Samuel de Araújo Evangelista

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Centro de Biociências

Bacharelado em Ciências Biológicas

Samuel de Araújo Evangelista

Implantação em laboratório de cultivos de Moina Micrura e

Ceriodaphnia cornuta (Cladocera; Crustacea), espécies de cladóceras

que ocorrem naturalmente em reservatórios do alto curso do rio Doce,

nordeste brasileiro.

Natal/RN

2018

Samuel de Araújo Evangelista

Implantação em laboratório de cultivos de Moina Micrura e Ceriodaphnia

cornuta (Cladocera; Crustacea), espécies de cladóceras que ocorrem

naturalmente em reservatórios do alto curso do rio Doce, nordeste brasileiro.

Trabalho de conclusão do curso de graduação em Ciências Biológicas, Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial para a obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas.

Natal/RN

2018

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, Izabel Cristina e Francisco Evangelista, por sempre acreditarem

em minha capacidade e me dar forças em momentos difíceis, além de serem

minha inspiração para crescer, amo muito vocês.

A minha orientadora, professora Dra. Raquel Franco de Souza, pela dedicação,

apoio e por me mostrar que não devo desesperar diante das dificuldades,

muitíssimo obrigado.

A Thiago por toda paciência e valiosas dicas dentro e fora do laboratório.

A minha companheira Bruna Silva, por estar ao meu lado principalmente nos

meus momentos de estresse.

A Alexsandra pelas conversas descontraídas durante os trabalhos no laboratório.

A Ernani pela ajuda na execução deste trabalho.

Ao professor Dr. Guilherme Fulgêncio por ceder o laboratório onde foi realizado

este trabalho.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Trabalhos realizados com espécies objeto nos estados brasileiros .... 12

Figura 2: Local de cultura dos organismos ... 14

Figura 3: Escola Agrícola de Jundiaí; reservatório artificial, local de coleta da

água para cultivo ... 15

Figura 4: Malha de 45µm usada para filtrara água ... 16

Figura 5: Equipamentos: medidor de oxigênio dissolvido portátil; medidor de

pH portátil... 16

Figura 6: Frascos plásticos numerados para uso em bioensaios ... 17

Figura 7: Identificação das estruturas morfológicas características de M.

micrura ... 19

Figura 8: Identificação das estruturas morfológicas características de C. cornuta

... 19

Figura 9: Cartas-controle de M. micrura e C. cornuta para sensibilidade ao

NaCl ... 21

LISTA DE TABELAS

TABELA 1: Identificação dos tratamentos usados no teste para escolha do

melhor cultivo ... 15

TABELA 2: Disposição das concentrações de NaCl de acordo com a

identificação dos frascos (id. Frascos) ... 18

TABELA 3: Sobrevivência e reprodução de M. micrura em teste com água ...

... 20

TABELA 4: Sobrevivência e reprodução de M. micrura em teste com alimento

... 21

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ... 10

1.1 Água ... 10

1.2 Ecotoxicologia ... 10

1.3 Cladocera ... 11

2 OBJETIVOS ... 13

2.1 Objetivo geral ... 13

2.3 Objetivo específico... 13

3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 13

3.1 Identificação dos organismos ... 13

3.2 Cultivo de estabilização ... 13

3.3 Teste de água de cultura e alimento para a cladóceras nativas ... 14

3.4 Ensaios agudos de sensibilidade ao reagente NaCl ... 17

3.5 Análises estatísticas ... 18

4 RESULTADOS ... 18

4.1 Identificação dos organismos ... 18

4.2 Cultivo de estabilização ... 20

4.3 Ensaios agudos de sensibilidade ao reagente NaCl ... 21

5 DISCUSSÃO ... 22

5.1 Identificação dos organismos ... 22

5.2 Teste de água de cultura e alimento para a cladóceras nativas ... 23

5.3 Ensaios agudos de sensibilidade ao reagente NaCl ... 25

6 CONCLUSÃO ... 26

RESUMO

Para validar o uso de organismos a serem utilizados em testes ecotoxicológicos, é necessário a padronização dos procedimentos dos cultivos em laboratório. Vários dos organismos teste padronizados não ocorrem no Brasil, não sendo representativos do ecossistema brasieliro. O uso de espécies nativas pode aumentar a representatividade dos trabalhos desenvolvidos com amostras ambientais. Cladocera são comumente utilizados como organismos teste em ensaios ecotoxicológicos, razão pela qual faz-se necessário o conhecimento da ecologia e da sistemática destes organismos. O objetivo deste trabalho foi identificar e implantar o cultivo das espécies Moina micrura e Ceriodaphnia cornuta, que ocorrem naturalmente em reservatórios do nordeste brasileiro. Após a identificação dos organismos, foram realizados testes para verificar a adaptabilidade de Moina micrura às condições de laboratório. Paralelamente, foram elaboradas cartas-controle para M. micrura e C. cornuta, utilizando NaCl como substância de referência. Nas condições laboratoriais, verificou-se que a água do açude da Escola Agrícola de Jundiaí apresentou melhor resultado para o cultivo. Os testes de sensibilidade ao NaCl apresentaram CL50 48h com valores de 2,16g/L ±0,44 para M. micrura e 1,89g/L ±0,22 para C. cornuta.

ABSTRACT

To validate the use of organisms to be used in ecotoxicological tests, it is

necessary to standardize the procedures of the cultures in the laboratory. Several

of the standardized test organisms do not occur in Brazil and are not

representative of the Brazilian ecosystem. The use of native species can increase

the representativeness of the work developed with environmental samples.

Cladocera are commonly used as test organisms in ecotoxicological trials, which

is why it is necessary to know the ecology and systematics of these organisms.

The objective of this work was to identify and implant the cultivation of the

species Moina micrura and Ceriodaphnia cornuta, which occur naturally in

reservoirs in the Brazilian northeast. After the identification of the organisms,

tests were performed to verify the adaptability of Moina micrura to the

laboratory conditions. At the same time, control charts were elaborated for M.

micrura and C. cornuta, using NaCl as reference substance. In the laboratory

conditions, it was verified that the water of the dam of the Agricultural School

of Jundiaí presented better result for the cultivation. The NaCl sensitivity tests

showed a 48h LC50 with values of 2.16g / L ± 0.44 for M. micrura and 1.89g / L

± 0.22 for C. cornuta.

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1. INTRODUÇÃO 1.1 Água

A água é o recurso natural essencial para a manutenção da vida na Terra, recobre a maior parte do planeta. No entanto 97,5% deste volume é de águas oceânicas e apenas 2,5% de água doce; a maior parte desta água doce está sob a forma de gelo, inviabilizando seu uso; diante disto, organizações de diversos países cooperam para a preservação deste recurso; no Brasil, o órgão que regula o uso da água é a Agência Nacional de Águas (ANA), criada pela lei n° 9.984 de 2000. A ANA regula, monitora, aplica a lei e planeja o uso da água de domínio da União de acordo com as diretrizes e objetivos descritos na lei n° 9.433 de 1997 (ANA, 2018). Para melhor administração das formas disponíveis de água no país, o Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA), regulamenta o Decreto n° 99.274, de 6 de junho de 1990, que dispõe sobre a classificação de corpos d’água e critérios ambientais, além de estabelecer as condições e padrões para o lançamento de efluentes. (MMA, 1990)

O crescimento populacional e sua perceptível concentração em centros urbanos resultam no aumento da poluição gerada; de acordo com Zagatto & Bertoletti (2008), esse crescimento não planejado causa grandes problemas ao meio ambiente e a contaminação dos corpos hídricos causa problemas diretos à população através de doenças.

1.2 Ecotoxicologia

Embora a preocupação com políticas públicas sobre o controle da poluição dos recursos naturais seja algo de longa data, apenas na década de 1960 o termo poluição tornou-se algo internacionalmente reconhecido graças aos problemas causados ao meio ambiente e consequentemente, ao homem; o crescimento exacerbado da população, sua concentração em centro urbano e principalmente a falta de saneamento nestes ambientes é um fator que pode acelerar o processo de poluição.

Atualmente há uma preocupação global com a preservação e conservação do meio ambiente, que é o reflexo de diversos acidentes envolvendo produtos químicos, os quais provocaram danos colaterais graves à população; dentre os acidentes ocorridos pode-se citar o uso indevido de DDT, na década de 1940, nos Estados Unidos, além de ocorrência de câncer de pele e pâncreas em trabalhadores expostos a bifenilas poli-cloradas (PCBs); a poluição causada por mercúrio, cádmio e PCBs no Japão; e no Brasil, em 1996, o caso conhecido como

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a “síndrome de caruaru” causado por uso irregular de equipamento de hemodiálise contaminado com hepatotoxinas (ZAGATTO & BERTOLETTI et al., 2008).

A partir da década de 1970 o Brasil inicia suas medidas para regulamentar a gestão de águas em território nacional, estabelecendo padrões e valores de quantidade para substâncias através de decreto, porém, estes padrões não atendiam às condições para preservação da vida aquática; apenas na década de 1980 microcrustáceos e peixes foram utilizados em métodos para avaliar a toxicidade de curta duração de substâncias e a padronização destes métodos foram adotadas em vários países. (ZAGATTO & BERTOLETTI et al., 2008)

Diante dos conceitos de toxicologia e ecologia de ambientes, década de 1970, na reunião do Committee of the Internacional Council of Scientific Unions (ICSU), em Estocolmo, o toxicologista francês René Trauhaut sugere o termo ecotoxicologia (TRAUHAUT, 1977). A partir disto foram definidos direcionamentos para os estudos ecotoxicológicos; no Brasil os termos metodológicos de ecotoxicologia começaram a ser utilizados em 1975, no programa internacional de padronização de testes de toxicidade aguda com peixes, que foi desenvolvido pelo Comitê Técnico de Qualidade de Águas TC 147 da

Internacional Organization for Standardization (ISO).

1.3 Cladocera

Os Cladocera são crustáceos diminutos da classe Branchiopoda, que possuem tamanhos variados que limitam-se entre 0,2 e 18,0 mm; seu corpo não é visivelmente segmentado; apresentam uma carapaça de aparência bivalve que o reveste, sendo esta aberta ventralmente; apresenta-se lisa ou marcada com linhas, retículos, pontos ou tubérculos; possuem a cabeça, em alguns casos, separada do corpo por uma depressão; na cabeça ainda identificam-se estruturas como olho composto e ocelo; também podem apresentar olho simples ou ocelo; o olho composto é formado por lentes hialinas e pigmentos granulares; possuem antenas que distinguem-se em função, sendo o primeiro par conhecido como antênulas e o segundo par conhecido apenas por antena; as antênulas possuem cerdas olfativas e em alguns casos pêlos sensoriais, estruturas pequenas inseridas ventralmente a cabeça; as antenas são grandes, inseridas lateralmente, produzem movimentos rápidos que lembram saltos e por esta característica estes organismos são conhecidos como “pulgas d’água”; os elementos da boca encontram-se próximos a região da junção entre cabeça e corpo; o corpo apresenta-se dentro da carapaça e dorsalmente, entre o corpo e a carapaça, encontra-se uma

12

câmara onde desenvolve-se ovos (câmara de incubação); o corpo é constituído de tórax e abdômen, sendo o ultimo segmento deste conhecido por posabdômen; o posabdômen pode servir como auxiliar na locomoção; no tórax são encontrados de 4 a 6 pares de patas, que podem ser lobadas, em forma de folha e com diversos pelos; as patas são responsáveis por criar uma corrente de água que auxilia na alimentação destes organismos, realizando um papel filtrador; estes organismos podem alimentar-se de algas, protozoários, detritos orgânicos e bactérias; as trocas gasosas são realizadas através da pele (ELMOOR-LOUREIRO, 1997).

Cladocera são organismos que reproduzem-se comumente de forma assexuada (partenogênese), podendo apresentar reprodução sexuada quando as condições do ambiente não são favoráveis; estas condições adversas podem ser falta de alimento ou mudanças nas condições físico-químicas da água; na reprodução assexuada são produzidos ovos diploides que são depositados na câmara de incubação; os jovens possuem estágios de desenvolvimento chamados instar (ELMOOR-LOUREIRO, 1997).

No Brasil, estes organismos são encontrados em diversos ambientes límnicos e são descritos em todos os estados brasileiros; das espécies descritas neste país, duas foram objeto do presente trabalho e suas ocorrências foram registradas nos trabalhos de Araújo (2016) na Bahia, Matsumura-Tundisi (2015) no Pará, Vieira (2011) e Porto (2016) na Paraíba, Gomes (2015) e Eskinazi-Sant’Anna et al. (2007) no Rio Grande do Norte e Perbiche-Neves (2014) em Sergipe. (Figura1)

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2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral

 Implantar cultivos das espécies Moina micrura e Ceriodaphnia cornuta (ordem Cladocera) em condições laboratoriais, validando-os com carta-controle (sensibilidade ao reagente NaCl).

2.2 Objetivos específicos

 Descrição de cladóceras encontradas em sedimento de pequeno reservatório na região de nascentes do rio do Mudo, bacia hidrográfica do rio Doce.

 Implantação de cultivo de cladóceras encontradas em sedimento de pequeno reservatório na região de nascentes do rio do Mudo, bacia hidrográfica do rio Doce.

 Testar a toxicidade aguda para M. micrura para o cloreto de sódio (NaCl).

 Testar a toxicidade aguda para C. cornuta para o cloreto de sódio (NaCl).

 Produzir carta-controle como critério de qualidade de cultivo de M. micrura.

 Produzir carta-controle como critério de qualidade de cultivo de C. cornuta.

3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Identificação dos organismos

Para o presente trabalho foram utilizadas duas espécies de cladocera límnicos, obtidas a partir de coleta de sedimento em pequeno manancial de água superficial do rio do Mudo, bacia hidrográfica do rio Doce, Rio Grande do Norte (216262.95 mE e 9367344.35 mS).

Os organismos foram identificados com ajuda de microscópio óptico binocular de marca BEL photonics® e fotografados a partir de câmera digital (13 mega pixels) de aparelho

smartphone Motorola® Moto G5. Os organismos foram identificados com ajuda do Manual

de identificação de cladóceros límnicos do Brasil (ELMOOR-LOUREIRO, 1997). 3.2 Cultivo de estabilização

Os organismos foram mantidos em sistema de cultivo com variáveis como temperatura e luminosidade controlados automaticamente (Figura 2); a temperatura foi mantida à 25°C(±1) e a luminosidade variando entre 16h com luz e 8h sem luz; além disso os cultivos foram mantidos sem aeração.

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Figura 2 – Local de cultura dos organismos: Iluminação (setas); cultura de M. micrura (Círculo da esquerda); cultura de C. cornuta (Círculo da direita).

3.3 Seleção da melhor forma de cultivo para cladóceras nativas

Para seleção da melhor condição de cultivo, foram realizados testes preliminares, com duração de sete dias, para avaliar o melhor tipo de água de cultivo e o alimento mais adequado para uma boa taxa de sobrevivência e reprodução dos organismos. Os testes para selecionar a água e o alimento foram independentes.

Os alimentos testados (todos em água destilada) foram: Alga (cultura de Scenedesmus

obliquus (cedidas pelo Laboratório de Microbiologia Aquática - LAMAQ)), ração P (ração

liquefeita de peixe (Tetramin)) e ração C (composto por extrato de ração de peixe (Tetramin), levedura - fermento biológico, óleo de prímula e complexo vitamínico).

As águas testadas foram: água natural de um reservatório pouco antropizado localizado na Escola Agrícola de Jundiaí – EAJ (Figura3), água mineral (marca SterBom) e água destilada; a água da EAJ foi utilizada de duas formas: com e sem condicionante de água (SERA® – blackwater). Os organismos foram alimentados com ração de peixe liquefeita (Tetramin) e cultura de Scenedesmus obliquus, uma gota em cada réplica.

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Figura 3 - Escola Agrícola de Jundiaí (círculo); Reservatório artificial, local de coleta de água para cultivo (seta)

Utilizaram-se 40 frascos plásticos numerados, 10 para cada tipo de água e um controle; para o teste com o alimento foi seguido o mesmo padrão do teste com a água, totalizando nos dois testes 80 frascos. Os ensaios consistiram em expor os organismos a variações de alimento e água, e foram realizados da seguinte forma: para o teste com o alimento, nos frascos numerados de 1 a 10, foi adicionado ração P e alga; de 11 a 20, ração P; de 21 a 30, alga; de 31 a 40, ração C; para o teste com a água, nos frascos numerados de 1 a 10, foi adicionada água EAJ sem condicionante; de 11 a 20, água mineral; de 21 a 30, água destilada; de 31 a 40, água EAJ com condicionante. O conteúdo de cada frasco está apresentado na tabela 1. Ao todo foram utilizados 3 tipos de água e três tipos de alimento.

Tabela 1 - Identificação dos tratamentos usados no teste para escolha do melhor cultivo

Os organismos foram acondicionados em béqueres com 1 litro de água, contendo 50 fêmeas partenogênicas. A água usada no cultivo foi filtrada em malha de 45µm (figura 4). Estas fêmeas foram alimentadas e todos os neonatos produzidos foram retirados diariamente; além disso, foi feita a limpeza dos aquários que consistiu na retirada de carapaças

Identificação (1 – 10) (11 – 20) (21 – 30) (31 – 40)

Tipo de alimento ração P + alga ração P alga ração C

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provenientes das mudas (instar) e outras impurezas indesejáveis que pudessem ser vistas a olho nu. Variáveis como pH e oxigênio dissolvido (OD) foram medidos periodicamente para manter os cultivos em condições compatíveis com a sobrevivência dos organismos. Estas variáveis foram medidas a partir de oxímetro portátil (marca Instrutherm MO-900) e pHmetro portátil (marca AKSO) (Figura 5).

Figura 4 – Malha de 45µm usada para filtrar água (A)

17

3.4 Ensaios agudos de sensibilidade ao reagente NaCl

Para realização dos ensaios de sensibilidade foi utilizada água destilada como água de diluição, com pH ±7, aerada no mínimo por 24h até atingir saturação de oxigênio. Os recipientes onde foram realizados os testes são constituídos de material plástico com capacidade máxima para 40ml. Os organismos foram transferidos para o béquer com ajuda de pipeta plástica; além disso, os frascos foram numerados para identificação (Figura 6). Como substância referência foi utilizado o Cloreto de Sódio, NaCl, diluído para obtenção de concentração de 10g/L na solução estoque.

Figura 6 –Frascos plásticos numerados para uso em bioensaios

Os ensaios tiveram duração de 48 horas (teste agudo), período no qual foi observado o efeito da substância referência sobre a sobrevivência dos organismos. A observação do efeito consistiu em averiguar se ocorreu imobilidade nos organismos em cada uma das concentrações testadas. Para o teste foram utilizadas 5 concentrações diferentes, além de um controle, cada um com 10 réplicas em frascos separados e identificados. Os frascos numerados de 1 a 10 foram utilizados como controle nos ensaios realizados com as duas espécies e as concentrações para cada espécie ficaram dispostas da seguinte forma: para os

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ensaios com M. micrura, nos frascos numerados de 11 a 20, 0,5 g/L; de 21 a 30, 1,0 g/L; de 31 a 40, 2,0 g/L; de 41 a 50, 4,0 g/L; de 51 a 60, 8,0 g/L; para os ensaios com C. cornuta, nos frascos numerados de 11 a 20, a concentração usada foi de 0,25 g/L; de 21 a 30, 0,5 g/L; de 31 a 40, 1,0 g/L; de 41 a 50, 2,0 g/L; de 51 a 60, 4,0 g/L (tabela 2). Em cada uma das réplicas foi adicionada uma fêmea partenogênica, totalizando 60 organismos de cada espécie. Durante o teste, a água não foi renovada e os organismos foram alimentados apenas no primeiro dia.

Tabela 2 - Disposição das concentrações de NaCl de acordo com a identificação dos frascos (Id. frascos)

Para o ensaio ser considerado válido, suas condições devem se manter constantes durante todo o período de exposição; a porcentagem de organismos considerados imóveis ou mortos no controle não pode exceder 10% e o teor de OD não deve ser menor que 2 mg/L. Uma carta controle foi confeccionada de modo que seus resultados expressassem valores dentro dos limites prescritos (±2 desvios padrão) (Zaggato & Bertoletti et al., 2008).

3.5 Análises de reprodução e morte

Com os dados obtidos a partir dos ensaios ecotoxicológicos agudos utilizou-se o programa estatístico Trimmed Spearman-Karber para avaliação da toxicidade. A concentração de esperada para 50% dos organismos (CE50) foi calculada. Os valores de reprodução e mortalidade foram analisados utilizando o método estatístico descritivo de Spearman-Karber, método Trimmed Spearman-Karber.

4 RESULTADOS

4.1 Identificação dos organismos

A espécie identificada como Moina micrura foi caracterizada por: (A) uma cabeça com depressão supraocular bem desenvolvida; (B) olho grande; (C) primeiro par de patas com seta anterior no penúltimo segmento; (D) antênulas longas atadas à margem ventral da cabeça; (E) efípio com 1 ovo e reticulado por inteiro ou só nas margens; (F) posabdômen com dentes penados e um dente bifurcado . O comprimento pode variar entre 0,50-1,20 mm (Figura 7).

Id. frascos 1-10 11-20 21-30 31-40 41-50 51-60

C. cornuta controle 0,25g/L 0,5 g/L 1 g/L 2 g/L 4 g/L

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Figura 7 - Indicação das estruturas morfológicas características de M. micrura. (A) Depressão supra-ocular; (B) olho grande; (C)(seta) primeiro par de patas com seta anterior no penúltimo segmento; (D) antênulas longas, atadas à margem ventral da cabeça; (E) efípio; (F)(elipse) posabdômen com dentes penados e um dente bifurcado (aumento de 100x, imagens I e II; de 400x images III e IV).

A espécie identificada como Ceriodaphnia cornuta foi caracterizada por: (A) cabeça curvada;(B) olho de tamanho moderado e ocelo puntiforme; (C) carapaça com presença de espinho no ângulo das valvas; (D) um ou mais espinhos no rostro, fórnices ou vértices; (E) antênulas pequenas, delgadas, com seta sensorial lateral entre o meio e a extremidade;(F) posabdômen com 5-8 espinhos anais; garras lisas ou pectinadas. O comprimento varia entre 0,4-0,6 mm (Figura 8).

Figura 8 – Indicação das estruturas morfológicas características de C. cornuta; (A) cabeça curvada; (B) olho ; (C) ângulo das valvas formando espinho ; (D) espinho ; (E) antênula; (F) posabdômen (aumento 200x, imagem da direita; aumento 400x, imagem da esquerda).

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4.2 Seleção da melhor forma de cultivo para Moina micrura

Para os ensaios realizados no teste com água foram obtidos os seguintes valores: no tratamento com água da EAJ com condicionante foi obtida uma sobrevivência de 10 organismos (100%) e uma reprodução de 134 neonatos; no tratamento com água mineral a sobrevivência foi de 5 organismos (50%) e uma reprodução de 77 neonatos; no tratamento com água destilada a sobrevivência foi de 7 organismos (70%) e uma reprodução de 121 neonatos; no tratamento com água da EAJ sem condicionante a sobrevivência foi de 7 organismos (70%) e a reprodução foi de 93 neonatos (tabelas 3).

Tabela 3 – Sobrevivência e reprodução de M. micrura em teste com água.

Para os ensaios realizados no teste com o alimento foram obtidos os seguintes valores: no tratamento com ração P + alga a sobrevivência foi de 4 organismos (40%) e a reprodução foi de 9 neonatos; no tratamento com ração P a sobrevivência foi de 1 organismo (10%) e a reprodução foi de 0 neonatos; no tratamento com alga a sobrevivência foi de 10 organismos (100%) e a reprodução foi de 7 neonatos; no tratamento com a ração C a sobrevivência foi 0 (0%) e a reprodução foi de 0 neonatos (tabela 4).

0 2 4 6 8 10 12 EAJ s/ Cond. Água mineral Água destilada EAJ + Cond.

Sobrevivência

EAJ s/ Cond. Água mineral

Água destilada

EAJ + Cond.

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Tabela 4 - Sobrevivência e reprodução de M. micrura em teste com alimento.

4.3 Ensaios agudos de sensibilidade ao reagente NaCl

Os resultados dos ensaios de sensibilidade foram exibidos em cartas-controle para cada uma das espécies (Figura 9); para C. cornuta a CE50 foi 1,89 g/L ±0,22; a CL50 para M.

micrura foi 2,16 g/L ±0,44.

Figura 9 - Cartas-controle de M. micrura e C. cornuta para sensibilidade ao NaCl

0 2 4 6 8 10 12 Ração P + Cultura

Ração P Cultura Ração C

Sobrevivência

Ração P Cultura Ração C

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5. DISCUSSÃO

5.1 Identificação dos organismos

No presente trabalho foram identificadas estruturas morfológicas que caracterizaram duas espécies da ordem Cladocera, pertencentes a famílias distintas, as espécies Moina

micrura e Ceriodaphnia cornuta. Em seu manual, ELMOOR-LOUREIRO (1997) descreve

estruturas que caracterizam as espécies identificadas neste trabalho. A autora afirma que algumas estruturas são comuns aos gêneros de maneira generalizada como tamanho diminuto e carapaça única aparentemente bivalve; porém, existem também características específicas que foram encontradas nas espécies descritas no presente trabalho como: eixo da cabeça contínuo ao corpo, característica do gênero Moina, ou eixo dobrado em relação ao corpo, que dá aparência de uma cabeça curvada, característica do gênero Ceriodaphnia.

Para descrever as estruturas dos organismos estudados verificou-se uma dificuldade; inicialmente as identificações destas estruturas foram desenvolvidas com os organismos ainda vivos, devido à pequena quantidade dos mesmos disponível no laboratório. De acordo com Elmoor-Loureiro (1997) os organismos devem ser fixados para identificação, que facilita sua manipulação.

Segundo (Elmoore-Loureiro et al., 1997), Baird (1850) descreveu o gênero Moina pela primeira vez como organismos com cabeça frequentemente com depressão supra-ocular, olho no centro da cabeça, antênulas longas e posabdômen com dente bifurcado; a família Moinidae foi descrita por Goulden (1968) e este descreveu a família como possuidora de cabeça proeminente, antênulas longas, posabdômen com projeção pós-anal com dentes penados e um dente bifurcado; Kurz (1874), descreve a espécie Moina micrura e algumas das características apresentadas por ele se fazem presentes na caracterização da espécie deste trabalho. Os organismos descritos neste trabalho apresentaram as seguintes estruturas que corroboram com os autores supracitados: antênulas longas, posabdômen curto e estreito com um dente bifurcado e cabeça com depressão supra-ocular bem desenvolvida com grande olho, conforme apresentado nasfigura 6. De acordo com (Elmoor-Loureiro et al., 1997), esta espécie ocorre, no Brasil, nos estados de Alagoas, Pernambuco, Mato Grosso do Sul, Distrito Federal, Minas Gerais e Rio Grande do Sul; outros autores descrevem esta espécie ainda na Bahia (Araújo,2016), Pará (Matsumura-Tundisi, 2015), Paraíba (Vieira, 2011; Porto, 2016), Rio Grande do Norte (Gomes, 2015) e Sergipe (Perbiche-Neves, 2014).

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Na identificação da segunda espécie apresentada neste trabalho foram observadas estruturas que caracterizam a família, gênero e espécie. De acordo com (Elmoor-Loureiro et al., 1997), Dana (1853) descreve o gênero Ceriodaphnia como organismos com cabeça curvada e deprimida, valvas ovais, arredondadas ou subquadradas, geralmente tendo o ângulo posterior-dorsal agudo ou formando um espinho; antênulas não muito livres e móveis; efípio triangular; Sars (1886) descreve Ceriodaphnia cornuta, espécie utilizada neste trabalho, como organismos de forma oval; valvas reticuladas com margens ventral e dorsal levemente arqueadas; cabeça curvada, com um ou mais espinhos localizados no vértice, rostro e fórnices. Algumas das características descritas por estes autores foram encontradas nos organismos aqui analisados e, como citado inicialmente, a identificação destes organismos foi feita com eles ainda vivos, o que constituiu dificuldade adicional; uma maneira encontrada para reduzir o movimento do animal durante a identificação foi a adição de pequena quantidade de álcool 45% na lâmina. A espécie Ceriodaphnia cornuta Sars(1886), de acordo com Elmoor-Loureiro (1997), foi identificada, no Brasil, nos estados do Acre, Amazonas, Pará, Maranhão, Piauí, Pernambuco, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, São Paulo, Rio Grande do Sul, Distrito Federal e Goiás; outros autores também identificaram esta espécie no estado Rio Grande do Norte (Eskinazi-Sant’Anna et al., 2007).

5.2 Identificação da melhor forma de cultivo para M. micrura

O ensaio para a escolha de água e alimento foi realizado para verificar a adaptabilidade de Moina micrura às condições de cultivo utilizadas no laboratório; além disso, estes organismos apresentavam efípios com frequência. Segundo Nakauth (2015), a redução drástica de alimento causa aumento na produção de ovos de resistência em cladóceros do gênero Moina sp. A espécie M. micrura, por estar presente em diversos reservatórios situados em regiões semiáridas e estas apresentarem períodos de seca prolongados, ocasionando reduções dos níveis de água e consequente eutrofização, apresenta uma estratégia de produção de efípios, assim como todos os Cladocera; é uma estratégia de sobrevivência bastante eficaz quando o ambiente não possui aporte para suprir as necessidades como alimentação, sobrevivência e reprodução destes organismos.

Zagatto & Bertoletti (2008), relatam que dafnídeos são facilmente cultivados em laboratório e indicados para testes de sensibilidade. Os dafnídeos utilizados no presente trabalho demonstraram boas condições, pois apresentavam reprodução e sobrevivência

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satisfatórias para uso e por este motivo não foram realizados ensaios para estabilização de cultivo.

O ensaio preliminar realizado para a escolha da água utilizada na manutenção dos cultivos mostrou que a melhor opção dentre as possibilidades oferecidas pelo laboratório foi a água da EAJ sem condicionante, como mostra a tabela 3; esta água é de um reservatório artificial situado no município de Macaíba (238717.87 mE e 9348414.94 mN) a 14 km da capital Natal-RN; este reservatório possui influência de atividades antrópicas de baixo impacto; observando os tipos de água utilizadas para o presente trabalho pode-se afirmar que a água da EAJ obteve melhores resultados pois por ser oriunda de ambiente natural possui elementos essenciais necessários para a sobrevivência dos mais diversos organismos, incluindo os cladóceros; a água destilada, por ser uma água pura, não possui estes elementos essenciais a vida e a água mineral, apesar de possuir íons em sua composição, é pobre em nutrientes que se fazem necessários à sobrevivência de diversas espécies aquáticas;Zagatto & Bertoletti (2008), indicam o uso de meios de cultura naturais para manutenção de cultivos de organismos utilizados pois estes são mais completos com relação aos elementos essenciais.

Os resultados do ensaio preliminar para escolha do alimento mostram que ensaios com cultura de Scenedesmus obliquus obtiveram reprodução e sobrevivência com melhores índices, seguidos dos ensaios com ração P e cultura de Scenedesmus obliquus; estes resultados corroboram com resultados obtidos por Pagano, 2008, que verificou diferença na preferência alimentar de M. micrura de acordo com tipo de alimento. Em seu trabalho, Pagano (2008), demonstra que M. micrura consegue alimentar-se de algas com variados tamanhos e formas que vão desde espécies de 2 a 4µm como a Chlorella sp., até espécies com tamanhos entre 20 e 40µm como a Coelastrum reticulatum coenobia, mas esta seleção depende da natureza e distribuição de tamanho do fitoplâncton. A Scenedesmus obliquus possui aproximadamente 7µm de tamanho. Resultados similares foram encontrados também no trabalho de Rodríguez-Estrada (2003) onde foram utilizadas as microalgas clorofíceas

Ankistrodesmus falcatus e Scenedesmus incrassatulus; em seus resultados eles demonstram

maior reprodução e longevidade de M. micrura alimentada com S. incrassatulus em temperatura controlada de 25°C.

Comparando os testes realizados com água e com alimento, observou-se que o tratamento com água da EAJ e o tratamento com a cultura de Scenedesmus obliquus são os mais indicados para manutenção dos cultivos de M. micrura.

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5.3 Ensaios agudos de sensibilidade ao NaCl

Os testes de sensibilidade para substância referência NaCl foram conduzidos de acordo com o indicado por Zagatto & Bertoletti (2008) com adaptações para as condições laboratoriais disponíveis para a realização deste trabalho; dentro da escala de concentrações de NaCl utilizadas, inicialmente a espécie M. micrura foi submetida às mesmas concentrações de NaCl que C. cornuta; porém, mesmo nos valores de concentração mais altos não foi observado efeito nos organismos; com isto, as concentrações foram ajustadas para M.

micrura, para atender ao propósito deste estudo. Durante a realização dos testes de

sensibilidade o pH foi mantido a ±7, o que segundo Nakauth (2015) é um pH ótimo para manutenção de cladocera.

Neste trabalho os valores do coeficiente de variação obtidos não ultrapassaram 20%, qualificando o método ecotoxicológicos utilizado. De acordo com Zagatto & Bertoletti (2008) o coeficiente de variação é uma ferramenta avaliativa para indicar a qualidade dos resultados obtidos nos testes com substância referência e os valores não devem ultrapassar 30%;

Ambas as espécies apresentaram sensibilidade ao cloreto de sódio. O gênero Moina apresenta espécies com relevante resistência ao NaCl. Em seu trabalho, Santangelo (2008) mostrou que Moina, diante de uma salinidade média de 1,69 psu, obteve efeitos positivos sobre sua dinâmica populacional em condições naturais. Saint-Jean (1994) afirma que Moina

micrura é uma espécie altamente produtiva e bem adaptada a ambientes de concentração de

NaCl, tolerando salinidade de até 4g/L, demonstrando altas taxas de fecundidade e crescimento populacional em temperaturas entre 25 e 30°C; Sarma (2006), expõe Moina

macrocopa a uma concentração de NaCl de 4,5g/L e observa que a população desta espécie

consegue se manter estável, indicando tolerância a substância referência utilizada. Neste trabalho o valor médio da concentração de sal que os organismos foram expostos foi de 2,03 g/L que indica uma leve salinidade, corroborando com os trabalhos citados.

Para a realização da análise estatística foi aplicado o método Trimmed Spearman-karber, pois, após a realização de testes iniciais verificou-se que não houve efeito letal sobre

M. micrura e, portanto, a concentração para esta espécie foi ajustada permitindo assim o

cálculo correto da CL50.

Realizando testes de sensibilidade ao cloreto de sódio com a espécie Ceriodaphnia

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obtidos aqui de 1,89g/L± 0,22; vale salientar que as condições apresentadas nos dois trabalhos foram diferentes quanto ao pH e dureza da água do cultivo dos organismos; além disso, a água utilizada para os testes da autora foi a mesma usada para o cultivo. Em nossos testes utilizou-se água destilada, portanto a diferença nos valores encontrados podem estar relacionadas ao parâmetros físico-químicos da água. Jaconetti (2005) encontra para C. dubia a CE50;48h de 1,57g/L±0,19, indicando que C. dubia é mais sensível ao NaCl que C. cornuta, em condições análogas às apresentadas neste trabalho

6. CONCLUSÃO

As espécies identificadas no presente trabalho compõem o leque de organismos que são amplamente utilizados na ecotoxicologia e portanto são indicadores de qualidade de água.

A identificação e caracterização de organismos representantes dos ambientes a serem estudados é de grande importância visto que estes podem apresentar resultados mais fiéis aos trabalhos realizados nestas áreas, porém, trabalhos que visam a identificação destes organismos ainda são escassos e dificultam a produção de novos conhecimentos nesta área.

Frente aos resultados apresentados, as duas espécies de cladóceros mostraram-se sensíveis à substância referência utilizada e, portanto, são indicadas para ensaios ecotoxicológicos; a espécie Moina micrura por sua vez, mostrou-se mais tolerante ao NaCl que a Ceriodaphnia cornuta e pode ser indicada para uso em ambientes de água salobra ou de clima semi-árido; devido às flutuações do nível da água dos reservatórios destes ambientes, as concentrações de nutrientes e consequentemente a salinidade podem elevar-se impedindo a utilização de outros organismos dulcícolas que sejam menos tolerantes.

Este trabalho mostra cartas-controle de duas espécies que apesar de serem conhecidas e amplamente estudadas no mundo, não possuem muitos trabalhos realizados dentro do estado do Rio Grande do Norte; a produção de uma carta-controle para a espécie Moina micrura terá grande importância para trabalhos futuros, visto que no estado ainda não havia sido produzida e esta espécie apresenta tolerância a salinidade; mais trabalhos necessitam ser realizados acerca desta espécie com objetivo de produção de novas cartas-controle com outras substâncias referência que caracterizem os ambientes dulcícolas e salobros que integram o semiárido nordestino.

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7. REFERÊNCIAS

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