Triagem fitoquímica e ação antibacteriana de Spondias mombin L. sobre bactérias bucais planctônicas

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE COLETIVA MESTRADO EM SAÚDE COLETIVA. EMANUELLE LOUYDE FERREIRA DE LIMA. TRIAGEM FITOQUÍMICA E AÇÃO ANTIBACTERIANA DE Spondias mombin L. SOBRE BACTÉRIAS BUCAIS PLANCTÔNICAS.. NATAL 2016.

(2) EMANUELLE LOUYDE FERREIRA DE LIMA. TRIAGEM FITOQUÍMICA E AÇÃO ANTIBACTERIANA DE Spondias mombin L. SOBRE BACTÉRIAS BUCAIS PLANCTÔNICAS. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Saúde Coletiva da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para obtenção do título de Mestra em Saúde Coletiva.. ORIENTADORA: Profa. Dra. Ruthinéia Diógenes Alves Uchôa Lins COORIENTADORA: Profa. Msc. Maria Regina Macêdo Costa. NATAL 2016.

(3) EMANUELLE LOUYDE FERREIRA DE LIMA. TRIAGEM FITOQUÍMICA E AÇÃO ANTIBACTERIANA DE Spondias mombin L. SOBRE BACTÉRIAS BUCAIS PLANCTÔNICAS. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Saúde Coletiva da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para obtenção do título de Mestre em Saúde Coletiva. Aprovada em: ____/____/____. _______________________________________________________________ Profª. Dra. Ruthinéia Diógenes Alves Uchoa Lins UFRN Orientadora. ________________________________________________________________ Profª. Dra. Isauremi Vieira de Assunção UFRN Membro. _________________________________________________________________ Prof. Dr. Cícero Romão Gadê Neto UnP Membro. NATAL 2016.

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(5) DEDICATÓRIA. A Deus, por ter me protegido todos os dias de minha vida e me guiado pelo melhor caminho abrindo portas para que eu chegasse até aqui. Dedico não só o mestrado como todas as conquistas da minha vida até aqui aos meus pais Ewerson Leandro e Ana Clara e as minhas irmãs Ewelanny Louyde e Ewellyn Louyde, pois por muitas vezes pensei em desistir devido tamanhas dificuldades que enfrentei, mas, por eles, continuei. Com certeza, não teria chegado ao fim sem o apoio e as orações de vocês. Ao meu amor, Gabriel Queiroz, pelo apoio em todos os momentos dessa caminhada. Te amo!.

(6) AGRADECIMENTOS. Desde que iniciei minha vida acadêmica tenho enfrentado grandes obstáculos e escrever os agradecimentos da minha dissertação de mestrado é, de certa forma, contar essa história. Não os enfrentei só, DEUS têm estado a frente a todo momento, por isso meu maior agradecimento a ele. As pessoas que estiveram nesse caminho só estiveram por sua permissão. Minha família sempre foi minha fortaleza, em tudo que me colocava para baixo eles, mesmo sem querer, me mostravam o quanto eu tinha que ser forte para vencer. Afinal, como sempre disse meu pai: “Se eu tivesse desistido a cada dificuldade que encontrei, não teria criado vocês”. Então... uma palavra resume tudo o que tenho pra dizer: Obrigada! Obrigada pelas vezes em que não desistiram de mim. A fé de Ana Clara, a garra de Ewerson, a doçura de Ewelanny e a inocência de Ewellyn me permitiram dar mais esse grande passo. Essa vitória, sem sombra de dúvidas, é nossa! Meus agradecimentos ao meu amor Gabriel que tem sido um ombro amigo, antes de qualquer coisa, há quase cinco anos. Pelas vezes em que me ouviu sem ter muito a dizer e mesmo assim esteve me apoiando e me dando força, mesmo à distância. Obrigada! Você é parte significativa dessa conquista. Agradeço aos meus avós, tios e tias, primos, parentes mais próximos e até os mais distantes, por acreditarem em mim e me ajudarem a construir cada novo começo desde que saí de casa. Agradeço a minha segunda família, D. Judite, Sr. Geraldo, Patrícia, Cacá e a princesa Isabella que por muitas vezes me acolheram e acolheram os meus como se fosse parte deles e torceram por mim em cada degrau que pretendi alcançar. À Profª Dra. Ruthinéia Diógenes Alves Uchôa Lins pelo acolhimento e orientação durante esses 24 meses de mestrado e por todas as palavras de conforto nos meus momentos de angustia. Sou muito grata! À Profª. Msc. Maria Regina Macedo Costa, coorientadora deste trabalho, por todo apoio e ensinamentos no decorrer de toda essa pesquisa fazendo com que tudo saísse nos conformes e sem a qual a realização desse estudo não teria sido possível. Obrigada!.

(7) Aos alunos de graduação Ana Palhares, Juliana Lima, Lucas Melo, Neto e em especial a Isabelle Helena pela ajuda e apoio na execução de todas as etapas dessa pesquisa. A mestranda Angélica Kercya sempre disposta a ajudar, principalmente durante a fase final dos experimentos. A irmã que a Odontologia me presenteou Dayanne Monielle por me ouvir, ajudar de todas as formas e estar sempre disposta a me estender a mão nos momentos em que precisei não só durante o mestrado. Sua amizade é um presente pra mim! Ao meu irmão Israel Alexandre o qual tive o prazer de dividir muitos momentos durante a vida e guardo no meu coração todas as nossas conversas. Como já disse... Você é do tipo de amigo pra vida toda! Obrigada! As minhas companheiras de mestrado Laura e Rayanne, amigas de almoços e desabafos que com certeza carregarei comigo para o resto da vida e desejo todo sucesso por serem pessoas do coração cheio de bondade. Aos meus colegas residentes em atenção básica, especialmente Caroline Nóbrega, Fernanda Greicy, Jonas Rayfe, Natja Alves e Patrícia Morais por ouvirem meus desabafos e me ajudarem a vencer essa etapa. Apesar de recente, a amizade de vocês é um presente pra mim! A Universidade Federal do Rio Grande do Norte, ao Programa de Pós-Graduação em Saúde Coletiva e aos professores do programa por terem me acolhido e me proporcionado tantas boas oportunidades enquanto aluna. Ao Departamento de Farmácia da UFRN pela parceria, em especial a Profª. Silvana Maria e as doutorandas Bárbara e Samara que sempre se mostraram prestativas em todas as fases da pesquisa. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de mestrado. A todos aqueles que se fizeram presentes, mesmo longe, e contribuíram para minha formação como pessoa e como profissional, muito obrigada!.

(8) “A HUMILDADE NÃO ESTÁ NA POBREZA, NÃO ESTÁ NA INDIGÊNCIA, NA PENÚRIA, NA NECESSIDADE, NA NUDEZ E NEM NA FOME. A HUMILDADE ESTÁ NA PESSOA QUE TENDO O DIREITO DE RECLAMAR, JULGAR, REPROVAR E TOMAR QUALQUER ATITUDE COMPREENSÍVEL NO BRIO PESSOAL, APENAS ABENÇOA.” Emmanuel.

(9) RESUMO Devido à alta prevalência de doenças bucais, como a cárie dentária, e ao elevado potencial terapêutico de matérias-primas vegetais, reconhecendo o Brasil como um país de grande variedade etnobotânica, a presente pesquisa buscou analisar fitoquimicamente o material vegetal e determinar a ação antibacteriana do extrato de Spondias mombin L. (cajá) sobre bactérias bucais planctônicas. Para isso foram realizadas a prospecção fitoquímica do material vegetal, a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e da Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA) do extrato de Spondias mombin L. (cajá) e do digluconato de clorexidina a 0,12% (controle) frente às bactérias S. mutans e S. oralis bem como a cinética bactericida das referidas substâncias (teste e controle) sobre o S. mutans. Os resultados revelaram que tal extrato inibiu o crescimento bacteriano em todas as concentrações testadas na CIM, além de ter impedido a aderência dos microrganismos à parede do tudo de vidro também até a concentração de 1:512 do extrato, mostrando-se superior, nessas duas análises, ao digluconato de clorexidina a 0,12%. Observou-se também que o extrato bruto de Spondias mombin L. já demosntrou ação bactericida após duas horas de contato com o S. mutans, enquanto o mesmo extrato, em sua concentração inibitória mínima, exibiu efeito bactericida somente após quatro horas de contato com tal microrganismo. Dessa forma, conclui-se que: o extrato de Spondias monbim L. se mostra bastante promissor como agente bactericida frente ao S. mutans e S. oralis quando comparado ao digluconato de clorexidina..

(10) ABSTRACT Due to the high prevalence of oral diseases and the considerable therapeutic potential of vegetable raw materials, and based on the fact that Brazil is a country of great ethnobotanic variety, the present study sought to phytochemically analyze plant material, as well as determine the antibacterial action of the extract of Spondias mombin L. (caja) on oral planktonic bacteria. To achieve this, phytochemical screening of the plant material was performed, along with the determination of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and the Minimum Inhibitory Concentration of Adherence (MICA) of Spondias mombin L. extract (caja) against S. mutans and S. oralis, and the bactericidal kinetic extract on S. mutans. It was found that the extract inhibited bacterial growth at all the MICs tested, and prevented the adhesion of the microorganisms to the glass wall at a concentration of 1:512 of the extract. As such it was more effective in these two tests than 0.12% chlorhexidine gluconate. It was also found that crude extract of Spondias mombin L. exhibited antibacterial action after two hours of contact with S. mutans, while the extract in its minimum inhibitory concentration displayed a bactericidal effect after four hours of contact time with S. mutans. Thus, it is concluded that: the Spondias mombin L. extract is shown quite promising as a bactericide against Streptococcus mutans and S. oralis compared to chlorhexidine digluconate..

(11) LISTA DE FIGURAS. Figura 1.. Representação esquemática da técnica utilizada na determinação da concentração inibitória mínima do extrato sobre cada amostra ensaiada ............................................................................................... Figura 2.. 27. Representação esquemática da técnica utilizada na determinação da concentração inibitória mínima de aderência dos extratos sobre cada amostra ensaiada ................................................................................. Figura 3.. 28. Representação esquemática da técnica utilizada na determinação da Cinética Bacteriana frente ao extrato testado para cada amostra ensaiada ................................................................................................. Figura 4.. 29. Cromatografia de camada delgada do extrato aquoso (Revelador: Reagente Natural A / UV 365 nm). Fase móvel: Tolueno: Acetato de etila: ácido fórmico 5:5:0,5) ................................................................... Figura 5.. Concentração inibitória mínima do Extrato de S. mombin L. e do Digluconato de Clorexidina. ........................................................................................ Figura 6.. 34. Halos de inibição do S. mutans e S. oralis frente a ação do extrato bruto de Spondias mombin L. até a diluição de 1:512 ........................... Figura 7.. 32. 34. Ausência de células aderidas ao tubo de vidro demonstrando a atividade antiaderente do extrato de Spondias mombin L.na diluição de 1:512 para S. mutans e S. oralis ......................................................... 35.

(12) LISTA DE QUADROS. Quadro 1.. Prospecção fitoquímica do extrato da folha de Spondias mombin L.. Quadro 2.. Concentração Inibitória Mínima (medida dos halos de inibição em. 32. mm) em meio sólido do extrato aquoso de Spondias mombin L. e do digluconato de clorexidina sobre Streptococcus mutans e Streptococcus oralis ............................................................................ 33.

(13) LISTA DE TABELA. Tabela 1. Aderência dos microrganismos ao tudo de vidro frente ao extrato de Spondias mombin L. .................................................................................................... 36 Tabela 2. Cinética bactericida do extrato de Spondias mombin L. sobre S. mutans ... 36.

(14) SUMÁRIO. 1.. INTRODUÇÃO ........................................................................................ 15. 2.. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................... 17. 2.1. A CÁRIE DENTÁRIA E SEUS ASPECTOS MICROBIOLÓGICOS .... 17. 2.2. CONTROLES MECÂNICO E QUÍMICO DO BIOFILME DENTÁRIO. 18. 2.3. FITOTERAPIA .......................................................................................... 19. 2.4. FITOTERAPIA E ODONTOLOGIA ........................................................ 20. 2.5. A ESPÉCIE Spondias mombin L. .............................................................. 21. 2.5.2. Uso popular ............................................................................................... 22. 3.. OBJETIVOS ............................................................................................. 23. 3.1. OBJETIVO GERAL .................................................................................. 23. 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................... 23. 4.. METODOLOGIA .................................................................................... 24. 4.1. COLETA DO MATERIAL VEGETAL .................................................... 24. 4.2. PREPARAÇÃO DO EXTRATO DE Spondias Mombin L. ...................... 24. 4.3. PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA .............................................................. 24. 4.4. MICRORGANISMOS UTILIZADOS ...................................................... 25. 4.5. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) DO EXTRATO DE Spondias mombin L. ......................................... 4.6. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA DE ADERÊNCIA DO EXTRATO DE Spondias mombin L. .................... 4.7. 25. 26. DETERMINAÇÃO DA CINÉTICA BACTERIANA DO EXTRATO DE Spondias mombin L. ............................................................................. 27. 4.8. ANÁLISE ESTATÍSTICA ......................................................................... 28. 5.. RESULTADOS ......................................................................................... 29. 5.1. REAÇÕES DE IDENTIFICAÇÃO ........................................................... 29.

(15) 5.1.1. Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) ................... 30. 5.2. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA DO EXTRATO DE Spondias mombin L. .................................................. 31. 5.3. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA DE ADERÊNCIA DO EXTRATO DE Spondias mombin L. .................... 33. 5.4. DETERMINAÇÃO DA CINÉTICA BACTERICIDA DO EXTRATO DE Spondias mombin L. ............................................................................. 34. 6.. DISCUSSÃO ............................................................................................. 35. 7.. CONCLUSÕES ........................................................................................ 38. 8.. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................... 39.

(16) 16 1. INTRODUÇÃO A cárie dentária é uma doença de etiologia multifatorial, biofilme dependente e acontece devido à perda mineral localizada. É considerada uma das doenças crônicas mais prevalentes, se distribui de maneira universal e, em muitos países, é vista como um problema de saúde pública (TORRES, 2000; FEJERSKOV; KIDD, 2011). Apesar de ter muitos fatores associados, o aparecimento das lesões de cárie dentária se deve basicamente à deficiência na higiene bucal e ao consumo frequente de açúcar (TORRES, 2000; FEJERSKOV; KIDD, 2011). Para o controle da quantidade de açúcar na dieta, a Organização Mundial de Saúde (OMS) publicou um novo guia, em 2015, recomendando para adultos e crianças, que o consumo de açúcar não ultrapasse 10% das calorias consumidas durante o dia. E quanto à característica de biofilmedependência da cárie dentária, recomenda-se que a desorganização do biofilme mecanicamente faça parte da rotina de higiene bucal para evitar o surgimento dessa doença (SCHEIE; PETERSEN, 2004). Frente às limitações dos métodos mecânicos de higiene bucal, agentes antimicrobianos têm sido propostos, principalmente nos casos em que há dificuldade de controle do biofilme e naqueles onde se necessita da diminuição da quantidade de microrganismos bucais (MOREIRA et al., 2008; MARSH, 2010). Dentre os agentes antimicrobianos bucais mais utilizados, o digluconato de clorexidina merece destaque devido ao seu potencial antimicrobiano e à sua característica de forte adsorção às superfícies bucais (MARSH, 2010; SCHEIE, PETERSEN, 2011). Por mais que promovam alguns efeitos colaterais como pigmentação dos dentes, alteração do paladar e descamação da mucosa, os antissépticos que têm como princípio ativo o digluconato de clorexidina a 0,12% ou 0,2% apresentam média elevada para o potencial de redução da microbiota bucal quando comparados a outros antissépticos (MATOS et al., 2015). Porém, deve-se reconhecer que o uso indiscriminado de antimicrobianos bucais, dentre eles o digluconato de clorexidina, causa resistência bacteriana. Diante dos efeitos colaterais do digluconato de clorexidina e da sua possibilidade de causar resistência bacteriana, torna-se necessário investigar as propriedades antimicrobianas de novas substâncias e, com a rica diversidade da flora do Brasil, parece salutar o estudo de produtos derivados de plantas como princípio ativo de possíveis agentes antimicrobianos (MOTA; TURRINI; POVEDA, 2015)..

(17) 17 No Brasil, o uso de fitoterápicos tem sido bastante abordado no âmbito da saúde coletiva e bastante estudado no ambiente acadêmico, seguindo as recomendações da Organização Mundial da Saúde (OMS) para o uso da Medicina Tradicional e Complementar/Alternativa nos sistemas de saúde, de maneira integrada às técnicas da medicina ocidental moderna. A Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares (PNPIC), do Ministério da Saúde, insere o uso da Fitoterapia no Sistema Único de Saúde (SUS) (BRASIL, 2006a; BRASIL, 2006b). Frente ao exposto, têm sido realizado ao longo dos anos estudos in vitro acerca da ação antimicrobiana de alguns extratos de plantas (COSTA, 2011; GEBARA; ZARDETTO; MAYER, 1996; MATSUMOTO-NAKAMO, 2011). Dentre as inúmeras espécies de plantas com propriedades medicinais (AGRA; FREITAS; BARBOSAFILHO, 2007; SANTOS et al., 2009), especialmente atividade antimicrobiana, a literatura cita a Spondias mombin L., popularmente conhecida como cajá (ABO; OGUNLEYE; ASHIDI, 1999; SILVA, 2011), existente em todo território brasileiro com maior concentração nas regiões norte e nordeste (JARDIM, 2016). O cajá pertence à família Anacardiaceae e possui outros nomes comuns como: taperebá, pequena cajá e cajámirim (BOSCO et al., 2000). Sabendo disto, o presente estudo objetivou a triagem fitoquímica do extrato de Spondias mombin L. e a determinação de sua ação antibacteriana frente a bactérias Streptococcus mutans e Streptococcus oralis, envolvidas no processo cariogênico, na tentativa de incentivar a prática do uso de fitoterápicos e plantas medicinais como recursos preventivo e terapêutico das doenças biofilme dependentes, tendo em vista sua possível efetividade e excelente relação custo-benefício..

(18) 18 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 A CÁRIE DENTÁRIA E SEUS ASPECTOS MICROBIOLÓGICOS A cárie dentária pode ser considerada uma doença típica do homem civilizado e, de maneira genérica, todo indivíduo adulto durante sua vida é acometido por esta doença, que teve aparecimento na pré-história entre os seres humanos. Num exame de 100 crânios do homem de Neanderthal não se constatou a presença de cárie, significando não a sua ausência, mas sim a incidência de cárie apenas ocasionalmente neste período, restrita a uns poucos espécimes. Porém, a partir de um maior consumo de açúcar por volta de 1665, a incidência de cárie aumentou intensamente (PINHEIRO, 1983). Existem várias definições de cárie, dentre elas, a de que se trata de uma destruição progressiva e localizada dos dentes, principalmente das coroas dentárias, embora também possa acometer as superfícies radiculares. Outra denominação seria de uma doença infectocontagiosa que resulta em uma perda localizada de miligramas de minerais dos dentes afetados, causada por ácidos orgânicos provenientes da fermentação microbiana dos carboidratos da dieta. Qualquer que seja a definição de cárie, quando não tratada, poderá haver progressão desta, culminando com a destruição quase total do dente e levando à infecção da polpa e dos tecidos de suporte dentário, com sequelas, por vezes, graves (BURNETT; SCHERP; SCHUSTER, 1978; WEYNE, 1989). Porém, o conceito estabelecido universalmente é de que a cárie dentária é uma doença multifatorial, infecciosa, transmissível (FITZGERALD; KEYES, 1960; KEYES, 1960) e dieta dependente, que produz uma desmineralização das estruturas dentárias. Não somente a superfície dentária, como todas as outras superfícies da cavidade oral estão sempre sendo colonizadas por microrganismos, constituindo os estreptococos parte essencial dessa microbiota. Ao acúmulo de microrganismos, embebidos em uma matriz aglutinante, sobre e toda e qualquer superfície sólida, denomina-se biofilme um conjunto de microrganismos, contidos em matriz orgânica formada por substâncias da saliva e da dieta do hospedeiro e por polímeros bacterianos (GEBARA; ZARDETTO; MAYER, 1996). A patogenicidade do biofilme é resultado de interações entre proteínas e bactérias e de bactérias entre si, produzindo compostos que ajudam na manutenção da própria estrutura do biofilme e na destruição de tecidos que servem de substrato para o estabelecimento da colonização (PEREIRA, et al. 2006)..

(19) 19 As pesquisas realizadas em busca da origem dos microrganismos presentes na saliva concluiram que a maior parte desses microrganismos são advindos da língua e, de maneira geral, influenciam diretamente a microbiota de toda a cavidade oral (TANNER et al., 2002), principalmente Staphylococcus e Streptococcus (UREÑA, 2002). Dentro da família dos Streptococcus é imprescindível ressaltar o grupo dos Streptococcus viridans, que engloba alguns conjuntos filogenéticos, dentre eles que engloba quatro conjuntos filogenéticos: mitis, salivarius e o S. mutans, que é a bactéria mais implicada em doenças orais como a cárie (TELES, 2010). O S. mutans é considerado, em alguns estudos, como sendo um microrganismo específico das cáries dentárias, é ricamente encontrado nas superfícies dentárias, além de constituir uma das bactérias com maior potencial cariogênico, em função de sua grande ação acidogênica (ROETERS et al., 1995; THIBODEAU; O'SULLIVAN; 1996; KLEINBERG, 2002; BEIGHTON et al., 2004; ALMAS; AL-SANAWI; ALSHAHRANI, 2005). Em estudo anterior, após isolamento das bactérias acidúricas predominantes no biofilme coletado das superfícies ainda não cariadas, foi encontrada quantidade considerável também de Streptococcus oralis que são microrganismos em forma de cocos gram positivos que está implicada diretamente na formação da placa dentária (BRAILSFORD et al, 1999). Outro microrganismo muito presente na cavidade oral é o Streptococcus sanguinis (TRUPER; CLARI, 1997). O S. sanguinis é reconhecido pelo seu papel antagonista ilegítimo na cárie dentária (LOESCHE et al., 1975). Acredita-se que o S. sanguinis pode competir com o S. mutans para a colonização da superfície dos dentes, uma vez que ambos os microrganismos requerem a presença de dentes para a colonização (CARLSSON; SODERHOLM; ALMFELDT, 1969; CARLSSON et al.,1970).. 2.2 CONTROLES MECÂNICO E QUÍMICO DO BIOFILME DENTÁRIO A deficiência na higiene oral associada ao consumo de sacarose provoca uma modificação na microbiota do biofilme dentário, podendo resultar na formação de lesões de cárie (TORRES, 2000; FEJERSKOV; KIDD, 2011). A correta limpeza dos dentes é o.

(20) 20 meio mais eficiente disponível até o momento para a prevenção da gengivite, da periodontite e da cárie (NEWBRUN, 1990; DITTERICH et al, 2007). Métodos de controle de biofilme dentário têm sido empregados para prevenir e limitar os efeitos e a progressão da cárie. O controle mecânico do biofilme dentário atua na prevenção e na remoção do mesmo, representando o método mais aceito, conforme estudos epidemiológicos que demonstram associação entre higiene bucal e biofilme dental. O controle mecânico caseiro, também conhecido como higienização bucal, consiste da escovação dos dentes, da limpeza interproximal e da limpeza dos tecidos moles da boca, sendo este reconhecidamente o meio mais simples e com melhor relação custo/benefício para o paciente (GEBRAN, et al. 2002; DITTERICH, et al. 2007). Devido ao fato de que muitos pacientes não conseguem desenvolver a habilidade mecânica operacional adequada e em função do uso restrito do fio dental, Sathler e Fischer (1996), sugerem a utilização de agentes químicos como coadjuvantes dos mecânicos, incorporados em dentifrícios ou soluções para bochechos. As substâncias químicas mais usadas são compostos quaternários de amônia, alcalóides, Bis-biguanidas, compostos fenólicos, enzimas, etc. Porém, dentre os numerosos estudos realizados, a clorexidina foi a substância que apresentou as melhores características enquanto antisséptico bucal, uma vez que possui propriedades como substantividade, eficiência, estabilidade e segurança (VINHOLIS, 1996). Apesar de se apresentar como padrão ouro no controle químico do biofilme dentário, a clorexidina apresenta alguns efeitos colaterais associados (JONES, 1997) incluindo: inativação na presença de sulfatos e cálcio, manchamento extrínsico no esmalte dentário, hiperplasia de papilas linguais e perda do sentido da gustação (VAN GRUNSVEN; CARDOSO, 1995). Esses efeitos junto ao advento de cepas multirresistentes a antibióticos têm incentivado à procura por produtos naturais com atividade antibacteriana no combate a doenças que afetam os tecidos bucais (ROBERTS, 2002) que provavelmente terão menos efeitos colaterais uma vez que os fitoterápicos, em sua grande maioria, agridem menos o organismo devido sua composição. 2.3 FITOTERAPIA De acordo com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA, na RDC nº 26/2014, a fitoterapia consiste na utilização de vegetais em preparações farmacêuticas.

(21) 21 como extratos, pomadas, tinturas e cápsulas, empregados no tratamento de doenças e na manutenção e recuperação da saúde (ANVISA, 2014). Os fitoterápicos são considerados os produtos obtidos de matéria-prima ativa vegetal, exceto substâncias isoladas, com finalidade profilática, curativa ou paliativa, incluindo medicamento fitoterápico e produto tradicional fitoterápico, podendo ser simples, quando o princípio ativo é proveniente de uma única espécie vegetal medicinal, ou composto, quando o princípio ativo é proveniente de mais de uma espécie vegetal (ANVISA, 2014). São considerados produtos tradicionais fitoterápicos aqueles obtidos com emprego exclusivo de matérias-primas ativas vegetais, cujas segurança e efetividade sejam baseadas em dados de uso seguro e efetivo (publicados na literatura técnicocientífica) e que sejam concebidos para serem utilizados sem a vigilância de um médico para fins de diagnóstico, prescrição ou monitorização (ANVISA, 2014). Uma das vantagens da aplicação da fitoterapia deve-se ao fato desta apresentar um baixo custo no processo de promoção de saúde. Dessa forma, o melhor acesso do paciente ao composto fitoterápico é extremamente importante dentro da dinâmica da humanização na relação profissional/paciente, em ações sociais e em políticas públicas, uma vez que a medicação sintética ainda tem um custo muito elevado diante da realidade do Brasil (MONTEIRO; FRAGA, 2015). É importante enfatizar que o uso da fitoterapia não deve se limitar somente ao conhecimento popular, devendo-se considerar também e principalmente o conhecimento científico (ZHENG; HUA; CHEUNG, 2011).. Além disso, é preciso que ocorra. aceitabilidade por parte dos profissionais de saúde, inclusive dos Cirurgiões-Dentistas, contribuindo assim para a inserção apropriada dessa prática nos serviços de assistência à saúde (REIS et al, 2014).. 2.4 FITOTERAPIA E ODONTOLOGIA Os relatos médicos medievais da Inglaterra, mostraram que, nos séculos XII e XIV, os cuidados com os dentes já tinham importância e grande parte dessas medidas de cuidados eram limitadas a tratamentos vistos como não-invasivos, envolvendo, em sua maioria, o uso de ervas medicinais (ANDERSON, 2004)..

(22) 22 O aumento da aplicação da fitoterapia dentro de programas preventivos e curativos tem, com o passar dos anos, estimulado o estudo de múltiplos extratos de plantas para aplicação dentro da Odontologia, principalmente no sentido de controlar o biofilme dentário e tratar as afecções bucais advindas dele. A efetividade dos fitoterápicos e suas vantagens em relação aos medicamentos alopáticos já são comprovadas, inclusive na Odontologia. O baixo custo dos medicamentos fitoterápicos, tornando-os mais acessíveis à população, a possibilidade de possuir menos efeitos colaterais ou tóxicos e a grande aceitação popular motivam a produção de medicamentos fitoterápicos pela indústria farmacêutica (ALELUIA et al, 2015). Em virtude disso, os estudos utilizando produtos naturais dentro da ciência odontológica vêm aumentando nos últimos anos em busca de novos produtos naturais com maior atividade terapêutica, menor toxicidade, maior biocompatibilidade e menor custo à população. A partir do momento em que há aceitação do uso da fitoterapia pela população, as perspectivas no mercado de produtos odontológicos que contém substâncias naturais são melhoradas (AGRA et al, 2007; ALELUIA et al, 2015). 2.5 A ESPÉCIE Spondias mombin L. A família Anacardiaceae compreende 55 espécies, sendo que 9 (nove) delas, apresentam interesse medicinal (MEDEIROS et al, 2013). Essa família é de origem nativa, no entanto, não é endêmica do Brasil. Distribui-se por todas as regiões do país, sendo mais prevalente nas regiões Norte, Nordeste e Centro-oeste (JARDIM, 2016). Do ponto de vista químico, os gêneros mais estudados são Mangifera, Rhus (Toxicodendron), Anacardium, Spondias, Lannea, Semecarpus, Schinus, Pistacia, Lithraea, Tapirira e Melanorrhoea (CORREIA; DAVID; DAVID, 2006). Dentro do gênero Spondias, as espécies que mais se destacam são: Spondias mombin L. (cajazeira), Spondias tuberosa Arruda (umbuzeiro), Spondias duleis Parkinson (cajaraneira), Spondias purpurea L. (serigueleira), Spondias sp. (umbucajazeira) (BRASIL, 2009). Essa família ainda tem como destaque diversas espécies frutíferas de importância econômica, com destaque para o cajueiro (Anacardium occidentale), cujo fruto produz a castanha de caju, e o grupo dos cajás proveniente da cajazeira (Spondias spp.) (LORENZI, 2008)..

(23) 23 A espécie Spondias mombin L. é distribuída em todo o Brasil, sendo o seu fruto conhecido por diversos nomes regionais, incluindo taperebá na Amazônia, pequeno cajá no sudeste, cajámirim no sul, ou simplesmente Cajá no nordeste (BOSCO et al., 2000). O cajá é rico em vitamina A, B1, B2 e C, cálcio, fósforo, potássio, carotenoides e taninos e é utilizado na culinária para produção de polpas, sucos, picolés, sorvetes, néctares e geléias (BRASIL, 2009). A madeira de cajá é empregada na indústria de fabricação de móveis, enquanto a casca e as folhas são usadas na medicina popular (SACRAMENTO; SOUZA, 2000). As frutas são a principal fonte de substâncias biologicamente ativa, contribuindo para o seu potencial quimiopreventivo (MAHATTANATAWEE et al., 2006; DEMBITSKY et al, 2011.; JIMENEZ et al., 2011) além de contribuir com calorias, sais minerais, vitaminas, fibras e água para o organismo humano (BRASIL, 2009). O fruto do cajá é muito aromático e tem quantidade de carotenoides e de compostos fenólicos, ainda maior que o maracujá e o abacaxi (CARVALHO et al, 2013). De acordo com Lorenzi (2009), a árvore da cajazeira (Spondias mombin L.) mede até 25 metros de altura, com folhas compostas de 3 (três) a 8 (oito) pares de folíolos de forma oval, lanceolada, com margens cerradas quando bem jovens. Os frutos são do tipo drupa, de cor amarelo-alaranjada e sabor ácido, com cerca de 1 (uma) polegada de tamanho. 2.5.2 Uso Popular De acordo com a etnofarmacologia, as cascas do caule de S. mombin L. têm efeito abortivo, podendo ser utilizados também como antídoto em picadas de serpentes e como substâncias eméticas (TRÓPICOS, 2013). As folhas são indicadas na forma de gargarejos como adstringentes para inflamações na cavidade oral e na garganta. Existem registros também de uso terapêutico em casos de prostatite, herpes labial, uretrite, cistite e conjuntivite, além de serem usados como antidepressivos, antiborrifaciente, e no tratamento de doenças venéreas e tumores (ALBUQUERQUE, et al. 2007; LORENZI; MATOS, 2008; TROPICOS, 2013). Para o fruto. da S. mombin L. especificamente, o. suco é referido por alguns autores como vermífugo e diurético, sendo porém mais utilizado como alimento (AYOKA, et al. 2008; BRASIL, 2009)..

(24) 24 Em estudo in vitro, os extratos aquoso e etanólico de folhas de cajazeira (S. mombin) inibiram o crescimento bacteriano. Este é o primeiro relato da validação do uso popular desta espécie como antibacteriano (AJAO; SHONUKAN; FEMI-ONADEKO, 1995). Os frutos do cajá são muito ricos em carotenoides e vitamina A, contendo como principal carotenoide a β-criptoxantina, seguido da luteína (HAMANO; ERCADANTE, 2001). Suas folhas apresentaram em estudos fitoquímicos a presença de taninos, saponinas, resinas, esteróis, triterpenos, flavonoides e alcaloides (ABO; OGUNLEYE; ASHIDI, 1999; ASUQUO et al., 2013; CARABALLO; CARABALLO; RODRÍGUEZACOSTA, 2004). A atividade antibacteriana do cajá ocorre pela presença do derivado de ácido anarcádico, isolado das folhas da cajazeira (S. mombin L), que possui a capacidade de inibir a β-lactamase, atividade atribuída também ao ácido clavulânico, antibacteriano comercialmente conhecido (COATES et al. 1994). Outros compostos secundários foram isolados das folhas e cascas desta espécie, identificados como ácido 2-O-cafeicol-(+)-alohidroxicítrico e butil éster de ácido clorogênico, que mostraram considerável atividade antiviral (CORTHOUT et al., 1992), bem como o ácido elágico e a quercetina, isolados das folhas, que apresentaram atividade antiviral contra o vírus da dengue tipo 2 (SILVA et al., 2011)..

(25) 25 3. OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL Analisar fitoquimicamente o extrato de S. mombin L. bem como avaliar in vitro a ação antibacteriana, o efeito antiaderente e a cinética bactericida do mesmo sobre bactérias bucais planctônicas. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Analisar fitoquimicamente o material vegetal do extrato de S. mombin L. para caracterizar a matéria-prima utilizada; 2. Determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) do extrato de S. mombin L. frente às bactérias Streptococcus mutans e Streptococcus oralis; 3. Determinar a Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA) do extrato de S. mombin L. frente às bactérias Streptococcus mutans e Streptococcus oralis; 4. Determinar a Cinética Bactericida (CB) do extrato de S. mombin L. frente ao Streptococcus mutans; 5. Comparar a ação antibacteriana, o efeito antiaderente e atividade bactericida entre o referido extrato e o digluconato de clorexidina a 0,12% frente às bactérias Streptococcus mutans e/ou Streptococcus oralis..

(26) 26 4. METODOLOGIA 4.1 COLETA DO MATERIAL VEGETAL A coleta da matéria prima vegetal ocorreu em novembro de 2011. As folhas de S. mombin L. foram adquiridas numa fazenda particular na região de Tábua em Dom Marcolino Dantas/ RN com coordenadas (Tábua- RN S S° 28’ 14’’ W 35° 27’ 37’’). A amostra coletada foi depositada no herbário da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) e identificado pelo botânico Alan Roque (exsicata 12252). Antes de coletado o material foi obtida autorização do Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade (SISBio/Ministério do Meio Ambiente (35017) assim como autorização para acesso ao patrimônio genético com finalidade de pesquisa científica via Plataforma Carlos Chagas/CNPq (número do processo 010688/2012-9).. 4.2 PREPARAÇÃO DO EXTRATO DE Spondias mombin L. As folhas coletadas de S. mombin L. foram submetidas à secagem, na sombra, sob temperatura ambiente por duas semanas. Logo após, as folhas foram trituradas em um moinho de facas. A partir de 450 g da droga vegetal de S. mombin L., foi preparado um extrato pelo método de decocção, onde a droga vegetal foi deixada em contato com a água em ebulição durante um período de 15 minutos, obtendo-se assim o extrato aquoso das folhas (EA). Logo após, foi feita liofilização do extrato para a realização dos testes biológicos.. 4.3 PROSPECÇÃO FITOQUÍMICA Foi realizada uma triagem fitoquímica preliminar, na qual foram testadas as principais reações de caracterização para metabólitos secundários. Os principais metabólitos pesquisados foram: polifenóis, flavonoides, taninos, saponinas e alcaloides. Para a identificação de fenóis adicionou-se ao extrato bruto uma quantidade do agente oxidante cloreto férrico (FeCl3). A reação foi considerada positiva, sendo evidenciada pelo desenvolvimento de uma coloração verde azulada. Na identificação de flavonoides foi utilizado o teste de Shinoda (HCl concentrado e magnésio em pó), sendo a reação considerada positiva através do desenvolvimento de uma coloração variável de laranja a verde..

(27) 27 Os taninos foram caracterizados pela reação de precipitação com gelatina, sendo a reação considerada positiva pelo desenvolvimento de um precipitado. Já para a detecção da presença de saponinas, empregou-se o teste de formação de espuma, sendo a reação considerada positiva pela persistência da espuma durante 15 minutos. O teste para alcaloides utilizou como base reações de formação de complexos insolúveis produzidos por reagentes específicos como: Dragendorff (formação de precipitado amarelo/alaranjado); Mayer (formação de precipitado branco); Wagner (formação de precipitado marrom escuro) e Bertrand (formação de precipitado branco amarelado).. 4.4 MICRORGANISMOS UTILIZADOS As cepas utilizadas foram Streptococcus mutans ATCC 25175 e Streptococcus oralis ATCC 10557. Todas as amostras foram solicitadas à Fundação Osvaldo Cruz (FIOCRUZ) e fazem parte da coleção de microrganismos de referência em Vigilância Sanitária. Os referidos microrganismos foram reativados em caldo nutritivo (BHI - Brain Heart Infusion – DIFCO®, Michigan, Estados Unidos) e repicados em placas de Petri contendo Ágar Sangue (Columbia Blood Agar Base - DIFCO®, Michigan, Estados Unidos), com auxílio de uma alça descartável, em três sentidos: horizontal, vertical e diagonal, permanecendo na estufa por 37ºC durante 24 horas, para que fossem testadas as suas viabilidades. Com alça descartável, as colônias foram retiradas dessas placas, semeadas em caldo nutritivo (BHI - Brain Heart Infusion – DIFCO® Michigan, Estados Unidos.) e incubadas a 37ºC por 18-20 horas. 4.5 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) DO EXTRATO DE Spondias mombin L. A atividade antibacteriana em placas foi realizada segundo a metodologia adaptada de Bauer e colaboradores (1966) para a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM). As linhagens bacterianas Streptococcus mutans ATCC 25175 e Streptococcus oralis ATCC 10557 foram cultivadas em caldo nutritivo (BHI – Brain Heart Infusion – DIFCO®, Michigan, Estados Unidos) e incubadas a 37ºC por ou 24 horas. Em placas de petri contendo Ágar Mueller Hinton (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos) foi introduzido o BHI (BHI-Brain Heart Infusion – DIFCO®, Michigan, Estados.

(28) 28 Unidos) inoculado com cada crescimento bacteriano, retirado o excesso e confeccionados cinco orifícios equidistantes, padronizados com seis mm de diâmetro (em cada placa). Foram introduzidos 70 µL de cada substância teste, incluindo o extrato aquoso puro e os extratos aquosos diluídos em água destilada, nos orifícios e as placas incubadas a 37ºC por 24 horas. Cada ensaio foi realizado em duplicata sobre cada linhagem. O mesmo procedimento foi utilizado para o controle positivo com o digluconato de clorexidina a 0,12% (Periogard®, Colgate-Palmolive Company, Nova York, EUA) (FIGURA 1). É considerada CIM a menor concentração do extrato capaz de inibir o crescimento microbiano, representado pela presença de um halo de inibição, aferido em mm com auxílio de um paquímetro (Eccofer®, China).. Formação dos halos de inibição. Medição dos halos formados Formação dos halos de inibição. Medição dos halos formados. Figura 1. Representação esquemática da técnica utilizada na determinação da CIM do extrato sobre cada amostra ensaiada. Fonte: Costa (2011)..

(29) 29 4.6 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA DE ADERÊNCIA (CIMA) DO EXTRATO DE SPONDIAS MOMBIN L. A Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA) do extrato de Spondias mombin L. foi determinada na presença de sacarose a 5%, de acordo com Gerbara, Zardetto e Mayer (1996), usando-se concentrações correspondentes ao extrato bruto até a diuição 1:512. A partir do crescimento bacteriano, as linhagens bacterianas Streptococcus mutans ATCC 25175 e Streptococcus oralis ATCC 10557 foram subcultivadas a 37ºC em caldo Mueller-Hinton (DIFCO, Michigan, Estados Unidos). Foi feita distribuição de 0,9 mL do subcultivo em tubos de hemólise e, em seguida, adicionado 0,1mL da solução correspondente às diluições do extrato. A incubação foi feita a 37°C por 24 horas em microaerofilia, com os tubos inclinados a 30°. A leitura foi realizada através da observação visual da aderência da bactéria às paredes do tubo, após agitação do mesmo. Cada ensaio foi realizado em duplicata frente à cada linhagem selecionada. O mesmo procedimento foi realizado para o controle positivo com o digluconato de clorexidina a 0,12% (Periogard®, Colgate-Palmolive Company, Nova York, EUA) (FIGURA 2). É considerada CIMA a menor concentração do agente em meio com sacarose capaz de impedir a aderência do microrganismo ao tubo de vidro.. Figura 2. Representação esquemática da técnica utilizada na determinação da CIMA dos extratos sobre cada amostra ensaiada. Fonte: Costa (2011)..

(30) 30 4.7. DETERMINAÇÃO DA CINÉTICA BACTERICIDA DO EXTRATO DE SPONDIAS MOMBIN L. A curva bacteriana frente ao extrato de Spondias Mombin L. foi avaliada pelo método de Peyret e colaboradores (1990). A amostra do Streptococcus mutans ATCC 25157 foi inoculada em caldo nutritivo (BHI-DIFCO, Michigan, Estados Unidos), incubada a 37º C por 24 hras e subcultivada em Caldo Mueller Hinton (DIFCO, Michigan, Estados Unidos) por 1 (uma) hora. Os 9mL de cultura bacteriana, foram adicionados a 1mL dos extratos (bruto e CIM). Os referidos tubos foram mantidos na estufa a 37º C por 24 horas e as alíquotas retiradas após 2 (duas), 4 (quatro), 6 (seis) e 24 horas de incubação, sendo então semeadas em placas com Agar Mueller Hinton (DIFCO, Michigan, Estados Unidos) (FIGURA 3). Cada ensaio foi realizado em duplicata frente ao microrganismo selecionado. A leitura das placas foi efetuada após incubação por 24 horas a 37ºC pelo método padrão de contagem de unidade formadora de colônia, observando o potencial bactericida do extrato nos tempos determinados.. Figura 3. Representação esquemática da técnica utilizada na determinação da Cinética Bacteriana frente ao extrato testado para cada amostra ensaiada. Fonte: Costa (2011)..

(31) 31 4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA Os resultados obtidos no teste da Concentração Inibitória Mínima foram coletados, organizados e apresentados em forma de tabelas com os seus respectivos valores das médias dos halos, indicando a inibição do crescimento bacteriano. Posteriormente, foram transferidos para um banco de dados e calculados os parâmetros estatísticos que incluíram valores das respectivas medidas descritivas: mínimo, máximo, média e desvio padrão. O nível de confiança utilizado para a obtenção dos intervalos foi de 95%. Ao nível de 5% de significância foi utilizado o teste U de Mann-Whitney na comparação da Concentração Inibitória Mínima do extrato em relação ao digluconato de clorexidina a 0,12% frente aos dois microrganismos..

(32) 32 5. RESULTADOS 5.1 REAÇÕES DE IDENTIFICAÇÃO No processo de prospecção fitoquímica do extrato da folha de Spondias mombin L. foram detectados os principais metabólitos secundários da planta como: compostos fenólicos, flavonoides, taninos e saponinas, conforme mostra o quadro 1. Quadro 1. Prospecção fitoquímica do extrato da folha de Spondias mombin L.. Classe. de. metabólitos Aspecto visual. Resultado. pesquisados Compostos fenólicos. A reação foi considerada positiva, sendo. evidenciada. pelo. desenvolvimento de uma coloração verde azulada.. Flavonóides. A reação foi considerada positiva através do desenvolvimento de uma coloração avermelhada.. Taninos. A reação foi considerada positiva pelo desenvolvimento de um precipitado..

(33) 33. Saponinas. A reação foi considerada positiva pela abundância e persistência da espuma durante 15 minutos.. Alcaloides. A reação foi negativa para a presença de alcaloides, não havendo formação de precipitado. e. nem. mudança. coloração.. Fonte: Cabral (2015).. 5.1.1 Análise por cromatografia em camada delgada (CCD) Na análise por CCD após a revelação com o Reagente Natural A, que é um revelador específico de flavonoides, quatro bandas com coloração amarela foram observadas, caracterizando a presença de flavonoides no extrato aquoso das folhas, sendo ainda verificada uma banda de coloração azul sugestiva de ácido fenólico (FIGURA 4).. Figura 4. CCD do EA. (Revelador: Reagente Natural A / UV 365 nm). Fase móvel: Tolueno: Acetato de etila:ácido fórmico 5:5:0,5. Fonte: Cabral (2015).. de.

(34) 34 5.2 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA DO EXTRATO DE Spondias mombin L. Os resultados da determinação da concentração inibitória mínima do extrato de Spondias mombin L. para os microrganismos Streptococcus mutans e Streptococcus oralis, bem como para a clorexidina sobre os mesmos microrganismos estão apresentados no quadro 2.. Quadro 2. Concentração Inibitória Mínima (média dos halos de inibição em mm) em meio sólido do extrato aquoso de Spondias mombin L. e do digluconato de clorexidina sobre Streptococcus mutans e Streptococcus oralis.. Extrato de Spondias mombin L. Linhagens. EB. 1:2. 1:4. 1:8. 1:16. 1:32. 1:64. 1:128. 1:256. 1:512. 24. 21. 18. 16. 16. 16. 18. 18. 18. 16. 21. 20. 19. 20. 20. 19. 18. 16. 16. 15. bacterianas Streptococcus mutans Streptococcus oralis. Digluconato de clorexidina a 0,12% Linhagens. SP. 1:2. 1:4. 1:8. 1:16. 1:32. 1:64. 1:128. 1:256. 1:512. 20. 18. 15. 14. 13. 13. 12. 0. 0. 0. 17. 16. 15. 14. 13. 0. 0. 0. 0. 0. bacterianas Streptococcus mutans Streptococcus oralis. EB: Extrato bruto; SP: Substância pura. No quadro 2, observou-se que o extrato de Spondias mombin L. apresentou atividade antibacteriana em todas as concentrações sobre as bactérias testadas, cujos halos de inibição variaram entre 15 e 24mm. O digluconato de clorexidina apresentou-se eficaz sobre todas as bactérias e os halos de inibição variaram entre 12 e 20 mm. Streptococcus mutans foi a bactéria mais sensível ao referido antimicrobiano, apresentando halo de inibição até a diluição 1:64. Para efeito de comparação entre os halos de inibição do extrato S. mombin L. e do digluconato de clorexidina 0,12% tanto para o S. mutans como para o S. oralis foi realizado teste U de Mann Whitney e percebeu-se que o extrato apresentou atividade.

(35) 35 antibacteriana estatisticamente superior à clorexidina somente a partir da concentração 1:32 (Figuras 5 e 6).. Figura 5. Concentração inibitória mínima do Extrato de S. mombin L. e do DIgluconato de Clorexidina.. Figura 6. Halos de inibição do S. mutans e S. oralis frente a ação do extrato bruto (1) de Spondias mombin L. até a diluição de 1:512 (10)..

(36) 36 5.3 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA DE ADERÊNCIA DO EXTRATO DE Spondias mombin L. Observou-se que o extrato de Spondias mombin L. apresentou efeito antiaderente sobre Streptococcus mutans e Streptococcus oralis em todas as concentrações testadas (Figura 7). O efeito antiaderente do extrato para os microrganismos citados foi maior inclusive do que o efeito do digluconato de clorexidina a 0,12%, que impediu a aderência do Streptococcus mutans até a concentração 1:256 e do Streptococcus oralis até a concentração de 1:16 (Tabela 1).. Figura 7. Ausência de células aderidas ao tubo de vidro, demonstrando a atividade antiaderente do extrato de Spondias mombin L.na diluição de 1:512 para S. mutans e S. oralis.. Tabela 1. Aderência dos microrganismos ao tudo de vidro frente ao extrato de Spondias mombin L..

(37) 37 5.4 DETERMINAÇÃO DA CINÉTICA BACTERICIDA DO EXTRATO DE spondias mombin L. Os resultados da determinação da cinética bactericida do extrato bruto e diluído (CIM) de Spondias mombin L. sobre S. mutans estão apresentados na tabela 2. Tabela 2. Cinética bactericida do extrato de Spondias mombin L. sobre S. mutans.. Na tabela 2, observou-se que o efeito bactericida do extrato de Spondias mombin L. bruto foi notável já nas primeiras duas horas de contato com a amostra do S. mutans. Para o extrato do Spondias mombin L. em sua concentração inibitória mínima foi observado efeito bactericida após quatro horas de contato com o S. mutans..

(38) 38. 6. DISCUSSÃO. A cárie dentária e as doenças periodontais ainda são considerados os problemas bucais mais prevalentes na população e isso se deve, em grande parte, à característica biofilme dependente dessas doenças. Grande parte da população encontra dificuldade e irregularidade na frequência da correta higienização dos dentes, o que facilita o acúmulo de biofilme e o surgimento de cáries (FEJERSKOV; KIDD, 2011). Diante disso, agentes antimicrobianos têm sido propostos com a intenção de complementar a higienização mecânica das superfícies dos dentes e diminuir a frequência de aparecimento desses problemas bucais (MOREIRA et al., 2008; MARSH, 2010). Atualmente o digluconato de clorexidina se destaca e é visto como padrão ouro no que diz respeito à capacidade antimicrobiana, apesar de apresentar alguns efeitos colaterais e ocorrer resistência de cepas bacterianas a agentes sintéticos como ele (MOTA; TURRINI; POVEDA, 2015). Portanto, atualmente têm-se estudado bastante os agentes antimicrobianos derivados de plantas, conhecidos como fitoterápicos, pois, considerando a grande variedade etnobotânica do Brasil, é salutar que essa variedade seja aproveitada e utilizada em benefício da população a fim de reduzir os custos e os efeitos colaterais que usualmente são observados em substâncias sintéticas (SANTOS, et al., 2009). Neste estudo buscou-se estudar os principais compostos do extrato do Spondias mombin L. (cajá) em função de ser uma planta bastante encontrada na região nordeste do Brasil, local onde foi realizada a presente pesquisa, e por existir alguns estudos mostrando a atividade antimicrobiana de tal extrato frente a determinados microrganismos (ABO; OGUNLEYE; ASHIDI, 1999; SILVA, 2011). Na triagem fitoquímica do referido extrato foi encontrada a presença de compostos fenólicos, flavonoides, taninos e saponinas. A leitura de alguns estudos mostra que substâncias como os compostos fenólicos têm muitas propriedades, dentre elas: ações antioxidante, antiviral, antibiótica, antitumoral e alergênica (THADHANI et al., 2012; DELAZAR, A.; et al, 2006). As substâncias com núcleo fenólico, como os flavonoides, também apresentam destaque especial como antioxidantes (DELAZAR, A.; et al, 2006). A atividade antioxidante dos taninos é bem conhecida (GÜLÇIN et al., 2010) e, de acordo com Serrano et al. (2009), as propriedades antimicrobianas dos taninos também foram identificadas e bem documentadas. Dessa forma, a presença de tais metabólitos no.

(39) 39 extrato de Spondias mombin L poderia estar perfeitamente relacionada com a atividade antimicrobiana deste. Ainda dentro dos achados da triagem fitoquímica do extrato, as saponinas constituem uma das classes de maior destaque, pois apresenta ampla atividade biológica (KAISER; PAVEI; ORTEGA, 2010). Côrrea, Melo e Costa (2008) constataram a atividade anti-inflamatória de algumas saponinas. Portanto, essa classe de metabólitos poderia justificar uma posterior pesquisa do extrato de Spondias mombin L. como possível agente também anti-inflamatório. Uma vez identificados no material vegetal: compostos fenólicos, flavonóides e taninos, que são compostos cujas atividades antimibrobianas já são bastante conhecidas, foi realiza avaliação in vitro da atividade antibacteriana do extrato da folha de Spondias mombin L. (cajá) frente às bactérias Streptococcus mutans e Streptococcus oralis, através da determinação da concentração inibitória mínima(CIM). Através da análise da CIM, foi constatada a eficácia do extrato sobre as linhagens testadas, pois houve inibição do crescimento bacteriano, medido em milímetros pelo halo de inibição, em todas as concentrações (do extrato bruto até a diluição de 1:512), tanto para o S. mutans como para o S. oralis. É salutar destacar que essa inibição do crescimento bacteriano foi significativamente maior quando comparados o extrato de Spondias mombin L. e o digluconato de clorexidina para ambos os microrganismos, a partir da concentração 1:32. Os achados do experimento da determinação da CIM bem como a presença de flavonóides e taninos, vistos através da triagem fitoquímica, apontam como justificativa para a atividade antibacteriana verificada pelo material vegetal frente às cepas testadas. Apesar da presença frequente do cajá no Nordeste do Brasil e dos estudos acerca de sua capacidade antimicrobiana, ainda havia a necessidade de se verificar tal capacidade frente a bactérias comumente encontradas no ambiente bucal, com vistas a determinar, com maior precisão, as atividades antibacteriana, bactericida e antiaderente do extrato de Spondias mombin L diante de bactérias bucais. Para tanto, além da comprovação do efeito antibacteriano do extrato de S. mombin L. foi necessário verificar se este possuía algum papel sobre a aderência bacteriana, visto que tal aderência à película adquirida representa um dos primeiros mecanismos envolvidos na iniciação do desenvolvimento do biofilme dentário (ALMEIDA, P. F., 2002)..

(40) 40 Frente ao exposto, o presente estudo determinou a Concentração Inibitória Mínima de Aderência (CIMA) do extrato de S. mombin L. frente a S. mutans e S. oralis e foi observado que o material vegetal apresentou efeito antiaderente, representado pela ausência de aderência ao tubo de vidro, na presença de sacarose, simulando a superfície dentária lisa, sobre todas as bactérias testadas, em todas as concentrações (desde o extrato bruto até a diluição de 1:512). A clorexidina, por outro lado, apresentou efeito antiaderente até a diluição 1:256 frente a S. mutans, corroborando assim com o estudo de Matsumoto-Nakano et al. (2011) e frente ao S. oralis até a diluição 1:16, concordando também com um estudo realizado anteriormente (JESUS et al., 2010). Dessa forma, o referido extrato mostrou efeito antiaderente maior sobre os microrganismos testados até mesmo quando comparado ao digluconato de clorexidina. Ainda visando determinar a ação antibacteriana do extrato de S. mombin L sobre bactérias relacionadas à cárie dentária, foi determinada a Cinética Bactericida do extrato de Spondias mombin L. bruto e na sua concentração inibitória mínima (1:512) frente ao S. mutans, por ser este o microrganismo presente no ambiente oral mais estudado nas últimas décadas, em virtude de estar sempre presente no biofilme dentário e ser potencialmente cariogênico, desempenhando um papel principal na patogênese da cárie (LOESCHE, 1986). Neste experimento, observou-se o efeito bactericida do extrato de S. mombin L. bruto nas primeiras duas horas de contato com a amostra de S. mutans. Para o mesmo extrato diluído na proporção de 1:512 (CIM) foi observado efeito bactericida somente após quatro horas de contato com a amostra de S. mutans. Fazendo um comparativo da atividade bactericida do extrato em questão com a atividade bactericida do digluconato de clorexidina, é imposrtante destacar que esse último apresenta substantividade de aproximadamente 12 horas. Sendo assim, tal substância exercerá uma ação bactericida inicial imediatamente após o seu bochecho, contando ainda com uma combinada ação bacteriostática prolongada, uma vez que é fortemente adsorvida pelas superfícies orais, formando “reservatórios de clorexidina”, que são liberadas paulatinamente (ZANATTA; RÖSING, 2007). Porém, quando foi traçado um comparativo entre o crescimento de unidades formadoras de colônias na presença do extrato e na presença somente de água destilada, percebeu-se que já após duas horas de ação do referido extrato frente ao S. mutans ocorreu uma significativa diminuição da proliferação dessas colônias e após 4 (quatro) horas de.

(41) 41 contato com o extrato de S. mombin L. já foi possível observar a inibição completa do crescimento dessas colônias. Diante de todos os experimentos realizados e dos resultados destes em comparação com a literatura vigente, foi observado que o extrato aquoso da folha de Spondias mombin L. (cajá) apresenta atividade antibacteriana in vitro sobre os microrganismos S. mutans e S. oralis na forma planctônica, viabilizando a realização de estudos com outros microrganismos presentes na microbiota bucal, no sentindo de avaliar posteriormente o efeito de Spondias mombin L., incorporado em uma solução para bochecho, sobre as bactérias orais e presentes no biofilme dentário, uma vez que um agente antimicrobiano fitoterápico, além de ser de baixo custo, é mais acessível à população, podendo ser prescrito, inclusive, nos serviços de Atenção Primária à Saúde, seguindo as recomendações da Organização Mundial da Saúde (OMS) para o uso da Medicina Tradicional e Complementar/Alternativa nos sistemas de saúde, de maneira integrada às técnicas da medicina ocidental moderna..

(42) 42 7. CONCLUSÕES 1. A triagem fitoquímica do extrato de Spondias mombin L. revelou a presença de compostos fenólicos, flavonoides e taninos, sendo essa composição uma provável justificativa para a atividade antimicrobiana desse extrato; 2. O extrato de Spondias mombin L, em todas as concentrações testadas, apresentou atividade antibacteriana sobre S. mutans e S. oralis; 3. O extrato de Spondias mombin L. também mostrou efeito antiaderente sobre as bactérias testadas, até mesmo em sua maior diluição (1:512); 4. O extrato de Spondias mombin L. bruto já apresentou ação antibactericida após duas horas de contato com o S. mutans, enquanto o referido extrato, em sua concentração inibitória mínima, revelou efeito bactericida somente após quatro horas de contato com o S. mutans; 5. O extrato de Spondias mombin L, em todas as concentrações testadas, exibiu atividades antibacteriana, antiaderente e bactericida superiores àquelas do digluconato de clorexidina a 0,12%.

(43) 43. 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1.. ABO, K.A.; OGUNLEYE, V.O.; ASHIDI, J.S. Antimicrobial potential of Spondias mombin, Croton zambesicus and Zygotritonia crocea. Phytother Res., v. 13, n. 6, p. 494-497, 1999.. 2.. AGRA, M.F.; FREITAS, P.F.; BARBORA-FILHO, J.M. Synopsis of the plants known as medicinal and poisonous in Northeast of Brazil. Rev. bras. Farmacogn., v. 17, n. 1, p. 114-140, 2007.. 3.. AJAO, A.O.; SHONUKAN, O.; FEMI-ONADEKO, B. Antibacterial Effect of Aqueous and Alcohol Extracts of Spondias mombin, and Alchornea cordifolia Two Local Antimicrobial Remedies. Phamaceutical biology, v.23, n.2, p. 67-72, 1995.. 4.. ALELUIA, C. M., et al. Medicines In Dentist Herbal. Rev. Odontol. Univ. Cid. São Paulo 27(2): 126-34. 2015.. 5.. ALBUQUERQUE, U.P. et al. Medicinal plants of the caatinga (semi-arid) vegetation. of. NE. Brazil:. A. quantitative. approach.. Journal. of. Ethnopharmacology, v. 144, p. 325-354, 2007. 6.. ALMAS, K.; AL-SANAWI, E.; AL-SHAHRANI, B. The effect of tongue scraper on mutans streptococci and lactobacilli in patients with caries and periodontal disease. Odonto-stomatologie Tropicale, v. 109, p. 5-10, 2005.. 7.. ALMEIDA, P. F. Microbióta estreptocócica associada com a formação inicial da placa dental. Revista de Ciências Médicas e Biológicas 1: 33-41. 2002.. 8.. ANDERSON, T. O. M. Dental treatment in Medieval England. Br Dent J, v. 197, n. 7, p. 419-425, 2004.. 9.. ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução da diretoria colegiada (RDC) n° 26, de 2014. Dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos e o registro e a notificação de produtos tradicionais fitoterápicos. Diário Oficial [da] República Federativa do Brasil, Brasília, DF, 13 de maio 2014, p. 34.. 10.. ASUQUO, O.R. et al. Histomorphological study of the anti-fertility effect of Spondias mombim L. in adult male rats. Journal of pharmacy and biological sciences, v. 3, p. 29-34, 2012.. 11.. AYOKA, A.O. et al. Medicinal and Economic Value of Spondias mombin. African Journal of Biomedical Research, v. 11, p. 129-136, 2008..

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