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GURGIANE RODRIGUES GURGEL CAVALCANTE
AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA,
BIOQUÍMICA E COMPORTAMENTAL
DO EFEITO DE TERMOGÊNICOS EM
RATOS SUBMETIDOS À
MOVIMENTAÇÃO ORTODÔNTICA
Natal - RN
2019
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AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA, BIOQUÍMICA E COMPORTAMENTAL DO EFEITO DE TERMOGÊNICOS EM RATOS SUBMETIDOS À
MOVIMENTAÇÃO ORTODÔNTICA
NATAL - RN 2019
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS- GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS ODONTOLÓGICAS CURSO DE MESTRADO
GURGIANE RODRIGUES GURGEL CAVALCANTE
AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA, BIOQUÍMICA E COMPORTAMENTAL DO EFEITO DE TERMOGÊNICOS EM RATOS SUBMETIDOS À
MOVIMENTAÇÃO ORTODÔNTICA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Odontológicas.
Orientadora: Prof. Dra. Ruthineia Diogenes Alves Uchoa Lins
NATAL - RN 2019
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede
Cavalcante, Gurgiane Rodrigues Gurgel.
AValiação macroscópica, bioquímica e comportamental do efeito de termogênicos em ratos submetidos à movimentação ortodôntica / Gurgiane Rodrigues Gurgel Cavalcante. - 2019.
670 f.: il.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Biociências, Programa de Pós-Graduação em
Ciências Odontológicas, Natal, RN, 2019.
Orientadora: Profa Dra. Ruthineia Diogenes Alves Uchoa Lins.
1. Cafeína - Dissertação. 2. Movimentação dentária -
Dissertação. 3. Ratos - Dissertação. I. Lins, Ruthineia Diogenes Alves Uchoa. II. Título.
RN/UF/BCZM CDU 616.314-086.23
DEDICATÓRIA
Dedico essa dissertação primeiramente a Deus, meu maior amor, sem ele nada disso seria possível.
Dedico aos meus pais, Gilka Rodrigues do Nascimento Gurgel e Sebastião Gurgel de Lima pelo amor e apoio incondicionais, por estarem presentes em todos os momentos de minha vida com amor e dedicação e por serem os maiores incentivadores dos meus sonhos.
Dedico também ao meu esposo, Rodrigo Cavalcante do Nascimento por sempre me incentivar e acompanhar em todos os momentos, mesmo nos mais difíceis sempre esteve ao meu lado.
Por fim, dedico essa dissertação a minha querida professora orientadora Dra. Ruthinéia Diógenes Alves Uchoa Lins, exemplo de mestre, a qual eu me inspiro, sem o seu apoio este trabalho não teria sido realizado.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a professora Dra. Ruthinéia Diógenes Uchoa Lins, por ter me escolhido como sua orientanda, por ter me acolhido de uma forma tão amorosa, compreensiva e por ter me incentivado a concluir esse projeto e realizar meu sonho de me tornar mestre. Exemplo de mestre, a qual eu me espelho.
Agradeço a professora Dra. Halissa Simplício, por ter me acompanhado e co-orientado desde o início do projeto até sua conclusão, sempre com palavras de incentivo e nos mostrando o caminho.
Agradeço a professora Dra. Augena Antunes, por ter nos mostrado o caminho de estudos com animais, por ter nos cedido seu laboratório para pesquisa, por ser tão acolhedora e por ter aceito o convite de participar da minha banca.
Agradeço a professora Dra. Patrícia Bittencourt por ter aceitado participar da minha banca, exemplo de docente, a qual também me inspiro.
Agradeço a professora Érika Janine, por ter nos ajudado com as análises microscópicas, com tanto zelo e dedicação
Agradeço ao professor Serguey e sua orientanda Ariane por ter nos cedido os ratos de maneira tão gentil e pelas contribuições na banca de qualificação
Agradeço ao professor Carlos Augusto pelas contribuições na banca de qualifcação Agradeço ao professor Dr. José Sandro Pereira, por ter nos ajudado em todo período experimental, dedicando seu tempo.
Agradeço a dona Neida, técnica do laboratório que nos recebeu com tanta dedicação, nos ajudando no manejo dos animais.
Agradeço a minha amiga Mariana Cabral, pela parceria de sempre, pela paciência, por tornar o nosso trabalho mais leve, pelo amor com que fez tudo acontecer.
Agradeço aos meus irmãos Rogério Gurgel e Elizabete Gurgel pela parceria de sempre e por me incentivarem a nunca desistir dos meus sonhos, eles sabem do quanto foi difícil chegar até aqui.
Agradeço ao CCS, especialmente ao professor Antônio de Lisboa Costa Lopes por ter nos dedido ao animais
Agradeço a UFRN, por ter me possibilitado todas as condições necessárias para realização deste sonho.
Agradeço a Capes pela bolsa recebida durante o período do mestrado, que foi essencial para realização dos experimentos
RESUMO
Introdução: Considerando que a cafeína aumenta o metabolismo, muito se tem questionado se os termogênicos à base dessa substância apresentariam também alguma influência sob a taxa de movimentação ortodôntica e comportamento de roedores. Objetivo: Avaliar o efeito de duas marcas comerciais de termogênicos sobre o comportamento, o metabolismo e a movimentação ortodôntica em ratos. Metodologia: Tratou-se de um estudo experimental, in vivo, randomizado, com base descritiva e inferencial. A amostra foi constituída de 19 ratos machos Wistar (Ratus norvegicus albinus) saudáveis, entre 7 e 12 semanas de idade, os quais foram submetidos a movimentação dentária ortodôntica contínua dos primeiros permanentes molares superiores, do lado esquerdo, durante o período de 21 dias. Os ratos foram divididos aleatoriamente em 3 grupos: Grupo controle (GC) - Ratos submetidos apenas à movimentação ortodôntica e à ingestão diária de água (n=7); Grupo experimental Termogênico C4 (GT1) - Ratos submetidos à movimentação ortodôntica e à dose diária de termogênico C4 (n=8) e Grupo experimental Termogênico PRE-HD (GT2) - Ratos submetidos à movimentação ortodôntica e à dose diária de termogênico PRE-HD (n=4). A análise de movimentação ortodôntica foi feita obtendo-se a diferença da distância (em mm) da distal do 1˚ molar superior esquerdo à mesial do 2˚ molar superior do mesmo lado, medida realizada na região cervical com o auxílio de um compasso de ponta seca; a análise sistêmica foi realizada por meio de testes bioquímicos e do leucograma e o estudo comportamental através do teste de campo aberto. Resultados: Não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos GT1, GT2 e GC quanto à quantidade de movimentação ortodôntica (p>0,005). Com relação ao teste de campo aberto, houve diferença estatisticamente significativa (p <0,005) entre os grupos para as variáveis: movimentos ambulatórios, movimentos em pé, quantidade de pulos, distância percorrida, velocidade da distância percorrida e movimentos realizados no centro e nas bordas. E no tocante aos efeitos sistêmicos, o leucograma e os testes bioquímicos realizados não exibiram resultados significativos. Conclusão: O uso de termogênicos não exerce influência sobre a taxa de movimentação ortodôntica em ratos e não produz alterações sistêmicas relevantes, no entanto, é capaz de afetar vários aspectos do comportamento desses animais.
Palavras Chaves: Cafeína. Movimentação dentária. Ratos. Metabolismo. Comportamento
ABSTRACT
Introduction: Considering that caffeine increases metabolism, much has been questioned
whether thermogenics based on this substance would also have some influence on the rate of orthodontic movement and rodent behavior. Objective: To evaluate the effect of two thermogenic brands on behavior, metabolism and orthodontic movement in rats.
Methodology: This was an experimental, in vivo, randomized study, with descriptive and
inferential basis. The sample consisted of 19 healthy male Wistar rats (Ratus norvegicus albinus) between 7 and 12 weeks of age, which were submitted to continuous orthodontic movement of the first permanent maxillary molars on the left side during the 21 day period. The rats were randomly divided into 3 groups: Control group (CG) - Rats submitted only to orthodontic movement and daily water intake (n = 7); Experimental group Thermogenic C4 (GT1) - Rats undergoing orthodontic movement and daily dose of thermogenic C4 (n = 8) and experimental Group Thermogenic PRE-HD (GT2) - Rats submitted to orthodontic movement and daily dose of thermogenic PRE-HD (n = 4). The analysis of orthodontic movement was done by obtaining the difference in distance (in mm) from the distal of the 1˚ molar left superior to the mesial of the 2˚ molar superior of the same side, a measurement performed in the cervical region with the aid of a tip compass dry; the systemic analysis was performed through biochemical and leukogram tests and the behavioral study through the open field test. Results: There was no statistically significant difference between groups GT1, GT2 and CG regarding the amount of orthodontic movement (p> 0.005). Regarding the open field test, there was a statistically significant difference (p <0.005) between the groups for the variables: ambulatory movements, standing movements, number of jumps, distance traveled, speed of distance traveled and movements performed in the center and on the edges.Regarding the systemic effects, the leukogram and the biochemical tests performed did not show significant results. Conclusion: The use of thermogenics has no influence on the rate of orthodontic movement in rats and does not produce relevant systemic changes, however, it is capable of affecting several aspects of the behavior of these animals.
LISTA DE QUADROS E FIGURAS
Quadro 1. Descrição do Termogênico C4 Beta Pump - New Millen®...32
Quadro 2. Descrição do termogênico PRE-HD/ Pre Workout (Body Action/Sport Nutricion® – São Paulo, SP – Brasil)...32
Quadro 3. Descrição das Variáveis dependentes e independentes...36
Quadro 4. Resultados do leucograma, de acordo com os grupos do estudo...38
Quadro 5. Resultados dos testes bioquímicos, de acordo com os grupos do estudo...39
Figura 1. Inserção do amarrilho na região posterior...30
Figura 2. Adaptação do conjunto amarrilho-mola...30
Figura 3. Fotopolimerização da resina composta adaptada na região...30
Figura 4. Orifício criado na região anterior...30
Figura 5. Amarrilho adaptado na região anterior...30
Figura 6. Resina composta adaptada na região anterior...30
Figura 7.PRE HD/Pre-Workout (Body Action/Sport Nutricion® – São Paulo, SP – Brasil), C4 Beta Pump (New Millen® – Cajamar, SP – Brasil)...31
Figura 8. Procedimento de gavagem...33
Figura 9. Cânula metálica curva, calibre 14 (Kent Scientific® – Torrington, CT – .EUA)...33
Figura 10. Pesagem do termogênico...33
Figura 11. Diluição do termogênico...33
Figura 12. Caixa de monitoramento (Insight/SP/Brasil) ...35
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Comparação intergrupos para a quantidade de movimentação ortodôntica (ANOVA one-way)...39 Tabela 2. Comparação dos grupos para a quantidade de movimentos ambulatorios nos quatro tempos (ANOVA one-way)...40 Tabela 3. Comparação dos grupos para a quantidade de movimentos em pé nos quatro tempos (ANOVA one-way)...40 Tabela 4. Comparação dos grupos para a quantidade de pulos nos quatro tempos (ANOVA one-way)...41 Tabela 5. Comparação dos grupos para a quantidade de descansos nos quatro tempos (ANOVA one-way)...41 Tabela 6. Comparação dos grupos para a quantidade de distância percorrida em cm nos quatro tempos (ANOVA one-way)...42 Tabela 7. Comparação dos grupos para a velocidade em cm/s nos quatro tempos (ANOVA one-way)...42 Tabela 8. Comparação dos grupos para o tempo em pé nos quatro tempos (ANOVA one- way)...43 Tabela 9. Comparação dos grupos para os movimentos nas bordas nos quatro tempos
(ANOVA
one-way)...43 Tabela 10. Comparação dos grupos para os movimentos no centro nos quatro tempos
(ANOVA
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 13 2 REVISÃO DA LITERATURA...15 3 OBJETIVOS ... 27 3.1OBJETIVOGERAL ... 27 3.2OBJETIVOSESPECÍFICOS ... 27 4 METODOLOGIA ... 28 4.1DESENHODOESTUDO ... 28 4.2CONSIDERAÇÕESÉTICAS... 28
4.3LOCALDOSEXPERIMENTOS ... 28
4.4AMOSTRAECARACTERIZAÇÃODOSGRUPOS ... 28
4.4.1 Tamano da amostra ... 29
4.4.2 Randomização ... 29
4.5DESENVOLVIMENTODOEXPERIMENTOECOLETAEANÁLISEDE DADOS ... 29
4.5.1 Pesagem do animal, anestesia e montagem do aparelho ortodôntico ... 29
4.5.2 Preparo e administração das soluções ... 33
4.5.3Avaliação comportamental dos animais através do teste de campo aberto (Open Field)... 35
4.5.4 Coleta de sangue ... 37
4.5.5 Análise do efeito sistêmico dos termogênicos...37
4.5.6 Eutanásia ... 38
4.5.7 Descarte da Carcaça...38
4.5.8 Avaliação da quantidade de movimento dentário...38
4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA...39
5.RESULTADOS...40
6. DISCUSSÃO ... 47
7. CONCLUSÃO ... 55
1. INTRODUÇÃO
A busca incessante por saúde, boa forma e melhora do desempenho durante o exercício físico tem atingido diversos segmentos da sociedade, abrangendo diversos gêneros, faixas etárias e classes sociais (COTA et al., 2008). Muitas pessoas têm sido, então, estimuladas a utilizar recursos para alcançar os seus objetivos no menor tempo possível (OLIVEIRA et al., 2017).
Dentre esses recursos, destacam-se o uso de termogênicos, que são suplementos que alegam promover a perda de peso pelo aumento do gasto energético, aumento da oxidação de gordura e diminuição do apetite, aumentando também a performance durante a realização do exercício físico (OTLAW et al., 2013).
Diversas substâncias são utilizadas na composição dos termogênicos, tais como a efedrina, a cafeína, a salicina, a taurina, os inibidores enzimáticos, o capscium, a DMAA (dimetilamilamina), a ioimbina, o citrus aurantium, o ginseng e o guaraná (OLIVEIRA et al., 2017). Dentre essas substâncias utilizadas como termogênicas, a cafeína tem recebido destaque por sua eficácia em aumentar o metabolismo, promover a lipólise e a oxidação de gordura e aumentar a força muscular (KALMAN et al., 2002; OTLAW et al., 2013).
Considerando que a cafeína promove um aumento do metabolismo, é possível que os termogênicos à base dessa substância apresentem também alguma influência sobre a taxa de movimentação ortodôntica, haja vista que o processo de movimentação dentária está relacionado ao turnover ósseo, com aposição de osso na região alveolar, onde há tensão do ligamento periodontal, e reabsorção óssea no lado oposto, onde há pressão (MEIKLE, 2006). Buscando elucidar melhor essa relação, Mediero e Crostein (2013) desenvolveram um estudo e concluíram que a cafeína age como antagonista do receptor da adenosina, que parece influenciar o metabolismo ósseo e a diferenciação dos osteoclastos através de diferentes processos. Como antagonista do receptor de adenosina, a cafeína pode inibir a formação e a função dos osteoclastos, reduzindo, com isso, a reabsorção óssea e a movimentação dentária (MEDIERO & CRONSTEIN, 2013).
Sob o ponto de vista clínico, os resultados encontrados com relação ao efeito da cafeína sobre a movimentação ortodôntica mostraram-se controversos. Enquanto que Shirazi et al. (2017) concluíram que a cafeína diminui a reabsorção radicular e a movimentação ortodôntica em ratos, o estudo de Yi et al. (2016) verificou que a cafeína exerce o seu efeito aumentando a reabsorção radicular e a movimentação ortodôntica.
Além disso, pesquisas têm demonstrado que a ingestão diária de café pode contribuir para acelerar a movimentação dentária. (SHEN e LIU 1994; LIU et al., 2006).
Considerando que a cafeína bloqueia os receptores de adenosina e que a mesma é um importante modulador da transmissão sináptica e com envolvimento na facilitação da liberação de neurotransmissores no sistema nervoso central, vários trabalhos na literatura pontuaram as propriedades estimulantes da cafeína nas alterações comportamentais e cognitivas, no entanto, nenhum estudo até então, investigou o papel do uso de termogênicos no comportamento de roedores. (ARAB et al., 2013; MEDIERO & CRONSTEIN, 2013; PALMER e STILES.,1995).
Diante disso, o presente estudo objetivou investigar o efeito do uso de duas marcas comerciais de termogênicos sobre a quantidade de movimentação dentária e o comportamento de ratos. Ademais, também constituiu proposição deste experimento investigar o efeito sistêmico dessas susbtâncias.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 MOVIMENTAÇÃO ORTODÔNTICA
O movimento dentário (MD) é obtido através de um processo em que há a presença de reabsorção óssea alveolar no lado da pressão e aposição óssea no lado da tensão. As cargas mecânicas afetam o movimento dentário (MD) por meio de respostas celulares biológicas no ligamento periodontal, osso alveolar e estruturas de suporte dentário, ou seja, a remodelação óssea do osso alveolar influencia a eficiência da movimentação dentária. ( STOREY et al., 1973; NOXON et al., 2001; Al-GHURABI et al., 2014; KITADURA et al., 2014; JIANG et al., 2015).
O movimento dentário sofre influência da magnitude da força aplicada. Esta está associada a respostas celulares variadas no lado da compressão. A força pesada corta o fluxo sanguíneo, resultando em morte celular sob compressão (hialinização). Como resultado, nenhuma diferenciação de osteoclastos ocorre dentro do espaço do ligamento periodontal comprimido. Em vez disso, um recrutamento / diferenciação tardia de osteoclastos do espaço da medula óssea adjacente é responsável pela “reabsorção prejudicial” que remove a lâmina dura ao lado do ligamento periodonttal comprimido. O movimento dentário segue a conclusão desses processos no lado da compressão. Portanto, geralmente leva-se de 7 a 14 dias para que ocorra movimento dentário quando uma força pesada é aplicada. Por outro lado, a força leve apenas reduz o fluxo sanguíneo, permitindo o rápido recrutamento de osteoclastos localmente dentro do ligamento periodontal ou via fluxo sanguíneo. Esses osteoclastos removem a lâmina dura no processo de “reabsorção frontal”. O movimento dentário começa logo depois, geralmente dentro de 2 dias após a aplicação da força leve. (PROFFITI et al., 2013)
Durante o movimento ortodôntico, as reações teciduais ocorrem nos tecidos paradescendentes, resultando em um turnover ósseo diferenciado. A extensão e a qualidade do movimento dentário dependem da natureza da força aplicada, do status biológico dos tecidos envolvidos e do estado geral de saúde do paciente. O controle mecânico e metabólico da homeostase do osso alveolar pode influenciar a extensão, a taxa e a qualidade do tratamento ortodôntico. (KING et al., 1991; MEIKLE et al., 2006). A força ideal deve promover a movimentação dentária com o mínimo de injúria para os tecidos periodontais. Ren, Maltha e Kujipers-Jagtman (2003) descreveram a força ideal como um estímulo mecânico extrínseco, que evoca uma resposta celular que objetiva restaurar o equilíbrio da área por meio da remodelação periodontal. Segundo esse
conceito, há uma força de certa magnitude e características temporais, capaz de produzir o máximo de movimento dentário, sem prejuízo aos tecidos e conforto para o paciente. De acordo com esse conceito, a força ideal pode ser diferente para cada dente e para cada paciente, devendo ser avaliada de maneira individual.
A remodelação óssea que ocorre durante o tratamento ortodôntico é um processo que permite o movimento dos dentes . Fatores que afetam o processo celular de reabsorção e remodelação óssea podem aumentar ou diminuir o movimento dentário. Hoje, um dos maiores desafios da ortodontia é reduzir a duração dos tratamentos ortodônticos. O tratamento ortodôntico prolongado causa irritação entre os adultos, além de aumentar os riscos de cárie, recessão gengival e reabsorção radicular. (DAVIDOVICH et al., 1975; NIMERI et al., 2013).
Métodos de aceleração do movimento dentário podem ocorrer em uma das três fases do movimento dentário: a fase inicial, caracterizada por movimentos rápidos após a aplicação da força; a segunda fase é período de latência, onde pouco ou nenhum movimento ocorre , e a última fase, onde ocorre um aumento gradual ou repentino do movimento (BURSTONE et al., 1986). A fase inicial do movimento dentário envolve respostas inflamatórias agudas caracterizadas por leucócitos que migram dos capilares sanguíneos e produzem citocinas, que estimulam a produção de prostaglandinas e fatores de crescimento A fase aguda é seguida pela fase crônica que envolve a proliferação de fibroblastos, células endoteliais, osteoblastos e e processo de remodelação das células da medula óssea alveolar (GARLET et al., 2007).
Durante a movimentação ortodôntica, os osteoclastos são ativados para absorver o osso velho e os osteoblastos são recrutados para a área de reabsorção. O aparecimento de osteoclastos foi o primeiro passo necessário para o movimento dentário. Portanto, quaisquer medidas que possam influenciar as funções dos osteoclastos possivelmente afetam a MD (NOXON et AL., 2001; RODY et al., 2001).
O movimento ortodôntico pode ser influenciado pelo uso de diversas substâncias ou suplementos da dieta. Alguns medicamentos podem acelerar a taxa de movimentação ortodôntica, enquanto outras podem exercer efeito contrário. A vitamina C e os corticosteróides, por exemplo, têm a estimulado. Enquanto o uso de bifosfonato tem diminuído a taxa de movimentação ortodôntica de maneira dose-dependente. (MIRESMAELI et al., 2015; MENDONÇA et al., 2010; SEIFI et al., 2017). Outras susbtâncias, como a nicotina e o etanol não demonstraram ter efeito sobre a taxa de movimentação ortôntica. (ARAÚJO et al., 2018)
Apesar de inúmeras substâncias terem sido testadas na literatura para avaliar seu efeito na aceleração do movimento ortodôntico, nem todas mostraram resultados promissores. A aplicação externa de compostos, como por exemplo as prostaglandinas, que afetam a remodelação óssea foram testados para acelerar o movimento dentário, no entanto, os resultados não foram favoráveis, pois a administração local desses agentes estava ligada ao aumento do risco de reabsorção radicular e dor (ARIAS et al., 2006; BRUDVIK et al., 1991). Novos agentes, como o fator de crescimento epidérmico (EGF) , o hormônio da paratireóide (PTH) e a osteocalcina, foram testado em estudos com animais e alguns mostraram efeitos aceleradores promissores; entretanto, sua segurança e eficácia em humanos ainda precisam ser investigadas. (LI et al., 2013; SOMA et al., 2000; HASHIMOTO et al., 2001; KOBAYACHE et al., 1998)
Os mecanismos moleculares exatos do processo da movimentação dentária induzida ainda não estão totalmente elucidados, uma maior compreensão dos elementos que afetam o movimento dentário (MD) pode permitir um melhor planejamento do tratamento e gerenciamento do paciente.(MEIKLE et al., 2006; OLTEANU et al., 2015; YI et al., 2016; MOLINA SILVA et al., 2016; MIRHASHEMI et al., 2013
2.2 TERMOGÊNICOS
O uso de suplementos dietéticos para melhorar o desempenho do exercício e melhorar a composição corporal tem sido uma estratégia popular para indivíduos ativos (BARON et al., 2004). Esses suplementos promovem a termogênese, que é o processo fisiológico de geração de calor. Um importante local desse processo é o tecido adiposo marrom. O mesmo gera calor em resposta a temperaturas frias para proteção contra hipotermia, bem como em resposta à alimentação para dissipação do excesso de energia dos alimentos (CANNON et al., 2004)
Os termogênicos são tipos de suplementos nutricionais que alegam promover a perda de peso pelo aumento do gasto energético, aumento da oxidação de gordura, convertendo-as em energia disponível, diminuição do apetite, aumentando também a performance durante o exercício físico. Esses suplementos são formados pela combinação de várias ingredientes, as quais em conjunto promovem o efeito termogênico. Os suplementos termogênicos mais comuns são a cafeína, carnitina, chá verde, ácido linoleico conjugado, forscolina, crómio, fucoxantina e sinefrina. No entanto, nos últimos anos alguns dos ingredientes considerados termogênicos foram retirados do mercado por
não serem considerados seguros para o consumo humano, como é o caso da efedrina. (VALGHAN 2015; OUTLAW 2013; JEUKENDRUP 2011; RATAMESS 2015).
Os termogênicos possuem recursos ergogênicos cuja composição pode apresentar variados tipos de substratos, como cafeína, catequinas, efedrina, vitamina C, Vitamina B 12 entre outras, que prometem aumentar o desempenho atlético, elevar a oxidação de gordura e, por conseguinte, melhorar a composição corporal através da redução da quantidade de gordura (SILVA FILHO et al., 2017). Recursos ergogênicos são definidos como substâncias produtoras de trabalho e que, consequentemente, aumentam o desempenho. Supostamente, esse aumento de trabalho induz a termogênese, gerando dessa forma maior dispêndio energético e maior perda de gordura corporal (GOMES et al., 2014; POWERS e HOWLEY, 2014).
A cafeína é um ingrediente comum encontrado na maioria dos suplementos termogênicos, devido aos seus efeitos no gasto de energia (RUMPLER et al., 2001). A mesma possui a capacidade de aumentar a atividade metabólica e as taxas de lipólise resultando potencialmente em reduções no peso corporal ao longo do tempo (Campbell et al., 2016)
Apesar das vantagens do uso de termogênicos, existe alguma preocupação de que os suplementos termogênicos baseados em estimulantes possam afetar adversamente as variáveis hemodinâmicas, como a frequência cardíaca (FC) e a pressão arterial (PA). Alguns estudos mostraram aumento agudo da FC e da PA após a ingestão de suplementos termogênicos contendo cafeína e efedrina (HALLER et al., 2005; VUKOVISH et al., 2005). Outros relataram elevações similares na FC e PA após a ingestão de um produto termogênico, mesmo quando a efedrina não está presente (HOFFMAN et al., 2009). Dos ingredientes encontrados nos produtos termogênicos atualmente sendo investigado, há algum suporte sugerindo que a cafeína e o GTE podem aumentar significativamente o gasto de energia sem afetar adversamente as variáveis hemodinâmicas.
2.3 CAFEÍNA
Dentre as substâncias utilizadas como termogênicas, a cafeína tem sido considerada como uma das mais eficientes no processo, sendo essa destinada predominantemente para atletas (KALMAN et al., 2002; ALVES, LIMA, 2009). Esse fato é decorrente a sua promessa de melhora do desempenho físico, produção de energia, prevenção de fadiga e auxílio na perda de massa corporal, através da mobilização dos ácidos graxos livres do tecido adiposo (ALTIMARI et al., 2006; Mello et al, 2007). A
cafeína pertence ao grupo das drogas metilxantinas (1, 3, 7 trimetilxantina), do qual também fazem parte a teofilina, a teína, a guaraína e a teobromina. As metilxantinas são alcalóides estreitamente relacionados que se diferenciam pela potência de suas ações farmacológicas sobre o sistema nervoso central (SNC). (RANG & DALE, 1993).
A cafeína apresenta potencial sob a performance das atividades esportivas, dando maior ênfase àquelas de características aeróbias. Quando administrada numa quantidade de 6 mg/kg, traz benefícios tanto no desempenho esportivo quanto nos sintomas da fadiga neuromuscular (ALTIMARI et al, 2008).
Recentes estudos têm mostrado que a cafeína pode atuar em alguma porção do sistema nervoso central (SNC) afetando a percepção subjetiva de esforço (DOHERTY, SMITH, 2005), bem como a propagação dos sinais neurais entre o cérebro e a junção neuromuscular (DAVIS et al., 2003), e sobre o músculo esquelético, facilitando o processo de estimulação-contração do músculo esquelético (LOPES et al., 1983).
A cafeína tem vários efeitos e mecanismos de ação. Nas células musculares lisas vasculares, a cafeína age predominantemente como um inibidor competitivo da enzima fosfodiesterase, responsável pela quebra de 3ʹ, 5ʹ-cAMP. O cAMP é um dos segundos mensageiros mais importantes em células de mamíferos e é responsável por diversas respostas de sinalização, incluindo as responsáveis pelo estado energético (relação AMP / ATP) e os efeitos da cafeína e do café (MONTOUA et al., 2014; NUNES et al.,2014). Um segundo mecanismo de ação da cafeína baseia-se na sua ligação e inibição dos receptores de adenosina A1 e A2a (BENOWITS, 1990; DONOVAN e DEVANE, 2001; NAWROT et al., 2003). A inibição do receptor A1 pela cafeína resulta na ativação da adenilato ciclase com um subseqüente aumento no AMPc e na atividade da proteína quinase A, esta última associada à estimulação do SNC. Os efeitos farmacológicos resultantes incluem um aumento no metabolismo energético, diminuição da contração da musculatura lisa, vasodilatação e liberação de neurotransmissores, resultando em estimulação do SNC, efeitos inotrópicos positivos (e possivelmente fracos cronotrópicos) no coração, vasoconstrição e aumento da pressão arterial. Algumas pessoas experimentam insônia em resposta à cafeína. Além disso, no rim, a cafeína induz diurese, vasodilatação e reabsorção de sódio em resposta a um aumento da taxa de filtração glomerular devido ao aumento da pressão arterial.
A cafeína é a droga mais consumida por adultos mundialmente, podendo ser encontrada em inúmeras comidas e bebidas, além de suplementos e produtos destinados à perda de peso (SMITH, 2002; VAN DE NEYNDE et al., 2008). A cafeína é bem
absorvida por via oral, sua concentração máxima é atingida em 30 a 45 minutos após a ingestão. A sua vida média é de aproximadamente três horas e é metabolizada em 90%. (TARNOPOLSKY et al., 1994)
A cafeína pode exercer efeitos no humor, no desempenho cognitivo e na atividade motora, além de promover efeitos antidepressivo, ansiolítico e neuroprotetor. De fato, muitos pesquisadores demonstraram que a cafeína, tem uma variedade de respostas farmacológicas e celulares em um amplo espectro de sistemas biológicos, como estimulação do sistema nervoso central e músculo cardíaco, aumento do débito urinário e relaxamento do músculo liso. Além da cafeína, o café também contém uma quantidade relativamente grande de tanino, um análogo da catequina do chá, produzindo efeitos biológicos como antioxidação, antimutação, angiogênese, ação antibiótica, anti-hipercolesterolemia, anti-hipertensiva e ações anti-inflamatórias (JOHNELL et al., 1995; FREDHOLM et al., 1995).
Os alvos moleculares responsáveis pelos efeitos comportamentais da cafeína foram extensivamente investigados, primariamente nos roedores. Isso se deve principalmente ao bloqueio dos receptores de adenosina, mas o papel relativo de cada subtipo ainda está em investigação. Os efeitos ansiolíticos de uma xantina com anel estendido e que contém um componente arilpiperazina parece ser devido à atividade agonista em receptores serotoninérgicos (SAWYNOK., 2011)
Como mencionado anteriormente a cafeína é um antagonista competitivo dos receptores de adenosina e atua diretamente ao nível desses receptores, para potenciar a liberação do cálcio do retículo sarcoplasmático, pelo desacoplamento da atividade da ATPase no músculo esquelético. Em consequência desses dois mecanismos celulares, a cafeína causa um aumento da lipólise, a facilitação da transmissão no sistema nervoso central, uma redução da concentração plasmática de potássio durante o exercício, um aumento da força de cwontração muscular em baixas frequências de estimulação e uma economia do glicogênio muscular (FAVERO et al.,1997; TARNOPOLSKY et al., 1994). Muitos pesquisadores têm avaliado o efeito da cafeína no metabolismo ósseo. Os estudos de Bezerra et al., (2008); Lacerda et al., (2010); Olchowik et al., (2011); Bezerra et al., (2013); Shin et al., (2015); Yi et al., (2016) encontraram relação entre a cafeína e o metabolismo ósseo, sugerindo que a mesma está associada a um risco significativamente aumentado de doença periodontal, perda de tecido ósseo , redução da neoformação óssea em dentes extraídos, diminuição no ganho de massa corporal e ativação da movimentação ortodôntica, sendo o impacto potencial dessa substância sobre
o tecido ósseo usualmente atribuído à sua capacidade de aumentar a excreção de cálcio (MASSEI et al., 1993). Em adição, Yi et al. (2016), Shin et al. (2015) e Lacerda et al. (2010) são unânimes em afirmar que a cafeína atua aumentando os níveis de cálcio no plasma e na urina, o que diminui a densidade mineral óssea, levando assim a retardo no processo de reparo ósseo.
Sakamoto et al., (2011) avaliou o efeito da cafeína no metabolismo ósseo, através de marcadores que tem sido implicados na perda óssea : Fator de necrose tumoral α e interleucina 6. O estudo concluiu que as dietas de café não foram associadas a diferenças no fator de necrose tumoral α e na interleucina-6, indicando fortemente que o café não estimula a perda óssea em ratos.
2.4 A INFLUENCIA DAS SUBSTÂNCIAS PRESENTES NOS TERMOGÊNICOS SOBRE A MOVIMENTAÇÃO ORTODÔNTICA
2.4.1 CAFEÍNA NA MOVIMENTAÇÃO ORTODÔNTICA
A hipótese de que a cafeína pode ter uma influência sobre o metabolismo ósseo foi testada em uma série de estudos laboratoriais, animais e clínicos. Em geral, esses estudos demonstraram um efeito moderado da cafeína no metabolismo ósseo em avaliações como viabilidade de células ósseas, histomorfometria e índice mineral (COOPER, et al.1992; RAPURI et al., 1992).
A cafeína interrompe o balanço de cálcio no tecido ósseo, levando a uma baixa densidade óssea, e isso pode ser compensado pelo aumento da absorção intestinal de cálcio através da regulação neuro-humoral. Quando exposto a uma dose apropriada de cafeína o desenvolvimento de células osteoblásticas pode ser retardado, induzindo baixa densidade mineral óssea e retornando ao normal, apesar da exposição contínua. A baixa densidade mineral óssea acelera a remodelação óssea e, assim pode encurtar a duração do tratamento ortodôntico. (HILL et al., 1998; TYROVOLA et al., 2001; YEH et al., 1986; TASSINARI et al., 1991).
Em nível celular e molecular, a cafeína tem múltiplas ações envolvendo fosfodiesterases, receptores de adenosina, prostaglandinas e mediadores inflamatórios (BRUTON et al., 2011; MEDIERO; CRONSTEIN, 2013; BARCELO et al., 2014). As funções bioquímicas dessa substância influenciam inúmeros eventos específicos de órgãos, incluindo a formação e reabsorção óssea, que são a base da movimentação ortodôntica (BARTZELA et al., 2009).
Estudos anteriores mostraram resultados controversos sobre os efeitos da cafeína no metabolismo ósseo. Alguns sugeriram que a ingestão de cafeína afeta o metabolismo ósseo em algum aspecto (BEZERRA et al., 2008; LACERDA et al., 2010; OLCHOWIK et al., 2011; BEZERRA et al., 2013; SHIN et al., 2015), enquanto outros relataram nenhum efeito detectável (N GLAJCHEN et al., 1988; SAKAMOTO et al., 2001; CHOI, 2011).
É pertinente mencionar que o objetivo da terapia ortodôntica é induzir a movimentação dentária sem comprometer o estado periodontal (DANNAN, 2010; SANDERS, 1999). O estudo de Yi et al. (2016) demonstrou que a administração da cafeína pode estimular a osteoclastogênese e assim, aumentar a movimentação ortodôntica em ratos ao induzir um estado de inflamação em nível periodontal. Por exemplo, a administração de cafeína aumentou a expressão de citocinas pró-inflamatórias como PGE2 e RANKL em fibroblastos e tecidos periodontais. É bem conhecido que estas citocinas podem induzir um estado de estresse oxidativo nos tecidos (incluindo os do periodonto), aumentando assim a perda óssea (BALTACIOGLU et al., 2014; BECERIK et al., 2017; WANG; ANDRUKHOV; RAUSCH-FAN, 2017).
Em contrapartida, o estudo de Shirazi et al. (2017) avaliou o impacto da cafeína na movimentação ortodôntica e foi verificado através de resultados histológicos um efeito decrescente na movimentação dentária em ratos pela diminuição do número de osteoclastos e reabsorção radicular. Dessa forma, tais resultados podem ser justificados através de mecanismos bioquímicos: sugere-se que a cafeína pode inibir receptores de adenosina (MEDIERO; CRONSTEIN, 2013), fosfodiesterases (KINOSHITA et al., 2000) e neutralizar os efeitos de prostaglandinas (BRUTON et al., 2011), além de demonstrar características antiinflamatórias (BARCELOS et al., 2014).
A adenosina, uma purina extracelular, exerce seus efeitos através dos receptores da superfície celular, é amplamente distribuída em vários tecidos, incluindo o osso. A função exata da adenosina em tecidos ósseos ainda não está elucidada, mas tem sido sugerido que pode influenciar no metabolismo ósseo e o desempenho/diferenciação de osteoclastos através de diferentes processos. Como antagonista do receptor de adenosina, a cafeína pode inibir a formação e a função dos osteoclastos e, consequentemente, levar à diminuição da reabsorção óssea (FOLWARCZNA et al., 2013; MEDIERO; CRONSTEIN 2013
2.4.2 VITAMINA C NA MOVIMENTAÇÃO ORTODÔNTICA
A vitamina C é um micronutriente essencial com várias funções biológicas importantes, sendo cofator para a biossíntese do colágeno, cartinina, neurotransmissores e também de hormônios peptídicos (CARR et al., 2013). Participa dos processos celulares de oxirredução, como também é importante na biossíntese das catecolaminas. Previne o escorbuto, é importante na defesa do organismo contra infecções e fundamental na integridade das paredes dos vasos sanguíneos (WELCH et al., 1995).
Forças ortodônticas podem aumentar os mensageiros secundários ao lado das células, que são críticos para a diferenciação osteoblástica e o movimento dentário (KING et al., 1991; YAMASAKI et al., 1983). O papel crítico do ácido ascórbico (vitamina C) na estimulação de osteoclastos no meio de cultura de células foi confirmado em algumas investigações (OTSUKA et al., 2000; TSUNETO et al., 2005). A falta de vitamina C interrompe a osteogênese e a organização do ligamento periodontal (LITON et al., 1974) Tem sido demonstrado que a deficiência de vitamina C durante o tratamento ortodôntico reduz o movimento dentário devido ao seu efeito na cicatrização tecidual. Seu principal efeito está no ligamento periodontal. A deficiência de ácido ascórbico inibe a degradação e a regeneração das fibras de colágeno, que são importantes no movimento ortodôntico. O ácido ascórbico aumenta a longevidade e a proliferação de osteoclastos e suas células progenitoras (RAGAB et al., 1998).
O estudo de Miresmaeli et al., 2015, que avaliou a influência da vitamina C na movimentação ortodôntica, encontrou em seus achados que a mesma aumentou significativamente a quantidade de movimentação ortodôntica em relação ao grupo controle. O estudo concluiu que a eficácia a longo prazo da suplementação de vitamina C para melhorar o movimento dentário ortodôntico e também a estabilidade do movimento dentário deve ser investigada.
2.4.3 TAURINA NA MOVIMENTAÇÃO ORTODÔNTICA
A taurina é outra substância que está presente na maior parte dos termogênicos nutricionais. A mesma, é um β-aminoácido que contém enxofre e que existe na forma livre em mamíferos. Vários papéis fisiológicos têm sido relatados para taurina, incluindo modulação de cálcio, estabilização de membrana, osmorregulação, neuromodulação, antioxidação e regulação da fosforilação de proteínas (BOUCKENOOGHE, REMACLE, REUSENS, 2006; OJA, SARANSAARI et al., 2007).
A taurina, como metabólito da metionina e da cisteína, é o aminoácido mais abundante nos tecidos animais (HUXTABE et al., 1992). A taurina é necessária para certos aspectos do desenvolvimento dos mamíferos, e sua deficiência leva a defeitos no crescimento, diferenciação tecidual e desenvolvimento imunológico (BOUCKENOOGHE, REMACLE, REUSENS, 2006; OJA, SARANSAARI et al., 2007). O estudo de PARK et al., 2001 apresentou evidências de que a taurina estimula a atividade da fosfatase alcalina e da síntese de colágeno, e que essas ações são mediadas pelo ERK2.
Estudos indicaram que o tecido ósseo contém altas concentrações de taurina, que surge como um elemento na regulação do metabolismo ósseo. A suplementação de taurina preveniu a perda óssea em ratas ovariectomizadas (TEURACHI et al., 1998; PAR, KIM H, KIM S., 2001). Koide et al.1999, relataram que a taurina reduziu a reabsorção óssea alveolar, a formação e a sobrevivência dos osteoclastos em modelos animais. Estudos in vitro demonstraram que o transportador de taurina (TAUT), um sistema específico de transporte de taurina, era expresso em osteoblastos e precursores de osteoclastos. A taurina promoveu proliferação e diferenciação de osteoblastos e estimulou a expressão do fator de crescimento do tecido conjuntivo em osteoblastos através da via extracelular regulada por sinalização quinase (ERK), enquanto inibiu a osteoclastogênese via TAUT (YUAN et al., 2006; YUAN et al., 2010). Esses resultados sugerem que a taurina pode interferir na movimentação ortodôntica através da inibição desse processo.
2.5 AVALIAÇÃO COPORTAMENTAL DE ANIMAIS ATRAVÉS DO TESTE DE CAMPO ABERTO (OPEN FIELD)
O teste de campo aberto (TCA) foi inicialmente desenvolvido em 1934 como um teste para medir a emotividade em roedores. Alcançou o status de ser uma das medidas de comportamento mais utilizadas na psicologia animal (WALSH, CUMMINS, 1976). O mesmo também é comumente utilizado para avaliar os efeitos sedativos, tóxicos ou estimulantes dos compostos. Como tal, o teste tem vários usos e está incluído em quase todas as análises completas de comportamento de roedores (MACHADO, KAPCZINSKI, SOARES, 2004).
Os estudos sobre o comportamento exploratório realizados em roedores, permitem analisar, entre outro fatores, as respostas a novidade, os mecanismos neurais subjacentes a determinados comportamentos, as vias envolvidas, bem como o efeito comportamental de diferentes tratamentos. (GUILHERMITTI, 2011). No teste de campo aberto, segundo alguns autores, o comportamento do animal é determinado pelo conflito entre a motivação
a explorar e a aversão a lugares abertos, desprotegidos e iluminados. Drogas de perfil ansiolítico ou ansiogênico tendem, respectivamente, a aumentar ou diminuir a ambulação no campo aberto (TREIT, 1985)
O TCA fornece uma avaliação fácil e razoavelmente rápida de comportamentos bem definidos, que não requerem treinamento para o sujeito do teste e pouco ou nenhum treinamento especializado para o pesquisador que administra o teste. Parte de sua popularidade surge do fato de que os conceitos psicológicos e fisiológicos subjacentes aos testes são geralmente diretos e bem compreendidos. Roedores, por exemplo, mostram aversões distintas a ambientes grandes, iluminados, abertos e desconhecidos(CHOLERIS et al., 2001). Esses animais foram filogeneticamente condicionados para ver esses tipos de ambientes como perigosos. Todos esses recursos são incorporados no labirinto de campo aberto e formam a base de seu uso no teste de paradigma comportamental. Esse labirinto consiste em uma área de parede fechada que é de altura suficiente para evitar que o sujeito escape. Formas típicas de labirinto são circulares ou quadradas com uma área grande o suficiente, com base no tamanho do objeto testado, para provocar uma sensação de abertura no centro do labirinto. Diversas variáveis podem ser pontuadas no labirinto de campo aberto com a maioria dos parâmetros envolvendo diferentes tipos de atividade motora (WALSH, CUMMINS, 1976).
Embora existam algumas exceções, em quase todos os projetos experimentais, os ratos são colocados no labirinto pelo investigador e, portanto, forçados a interagir com um ambiente novo. Essa entrada forçada deve ser considerada ao interpretar os resultados, já que os animais não são ativamente observados na arena. O teste de campo aberto tradicional tem duração entre dois e dez minutos. O animal é colocado no centro ou próximo as paredes do aparelho e vários itens comportamentais são registrados durante esse período. (PRUT, BELZUNG, 2003)
Muitos testes comportamentais de ansiedade baseiam-se na atividade corporal e locomoção do animal em questão (RAMOS, 2008). Como o teste de campo aberto foi originalmente descrito, duas medidas de comportamento podem ser deduzidas: atividade locomotora e depósitos de boleto fecal ou defecação. (WALSH, CUMMINS, 1976). No entanto, em alguns estudos, essas duas medidas mostraram-se não relacionadas, confirmando a conclusão de que a avaliação comportamental em roedores é multidimensional. Independentemente disso, discrepâncias na literatura sobre essas medidas e comportamento ou ansiedade em modelos de ratos podem ser atribuídas a diferenças nos critérios de análise ou diferenças nos procedimentos de teste. Os estudos
associaram conclusivamente os resultados da análise do teste de campo aberto com outras medidas de ansiedade ao comparar modelos de ratos. (CAROLA et al. 2008)
Um dos parâmetros que pode ser utilizado para avaliar a ansiedade em roedores é chamado de tigmotaxia, ou seja, é a tendência de permanecer perto da parede. Como os animais são colocados em um novo ambiente, o tempo gasto no centro do dispositivo nos primeiros minutos do teste pode ser indicativo de ansiedade (TREIT, FUNDYTUS et al., 1988; CHOLERIS; THOMAS et al., 2001). Além disso, a distância percorrida em diferentes períodos de tempo e a qualidade do movimento também podem ser analisadas. (GOULD et al., 2009)
Existem muitas outras medidas menos comumente relatadas, incluindo o tempo gasto sem movimentação, farejamento, vocalização e batidas de dentes (WALSH e CUMMINS, 1976). Mais recentemente, particularmente com o advento da metodologia de alto rendimento e um foco em resultados únicos em estudos comportamentais, houve geralmente uma diminuição no número de variáveis que são relatadas. Entretanto, tem havido esforços para incluir muitas das variáveis que podem ser avaliadas por sistemas de computador, incluindo textura do caminho percorrido, densidade de atividade e análise de componentes principais, incluindo medidas etológicas e variáveis convencionais (TAKASASHI et al., 2006; LIPIKIND et al., 2004)
Tem havido discussões sobre até que ponto o teste de campo aberto é uma medida confiável de emocionalidade (RODGERS et al., 2007; ARCHER et al., 1973). Alguns resultados, particularmente a defecação, o tempo no centro e a atividade nos primeiros 5 minutos, provavelmente medem algum aspecto da emotividade. A atividade precoce no campo aberto pode medir a ansiedade, pois pode induzir o estresse de separação (já que o animal é separado de seus companheiros de gaiola) e agorafobia (a exposição a uma grande arena é bem diferente das gaiolas comuns conhecidas) (PRUT, BELZUNG., 2003). O arranjo de um campo aberto típico também contrasta com o modo como os roedores costumam viver na natureza: nas redes sociais, nas tocas subterrâneas ou nas áreas protegidas.
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar os efeitos macroscópico, bioquímico e comportamental de termogênicos em ratos submetidos à movimentação ortodôntica.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Avaliar o efeito de duas marcas comercias de termogênicos sobre a quantidade de movimentação dentária em ratos.
b) Avaliar o efeito de duas marcas comerciais de termogênios sobre o comportamento de ratos.
4. METODOLOGIA
4.1 DESENHO DO ESTUDO
Foi realizado um estudo experimental, in vivo, randomizado, com base descritiva e inferencial, utilizando como modelo animal ratos Wistar (Ratus norvegicus albinus)
4.2 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
A presente pesquisa foi aprovada pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) sob o número de protocolo 028/2018, CERTIFICADO nº 107.028/2018.
4.3 LOCAL DO EXPERIMENTO
Os procedimentos experimentais e laboratoriais, incluindo o preparo e a manipulação dos animais, a coleta de materiais orgânicos e os diferentes tipos de análises foram realizados nos Laboratórios de Farmacologia e Anatomia Patológica localizados, respectivamente, no Centro de Biociências e no Departamento de Odontologia da UFRN. A manipulação dos animais foi feita pela pesquisadora responsável que possui curso de capacitação no uso e manejo de animais.
4.4 AMOSTRA E CARACTERIZAÇÃO DOS GRUPOS
A amostra foi constituída de 19 ratos machos da linhagem Wistar (Ratus norvegicus albinus) saudáveis, entre 7 e 12 semanas de idade, pesando entre 150-350g, com dentição permanente, oriundos do biotério do Centro de Ciências da saúde da UFRN. A dentição do rato adulto, no arco superior, caracteriza-se pela presença de dois incisivos na região anterior e seis molares (três em cada lado) na região posterior. Nesta pesquisa, foi realizada a movimentação dentária ortodôntica contínua dos primeiros molares superiores, do lado esquerdo, durante o período de 21 dias.
Os ratos foram mantidos no biotério experimental do Departamento de Biofísica e Farmacologia da UFRN, em caixas de propileno, com dimensões de 41x34x16 cm, na proporção de três a quatro animais por caixa. Os animais ficaram em regime de claro-escuro, 12/12h, em ciclo invertido em relação ao ambiente natural e com intensidade luminosa no interior da caixa de 60 lux, conforme recomendado pelos Princípios Éticos da Experimentação Animal, artigo 10˚ e 11˚ (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal – COBEA, 1991). Eles foram alimentados com ração padrão apropriada (Nuvilab
CR-1 autoclvável®), a qual foi umedecida com água para minimizar o possível
desconforto provocado pelo dispositivo ortodôntico assim como para evitar danos ao aparelho (MIRHASHEMI et al., 2015). Adicionalmente, os animais tiveram acesso a um bebedouro acoplado na caixa (ad libitum), segundo a resolução RDC n˚ 274, de 22 de setembro de 2005 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária.
4.4.1 Tamanho da amostra
Como até o momento inicial do experimento ainda não tinham sido realizados estudos que avaliassem o efeito do uso de termogênicos na movimentação ortodôntica, o cálculo do tamanho da amostra foi dimensionado com base nos estudos anteriores de Shirazi et al. (2017) e Yi et al. (2016), que avaliaram o efeito da cafeína na movimentação ortodôntica, utilizando 10 e 15 ratos, por grupo experimental, respectivamente. Além disso, foi considerado o princípio dos 3 R’s preconizado por Russell-Burch (1959) de “redução, substituição e refinamento” no uso de animais.
.
4.4.2 Randomização
Antes do início do experimento, os animais foram aclimatados no ambiente laboratorial por uma semana. Passado esse período, foram aleatoriamente divididos em 3 grupos, sendo eles:
Grupo controle (GC): grupo de ratos submetidos somente à movimentação ortodôntica e à ingestão diária de água;
Grupo experimental termogênico C4 Beta Pump (GT1): grupo de ratos submetidos à movimentação ortodôntica e à ingestão diária do termogênico C4 Beta Pump; e
Grupo experimental termogênico PRE-HD/Pre Workout (GT2): grupo de ratos submetidos à movimentação ortodôntica e à ingestão diária do termogênico PRE-HD/Pre Workout.
4.5 DESENVOLVIMENTO DO EXPERIMENTO E COLETA E ANÁLISE DE DADOS
4.5.1 Pesagem do animal, anestesia e montagem do aparelho ortodôntico
Os animais foram pesados, com uma balança digital (Gehaka - BG 4001, São Paulo, Brasil) no início dos experimentos e uma vez por semana até a eutanásia, com o objetivo de observar quaisquer alterações de peso relacionadas à alimentação e/ou às
condições experimentais. Em seguida, cada animal foi anestesiado com solução anestésica de ketamina a 10% (80mg/Kg) e xilazina a 2% (10mg/kg). Para a realização da movimentação dentária, foi utilizado um modelo de aparelho proposto por King et al. (1991), modificado quanto à inserção nos incisivos superiores do animal.
Enquanto anestesiados, cada animal foi posicionado em uma mesa de intervenção cirúrgica (Plataforma cirúrgica multifuncional SurgiSuite – Kent Scientific® – Torrington, CT – EUA) em decúbito dorsal. A montagem do aparelho foi realizada por um ortodontista, devidamanete calibrado. Obtendo-se um coeficiente de correlação intra-classe de 0.96. Inicialmente, foi realizada a abertura da cavidade oral através de dois elásticos (Elástico super amarelo, n.18 – Mercur® – São Paulo, SP – Brasil) estendidos na região de incisivos superiores e inferiores. Ademais, foram utizaladas duas pontas retratoras (Kent Scientific® – Torrington, CT – EUA) de 7,5mm localizadas nas mucosas jugais direita e esquerda, com a finalidade de facilitar o acesso à cavidade oral do animal durante os procedimentos experimentais.
Em seguida, a cavidade oral foi desinfetada com hastes flexíveis com pontas de algodão (Cotonetes – Johnson & Johnson® Ltda. São Paulo, SP – Brasil) embebidas em
clorexidina a 0,12% (Clinexidin – Dental Clean® Londrina, PR – Brasil). Medidas
preliminares da posição dentária foram obtidas naquela ocasião, através de um compasso de ponta seca (Dentaurum® 030-395-03/Alemanha), adaptado com a utilização de duas agulhas nas pontas para medir a distância (em mm) da distal do 1˚ molar superior esquerdo à mesial do 2˚ molar superior do mesmo lado pela região cervical.
Posteriormente, foi preparado um conjunto composto de duas secções de fio de amarrilho 0,08” (Morelli® - Sorocaba, SP – Brasil), os quais foram fixados em ambas as
extremidades de uma mola helicoidal fechada de níquel-titânio de 7 mm (Morelli® –
Sorocaba, SP – Brasil). Com o auxílio de um porta agulha Mathieu (Quinelato® – São
Paulo, SP – Brasil), um dos lados do conjunto (mola e fios de amarrilho) foi adaptado na região cervical do primeiro molar superior esquerdo, passando abaixo da ameia distal, trançando o fio ao redor do dente (Figura 1). O conjunto amarrilho-dente recebeu uma pequena quantidade de resina composta (resina Transbond XT 3M®- São Paulo, SP – Brasil), após condicionamento ácido com ácido fosfórico a 37% durante 12s (Condac® – São Paulo, SP – Brasil) e aplicação do adesivo (primer Transbond XT 3M®- São Paulo,
SP – Brasil), para reforço da retenção e estabilidade do aparelho (Figuras 2 e 3). Logo após, a secção do fio de amarrilho 0,08” restante foi trançada com o auxílio do porta
O fio de amarrilho na região anterior foi transpassado através da criação de um orifício entre os incisivos superiores, no terço médio (Figura 4). O orifício foi confeccionado com uma ponta diamantada esférica número ¼ (FG-KG. Sorensen® – São Paulo, SP – Brasil) adapatada em um motor elétrico de baixa rotação (Motor elétrico cirúrgico Smart – Driller® – São Paulo, SP – Brasil).
Para ativação do dispositivo ortodôntico, com o animal posicionado sobre a mesa cirúrgica, horizontalmente, de forma que a linha de força mantivesse-se paralela ao solo, a extremidade mesial do fio de amarrilho foi fixada a um dinamômetro calibrado (Federwaage 25-250 gf – Dentaurum® – São Paulo, SP – Brasil) a fim de padronizar um força de 50gf. Após a aferição, para garantir a continuação da fidelidade da medida, essa extremidade da mola foi amarrada ao incisivo superior com fio de amarrilho 0,08” no orifício criado (Figura 5).
Após essa etapa, foi realizado o condicionamento ácido do esmalte dos incisivos superiores com ácido fosfórico a 37% (Condac® – São Paulo, SP – Brasil), por 12
segundos, posteriormente removido com hastes flexíveis com pontas de algodão (Cotonetes – Johnson & Johnson® Ltda. São Paulo, SP – Brasil) embebidas em água
destilada e secado com o auxílio de uma pera de látex sem válvula (Mikatos® – Santo
Amaro, SP – Brasil). Em seguida, após a fixação do amarrilho e o condicionamento ácido, foi reforçada a retenção na região anterior, através da utilização de resina composta fotopolimerizável (Transbond XT 3M® – São Paulo, SP – Brasil) no conjunto amarrilho-dente (Figura 6). A extensão em excesso do fio de amarrilho 0,08” foi removida com alicate de corte de amarrilho (Quinelato® – São Paulo, SP – Brasil).
Logo após a instalação dos aparelhos, os incisivos inferiores de cada animal, foram desgastados em aproximadamente 1,5 mm, no terço médio, com ponta esférica diamantada ¼ (FG-KG. Sorensen® – São Paulo, SP – Brasil) adaptada em motor elétrico de baixa rotação (Motor elétrico cirúrgico Smart – Driller® – São Paulo, SP – Brasil) para evitar danos ao aparelho ortodôntico durante o experimento. Naquele momento, a cavidade oral foi novamente desinfectada com hastes flexíveis com pontas de algodão (Cotonetes – Johnson & Johnson® Ltda. São Paulo, SP – Brasil) embebidas em clorexidina a 0,12% (Clinexidin – Dental Clean® – Londrina, PR – Brasil). As molas após ativadas não foram reativadas durante o período experimental. No entanto, sua posição foi verificada diariamente e os animais que por ventura tiveram seu aparelho danificado foram excluídos da amostra.
Após a montagem do aparelho, foi realizada a lavagem dos olhos dos animais com soro fisiológico. Tal procedimento foi recomendado para evitar o ressecamento da região ocular pós-cirurgia.
Os animais foram então, mantidos por 21 dias, tempo mínimo necessário para que ocorresse a movimentação dentária, com acesso à água e à ração, conforme mencionado anteriormente. No 22˚ dia, todos os ratos foram pesados imediatamente antes da eutanásia.
Figura 1. Inserção do amarrilho na região posterior Figura 2. Adaptação do conjunto amarrilho-mola (Imagem autoral) (Imagem autoral
Figura 3. Fotopolimerização da resina composta adaptada na região Figura 4. Orifício criado na região anterior
posterior (Imagem autoral) (Imagem autoral)
Figura 5. Amarrilho adaptado na região anterior Figura 6. Resina composta adaptada na região anterior
4.5.2 Preparo e administração das soluções
Os termogênicos C4 Beta Pump (New Millen® - Cajamar, SP - Brasil), PRE HD/Pre-Workout (Body Action/Sport Nutricion® - São Paulo, SP - Brasil) (Figura 7 e Quadros 1 e 2) e a água foram administradas por gavagem (Figura 8). Para tanto, foi utilizada uma seringa descartával de 3ml, contendo 1 ml de cada substância por animal, a qual foi administrada com auxílio de uma cânula metálica curva, calibre 14 (Kent Scientific® – Torrington, CT – EUA) (Figura 9).
O cálculo das dosagens dos termogênicos C4 Beta Pump (New Millen® – Cajamar, SP – Brasil) e PRE HD/Pre-Workout (Body Action/Sport Nutricion® – São Paulo, SP – Brasil) foi baseado no consumo médio de cafeína em humanos – de 450mg de cafeína/60kg/de peso corporal/dia. De forma que os termogênicos foram preparados diariamente para o GET1 e GET2, na concentração de 3 g/L, conforme estudo de Shirazi et al. (2017), com auxílio de uma balança analítica (FA2204B-BI - 220G X 0,0001G BioScale® - Campinas, SP - Brasil) (Figura 10). Após pesagem, acrescentou-se água
destilada, formando uma solução de 5ml (Figura 11), que foi agitada por 30 segundos em um vibrador de alta itensidade (Loccus biotecnologia/Flex Vortex®-São Paulo,SP-Brasil).
Após o preparo das substâncias, os termogênicos e a água foram administrados aos grupos experimentais (GET1 e GET2) e ao grupo controle (GC), respectivamente. As gavagens foram iniciadas um dia após a instalação do aparelho e continuaram por 20 dias, totalizando 21 dias de administração e experimentação. A gavagem foi realizada por dois manipuladores devidamente treinados. Um manipulador realizou a contenção do animal e outro a administração das substâncias, com cegamento quanto ao composto administrado em cada animal.
Figura 7. PRE HD/Pre-Workout (Body Action/Sport Nutricion® – São Paulo, SP – Brasil), C4 Beta Pump (New Millen® – Cajamar, SP – Brasil)
Quadro 1. Descrição do Termogênico C4 Beta Pump - New Millen®. Termogênico C4 Beta Pump Ingredientes
Taurina 1.600mg / 400ml
Glucoronolactona 1.000 mg / 400 ml
Cafeína 140 mg / 400 ml
Inositol 80 mg / 400 ml
Semente de uva em pó (Vitis Vinífera) Bisglicinato de zinco
Bisglicinato de cálcio Bisglicinato de magnésio
Polpa de melancia desidratada (Citrullus Vulgaris Extract)
Mix de vitaminas [B9 (ácido fólico), C (ácido ascórbico), B3 (nicotinamida), B5 (pantotenato de cálcio), B12 (cianocobalamina), B6(piridoxina), B1 (tiamina), B2 (riboflavina)]
Aromas Artificiais
Goma Xantana (espessante) Ácido Cítrico (acidulante) Sucralose (edulcorante)
Fórmula Beta Pump
http://www.newmillen.com.br/
Quadro 2. Descrição do termogênico PRE-HD/ Pre Workout (Body Action/Sport Nutricion® – São Paulo,
SP – Brasil) Termogênico PRE-HD/Pre-Workout Ingredientes Taurina 800 mg/250 ml Glucoronolactona 600 mg/20 ml Cafeína 88 mg/250 ml Inositol 50 mg/250 ml
Beta-5 {Beta Vulgaris L. Beterraba em Pó, Vitamina B5 Ácido Pantotênico 3-[(2r,4-Dihidroxi-3,3-Dimetilbutanoil)Amino] Propanoico}, NO2Drive {Melancia Citrullus Vulgaris Polpa, Vitamina B3 Nicotinamida Pyridine-3-Carboxamide 3-Pyridinecarboxamide, Vitamina B2 Riboflavina 7,8-Dimetil-10- ((2r,3r,4s)- 2,3,4,5-Tetra-Hidroxipentilo)Benzo[g]Pteridina-2,4 (3h,10h)-Diona e L-Ascorbato de Cálcio}, Vitamina PP Niacina Pyridine-3-Carboxylic Acid, Vitamina B6 Piridoxina 4,5-bis(Hydroxymethyl)- 2-Methylpyridin-3-ol, Vitamina B12 Cianocobalamina (5,6-Dimethylbenzimidazolyl) Cobaidcyanide, Glucoronolactona (60mg/250ml), Inositol (50mg/250ml), Aroma Idêntico ao Natural de Limão, Acidulante Ácido Cítrico, Antiumectante Dióxido de Silício, Edulcorantes Sucralose e Acessulfame-K.
https://bodyaction.com.br/produto/pre-hd/
Figura 8. Procedimento de gavagem Figura 9. Cânula metálica curva, calibre 14
(Kent Scientific® – Torrington, CT – EUA)
(Imagem autoral) (Imagem autoral
Figura 10. Pesagem do termogênico Figura 11. Diluição do termogênico (Imagem autoral) (Imagem autoral)
4.5.3 Avaliação comportamental dos animais através do teste de campo aberto (Open Field)
O teste de campo aberto visou a observação do comportamento dos animais do teste durante 4 (quatro) tempos: T0 (antes da movimentação ortodôntica e gavagens), T1 (um dia pós a instalação do dispositivo ortodôntico), T2 (um dia após a realização da primeira gavagem) e T3 (Após 21 dias de movimentação ortodôntica). Para realização do teste, utilizou-se uma caixa de monitoramento em acrílico Cristal (Insight/SP/Brasil) (Figura 12), com as seguintes características: dimensões em mm (C x A x P): 500 x 480 x 500; peso: 17 kg; tensão de alimentação 127 / 220 AC, 1A; barra com 16 sensores de infra-vermelho; ajuste de posicionamento da barra de sensores; e conexão ao computador via USB. As variáveis que fizeram parte da análise dos testes de comportamento foram as seguintes: quantidade de movimentos ambulatórios, quantidade de movimentos em pé, quantidade de pulos, quantidade de descanso, distância percorrida em cm, velocidade dos movimentos em cm/s, movimentos nas bordas e movimentos no centro. Para realização do teste, seguiu-se as seguintes etapas:
1. Os animais foram levados para o local de experimentação em um período de 3h prévios ao tempo do experimento para ambientação;
2. Antes de iniciar o experimento, os animais foram pesados com uma balança digital (Gehaka - BG 4001, São Paulo, Brasil) e identificados em algarismos romanos com uma caneta permanente não tóxica para serem diferenciados em cada caixa;
3. A Higienização da caixa de monitoramento (Insight/SP/Brasil) foi realizada com álcool a 70% e foi aguardado 5 minutos para o início do experimento.
4. Foi realizada a Pré determinação de algumas configurações desejadas no programa “Monitor de Atividades” de fácil manuseio em computador. Definição da duração do bloco em 6 min (00:06:00), sendo 1 min (00:01:00) o tempo de habituação do animal e 5 min (00:05:00) o tempo de duração do experimento. Foram definidos o n˚ de 5 sensores e a unidade desejada em cm;
5. Foram apagadas as luzes da sala e apenas uma fonte de luz vermelha (15 W; 110 mA) continuou ligada em um ambiente silencioso (Figura 13).
6. Os animais foram inseridos um de cada vez no centro da arena e a caixa foi fechada para ser iniciado o estudo. Foi aguardado o tempo pré-determinado; 7. Em seguida, foi verificado e registrado um relatório com planilha de dados dos
movimentos realizados por cada animal;
8. Após o término do tempo pré-determinado, o animal foi retirado da arena para uma caixa diferente daquela que ele foi alojado para não influenciar no comportamento do animal seguinte;
9. O relatório com planilha de dados foi salvo após cada experimento;
10. A arena quadrada foi devidamente higienizada após cada experimento, utilizando um papel toalha para remover maiores resíduos – fezes e urina – em seguida, foi aplicado um pouco de água destilada para limpar bem a base do equipamento e todas as suas paredes. Posteriormente, foi aplicado álcool a 70% com auxílio de papel toalha em todas as paredes. Por fim, foi removido o excesso com gaze. 11. Foram aguardados 5 minutos após a higienização/desinfecção da arena para
iniciar um novo experimento. Esse procedimento foi repetido após cada novo experimento a fim de eliminar possíveis viéses devido a odores deixados por animais anteriores (PELOW, 1985)
12. Por fim, os animais foram levados para o biotério de manutenção e experimentação dos animais do Centro de Biociências/UFRN.
Figura 12. Caixa de monitoramento Figura 13. (Fonte de luz vermelha) (Insight/SP/Brasil) (Imagem autoral) (Imagem autoral)
4.5.4 Coleta de sangue
No 22° dia de experimento, no momento que antecede a eutanásia, os ratos dos grupos experimentais e controle tiveram amostras sanguíneas coletadas, baseado no estudo realizado por Amorim et al. (2002). A coleta de sangue visou elucidar a toxicidade, a ação metabólica e o efeito dessas susbtâncias nos sistemas renal e hepático.
Para coleta de sangue, os animais foram submetidos a um jejum de 8 (oito) horas. Os animais foram anestesiados através da administração intraperitoneal de Ketamina a 10% (80mg/Kg) [Agener – União Química Farmacêutica Nacional, São Paulo, SP, Brasil] e Xilazina a 2% (10mg/kg) [Syntec do Brasil Ltda, Cotia, SP, Brasil]. A coleta de sangue ocorreu por punção intracardíaca e com o auxílio de uma seringa descartável de 3 ml foram coletados a maior quantidade de sangue de cada animal.
4.5.5 Análise do efeito sistêmico dos termogênicos
Para análise do efeito sistêmico dos termogênicos 1 mL do sangue foi armazenado em tubos que continham EDTA jateado em suas paredes para realização de leucograma (contagem de leucócitos, bastonetes, neutrófilos, linfócitos, basófilos e eosinófilos). O remanescente de sangue coletado foi centrifugado, através de uma centrífuga sorológica de bancada (SPLabor-32 T – Presidente Prudente, SP – Brasil), para obtenção do soro, no qual foram realizados diversos exames bioquímicos através do Analisador bioquímico semiautomático (BIO 2000 IL – Barueri, SP – Brasil), na intenção de verificar a ação metabólica (através dos níveis de glicose, colesterol HDL, colesterol LDL, triglicerídeos); e os efeitos nos sistemas hepático (através da verificação dos níveis da aspartato amino
