casos subagudos, pode ser necessário estabelecer alguns diagnósticos diferenciais, tais como, coccidiose aviária, forma visceral da doença de Newcastle, anemia infeciosa aviária, micotoxinas e forma nefrogénica de bronquite infeciosa, assim como, doença de Marek (Van Der Berg et al., 2000).
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2.7.2. Diagnóstico histológico
O diagnóstico histológico pode ser necessário para diagnosticar formas subclínicas da doença de Gumboro. As alterações anteriormente descritas na bolsa de Fabricius confirmam o diagnóstico, assim como, as alterações no timo e baço, além de que, a associação das alterações provocadas nestes 2 últimos órgãos possam sugerir a identificação da virulência das estirpes do vírus (Van Der Berg et al., 2000).
2.7.3. Diagnóstico serológico
Os testes serológicos normalmente utilizados para deteção do vírus da doença de Gumboro são: a técnica de ELISA (ensaio imunoenzimático), neutralização de vírus (VN) e AGID (imunodifusão em gel de agar).
A AGID é útil para uma deteção rápida de antigénios solúveis de grupo específico, ou anticorpos em aves convalescentes, mas apresenta baixa sensibilidade. A não quantificação e a incapacidade de detetar as diferenças serotípicas tornam o seu uso limitado (Phillips, 1981; Nicholas et al., 1985; Raj et al., 1995).
A técnica de ELISA é o teste serológico mais utilizado para deteção de anticorpos do vírus da doença de Gumboro por ser económico, simples, rápido e permitir o processamento de um grande número de amostras ao mesmo tempo sendo passível de automatização (Ashraf, 2005). A técnica de ELISA permite quantificar o título de anticorpos para a doença de Gumboro, sendo útil para monitorizar o estado imunitário dos bandos, comprovar a eficácia da vacinação e prever a diminuição do título de anticorpos maternos (Ashraf, 2005). Existem vários kits de ELISA disponíveis no mercado para a deteção de anticorpos no soro. As infeções subclínicas e qualquer surto da doença nas grandes unidades de produção de aves pode ter um impacto económico significativo, por isso, os bandos são monitorizados regularmente para qualquer alteração no título na linha de base (Ashraf, 2005
)
.Os kits comerciais de ELISA não permitem diferenciar os anticorpos específicos dos 2 serótipos do vírus da doença de Gumboro, assim como, não permitem diferenciar as várias estirpes do serótipo patogénico (Ismail e Saif, 1990; Jackwood et al., 1996). Devido a este facto, é necessário especial atenção à monitorização do título de anticorpos em reprodutoras, pois o serótipo 2 apatogénico está disseminado mundialmente, fornecendo uma ideia errada dos níveis de anticorpos dos bandos (Ashraf, 2005
).
De Wit et al. (2001) compararam 5 kits comerciais de ELISA, entre estes BioChek standard® (BioCheck CV., Gouda, The Netherlands), IDEXX Flock check standard®, IDEXX-XR Flock check® (IDEXX Corp., Portland, Maine), KPL Proflock e KPL Proflock Plus® (Kirkegaard and Perry Labs.,Gaithersburg, Md.) e comprovaram que a especificidade dos testes variava entre 63,8 a 100%. Todos os kits apresentaram sensibilidade de 100% entre os
