microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano

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Mestrado em Medicina Legal

microRNAs como biomarcadores do

ritmo circadiano.

Joana Rodrigues Pinto

m ic ro R N As c o m o bio m ar ca do re s do r it m o cir ca dia no .

M

2019

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JOANA RODRIGUES PINTO

microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano.

Dissertação de Candidatura ao Grau de

Mestre em Medicina Legal submetida ao

Instituto de Ciências Biomédicas Abel

Salazar da Universidade do Porto

Orientadora - Doutora Ana Luísa Teixeira,

Investigadora Júnior, Grupo de Oncologia

Molecular e Patologia Viral do Centro de

Investigação do Instituto Português de

Oncologia do Porto; Colaboradora externa,

Instituto de Ciências Biomédicas de Abel

Salazar da Universidade do Porto

Co-orientadora – Mestre Francisca Dias,

Doutoranda em Ciências Biomédicas,

Grupo de Oncologia Molecular e Patologia

Viral do Centro de Investigação Português

de Oncologia do Porto

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INFORMAÇÃO TÉCNICA

TÍTULO:

microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano.

Dissertação de Candidatura ao Grau de Mestre em Medicina Legal, apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto

AUTOR: Joana Rodrigues Pinto

DATA: setembro de 2019

EDITOR: Joana Rodrigues Pinto

CORREIO ELETRÓNICO: [email protected]

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“Time is what we want most, but what we use worst.” By William Penn

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7 microRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano

ÍNDICE AGRADECIMENTOS ... 9 RESUMO ... 13 ABSTRACT ... 17 ÍNDICE DE FIGURAS ... 19 ÍNDICE DE TABELAS ... 20 ABREVIATURAS ... 21 1. Introdução... 27 1.1. Contextualização histórica ... 27

1.2. Relógio biológico e mecanismos moleculares do ritmo circadiano ... 30

1.3. Regulação do ritmo circadiano pela luz ... 33

1.4. Importância do cortisol no ritmo circadiano ... 34

1.5. microRNAs ... 38

1.6. microRNAs envolvidos na via do cortisol e sua importância para as ciências forenses ... 40

2. Objetivos ... 45

2.1. Objetivo principal ... 45

2.2. Objetivos específicos ... 45

3. Materiais e métodos ... 49

3.1. Seleção do perfil de microRNAs... 49

3.2. População em estudo ... 49

3.3. Processamento de amostras ... 50

3.4. Extração de microRNAs ... 51

3.5. Síntese de cDNA ... 51

3.6. Quantificação por PCR tempo real ... 52

3.7. Quantificação dos níveis de cortisol sérico e salivar ……….52

3.8. Análise estatística ... 53

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4.1. Frequências de deteção dos microRNAs estudados em amostras de sangue e saliva

... 57

4.2. Níveis de cortisol e quantificação relativa dos microRNAs nas amostras de sangue e saliva ... 59

5. Discussão ... 65

6. Conclusão e perspetivas futuras ... 71

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AGRADECIMENTOS

Ao concluir esta etapa do meu percurso académico, não poderia deixar de agradecer a todas as pessoas que contribuíram, de forma direta e indireta, para a execução deste projeto.

Agradeço à Professora Doutora Maria José Pinto da Costa, Diretora do Mestrado em Medicina Legal, a oportunidade de ingressar neste mestrado, assim como todos os conhecimentos transmitidos e disponibilidade.

À Doutora Ana Luísa Teixeira, minha orientadora um muito obrigada por ter aceite a orientação científica deste trabalho e por me ter proposto este projeto tão desafiante. Obrigada por todas as sugestões, saber partilhado, críticas construtivas e principalmente por me ter ajudado a crescer a nível científico, laboratorial mas também pessoal.

À minha coorientadora, Mestre Francisca Dias, um muito obrigada pela paciência que teve comigo, pelo conhecimento partilhado e por todas as vezes que me “salvou” e arranjou soluções para os obstáculos que foram surgindo ao longo deste caminho. A tua boa disposição contagia qualquer um e faz toda a diferença.

A todo o Grupo de Oncologia Molecular e Patologia Viral do Instituto Português de Oncologia do Porto, em especial à Mariana Morais e Inês Nogueira pela ajuda esclarecimento de dúvidas.

Agradeço a colaboração do Serviço de Química Clínica do Departamento de Diagnóstico Laboratorial do IPO-Porto pela quantificação dos níveis de cortisol e a todos os voluntários, sem os quais, a realização deste projeto não teria sido possível.

Um muito obrigada, às minhas amigas e colegas de Mestrado Bruna Cavalcante e Bela Barros. Foi muito importante para mim todo o vosso apoio e amizade. Crescemos juntas nesta etapa e espero continuar a compartilhar muito bons momentos ao vosso lado. À minha melhor amiga Rafaela Maia, por sempre acreditar em mim, estar sempre do meu lado a ouvir as minhas lamentações. O teu apoio foi e será sempre fundamental.

Aos meus amigos(as), em especial João Miranda e André Almeida, por me fazerem rir mesmo quando as coisas não correram bem e estarem sempre do meu lado. Obrigado por todos os momentos de descontração.

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AGRADECIMENTOS

À minha irmã Sara Pinto, não há pessoa que me conhece melhor do que tu. Muito obrigada pelo teu esforço e disponibilidade em ajudar, mesmo não sendo a tua área de formação. És sempre a primeira a estender a mão quando mais preciso.

A toda a minha família, mas em especial aos meus pais, os melhores do mundo. O vosso apoio é incondicional e sem vocês nada disto seria possível. Obrigada por todos os valores que me transmitiram ao longo deste caminho, que é a minha vida. Por todos os momentos que me fizeram ver o lado positivo da situação, por todos os obstáculos que me ajudaram a ultrapassar e por toda a compreensão.

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RESUMO

A vida na Terra adaptou-se ao ciclo de dia e de noite, através da evolução dos relógios biológicos. Os relógios biológicos são ritmos biológicos endógenos que ajustam o equilíbrio entre o comportamento e as necessidades do organismo, face às mudanças constantes do ambiente, sendo um processo transversal aos organismos unicelulares e multicelulares. O estudo do funcionamento e regulação dos relógios biológicos é designado de Cronobiologia, nesta área os ritmos biológicos são classificados em ritmos ultradianos, infradianos e circadianos. O ritmo circadiano, é o período de aproximadamente 24 horas, de acordo com o tempo de rotação da Terra em torno do seu eixo. O controlo deste permite a regulação de uma ampla variedade de processos fisiológicos, nomeadamente a regulação da via do cortisol sérico.

O cortisol é uma hormona corticosteróide produzida pela glândula suprarrenal, estando diretamente envolvida na regulação dos níveis de stress e do ritmo circadiano. Na regulação da via do cortisol, estão envolvidos mecanismos de regulação epigenéticos como é o caso dos microRNAs (miRNAs). Os miRNAs pertencem a uma família de pequenas moléculas de RNA não codificante, com uma grande importância em estudos forenses, uma vez que apresentam uma elevada estabilidade, podendo permanecer estáveis ao longo do intervalo post-mortem (IPM). O IPM fornece uma estimativa do intervalo que ocorre entre a morte e a descoberta do respetivo cadáver. Deste modo, a elevada estabilidade dos miRNAs neste intervalo, poderá permitir a análise da dinâmica dos miRNAs associada à via de produção do cortisol possibilitando que seja fornecida uma estimativa do momento da morte de um indivíduo, e assim auxiliar na inclusão ou exclusão de possíveis suspeitos a um local de crime ou fornecer informações temporais de amostras biológicas depositadas num suporte físico.

O objetivo deste estudo foi analisar o potencial dos miRNAs envolvidos nas vias de produção do cortisol como biomarcadores de ritmo circadiano em amostras de sangue e saliva. Inicialmente, foi realizada a revisão da literatura com o objetivo de selecionar o perfil de miRNAs com maior potencial para ser analisado, tendo sido selecionados os seguintes miRNAs: hsa-miR-10a, hsa-miR-10b, hsa-miR-16, hsa-miR-20, hsa-miR-21, hsa-miR-24 e hsa-miR-144-5p. Realizaram-se colheitas de sangue a 20 indivíduos voluntários saudáveis, nos períodos da manhã e da tarde e colheitas de saliva no período da noite. As amostras foram processadas e os miRNAs extraídos. Posteriormente foi realizada a síntese de DNA complementar e, de seguida os miRNAs foram analisados por qPCR em tempo real.

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RESUMO

Observamos que os miRNAs foram detetados em ambos os fluídos biológicos, contudo apresentaram frequências de deteção muito variáveis, com exceção do hsa-miR-144-5p que não foi detetado na saliva. De acordo com os resultados, observamos que os hsa-miR-10a, hsa-miR-16 e hsa-miR-24 apresentam um aumento de expressão ao longo do dia, contrariamente aos níveis de cortisol, que foram diminuindo ao longo deste. Por outro lado, o hsa-miR-144-5p também demonstrou um aumento de expressão entre os períodos da manhã e da tarde mas não foi detetado à noite. O presente estudo concluiu que os hsa-miR-10a, hsa-miR-16, hsa-miR-24 e hsa-miR-144-5p poderão ser biomarcadores úteis no que respeita à determinação do espaço temporal em que uma amostra de sangue foi colhida, podendo ser fortes candidatos a serem incluídos num perfil de miRNAs a estudar a quando de uma determinação do IPM.

Futuramente, o presente estudo deveria ser replicado num maior número de indivíduos, de modo a validar as associações encontradas. Adicionalmente também seria interessante o estudo da expressão destes miRNAs em amostras de sangue periférico durante o período da noite e em amostras de saliva durante o período da manhã e tarde, de modo a complementar os resultados obtidos.

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ABSTRACT

Life on Earth has adapted to the day and night cycle through the evolution of biological clocks. Biological clocks are endogenous biological rhythms that adjust the balance between the behavior and the needs of the organism, in response to the constant changes of the environment. This process is transversal to the unicellular and multicellular organisms and the study area of the regulation of biological clocks is called chronobiology. Biological rhythms are classified into ultradian, infradian and circadian. The circadian rhythm is the period of approximately 24 hours, according to the time of rotation of the earth around its axis. Its control allows regulation of a wide variety of physiological processes, including regulation of the serum cortisol pathway.

Cortisol is a corticosteroid hormone produced by the adrenal gland and is directly involved in the regulation of the stress levels and the circadian rhythm. The regulation of the cortisol pathway is made by several mechanisms, including epigenetic mechanisms like microRNAs (miRNAs). MiRNAs are small non-coding RNAs that present a high stability in several body fluids, including over the postmortem interval (PMI). The PMI provides an estimate of the interval that occurs between the death and discovery of the respective body. The high stability of miRNAs during this period may be usefull in the analysis of the miRNA dynamics associated with the cortisol pathway, therefore allowing the estimation of an individual's time of death. Consequently, miRNAs are potential biomarkers capable of determine the timeline of biological samples found on a crime scene and also assist in the inclusion or exclusion of possible suspects.

The aim of this study was to analyse the miRNAs involved in the cortisol pathway as potential circadian rhythm biomarkers in blood and saliva samples. Initially, a literature review was performed in order to select the miRNAs profile with the highest potential to be analyzed, and the following miRNAs were selected: 10a, 10b, hsa-miR-16, hsa-miR-20, hsa-miR-21, hsa-miR-24 and hsa-miR-144-5p. Blood samples were taken from 20 healthy volunteers in the morning and afternoon and saliva samples were collected in the evening. The samples were processed and the miRNAs were extracted. Subsequently, complementary DNA synthesis was performed and then miRNAs were analyzed by real time quantitative PCR. We observed that, with the exception of has-miR-144-5p that was not detected in the saliva, all the miRNAs were detected in both biological fluids, but had very variable detection frequencies. According to the results, we observed that hsa-miR-10a, hsa-miR-16 and hsa-miR-24 showed an increased expression throughout the day, as opposed to cortisol levels, which decreased over the course of the

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ABSTRACT

day. Hsa-miR-144-5p also showed increased expression between morning and afternoon but was not detected at night. The present study concluded that hsa-miR-10a, hsa-miR-16, hsa-miR-24, and hsa-miR-144-5p may be useful biomarkers for determine the time frame in which sample was taken. Additionally, these miRNAs may be strong candidates to be included in a miRNA profile to be studied at the time of an PMI determination.

In order to validate the associations found, future studies should replicate this study in a larger number of volunteers. Moreover, it would be interesting to study these miRNAs expression in peripheral blood samples at night and in saliva samples in the morning and afternoon to complement the results obtained.

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ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Localização do núcleo supraquiasmático (Adaptado de Netter FH (21)). ... 30 Figura 2. Transcription-translation feedback loop – Formação do dímero CLOCK:BMAL1 e consequente ativação da transcrição dos genes que codificam reguladores CRY e PER no núcleo. Ligação do dímero PER:CRY no citoplasma que é transportado para o núcleo para inibir ativadores de transcrição dos genes CLOCK e BMAL1. ... 32 Figura 3. Auxiliar transcription-translation feedback loop responsável pela regulação do gene BMAL1. Ativação de Reverb α e Ror α que consequentemente inibem ou ativam (respetivamente) da produção de BMAL1. ... 32 Figura 4. Regulação da transcrição dos clock controlled genes (ccgs), responsáveis por codificar substâncias que regulam os neurónios do NSQ. ... 33 Figura 5. Regulação dos relógios circadianos. A informação da entrada do estímulo luminoso na retina transportado para o SNC, é coordenado pelo NSQ onde está localizado o relógio central responsável por regular ciclos sono-vigília, performances cognitivas e transmitir as informações para os relógios dos órgãos periféricos, permitindo assim a homeostasia corporal. ... 34 Figura 6. Mecanismo de ação eixo hipotálamo-hipófise-adrenal. ... 35 Figura 7. Síntese de glicocorticóides e posterior formação de proteína quinase. ... 36 Figura 8. Via da síntese do cortisol. Transporte do colesterol da membrana mitocondrial externa para a membrana mitocondrial interna pela proteína StAR. Na mitocôndria e reticulo endoplasmático, o colesterol passa por ações sequenciais até ser transformado em cortisol. ... 36 Figura 9. Variações dos níveis de cortisol ao longo de um dia (Adaptado de Fleming B. (51)). ... 37 Figura 10. Representação esquemática da biogénese de microRNAs ... 39 Figura 11. Mecanismo de ação dos miRNAs (Adaptado de Teixeira AL e colaboradores (52)). ... 39 Figura 12. Frequência de deteção (%), dos miRNAs em estudo ao longo do dia. ... 58 Figura 13.Níveis do cortisol e miRNAs ao longo do dia. ... 60 Figura 14. Relação dos hsa-miR-10a, hsa-miR-16 e hsa-miR-24 com a regulação da via da síntese do cortisol. ... 68

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ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1. Colheita das amostras biológicas ... 50 Tabela 2. Valores de fold-change e pvalue para os 10a, 16 e hsa-miR-24. ... 61

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ABREVIATURAS

A

AC Adenilciclase

ACTH Hormona adrenocorticotrófica

ACTHr Recetor da hormona adrenocorticotrófica AGO Argonauta

AVP Arginina vasopressina ou Hormona antidiurética AKE Cloreto de amónio fosfato de hidrogénio e EDTA

B

BMAL1 Brain and muscle arnt-like-protein-1

C

cAMP Adenosina 3’ 5’ monofosfato cíclico CCGs Clock controlled genes

cDNA DNA complementar

CLOCK Circadian locomotor output cycles kaput CRE cAMP response element

CREB cAMP response element binding CREm Modulador de CRE

CRH Hormona libertadora de corticotrofina CRY Crypthochrome gene

Ct Cycle threshold D

DGCR8 DiGeorge Syndrome Critical Region 8 dL Decilitro

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ABREVIATURAS

dsRNA Double-stranded ribonucleic RNA

E

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

G

CG Glucocorticóides

H

HSF1 Heat shock factor 1

I

IFN γ Interferão gama

L

LSS Lanosterol sintase

M

MCR2 Recetor melanocortina-2 MiRNA MicroRNA

mRNA RNA mensageiro

N

NFR2 Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 NSQ Núcleo supraquiasmático

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ABREVIATURAS

P

PCR Polymerase Chain Reaction PER Period gene

PKA Proteína quiinase A IPM Intervalo post-mortem pre-miRNA microRNA precursor pri-miRNA microRNA primário PVN Núcleo paraventricular

R

RER Reticulo endoplasmático rugoso RISC RNA-induced silencing complex RNA Ácido ribonucleico

RNase Ribonuclease RNA Pol II RNA Polimerase II RT Reverse Transcriptase

S

SNC Sistema nervoso central

StAR Proteína reguladora aguda esteroideogénica STAT3 Signal transducer and activator of transcription 3

T

TNF α Fator de necrose tumoral

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ABREVIATURAS

X

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INTRODUÇÃO

1. Introdução

1.1. Contextualização histórica

O relógio tornou-se imprescindível para controlar a passagem do tempo na vida agitada da nossa sociedade, visto que horários e prazos são critérios continuamente presentes no dia-a-dia do Homem. Porém, os relógios biológicos já são parte integrante e indispensável na Terra desde a evolução dos organismos unicelulares mais primitivos até ao ser humano. À medida que a trajetória do Sol e da Lua se concretiza, juntamente com a inclinação natural do eixo da Terra, resultam a ocorrência de ciclos associados ao dia e à noite, estações do ano, fases da Lua e oscilação de marés (1). Deste modo, as espécies desenvolveram determinados comportamentos de forma a se adaptarem e viverem com estas mudanças ciclícas. Exemplos destas oscilações, são o facto de algumas espécies de plantas germinarem numa determinada época, de outras perderem as folhas, de alguns animais migrarem para regiões mais propícias à sua sobrevivência e outros hibernarem durante épocas adversas para a sua sobrevivência. Tal como outras espécies, o organismo do ser humano apresenta ritmos biológicos endógenos denominados de relógios biológicos, que lhe permite adaptar antecipadamente as suas respostas, face a estímulos externos como a luz e a temperatura (1).

O estudo do funcionamento e regulação dos relógios biológicos é designado de Cronobiologia. A Cronobiologia é a ciência que se dedica a estudar a relação entre o tempo cronológico (resultante da rotação do planeta Terra no seu próprio eixo) e o ritmo biológico dos organismos, bem como os efeitos que resultam da desregulação entre ambos, como por exemplo, desregulações no sono, no desenvolvimento, metabolismo e funções comportamentais (2). O primeiro cientista a suspeitar da existência de relógios biológicos foi o astrónomo Jean Jaques de Mairan, que em 1729 observou que uma planta no seu escritório, de espécie Mimosa pudica, abria conforme a luminosidade. Para comprovar essa observação, decidiu colocar a planta dentro de um baú e verificou que mesmo nas condições de escuridão, a planta continuou a movimentar-se como se acompanhasse os ciclos de dia e noite durante alguns dias (3). Um século após, em 1835, Augustin Pyrame de Candolle, observou que a planta de espécie Mimosa pudica, mantida no escuro num período mais prolongado, apresentava um movimento variável entre as 22 horas e 23 horas, mas em condições normais de iluminação, o movimento da planta era ajustado para as 24 horas. Isto, permitiu-lhe concluir que o ciclo era uma expressão do ritmo endógeno da planta e que dependia da variável claro/escuro do ambiente (4). Apesar das

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INTRODUÇÃO

descobertas, a Cronobiologia não foi considerada um campo legítimo de estudos científicos e, apenas no século XX é que começou a ganhar relevo quando novas técnicas começaram a comprovar a importância do funcionamento dos relógios biológicos ao nível neurológico e molecular (5).

O termo relógio biológico foi introduzido só no final da década de 40 do século passado, pelo alemão Gustav Kramer. Este investigador estudou a migração das aves, argumentando que as aves migravam para Norte na primavera tendo como ponto de referência o sol (6). Para Gustav Kramer, as aves necessitavam de uma entidade fisiológica que fosse precisa para a contagem do tempo, ou seja, um relógio (7). A luz, tal como a temperatura por exemplo, são definidos como “inputs” ambientais, também designados por zeitgebergs, capazes de sincronizar o tempo cronológico com o tempo biológico e assim, conferir vantagem seletiva na espécie (6). Mais tarde, Franz Halberg não só definiu os ritmos biológicos como atividades endógenas do organismo sincronizadas com o ambiente e que se repetiam ciclicamente, como também os classificou em ritmos ultradianos, infradianos ou circadianos (8). Halberg definiu os ritmos ultradianos como ritmos caracterizados por pequenas variações em curtos espaços de tempo, ou seja, ritmos que ocorrem várias vezes num período de 24 horas. Exemplo destes ritmos são os batimentos cardíacos e respiratórios (9). Relativamente aos ritmos infradianos, caracterizou-os como variações ocorridas num período superior a 28 horas. Exemplos destes ritmos são os ciclos estrais em roedores (que ocorrem a cada 3 ou 4 dias em ratos) e o ciclo menstrual (que ocorre aproximadamente a cada 28 dias nas mulheres) (9). Por último, Halberg definiu os ritmos circadianos (do latim Circa diem que significa “sobre o dia”) como ritmos caracterizados pela ocorrência num período de 24 horas, de acordo com o tempo de rotação da terra em torno do seu próprio eixo. Exemplos destes ritmos são o ciclo claro/escuro, a produção hormonal (cortisol, melatonina), regulação da temperatura corporal e pressão arterial (10).

Tal como Gustav Kramer, também Curt Richter afirmou que os relógios biológicos seriam “instrumentos do corpo para manter a contagem do tempo”. Sugeriu também, que os relógios biológicos poderiam estar presentes em diferentes órgãos (7). O reconhecimento da presença de estruturas envolvidas na medição do tempo, através de experiências que consistiram na observação de lesões progressivas no sistema nervoso central (SNC) em ratinhos, com a permanência ou supressão de ritmos diários, levou-o à conclusão que o centro responsável pela regulação da ritmicidade era o hipotálamo (7). Com esta descoberta, em 1972, Martin Moore Ede, juntamente com a sua equipa, partiu do princípio que o zeitgeberg com maior influência sobre o relógio biológico seria o ciclo

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INTRODUÇÃO

claro/escuro e por isso decidiu estudar o papel da visão neste ciclo, conseguindo descrever a via retino-hipotalâmica que terminava em dois núcleos na base do cérebro, os núcleos supraquiasmáticos (NSQ) (11). No mesmo ano, um estudo em ratinhos demonstrou que os ritmos circadianos envolvidos na ingestão de água ficavam suprimidos na existência de lesões nos NSQ (12). Passados 7 anos, Kawamura e Inouye cortaram todas as ligações das restantes estruturas do cérebro dos ratinhos com os NSQ. Antes do “knockout” das restantes estruturas, observaram que a atividade elétrica do hipotálamo apresentava ritmicidade circadiana, porém após o procedimento, a ritmicidade circadiana apenas persistiu na região dos núcleos, confirmando que eram as estruturas responsáveis pela oscilação endógena do sistema nervoso central (SNC) (13). Estabeleceram então dois critérios para que uma estrutura fosse considerada um oscilador endógeno: 1) atividade autónoma mesmo quando isolado de outras estruturas e mantido in vivo e, 2) a capacidade do tecido restaurar a sua atividade se implantado em hospedeiros sem atividade (13). Na década de 90, o segundo critério foi confirmado através de uma experiência com ratinhos com um período de atividade de 21 horas versus ratinhos com um período de atividade de 24 horas. Ao ser provocada uma lesão nos NSQ dos modelos animais com período de atividade de 24 horas, estes ficaram sem atividade, porém, após serem transplantados os NSQ com um período de atividade de 21 horas, os ratinhos que anteriormente tinham um período de atividade de 24 horas passaram a ter ritmos de atividade e repouso com períodos iguais aos dos dadores (14).

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INTRODUÇÃO

1.2. Relógio biológico e mecanismos moleculares do ritmo circadiano

Os relógios biológicos são um mecanismo intrínseco às células, organizados, e que preparam o organismo para os estímulos externos com o objetivo de manter a homeostasia corporal

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. O nosso organismo possui um relógio principal no cérebro que funciona como um temporizador, coordenando todos os relógios biológicos do organismo e mantendo-os sincronizados. Nos seres vertebrados, o relógio principal constitui cerca de 20 000 neurónios com capacidade rítmica autossustentável que formam uma estrutura denominada NSQ

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. O NSQ localiza-se mais precisamente no hipotálamo anterior, na região ventral do cérebro, na junção do cérebro médio com os tálamos óticos

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. Este núcleo, está estrategicamente posicionado para receber informações visuais e para percecionar a presença e ausência de luz, tanto direta como indiretamente através da via da retina (Figura 1)

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. Outro temporizador presente no cérebro é a glândula pineal, responsável pela secreção de melatonina (18). Embora o SNC regule a maioria dos ritmos circadianos nos mamíferos, muitos órgãos e tecidos do corpo podem gerar ritmos circadianos independentemente, sendo denominados osciladores circadianos periféricos (19). Os osciladores periféricos estão presentes no sangue, coração, fígado, tecido adiposo e outras regiões (20).

Figura 1. Localização do núcleo supraquiasmático (Adaptado de Netter FH (21)).

Os relógios biológicos têm a capacidade de estabelecer os horários das refeições, do sono, os níveis das hormonas como é o caso do cortisol sérico, regular a resposta do

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INTRODUÇÃO

corpo ao açúcar, entre outros processos biológicos. Permitem também que as mudanças nos processos celulares ocorram em tempos ideais (22). A realização destes processos biológicos é realizada uma vez que, o relógio do SNC é composto por múltiplos osciladores unicelulares que quando sincronizados, geram respostas circadianas coordenadas (23).

Embora os componentes moleculares individuais do relógio circadiano não sejam totalmente homólogos entre o ser humano e a mosca Drosophila melanogaster, o conhecimento atual sobre o ritmo circadiano e a sua interação com fatores externos foi aprofundado pelos estudos realizados neste modelo animal (24). Foi a partir deste modelo que o primeiro gene do relógio foi identificado, nomeadamente o gene period (PER) (7). Os restantes genes foram identificados nos anos 90: cryptochrome (CRY), brain and muscle arnt-like protein-1 (BMAL1) e circadian locomotor output cycles kaput (CLOCK) (25).

Ao nível celular, os ritmos circadianos são consequência dos genes relógio que conjuntamente se autorregulam para gerar ritmos que regulam e preparam o organismo para estímulos externos, mantendo a homeostasia corporal (26-28). Por sua vez, ao nível molecular os ritmos circadianos são sustentados por interações de loops de feedback negativo que produzem ritmos cíclicos ao nível das proteínas e do ácido ribonucleico (RNA) dos principais componentes do relógio (2).

Tal como já foi referido, os principais genes envolvidos nos mecanismos do relógio são: os genes CLOCK, BMAL1, PER e CRY (2). Estes genes podem ser divididos em duas categorias antagónicas: os reguladores positivos e os reguladores negativos. Nos reguladores positivos estão incluídos os principais fatores responsáveis pela transcrição no primeiro feedback loop, nomeadamente os genes CLOCK e BMAL1. Estas proteínas ligam-se, formando um dímero e têm como principal função a ativação da transcrição. No núcleo ligam-se a promotores E-box que, por sua vez, vão aumentar e controlar a transcrição dos genes que codificam os reguladores negativos: CRY e PER. As proteínas CRY e PER quando são produzidas no citoplasma ligam-se, formam um dímero, e são transportadas novamente para o núcleo onde vão ter a função de inibir ativadores de transcrição dos genes CLOCK e BMAL1 (29). Antes do próximo ciclo iniciar, o dímero CLOCK:BMAL1 deve ser reativado e por isso, os níveis de produção das proteínas CRY e PER vão diminuir até se tornarem insuficientes para reprimir a atividade de CLOCK:BMAL1, o qual volta a ativar a transcrição dos genes que codificam os reguladores negativos, reiniciando um novo ciclo (Figura 2).

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INTRODUÇÃO

Figura 2. Transcription-translation feedback loop – Formação do dímero CLOCK:BMAL1 e consequente ativação da transcrição dos genes que codificam reguladores CRY e PER no núcleo. Ligação do dímero

PER:CRY no citoplasma que é transportado para o núcleo para inibir ativadores de transcrição dos

genes CLOCK e BMAL1.

Ao mesmo tempo, um segundo feedback loop (Figura 3) é responsável pela regulação do gene BMAL1. No núcleo, os dímeros CLOCK:BMAL1 ativam a transcrição do gene Reverb α e β (conhecido como NR1D1 e NR1D2 ou subfamília do recetor nuclear 1) cuja respetiva proteína compete com a proteína Ror α, β e γ, para se ligarem a CORE que está localizado em E-box de promotores do BMAL1. No entanto, quando se ligam ao promotor, as proteínas possuem ações contrárias. A Ror α vai ativar a expressão de BMAL1, enquanto que Reverb α vai inibir a expressão (30). Como consequência ocorrem oscilações das concentrações de Reverb α, Ror α e produção de BMAL1. Contudo, se ocorrer uma maior expressão de Ror α, ou seja, mais ativação, a proteína BMAL1 vai ser produzida para formar novamente dímeros com a proteína CLOCK.

Figura 3. Auxiliar transcription-translation feedback loop responsável pela regulação do gene BMAL1. Ativação de Reverb α e Ror α que consequentemente inibem ou ativam (respetivamente) da produção de BMAL1.

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INTRODUÇÃO

É importante referir que as proteínas envolvidas na regulação da transcrição dos próprios genes do relógio também regulam a transcrição de genes alvo, denominados clock controlled genes (CCGs) (Figura 4). Os CCGs são responsáveis por codificar substâncias como vasopressina, recetores de hormonas (glucocorticoides, estrogénios) neurotransmissores, fatores de transcrição (HSF1, STAT3), neuropéptidos, que regulam os neurónios do NSQ e posteriormente, todo o organismo através de enervações diretas sobre o tecido alvo (31).

Figura 4. Regulação da transcrição dos clock controlled genes (ccgs), responsáveis por codificar substâncias que regulam os neurónios do NSQ.

1.3. Regulação do ritmo circadiano pela luz

O estímulo externo, que vai permitir regular o ritmo circadiano, é a luz. A entrada da luz é permitida através da retina, apresentando o seguinte trajeto: retina, NSQ, órgãos periféricos.

A retina é uma estrutura localizada na parte mais interna do globo ocular. Esta estrutura, constituída por células especializadas, nomeadamente fotorrecetores, tem como principal função converter o estímulo luminoso em impulsos nervosos, através da transdução e transmissão de sinal pelo nervo ótico para o cérebro (32). Alguns estudos demonstram que muitos aspetos da função e da fisiologia da retina são controlados por um relógio circadiano, tais como a libertação da melatonina pela glândula pineal, o aumento do cortisol nas primeiras horas do dia e posterior diminuição, a síntese de dopamina, entre outros (33-35). A informação da entrada de luz é transportada para o SNC diretamente pela via trato retina-hipotálamo para o NSQ (28). Após receber a informação, o NSQ coordena-a para todos os órgãos periféricos como o fígado, o coração, os pulmões e outros sistemas, de forma a regular e organizar os processos fisiológicos (36) (Figura 5).

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INTRODUÇÃO

Figura 5. Regulação dos relógios circadianos. A informação da entrada do estímulo luminoso na retina transportado para o SNC, é coordenado pelo NSQ onde está localizado o relógio central responsável por regular ciclos sono-vigília, performances cognitivas e transmitir as informações para os relógios dos órgãos periféricos, permitindo assim a homeostasia corporal.

1.4. Importância do cortisol no ritmo circadiano

O eixo hipotálamo-hipófise-adrenal é considerado um importante circuito neuroendócrino responsável pelo controlo de respostas ao stress, sendo a sua atividade efetuada em resposta a hormonas excretadas pela glândula suprarrenal. No hipotálamo são libertados sinais neuroquímicos provocados por uma resposta ao stress que estimulam os neurónios do núcleo paraventricular (PVN) a libertar hormona libertadora de corticotrofina (CRH) e arginina vasopressina (AVP). As hormonas libertadas possuem como objetivo induzir a síntese da hormona adrenocorticotrófica (ACTH) e secreção na hipófise, visto que a sua produção aumenta em períodos de stress. Por sua vez, a ACTH induz a síntese e secreção na glândula SR de glucocorticóides (GC), nomeadamente o cortisol (37), que interagem com recetores específicos do SNC e em vários tecidos-alvo periféricos (38) (Figura 6). Assim, os GC em circulação desativam a atividade neuroendócrina do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, através de um feedback negativo, de maneira que preparam o corpo para lidar com estímulos e manter assim a homeostasia (39).

(36)

INTRODUÇÃO

Figura 6. Mecanismo de ação eixo hipotálamo-hipófise-adrenal.

A glândula suprarrenal, é um relógio periférico que pode influenciar os ritmos dos tecidos periféricos através da libertação de hormonas com propriedades moduladoras. Enquanto que a medúla é responsável por libertar catecolaminas (nomeadamente epinefrina e norepinefrina), o córtex da suprarrenal secreta mineralocorticóides, glucocorticóides (CG) e esteróides sexuais (40).

Os GC são libertados com a ligação da hormona ACTH que é secretada pela hipófise, ao recetor da melanocortina 2 (MCR2) na glândula suprarrenal. Após a ativação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, a ACTH liga-se ao recetor da hormona adrenocorticotrofica (ACTHr), ativando a proteína G e posteriormente estimulando a adenilciclase (AC) que catalisa a formação da adenosina 3',5'-monofosfato cíclico (cAMP). Com a estimulação da atividade da cAMP, os fatores de transcrição nuclear da proteína quinase (PKA), as proteínas de ligação ao elemento de resposta cAMP (cAMP response element binding (CREB) e cAMP response element (CRE)) e o modulador da CRE (CREm) também são ativados (Figura 7). Estes fatores são responsáveis pela modulação da expressão dos genes envolvidos na síntese de GC (41).

(37)

INTRODUÇÃO

Figura 7. Síntese de gluocorticóides e posterior formação de proteína quinase.

Após a ativação dos vários fatores, a proteína reguladora aguda esteroideogénica (StAR) atua como um transportador que regula a passagem do colesterol da membrana mitocondrial externa para a membrana mitocondrial interna. É importante salientar que o gene codificante da StAR é controlado pelo relógio específico da suprarrenal bem como pelo heterodímero CLOCK: BMAL1 (42, 43). Na mitocôndria, o colesterol passa por várias ações sequenciais mediadas por hidroxiesteróides desidrogenases e citocromos P450. Este, começa por ser clivado pela enzima cyp11a1 e é convertido em pregnenolona. De seguida, no retículo endoplasmático rugoso (RER), a pregnenolona é metabolizada pelas enzimas 17-α-hidroxilase (cyp17) (presente apenas em espécies produtoras de cortisol) e 3-β-hidroxiesteróide desidrogenase (3β-HSD ou HSD3B) e é convertida em 17-α-hidroxipregnenolona e 17-α-hidroxiprogesterona, respetivamente (44). Posteriormente, a 21-β-hidroxilase (cyp21) converte 17-α-progesterona em 11-desoxicortisol. Finalmente, na mitocôndria e por ação de 11-β-hidroxilase (cyp11b1), o 11-desoxicortisol é transformado em cortisol (41) (Figura 8).

Figura 8. Via da síntese do cortisol. Transporte do colesterol da membrana mitocondrial externa para a membrana mitocondrial interna pela proteína StAR. Na mitocôndria e reticulo endoplasmático, o colesterol passa por ações sequenciais até ser transformado em cortisol.

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INTRODUÇÃO

O cortisol é uma hormona glucocorticóide diretamente envolvida com a adaptação a respostas de stress e controlo da via do eixo neuro endócrino do hipotálamo-hipófise-adrenal (ritmo circadiano). Possui também outras funções, nomeadamente, a regulação da resposta imune, da função cerebral, da atividade cardiovascular e do metabolismo. É o principal glucocorticóide presente em humanos e possui uma oscilação circadiana muito característica. A hormona corticosteroide é considerada um índice útil para a atividade do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, pois a sua atividade aumenta no organismo imediatamente após uma pessoa despertar (45, 46).

Num indivíduo saudável, os níveis de cortisol apresentam variações específicas ao longo do dia. A sua concentração mais elevada observa-se aproximadamente 20-45 minutos após o indivíduo despertar e vai diminuindo ao longo do dia até atingir um valor mínimo durante a noite (47). Por norma, o cortisol atinge o seu pico mais elevado por volta das 9 horas da manhã, a partir das 14:30 e as 15:30 verificam-se uma diminuição dos valores de cortisol, atingindo um valor mais baixo por volta da meia-noite, independentemente do género. No entanto, é importante salientar que na presença de determinadas patologias como o síndrome de Cushing (hipercortisolismo) ou na presença de um tumor adrenal a produção de cortisol fica descontrolada e os seus níveis anormalmente elevados, não sendo possível observar uma variação circadiana (Figura 9) (48). É ainda de referir que indivíduos que façam trabalhos noturnos ou trabalhem por sistema de turnos também podem apresentar um padrão de níveis de cortisol alterado (49, 50).

Figura 9. Variações dos níveis de cortisol ao longo de um dia (Adaptado de Fleming B. (51)).

Atualmente, sabe-se que na regulação da via do cortisol, estão envolvidos mecanismos de regulação epigenéticos como é o caso dos microRNAs (miRNAs). Os miRNAs apresentam um papel importante na modulação da produção do cortisol, modulando a expressão dos genes envolvidos.

(39)

INTRODUÇÃO

1.5. microRNAs

Os miRNAs são pequenas moléculas de cadeia simples de RNA não codificante, com aproximadamente 19-25 nucleotídeos de comprimento, que regulam a expressão de genes através da degradação ou repressão da tradução de moléculas-alvo de RNA mensageiro (mRNA) (52). Desta forma, poderão influenciar a regulação de processos celulares fisiológicos de reação ao stress (53). Estes pequenos RNAs endógenos estão envolvidos em várias funções no organismo tais como proliferação celular e apoptose, metabolismo de gordura, diferenciação celular, regulação do sistema imunitário, envelhecimento e também homeostasia da glicose. Adicionalmente, cada miRNA tem a capacidade de regular até 100 mRNAs diferentes, o que torna a sua expressão dinâmica (52).

O processo de síntese dos miRNAs inicia-se no núcleo, onde os genes dos miRNAs são transcritos pela RNA polimerase II (RNA Pol II), resultando precursores de miRNAs de grandes dimensões designados miRNAs primários (pri-miRNAs). Os pri-miRNAs sobre ação da enzima Drosha, uma ribonuclease III associada à proteína do domínio dsRNA (double-stranded ribonucleic RNA), conhecida como DGCR8 (DiGeorge syndrome critical region), dão origem a miRNAs precursores (pré-miRNAs). Os pré-miRNAs são transportados para o citoplasma com o auxílio da proteína exportina-5 (XPO5). No citoplasma, os pré-miRNAs são processados pela RNAse III dicer (enzima que cliva moléculas de cadeia dupla de RNA) resultando numa cadeia de miRNA madura e a sua cadeia complementar. De seguida, a dicer associa-se à transactivation-responsive RNA-binding protein (TRBP) juntamente com proteínas argonautas (AGO). Ao mesmo tempo, que acontece esta associação, as cadeias vão desenrolando e o miRNA maduro é incorporado no RNA-induced silencing complex (RISC). O miRNA guia assim, o RISC (complexo multiproteico) para o RNA mensageiro complementar (mRNA alvo) (54). (Figura 10).

(40)

INTRODUÇÃO

Figura 10. Representação esquemática da biogénese de microRNAs

Dependendo do grau de complementaridade entre os miRNAs e a sequência do mRNA alvo, o silenciamento pode ocorrer de duas formas: degradação do mRNA alvo (quando a complementaridade é total) ou por repressão da tradução (quando a complementaridade é parcial) (55, 56) (Figura 11).

(41)

INTRODUÇÃO

1.6. microRNAs envolvidos na via do cortisol e sua importância para as ciências forenses

Na prática forense, um dos maiores dogmas para o perito legista é a determinação da hora da morte de um indivíduo. Determinar a hora da morte, é um grande desafio, principalmente no caso de cadáveres pouco conservados, no entanto é possível estabelecer a sequência de acontecimentos (através do estudo de processos físicos como o livor mortis, tanatoquímicos como as alterações oftalmológicas , microbiológicos como a decomposição, físico-químicos como a rigidez cadavérica, entre outros) que ocorreram após a morte através do intervalo post-mortem (IPM) (57). O IPM corresponde ao intervalo de tempo que decorre entre a morte de um indivíduo e a descoberta do respetivo cadáver (58). A determinação do IPM permite auxiliar na resolução de muitos crimes, identificar vítimas e suspeitos, aceitar ou rejeitar álibis, fornecer uma estimativa da altura da morte e é essencial para o preenchimento do atestado de óbito (59). Contudo, a estimativa muitas vezes não é precisa e fiável uma vez que os cadáveres são suscetíveis à ação de fatores extrínsecos como a temperatura, humidade, pH e fatores intrínsecos como a idade do indivíduo, género ou patologias associadas (60).

Atualmente, realizam-se estudos que se centram no potencial dos miRNAs para obter uma estimativa exata do IPM (59, 61). O pequeno tamanho destes, permite que não sejam tão suscetíveis à degradação mantendo-se estáveis ao longo do IPM, simultaneamente estas moléculas são colhidas em quantidade e qualidade suficiente para a análise, mesmo que tenham sido expostas a condições adversas como é o caso de variações de pH e múltiplos ciclos de congelação/descongelação (59, 60). Os miRNAs também são moléculas capazes de regular vários constituintes de uma única via (como por exemplo a via do cortisol), de modo que, a soma de todos esses efeitos podem resultar em alterações pronunciadas no geral (62). Deste modo, a sua estabilidade ao longo do IPM permite que a quantificação de miRNAs sensíveis ao ritmo circadiano (um importante regulador da via do cortisol e consequentemente do ciclo sono-vigília) diferencie de uma maneira exata o período do dia (manhã, tarde ou noite) em que ocorreu uma morte e assim pode auxiliar na inclusão ou exclusão de possíveis suspeitos a um local de crime (63).

Segundo a literatura, no decorrer da produção de cortisol, a modificação pós-transcrição por miRNAs desempenha um papel bastante significativo pois, verifica-se uma inibição da expressão de miRNAs por knockdown da enzima Dicer (62). Esta inibição leva ao aumento da produção do cortisol, implicando que a esteroidogénese é regulada

(42)

INTRODUÇÃO

negativamente por miRNAs. Outro estudo refere que entre os miRNAs cuja expressão aumentou significativamente após knockdown da enzima Dicer, são assinalados os hsa-miR-24 e hsa-miR-10b que regulam negativamente cyp11b1, e o hsa-miR-320a-3p que regula negativamente cyp11a1 e cyp17a1 (64).

Por isso, mostra-se interessante estudar o potencial de miRNAs envolvidos nas vias de produção do cortisol como biomarcadores de ritmo circadiano e assim associá-los com os níveis de cortisol, nas 3 fases do ciclo circadiano (manhã, tarde e noite).

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OBJETIVOS

45 miRNAs como biomarcadores do ritmo circadiano

2. Objetivos

2.1. Objetivo principal

Estudo do potencial de miRNAs envolvidos nas vias de produção do cortisol como biomarcadores de ritmo circadiano em amostras de sangue e saliva.

2.2. Objetivos específicos

• Revisão da literatura de modo a selecionar os miRNAs envolvidos na via de produção do cortisol com potencial para serem usados como biomarcadores do ritmo circadiano em amostras de sangue e saliva.

• Estudo do perfil de miRNAs selecionados em amostras de sangue periférico e saliva e estabelecimento da sua associação com os níveis de cortisol, nas 3 fases do ciclo circadiano (manhã, tarde e noite) numa população de 20 indivíduos saudáveis provenientes do Norte de Portugal.

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MATERIAIS E MÉTODOS

3. Materiais e métodos

3.1. Seleção do perfil de microRNAs

Inicialmente realizou-se uma revisão da literatura com recurso à Pubmed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/). Numa primeira fase, pesquisaram-se as seguintes palavra-chave “microRNA biomarker in cortisol”; “microRNA in glucocorticoid action”; “MicroRNA cortisol regulator”; “microRNAs in circadian rhythm” e “microRNAs as a stress biomarker”, obtendo-se um total de 794 artigos. Destes, foram selecionados aqueles que incluíssem pelo menos um dos seguintes critérios: estudos realizados em amostras de sangue periférico ou saliva em indivíduos, estudos com informações relativas à influência de miRNAs na via de cortisol, estudos que associam níveis de stress com expressão de miRNAs e artigos publicados a partir de 2010. Foram exluídos todos os artigos que envolviam o estudo de diferentes patologias, tendo resultado desta seleção 7 artigos científicos.

3.2. População em estudo

Foram realizadas colheitas de sangue e saliva em 20 indivíduos voluntários, caucasianos e saudáveis (6 homens e 14 mulheres) provenientes do Norte de Portugal. As amostras de sangue periférico foram obtidas por punção venosa ante cubital em tubos com EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) e em tubos com ativador de coágulo (para análise bioquímica do cortisol) ao início da manhã (aproximadamente 8 horas) e à tarde (aproximadamente 15 horas). As amostras de saliva foram recolhidas através de um kit salivette à noite (aproximadamente 24 horas) (Tabela 1). Todas as colheitas foram realizadas após consentimento esclarecido e informado escrito, de acordo com os princípios da Declaração de Helsínquia. Após a colheita as amostras, foram submetidas a um processamento segundo um protocolo padronizado e estabelecido pelo laboratório. O primeiro passo foi registar as amostras. Para cada amostra foi também atribuído um código de forma a que as amostras fossem aleatorizadas.

(51)

Tabela 1. Colheita das amostras biológicas

N Média idade Amostra Modo colheita Período dia

14 Mulheres 25,5 anos

Sangue periférico

Tubo EDTA Manhã

Tarde Tubo com ativador de coágulo Manhã Tarde

Saliva Kit Salivette Noite

6 Homens 39,7 anos

Sangue periférico

Tubo EDTA Manhã

Tarde Tubo com ativador de coágulo Manhã Tarde

Saliva Kit Salivette Noite

3.3. Processamento de amostras

Após realizadas as colheitas das amostras, processaram-se os dois tipos de amostra da seguinte forma: os kits salivette com as amostras de saliva foram centrifugados durante 2 minutos a 1000 g, transferindo-se o sobrenadante para um eppendorf. Os tubos com amostras de sangue periférico foram centrifugados a 2500 rpm durante 5 minutos. Após a centrifugação, foi recolhido 1 mL de plasma para um eppendorf, 1 mL de sangue total para outro eppendorf e 200 µL de sangue para extração de miRNAs para outro eppendorf devidamente identificados e armazenados a -20 ºC. O restante sangue foi transferido para um tubo cónico à qual foi adicionado cloreto de amónio, fosfato de hidrogénio e EDTA (AKE 1X) para a lise de eritrócitos, até perfazer 50 mL. As amostras foram refrigeradas durante 20 minutos e centrifugadas durante 10 minutos a 2500 rpm. O sobrenadante foi descartado, o pellet de leucócitos ressuspendido em AKE 1X e foi centrifugado durante 10 minutos a 2500 rpm. De seguida, o sobrenadante foi novamente descartado e o pellet de leucócitos ressuspendido em PBS 1X (solução salina tamponada com fosfato) para lavagem celular. Foi centrifugado mais uma vez nas mesmas condições, o sobrenadante foi descartado e o pellet de leucócitos ressuspendido em TripleExtractor (Grisp-Research Solutions®) e armazenado a -80ºC.

(52)

3.4. Extração de microRNAs

A extração de miRNAs das amostras de saliva e sangue periférico foi realizada com o GRS microRNA Purification kit, após adaptação das especificações do procedimento laboratorial (Grisp Research Solutions®_{). Este método de extração é eficiente e rápido para}

a purificação de miRNAs, com baixa contaminação de grandes moléculas de RNA e DNA genómico. Nas amostras extraídas de sangue periférico começou-se por adicionar 600 µL de tampão de lise de eritrócitos e incubou-se durante 5 minutos à temperatura ambiente. De seguida foi adicionado 200 µL de tampão de lise e ressuspendeu-se. Incubou-se novamente durante 10 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente foi adicionado 20 µL de tampão de miRNAs, 220 µL de fenol-clorofórimo e centrifugou-se a 15.000g por 3 minutos permitindo assim a separação de 3 fases: fase transparente correspondente aos miRNAs, anel branco correspondente ao DNA e deposição no fundo do eppendorf correspondente às proteínas. Colheu-se a fase transparente e procedeu-se para a purificação dos miRNAs seguindo o protocolo do kit. Relativamente às amostras de saliva, também foram adicionados 200 µL de tampão de lise e ressuspendeu-se. Incubou-se novamente durante 10 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente foi adicionado 35 µL de tampão de miRNAs, 385 µL de fenol-clorofórmio e centrifugou-se a 13.000g por 10 minutos permitindo assim a separação das 3 fases. Os restantes passos foram seguidos tendo em conta as instruções do fabricante, sendo que o principal objetivo deste kit é utilizar sais caotrópicos e várias concentrações de etanol para permitir a ligação seletiva de RNA de tamanhos específicos à matriz da coluna. Os materiais contaminados são removidos com um tampão de lavagem e de seguida a coluna é centrifugada. De seguida, o RNA purificado é eluído com tampão de eluição livre de ribonucleases (RNAses).

Após a extração, para avaliar a integridade e qualidade do miRNA presente em cada amostra, estas foram quantificadas pelo Qubit™ 4 Fluorometer. Este equipamento para além de fazer uma deteção rápida e muito precisa, é suficiente 1 µL de amostra para ser realizada a sua quantificação.

3.5. Síntese de cDNA

Depois de devidamente quantificadas, procedeu-se à síntese de DNA complementar (cDNA). A síntese de cDNA do RNU-48 e dos miR-21 e miR-144-5p foi realizada através da utilização do kit TaqMan™ microRNA reverse Transcription (Applied Biosystems®). A síntese de cDNA para os restantes miRNAs selecionados foi realizada

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através do kit TaqMan™ Advanced miRNA cDNA synthesis (Applied Biosystems®_{). O uso}

do kit TaqMan™ Advanced miRNA cDNA synthesis (Applied Biosystems®_{) assegura: uma}

elevada sensibilidade, permitindo assim também uma quantificação de miRNAs de baixa expressão (especialmente em amostras biológicas como soro, plasma e tecidos); flexibilidade, uma vez que, possui uma etapa de RT universal que cria modelos universais de cDNA para todos os miRNAs presentes na amostra de forma a simplificar o processo de síntese de cDNA e necessita apenas de uma pequena quantidade de amostra.

3.6. Quantificação por PCR tempo real

Para avaliar os níveis de expressão dos miRNAs foram realizadas quantificações relativas por PCR quantitativo em tempo real por ser um método capaz de gerar dados quantitativos precisos, ser rápido devido à diminuição dos tempos dos ciclos de amplificação e ao uso de equipamento com alta sensibilidade para a deteção da fluorescência. O PCR em tempo real associa a metodologia de PCR convencional com um sistema de deteção e quantificação de fluorescência produzida nos ciclos de amplificação no decorrer da reação, ou seja, determina para cada amostra utilizada o número de ciclos no qual a fluorescência acumulada ultrapassa a sua baseline: o Ct (cycle threshold). Durante a amplificação, as amostras foram sujeitas a temperaturas de 95ºC durante 10 minutos e depois a 40 ciclos de 95ºC durante 15 segundos, seguida de 60ºC durante 1 minuto.

As reações foram realizadas no aparelho StepOne™ qPCR Real-Time. A mistura de reação foi feita com os seguintes componentes: H2O, 1X TaqMan® Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems®), 1X sondas específicas para amplificar os miRNA alvo (Taqman® microRNA Expression Assays®, miR-21, miR-144-5p e Taqman® Advanced microRNA Assays®, miR-10a, miR-10b, miR-16, miR-20, miR-24) e o controlo endógeno RNU48 (Applied Biosystems®) juntamente com as amostras de cDNA (5µL por amostra). Todas as quantificações foram realizadas em duplicado e foi incluído um controlo negativo de maneira a controlar possíveis contaminações.

3.7. Quantificação dos níveis de cortisol sérico e salivar

A quantificação dos níveis de cortisol foi efetuada com a colaboração do Serviço de Química Clínica do Departamento de Diagnóstico Laboratorial do IPO-Porto, de acordo

(54)

com os procedimentos de rotina do mesmo. A quantificação dos níveis de cortisol foi realizada com recurso ao teste ElecsysCortisol II® (Cobas®).

3.8. Análise estatística

De seguida foram feitas as análises das curvas de amplificação utilizando o StepOne™ (Applied Biosystems®) com a mesma linha de base e limite definido para cada placa, de forma a gerar valores de cycle threshold (Ct) para todos os miRNAs presentes em cada amostra.

No final, a análise estatística foi realizada com recurso ao software estatístico IBM®_SPSS®_{Statistics for Windows (Versão 25.0), de maneira a avaliar potenciais}

diferenças na expressão dos miRNAs estudados. Para avaliar a diferença dos níveis de expressão dos vários miRNAs analisados, calculou-se o fold-change ou método de Livak através da fórmula (65):

𝟐−∆∆𝑪𝒕_{⟷ ∆∆Ct = ∆Ct (tarde) - ∆Ct (manhã)}

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RESULTADOS

4. Resultados

4.1. Frequências de deteção dos microRNAs estudados em amostras de sangue e saliva

Na população em estudo, observou-se que todos os miRNAs analisados foram detetados em ambos os fluídos biológicos (sangue e saliva) apresentando frequências de deteção muito variáveis, com exceção do hsa-miR-144-5p que não foi detetado na saliva. No período da manhã, podemos verificar que todos os miRNAs foram detetados no sangue total. Na figura 12 verifica-se que o hsa-miR-20 (figura 12d), o hsa-miR-21 (figura 12e) e hsa-miR-24 (figura 12f) foram os miRNAs com maior frequência de deteção, a variar entre os 80 e 90%, neste período do dia. Contrariamente, o hsa-miR-10b (figura 12b) foi o miRNA com menor frequência de deteção (15%), nesse mesmo período do dia.

Ao analisarmos, as frequências correspondentes ao período da tarde, podemos também concluir que todos os miRNAs também foram detetados no sangue total. Verificando-se que o hsa-miR-16 (figura 12c), hsa-miR-20 (figura 12d) e o hsa-miR-24 (figura 12f) foram os mais frequentes, com uma taxa de deteção de 80%). Por outro lado, verificámos que o hsa-miR-10b (figura 12b) e o hsa-miR-21 (figura 12e) apresentam a menor frequência de deteção (30%).

Relativamente à colheita realizada no período da noite, podemos observar que três miRNAs apresentam uma frequência máxima de deteção (100%) nas amostras de saliva, nomeadamente o hsa-miR-16 (figura 12c), o hsa-miR-21 (figura 12e) e o hsa-miR-24 (figura 12f). No entanto, o hsa-miR-10a (figura 12a), o hsa-miR-10b (figura 12b) apresentam baixas frequências (20%, 10%) e o hsa-miR-144-5p (figura 12g) não apresentou frequência de deteção.

Deste modo, verificámos que o miRNA mais frequente quando considerado os três períodos do dia foi o hsa-miR-24, sendo o hsa-miR-10b o miRNA menos frequente nas amostras de sangue e saliva.

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RESULTADOS

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RESULTADOS

4.2. Níveis de cortisol e quantificação relativa dos microRNAs nas amostras de sangue e saliva

De forma a estudar a dinâmica de expressão dos miRNAs em estudo ao longo do dia, foi determinado em simultâneo os níveis de cortisol de modo a estabelecer inferências relacionadas com o ritmo circadiano humano. Na população em estudo, verificamos uma variação dos níveis de cortisol ao longo do dia, sendo os valores mais elevados verificados no período da manhá (média de cortisol da população 26,12 µg/dL), diminuindo ao longo do dia (média de cortisol da população no períoda da tarde 14,03 µg/dL) e atingindo os valores mais baixos à noite (0,17 µg/dL).

Podemos visualizar na figura 13, que à medida que os níveis de cortisol vão diminuindo ao longo do dia, os níveis dos miRNAs vão aumentando, com exceção do hsa-miR-21 que se verifica uma lenta e pequena diminuição entre o período da manhã e da tarde e um acentuado aumento entre o período da tarde e da noite.

O hsa-miR-10a, hsa-miR-16 e hsa-miR-24 (figura 13a, 13c, 13f, respetivamente) apresentam um aumento gradual e constante ao longo do dia. No entanto, não se verifica o mesmo comportamento nos outros miRNAs.

O hsa-miR-10b (figura 13b) apresenta um aumento lento entre os períodos da manhã e tarde mas um aumento mais acentuado do período da tarde para a noite. Pelo contrário, tal como referido anteriormente, o hsa-miR-21 (figura 13e) apresenta uma pequena e lenta diminuição entre os períodos da manhã e tarde mas à semelhança com o hsa-miR-10b verifica-se um aumento mais acentuado entre os períodos da tarde e noite.

Os restantes miRNAs, nomeadamente o hsa-miR-20 (fig 13d) e hsa-miR-144-5p (fig 13g), apresentam inicialmente uma dinâmica semelhante (um aumento acentuado) entre a manhã e a tarde. Porém, verifica-se um aumento mais lento no hsa-miR-20 entre a tarde e a noite enquanto que não há deteção de hsa-miR-144-5p no mesmo período.

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RESULTADOS

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RESULTADOS

De acordo com os resultados, podemos verificar um aumento dos níveis de expressão do hsa-miR-10a, hsa-miR-16 e hsa-miR-24 nas amostras de sangue colhidas no período da tarde, comparativamente aos níveis de expressão detetados nas amostras de sangue colhidas no período da manhã. Sendo este aumento de 75,6 (P=0,013), 26,7 (P=0,018) e de 135,6 (P=0,002), respetivamente (Tabela 2).

Tabela 2. Valores de fold-change e pvalue para os hsa-miR-10a, hsa-miR-16 e hsa-miR-24.

hsa-miR Fold-change P

hsa-miR-10a 75,6 0,013

hsa-miR-16 26,7 0,018

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DISCUSSÃO

5. Discussão

Com o presente estudo pretende-se avaliar o potencial dos miRNAs associados à via de produção do cortisol como biomarcadores do ritmo circadiano. Atualmente, os miRNAs têm-se tornado alvo de estudo na área das ciências forenses pois a sua análise fornece informações úteis, principalmente em amostras que já se encontram degradadas (66). Na Medicina Legal, continua a ser um grande desafio a determinação da hora exata de morte de um cadáver. Como tal, é utilizado o intervalo post-mortem (IPM) que fornece uma estimativa do intervalo que ocorre entre a morte e a descoberta do respetivo cadáver para auxiliar o perito forense (58). Estudos que se centram no estudo do potencial dos miRNAs para obter uma estimativa do IPM demonstram que, o seu pequeno tamanho torna-se uma vantagem na sua utilização em relação ao mesmo tipo de estudos que analisam amostras de DNA, uma vez que estes não são tão suscetíveis à degradação por fatores físicos e químicos, mantendo-se estáveis durante longo períodos de tempo (59-61). Simultaneamente a esta característica, a quantidade e qualidade destas moléculas continua a ser suficiente para análise molecular mesmo que estas tenham sido expostas a condições adversas, como é o caso de variações de pH e temperatura (60). Deste modo, a elevada estabilidade dos miRNAs poderá permitir a análise da sua dinâmica associada à via de produção do cortisol possibilitando que seja fornecida uma estimativa da altura do dia (manhã, tarde ou noite) da morte de um indivíduo, uma vez que os níveis de cortisol apresentam uma ritmicidade diária. O conhecimento sobre o período do dia em que ocorreu a morte, poderá auxiliar a investigação criminal, permintindo inclusive restringir possíveis suspeitos ou encontrar possíveis testemunhas oculares, o que facilitará o conhecimento do evento.

Da análise dos níveis de expressão dos hsa-miR-10a, hsa-miR-10b, hsa-miR-16, hsa-miR-20, hsa-miR-21, hsa-miR-24 e hsa-miR-144-5p em amostras de sangue periférico e saliva, observou-se que estes apresentaram oscilação mediante o período do dia em que foram colhidas. Verificou-se que os hsa-miR-10a, hsa-miR-16 e hsa-miR-24 apresentaram um aumento de expressão ao longo do dia, contrariamente aos níveis de cortisol, que foram diminuindo ao longo do mesmo, tal como o esperado.

Um estudo realizado por Beech e colaboradores relacionou o aumento dos níveis de stress agudo com o aumento de expressão de hsa-miR-10a utilizando amostras de sangue, tendo sido colocada a hipótese deste miRNA ser influenciado por condições de stress agudo (67). Contudo, este autores não conseguiram estabelecer qualquer relação