Centro de Ciências da Saúde
Faculdade de Odontologia
NANO PROPRIEDADES E COMPOSIÇÃO DO RECOBRIMENTO, CITOTOXICIDADE E CORROSÃO DOS FIOS ORTODÔNTICOS ESTÉTICOS
Dayanne Lopes da Silva, CD, MO
Tese submetida ao corpo docente da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos, para a obtenção do Título de Doutor em Odontologia (Ortodontia).
Rio de Janeiro 2018
CITOTOXICIDADE E CORROSÃO DOS FIOS ORTODÔNTICOS ESTÉTICOS
DAYANNE LOPES DA SILVA, CD, MO
Orientador: Prof. Dr. ANTÔNIO CARLOS DE OLIVEIRA RUELLAS, CD, MO, DO
TESE submetida ao corpo docente da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos, para obtenção do Título de Doutor em Odontologia (Ortodontia).
Comissão Examinadora
__________________________________ __________________________________
Prof. Dr. Antônio Carlos de Oliveira Ruellas Prof. Dr. Carlos Alberto Estevanell Tavares
__________________________________ _________________________________
Prof. Dr. Ivo Carlos Correa Profa. Dra. Matilde Gonçalves Nojima
______________________________________
Profa. Dra. Margareth Maria Gomes de Souza
Rio de Janeiro 2018
CD, MO, DO CD, MO, DO
CD, MO, DO CD, MO, DO
Ficha Catalográfica
SILVA, Dayanne Lopes
Nano propriedades e composição do recobrimento, citotoxicidade e corrosão dos fios ortodônticos estéticos. Rio de Janeiro: UFRJ/Faculdade de Odontologia, 2018.
xxii, 79f.
Tese: Doutorado em Odontologia (Ortodontia) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Odontologia, 2018.
1 Fios ortodônticos 2 Citotoxicidade
3 Corrosão 4 Teses
I Título
II Tese (Doutorado – UFRJ/Faculdade de Odontologia)
Linha de Pesquisa: Físico química e estrutura dos materiais biocompatíveis.
Projeto: Avaliação clínica e laboratorial de fatores relacionados com o tratamento ortodôntico.
Comitê de Ética em Pesquisa: Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto
de Estudos de Saúde Coletiva, Comitê de ética em Pesquisa. Avaliação das
propriedades de fios ortodônticos estéticos X aço inox e níquel titânio.
“É o vento frio que torna as brasas mais quentes”
DEDICO
A Deus
pelo dom da vida, por me conduzir por caminhos excelentes e por cuidar de mim a cada dia.
Aos meus pais Bete e Rondon
pela grande dedicação comigo ao longo desses anos, por todo investimento na minha pessoa e educação. A você mãe, pela enorme confiança depositada em mim durante a trajetória deste curso. Foram incentivos preciosos para eu chegar até aqui, minha guerreira.
Ao meu irmão Layon
pelos bons anos de convivência e pelas boas recordações.
Ao meu marido Ivan
por estar comigo em todos os momentos, bons e ruins, por me apoiar e me encorajar a enfrentar os desafios e por saber entender as dificuldades que acompanharam essa jornada.
AGRADECIMENTOS
Às minhas queridas avós, Luzia da Silva e Terezinha Kork, pelo amor incondicional e por se fazerem sempre presentes, mesmo à distância. Quero agradecê-las principalmente pelas palavras confortadoras e pelo estímulo em buscar a Deus sobre todas as coisas.
Aos meus sogros, Igor Uhrig e Vânia Uhrig e a toda a família Uhrig pelo cuidado comigo e pelo carinho.
Aos meus amigos pelo carinho, incentivos e por acreditarem em mim sempre. Vocês fazem parte da minha felicidade.
Ao meu querido orientador Dr. Antônio Carlos de Oliveira Ruellas pelos ensinamentos, pela disponibilidade, pelas constantes palavras amigas e de incentivo e por confiar em meu trabalho. Levarei boas lembranças da nossa convivência e do seu admirável profissionalismo.
À Dra. Ana Maria Bolognese por sua dedicação ao ensino da Ortodontia e à pesquisa, bem como pelo carinho e orientação.
Ao Dr. Lincoln Issamu Nojima e Dra. Matilde Gonçalves Nojima pelas constantes conversas repletas de carinho, incentivos e preocupação. Foram momentos preciosos que sempre levarei em meu coração.
Ao Dr. Eduardo Franzotti Sant’Anna pela preocupação, disponibilidade, incentivo e pelas valiosas sugestões no decorrer do desenvolvimento deste trabalho.
Aos professores do Curso de Doutorado em Ortodontia da FO – UFRJ,
Dra. Margareth Maria Gomes de Souza, Dra. Mônica Tirre de Souza Araújo, Dra. Maria Evangelina Monnerat, José Fernando Stangler Brazzalle, Dra. Teresa Cristina Moreira (in memoriam) e Dr. José Vinícius Bolognesi Maciel
pelos preciosos ensinamentos, disponibilidade, bons momentos de convivência e pela dedicação em formar profissionais qualificados e comprometidos com a Ortodontia.
A todos os professores, funcionários e estagiários do Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes. Agradecimento especial à Profa. Maria
Teresa Villela Romanos e à doutoranda Jéssica Cavalcante. Muito obrigada
pelo carinho, acolhimento e pela confiança. A convivência com vocês foi maravilhosa.
Aos professores Sérgio de Souza Camargo Junior e Emanuel Santos
Junior, do Departamento de Engenharia Metalúrgica e de Materiais
COOPE/UFRJ, pelos conselhos e ensinamentos e pela disponibilidade e atenção.
As minhas queridas companheiras de turma Alline Birra, Geórgia Wain
Thi Lau, Lígia Vieira Claudino e Teresa Cristina de Oliveira Pereira pelos bons
momentos. Guardo boas lembranças com cada uma de vocês no coração e torço pelo sucesso e felicidade de todas. Em especial, quero agradecer a minha amiga
Tete, pelas incessantes conversas, aprendizados e principalmente pela carinhosa
amizade. Geo, obrigada pelo acolhimento, carinho e confiança. Admiro-as e tenho muito orgulho de vocês minhas amigas.
Aos colegas da 47ª turma, Adriele Silveira Araújo, Ana Carolina Portes
Koerich de Paula e Rodrigo Lopes de Lima pela convivência agradável e bons
momentos compartilhados. Em especial ao meu amigo Rodrigo, pelo cuidado comigo e pelas divertidas conversas nas voltas do Fundão. Meu querido irmão, espero que nos reencontremos sempre.
Aos colegas de Doutorado, Amanda Osório Ayres de Freitas, Carolina
Baratieri, Cláudia Trindade Mattos, Matheus Alves (in memoriam), Mariana Marquezan, Thiago Lau, Sânia Ornellas, Hibernon Lopes, Lúcio Gurgel Maia, Daniel Paludo Brunetto, Adriele Silveira Araújo e Ana Paula Tenório de Sá
pelo auxílio e convivência prazerosa. Em especial à minha irmã Claudinha, por ser um exemplo de simplicidade e devoção ao que se faz. Juntas compartilhamos excelentes momentos, sempre unidas e dispostas. Obrigada pela paciência, pelos momentos de aprendizado e pelas alegrias que nossa história de amizade traz. Você foi um presente em minha vida! Aninha, obrigada minha amiga por ser sempre muito solícita e estender as mãos sem exigir nada em troca. Sou muito grata por tê-la sempre por perto e pela nossa cumplicidade.
Aos funcionários e amigos Diane Esteves de Souza Dores, Fernanda
Ribeiro, Mônica Mello do Nascimento Gonçalves, Robson Antônio de França
(in memoriam) e Vanilda Antônio Saturnino por nos auxiliarem, facilitando nossa caminhada. Ao querido funcionário Waltencir Silva Ferreira pelo cuidado e carinho comigo, sempre prestativo e com um sorriso no rosto.
Às minhas professoras de graduação e pós-graduação, Luciane Macedo
de Menezes e Susana Maria Deon Rizzato por me aceitarem na monitoria da
disciplina de Ortodontia e nos cursos de Extensão e me incentivarem a buscar qualificação profissional.
Ao querido professor Carlos Alberto Estevanell Tavares pela oportunidade de conhecer e conviver com esta pessoa maravilhosa que você é. Se cheguei até aqui, foi graças ao seu incentivo e carinho em um momento tão difícil da minha vida. Admiro-o por sua conduta correta, competência e dedicação à Ortodontia. Muito obrigada pelos anos de convivência acompanhando sua prática clínica e por ser uma inspiração para mim meu “padrinho ortodôntico”.
Ao meu amigo Sérgio Freire e família Freire, que gentilmente disponibilizaram sua casa no Rio de Janeiro para que eu ficasse hospedada o tempo que fosse necessário. Sérgio, os primeiros meses de adaptação foram os mais difíceis e, certamente, ter um porto seguro como você foi muito importante. Obrigada pelo cuidado e carinho que teve comigo. Sem você este sonho não seria possível!
À Escola Fabiano Gomes High Performance School, pela acolhida, convívio maravilhoso e pela oportunidade de evoluirmos juntos.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), pelo incentivo à qualificação profissional através de bolsa de estudos
concedida.
Enfim, gostaria de agradecer a todos aqueles que, de alguma forma, contribuíram para que esta conquista fosse possível.
RESUMO
SILVA, Dayanne Lopes. Nano propriedades e composição do recobrimento,
citotoxicidade e corrosão dos fios ortodônticos estéticos. Orientador: Dr.
Antônio Carlos de Oliveira Ruellas. Rio de Janeiro: UFRJ/Faculdade de Odontologia, 2018. Tese (Doutorado em Odontologia – Ortodontia). xxii, 79f.
Este trabalho teve como objetivos avaliar a composição, as propriedades nanomecânicas e a resistência ao risco do recobrimento, a citotoxicidade e a liberação de metais de quatro marcas de fios ortodônticos com recobrimento estético como recebidos e após 21 dias de uso clínico. O estudo foi composto por dois experimentos. No primeiro, fios estéticos (Grupo OO: Ortho Organizers; Grupo TP: TP Orthodontics; Grupo OM: Orthometric; e Group TN: Trianeiro) foram avaliados quanto: à composição do recobrimento por espectroscopia no infravermelho por Transformada de Fourier; à dureza e ao módulo de elasticidade por testes de nano-indentação e quanto à resistência ao risco pelo teste de risco. No segundo experimento, os fios estéticos e seus respectivos fios convencionais de aço inoxidável e níquel titânio dos mesmos fabricantes foram avaliados quanto à citotoxicidade e à liberação de metais como recebidos e após 21 dias de exposição ao meio bucal. No ensaio de citotoxicidade cada tipo de fio foi incubado em placas contendo meio mínimo essencial de Eagle (MEM) e as alíquotas dos sobrenadantes de cada grupo foram retiradas em (T) 0 hora, 1, 2, 3, 7, 14, 21 e
60 dias e adicionadas a culturas de células L929 sendo a viabilidade celular determinada com o uso de vermelho neutro (Método Dye Uptake). O teste de corrosão foi realizando imergindo cada amostra numa solução de cloreto de sódio a 0,9% com 20µL de ácido nítrico por 28 dias. A quantidade de níquel, cromo,
ferro, titânio, cobalto e manganês nos intervalos de tempo (T) 7, 14, 21, e 28 dias foi mensurada através de espectrômetro de emissão óptica com fonte de plasma indutivamente acoplado (ICP OES). Todos os recobrimentos foram caracterizados pelo pico de benzeno a cerca de 1500 cm-1 e são compostos de poliéster e politetrafluoretileno. O ensaio de risco mostrou uma alta elasticidade do recobrimento com recuperação elástica maior que 60%, mas com diferentes tipos de falhas e irregularidades ao longo da região do teste. Níquel foi o íon mais frequentemente liberado durante os intervalos do estudo. Depois do uso clínico, o grupo TP apresentou uma liberação significativa de níquel somente nos fios estéticos em T7, T14 e T21. No grupo TN, a liberação de níquel pós fase clínica também foi estatisticamente maior nestes fios em T7, T21 e T28. Os fios estéticos do grupo TP, após o uso clínico apresentaram uma menor viabilidade celular em comparação aos seus respectivos fios controles em T1, T3 e T28. Todos os grupos apresentaram uma superfície irregular do recobrimento com delaminações em várias áreas após 21 dias de exposição ao meio bucal. Mesmo os fios mais citotóxicos e que liberaram maiores quantidades de íons metálicos, apresentaram uma boa biocompatibilidade para o uso clínico. Sugere-se que o método de aplicação, a composição química do recobrimento, e o tratamento da superfície do substrato metálico influenciem na corrosão e na biocompatibilidade dos fios ortodônticos estéticos quando expostos ao meio bucal.
SUMMARY
SILVA, Dayanne Lopes. Nano propriedades e composição do recobrimento,
citotoxicidade e corrosão dos fios ortodônticos estéticos. Orientador: Dr.
Antônio Carlos de Oliveira Ruellas. Rio de Janeiro: UFRJ/Faculdade de Odontologia, 2018. Tese (Doutorado em Odontologia – Ortodontia). xxii, 79f.
The aims of this study were to evaluate the material composition, the nano mechanical properties and scratch resistance of the coating; the cytotoxicity and metal release of four brands of esthetic coated archwires as received and after 21 days of oral exposure. This study was composed by two experiments. In the first, esthetic archwires (Group OO: Ortho Organizers; Group TP: TP Orthodontics; Group OM: Orthometric; and Group TN: Trianeiro) were evaluated for composition assessed by infrared spectroscopy (FTIR). Coatings hardness and elastic modulus were analyzed by nanoindentation tests. Scratch resistance of coatings were evaluated by scratch test. In the second experiment, esthetic coated archwires and conventional stainless steel and nickel titanium archwires from the same manufacturers (control) were evaluated for cytotoxicity and metals released as received and after 21 days of oral exposure. The cytotoxicity assay was performed incubating each type of wire in Eagle’s essential medium (MEM), removing the supernatant after T: 0 hour, 1, 2, 3, 7, 14, 21, 28 and 60 days and adding it to cultures of L929 mouse fibroblasts, and in each time the cell viability was
determined with neutral red (dye uptake method). The corrosion testing was performed incubating each type of wire in a solution of 0,9% sodium chloride with 20µL of nitric acid for 28 days at 37 ±1 °C. The content of nickel, chromium, iron,
titanium, cobalt and manganese ions at intervals of T: 7, 14, 21 and 28 days was measured by Inductively Coupled Plasma – Optical Emission Spectroscopy (ICP-OES). All analyzed coatings were markedly characterized by the benzene peak at about 1500 cm-1 and are a composite of polyester and polytetrafluoroethylene. Scratch test showed a high coating elasticity after load removal with elastic recoveries greater than 60%, but different failure features could be observed along the scratches. Nickel was the most frequently ion released. After clinical use, TP group showed a significant nickel release only in esthetic wires at T7, T14 and T21. TN group presented a nickel release statistically higher in the retrieved esthetic wires at T7, T21 and T28. At T1, T3 and T28 the post clinical esthetic wires of TP group showed significant lower cell viability than their control wire. The esthetic coatings presented an irregular surface aspect and peeled off in many areas after oral exposure. Even the wires that were more cytotoxic and released more metals in sometimes, all seems to present a good biocompatibility for clinical use. However, the applying coating technique, the coating material and the metallic surface treatment in order to improve mechanical adhesion seem to influence the corrosion behavior and biocompatibility of esthetic orthodontic coated archwires when exposed to the oral environment.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
DESENVOLVIMENTO DA PESQUISA
Figura 1 Corpos de prova para o ensaio de espectroscopia FTIR ... 7 Figura 2 Fotografias ilustrativas da disposição e amarração dos segmentos de fios no meio bucal: A) vista frontal; B) vista lateral aproximada; C - segmento de fio controle, grupo TP; E - segmento de fio estético, grupo TP ... 11 Figura 3 Fotomicrografias da morfologia celular, antes e após a incorporação do vermelho neutro. Antes: A) Grupo CC e B) Grupo C+. Depois: C) Grupo CC e D) Grupo C+. ... 15
ARTIGO 1
Figure 1. Example of a scratch test performed on the TP sample using ramping loads from 0 to 500 mN. The SEM image shows the scratch formed after load removal. The parameter elastic recovery is indicated by the arrow………..23 Figure 2. Coating FTIR spectra esthetic orthodontic archwires compared with a reference PTFE sample………...23 Figure 3. Nanoindentations: coating hardness (A) and elastic modulus (B) of esthetic orthodontic archwires. The insert in (A) shows a typical load-displacement curve obtained for TN samples (5 load-unload cycles)………..24 Figure 4. Photomicrographs of scratches formed on the samples after scratch tests. (A) OM group; (B) OO group; (C) TP group; (D) TN group. Original magnification at 200x……….25 Figure 5. Photomicrographs of scratches formed on the samples after scratch tests. (A) ckacks on OM group and (B) debris on TP group. Original magnification at 200x……….25 Figure 6. Coating elastic recovery of esthetic orthodontic archwires. Calculation derived from load-displacement curves at 200, 300, 400 and 450 mN loads………...….26
ARTIGO 2
Fig 1. Photomicrographs of TP group wires: (A, C) post-clinical control wire; (B, D) rough surface of post-clinical coated wire that lost the coating layer. Original magnification at 200x and 500x. ... 40 ARTIGO 3
Fig 1. Photomicrographs of post-clinical wires: A and D, conventional wires of TP and TN group respectively, B and E, remaining coating of esthetic wires of TP and TN group respectively, C and F, rough metallic substrate of esthetic wires that lost the coating layer of TP and TN group respectively. Original magnification, 90 and 200 times. ... 58
LISTA DE TABELAS
DELINEAMENTO DA PESQUISA
Tabela 1 Características dos fios ortodônticos com recobrimento estético ... 6 Tabela 2 Características dos fios metálicos com recobrimento estético e dos seus respectivos fios controle ... 10 Tabela 3 Condições operacionais para o ICP OES utilizadas na determinação de cobalto, cromo, ferro, manganês, níquel e titânio nas amostras. ... 19
ARTIGO 1
Table 1. Commercially available coated archwires used in this study………...22 Table 2. Coating hardness and elastic modulus (2.0 mN load) of esthetic archwires and intergroup comparison using Tukey post hoc test………...………24
ARTIGO 2
Table I. Characteristics of archwires used in the study...40 Table II. Mean values for the amount of viable cells, standard deviation, cell viability and statistical analysis of the groups studied at the times (T) 0 hour, 1 day and 2 days……….41 Table III. Mean values for the amount of viable cells, standard deviation, cell viability and statistical analysis of the groups studied at the times (T) 3, 7 and 14 days……….42 Table IV. Mean values for the amount of viable cells, standard deviation, cell viability and statistical analysis of the groups studied at the times (T) 21, 28 and 60 days……….43
ARTIGO 3
Table I. Characteristics of archwires used in the study ... 58 Table II. Nickel values for each wire type, time period and condition. Differences between each coated wire and its conventional and between each wire and the negative control (Mann-Whitney test) and for each wire between time periods (Wilcoxon test) ... 59 Table III. Iron values for each wire, time period and condition. Differences between each coated wire and its conventional and between each wire and the negative control (Mann-Whitney test) and for each wire between time periods (Wilcoxon test) ... 60 Table IV. Manganese values for each wire, time period and condition. Differences between each coated wire and its conventional and between each wire and the negative control (Mann-Whitney test) and for each wire between time periods (Wilcoxon test) ... 61
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ABEX expansão de bandas
ANOVA análise de variância
ATR Attenuated Total Reflection /reflexão total atenuada
bar pressão
CA Califórnia
CCD dispositivo de carga acoplado
CO cobalto
CO2 gás carbônico
Cr cromo
CrNi cromo níquel
cm centímetro
cm-1 centímetro elevado a menos 1
DLS Dayanne Lopes da Silva
E módulo de elasticidade
et al e outros
F força
Fe ferro
FLAT alinhamento de linha de base
g grama
g/ml grama por mililitro
GPa giga pascal
H dureza; hardness
ICP OES espectrômetro de emissão óptica com fonte de plasma indutivamente acoplado
ISO International Organization for Standardization
Ind Indiana
KCl2 cloreto de potássio
kV quilovolts
K2HPO4 fosfato de potássio dibásico
L min-1 litro por minuto elevado a menos 1
MEM meio mínimo essencial de Eagle
MEV Microscopia Eletrônica de Varredura
Mn manganês ml mililitro nm nanômetro mm milímetro mM milimolar mN milinewton
mg L-1 miligrama por litro elevado a menos 1
NaCl cloreto de sódio
Na2HPO4 2H2O fosfato dicálcico di-hidratado
Ni níquel
pos Scan profundidade residual
PBS tampão fosfato-salino
pH potencial hidrogeniônico
pré scan perfil original
PTFE politetrafluoretileno
RE recuperação elástica
RJ Rio de Janeiro
rpm rotação por minuto
s segundo
SD standard deviation/ desvio padrão
SEM scanning electron microscopy/ microscopia eletrônica de varredura
SFB soro fetal bovino
SMOOTH suavização de ruídos
SP São Paulo
SPSS statistical package for social sciences
T tempo
Ti titânio
UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro
USA United States of America
UV ultravioleta
W watts
x vezes
µm micrômetro
% porcento
ºC graus Celsius
< menor
ÍNDICE
1 INTRODUÇÃO ... 1 2 PROPOSIÇÃO ... 5 3 DELINEAMENTO DA PESQUISA ... 6 3.1 METODOLOGIA APLICADA NO ARTIGO 1 ... 6 3.1.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA ... 6 3.1.2 ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO DE FOURIER ... 7 3.1.3 PROPRIEDADES NANOMECÂNICAS ... 8 3.1.4 ENSAIO RESISTÊNCIA AO RISCO ... 8 3.1.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 9 3.2 METODOLOGIA APLICADA NOS ARTIGOS 2 E 3 ... 10 3.2.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA ... 10 3.2.2 FASE CLÍNICA ... 10 3.2.3 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA ... 12 3.2.4 AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE ... 13 3.2.4.1 Cultura de células ... 13 3.2.4.2 Ensaio de citotoxicidade ... 14 3.2.4.3 Análise da morfologia celular ... 15 3.2.4.4 Análise da viabilidade celular ... 16 3.2.4.5 Análise estatística ... 17 3.2.5 AVALIAÇÃO DA LIBERAÇÃO DE METAIS ... 17 3.2.5.1 Análise estatística ... 19 4 DESENVOLVIMENTO DA PESQUISA ... 20 4.1 ARTIGO 1 SILVA, D. L.; SANTOS, E. J.; RUELLAS, A. C. O. Infrared spectroscopy, nano-mechanical properties, and scratch resistance of esthetic orthodontic coated archwires. Angle Orthod. 2015; 85: 777-783 ... 21
4.2 ARTIGO 2 SILVA, D. L; MATTOS, C. T.; ROMANOS, M. T. V.; RUELLAS, A. C. O. Cytotoxicity os esthetic orthodontic coated archwires. Artigo submetido para publicação no American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics. ... 28 4.3 ARTIGO 3 SILVA, D. L.; MATTOS, C. T.; FREIRE, A. S,; RUELLAS, A. C. O. Release of metals ions from retrieved esthetic coated and conventional orthodontic archwires. Artigo submetido para publicação no American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics ... 44 5 DISCUSSÃO ... 62 6 CONCLUSÃO ... 73 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 75 8 ANEXOS ... 79 8.1 ANEXO 1: Parecer do Comitê de Ética ... 79
1 INTRODUÇÃO
A Ortodontia tem como princípios fundamentais a estética facial, a estabilidade, a eficiência funcional e a saúde dos tecidos periodontais (TWEED, 1945). Dentre estes, a estética é o principal motivo pelo qual os pacientes procuram tratamento ortodôntico (KHAN e HORROCKS, 1991). Com isso, muitas vezes a primeira preocupação do paciente ao procurar pelo tratamento está relacionada à aparência do acessório ortodôntico em si e ao impacto estético que este pode causar em sua qualidade de vida (ZHANG et
al., 2007; BERTO et al., 2009).
A aparência dos aparelhos ortodônticos fixos tem-se tornado uma preocupação vital (FALTERMEIER et al., 2006), que está relacionada principalmente ao aumento do número de adultos em busca de tratamento ortodôntico (KHAN e HORROCKS, 1991). Assim, bráquetes estéticos foram introduzidos no mercado como substitutos aos bráquetes metálicos para satisfazer tal demanda (BIRNIE, 1990; FALTERMEIER et al., 2007a; LEE, 2008b) e apresentaram grande aceitação por parte dos pacientes e da
população em geral (IMAI et al., 1998; IMAI et al., 1999; ROSVALL et al., 2009).
Atualmente, as indústrias mostram um avanço no desenvolvimento de acessórios ortodônticos estéticos. Além dos bráquetes, dois tipos de fios
ortodônticos estéticos estão sendo produzidos: os fios metálicos, particularmente os de aço inoxidável e de níquel titânio, que apresentam recobrimento de superfície à base de resina epoxídica ou de Teflon® (politetrafluoretileno) de cor similar aos dentes, e os fios FRP (fiber re-inforced plastic), manufaturados à base de material compósito translúcido, constituído por uma matriz de polímero metilmetacrilato e fibras de vidro para reforço (IMAI
et al., 1998).
O processo de aplicação do recobrimento estético sobre o arco metálico inclui um possível tratamento da superfície do fio e a utilização de ar comprimido como meio de transporte de partículas atomizadas de Teflon®, seguido de tratamento térmico de todo o conjunto em um forno de calor (HUSMANN et al., 2002). A corrosão e a citotoxicidade destes fios com recobrimento estético poderiam ser afetadas por este processo ou também pela qualidade, estabilidade e composição do material de recobrimento.
Alguns autores (POSTLETHWAITE, 1992; KUSY, 1997; ELAYYAN et
al., 2008 SILVA et al., 2013a, SILVA et al., 2013b,) apresentaram dificuldades
com estes fios, relatando que a cor do recobrimento tende a mudar com o tempo e que o recobrimento se desintegra durante o uso no meio bucal, expondo a superfície do metal. Os defeitos na superfície destes materiais podem ser fatores desencadeadores de corrosão (NEUMANN et al., 2002; KRISHNAN e KUMAR, 2004; HUANG, 2005), de acúmulo de placa bacteriana (NEUMANN et al., 2002; ELIADES, 2007; MARQUES et al., 2010) e possivelmente de aumento na concentração de íons metálicos no meio bucal (KOBAYASHI et al., 2007; SUAREZ et al., 2010). Além disso, não se sabe ao certo a composição do recobrimento e os possíveis riscos que este material
pode oferecer a saúde do paciente. Contudo, estes arcos estéticos continuam sendo produzidos e utilizados na prática clínica, principalmente quando é necessária uma alternativa estética.
A biocompatibilidade dos materiais odontológicos tem sido motivo de pesquisas e depende de diversos fatores relacionados à sua composição e utilização (ELIADES, 2007). Alguns estudos mostram preocupação em avaliar a biocompatibilidade de diferentes tipos de materiais ortodônticos (BISHARA e ANDREASEN, 1970; KAO et al.,2007; VANNET e HANSSENS, 2007). Dentre os critérios de avaliação da biocompatibilidade de um novo material odontológico, encontra-se a determinação de quanto este pode ser tóxico para células em contanto direto ou nas proximidades do material (citotoxicidade). Ensaios in vitro de citotoxicidade são, portanto, etapas necessárias no cenário de novos materiais para utilização in vivo.
Os tipos de ligas usadas na Ortodontia diferem em sua composição e em suas propriedades físicas. No meio bucal estes materiais estão sujeitos a processos corrosivos, podendo ocorrer liberação de substâncias tóxicas (ROSE
et al., 1998; SHIH et al., 2000; TOMAKIDI et al., 2000). Em Odontologia, vários materiais mantêm contato direto com os tecidos bucais por longo período de tempo. Os fios ortodônticos, que estão entre estes materiais, poderiam oferecer riscos aos pacientes (OH e KIM, 2005; KAO et al., 2007; VANDE VANNET e HANSSENS, 2007).
Porém, o impacto da degradação dos materiais ortodônticos na saúde dos pacientes não é completamente entendido e tem sido frequentemente abordado e questionado em editoriais (UMESAN et al., 2011; JERROLD,
2012). Até o momento a literatura ainda é falha em relação aos estudos de avaliação da composição do recobrimento, da biocompatibilidade e da corrosão dos fios ortodônticos com recobrimento estético, É importante relembrar que o sucesso na clínica ortodôntica não envolve somente o domínio da técnica de tratamento, mas também requer a aplicação das normas de biossegurança e a preocupação com as possíveis consequências locais e sistêmicas dos materiais dentários utilizados para tal. Desta forma, os acessórios estéticos precisam conservar as propriedades ópticas, mecânicas e de superfície ideais quando expostos ao meio bucal. Somente deverá ser aceito um arco estético que mantenha as demais propriedades de forma adequada (KUSY, 1997).
O mais importante advento do conhecimento das propriedades dos fios estéticos, reside no fato de permitir ao ortodontista optar por materiais com segurança na escolha, sem se deixar influenciar apenas por apelos comerciais. Com isso, o propósito deste estudo foi avaliar a composição e as propriedades nano mecânicas do recobrimento, a citotoxicidade e a corrosão dos fios ortodônticos estéticos, antes e depois da exposição ao meio bucal, comparando-os aos fios convencionais de aço inoxidável e níquel titânio.
2 PROPOSIÇÃO
2.1. Avaliar o material de recobrimento dos fios estético quanto: 2.1.1 à composição química;
2.1.2 às propriedades nanomecânicas e à resistência ao risco. 2.2. Comparar os fios estéticos com os fios convencionais de aço inoxidável e níquel titânio do mesmo fabricante, quanto:
2.2.1 à citotoxicidade, antes e depois da exposição ao meio bucal; 2.2.2 à liberação de metais, antes e depois da exposição ao meio bucal.
3 DELINEAMENTO DA PESQUISA
3.1 METODOLOGIA APLICADA NO ARTIGO 1
3.1.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
Para a realização deste estudo foram selecionadas quatro marcas comerciais de fios estéticos (Tabela 1).
Tabela 1 Características dos fios ortodônticos com recobrimento estético
Grupo Fabricante Dimensões Substrato Recobrimento
OO Ortho Organizers, São Marcos, CA, USA
Tooth Tone Plastic Coated 0,018”x 0,024” CrNi Todas as faces
TP TP Orthodontics, La Porte, Ind, USA
Aesthetic Shiny Bright 0,018”x 0,025” CrNi Vestibular
OM Orthometric, Haidian, Beijing, China
Esthetic Flexy Super Elastic 0,018”x 0,025” NiTi Vestibular
TN Trianeiro, Rio Claro, SP, Brazil
Coated wire NiTi 0,018”x 0,024” NiTi Todas as faces
Através de cálculo amostral baseado em estudo piloto, foram confeccionados cinco corpos de prova por marca, compostos por segmentos de fios com recobrimento estético de 10 mm de comprimento justapostos e unidos em suas extremidades por cianocrilato de etila (SuperBonder, Loctite, Company, Brasil), com a superfície vestibular voltada para cima, totalizando a largura de no mínimo 7 mm. As amostras foram identificadas por etiquetas, com a face voltada para a superfície a ser analisada e coladas na extremidade
de um fio de amarrilho metálico 0,010” trançado (Morelli, Sorocaba, SP, Brasil) de 10 cm de comprimento fixado ao corpo de prova (Figura 1).
Figura 1 Corpos de prova para o ensaio de espectroscopia FTIR
3.1.2 ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO DE FOURIER
A composição química do recobrimento dos fios estéticos foi investigada por espectroscopia no infravermelho por Transformada de Fourier (Fourier Transform Infrared -FTIR) e por micro Refletância Total Atenuada (micro ATR). As extremidades das amostras foram pressionadas contra o elemento reflexivo de diamante de um acessório micro-ATR ligado a um espectrômetro (Nicolet 6700 model, Thermo Scientific, USA). Os espectros foram registrados para a faixa de 4000-650 cm-1, com resolução de 4 cm-1, aquisição de 128 escaneamentos, frequência do laser de 15798.0 cm-1 e grão de fundo 8. Para a
obtenção de alguns espectros foram aplicados comandos para a melhora da apresentação das absorções, tais como: alinhamento de linha de base (FLAT), expansão de bandas (ABEX) e suavização de ruídos (SMOOTH), utilizando-se fatores adequados e permitidos pelo espectrômetro. Utilizou-se como referência um espectro FTIR de politetrafluoretileno (PTFE). (CUI e ZHONG et
3.1.3 PROPRIEDADES NANOMECÂNICAS
A dureza (H) e módulo de elasticidade (E) dos recobrimentos estéticos foram mensurados por testes de indentação instrumentada com um Nanoindentador G200 (MTS Agilent, USA) seguindo o método Oliver-Pharr (OLIVER e PHARR, 2004). Este método leva em consideração a interação entre o penetrador e o material indentado através da análise da curva de carregamento e descarregamento em função da profundidade. Os testes foram realizados utilizando uma ponta de diamante do tipo Berkovich que possui a geometria de uma pirâmide regular de base triangular, onde cada lado faz um ângulo de 65,3°. Um total de 28 indentações, 100 µm de espaçamento entre elas foram realizadas em cada amostra sob cinco ciclos de carregamento com carga máxima de 2.0 mN, tempo de carregamento de 10 segundos e tempo de espera de pico de 15 segundos. Uma amostra de sílica fundida com propriedades conhecidas (E= 73,0 GPa) foi utilizada para a calibração da área da ponta. A proporção de Poisson de 0,2 foi utilizada nos cálculos.
3.1.4 ENSAIO RESISTÊNCIA AO RISCO
Os ensaios de resistência ao risco foram realizados nos recobrimentos estéticos utilizando-se equipamento de tribo-indentação G200/MTS (MTS Agilent, EUA). Os experimentos foram realizados no ar à temperatura ambiente e 55% de umidade relativa. Uma ponta de diamante com geometria Berkovich foi empregada. Inicialmente o perfil original (pré scan) foi feito com a carga normal de 0,05 mN. Foram aplicadas forças crescentes de 0 a 500 mN, velocidade de risco de 50 µm/s e riscos de 250 µm a 750 µm de comprimento. No final do teste a ponta foi reposicionada novamente no risco formado sob a
carga de 0,05 mN para escanear a profundidade residual (pos scan). A recuperação elástica (RE) do recobrimento estético foi calculada pela diferença entre a profundidade máxima de penetração e a profundidade residual (pos scan) na carga (posição) de 200, 300, 400 e 450 mN.
As características micromorfológicas da superfície vestibular do recobrimento após o ensaio de risco foram observadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) utilizando-se um microscópio JEOL (JSM 6460 LV, PeaBody, Mass) com tensão de 15 kV e ampliação de 200x e 1000x.
3.1.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística no Programa
Statistical Package for the Social Science (versão 17, SPSS Inc. Chicago,
Illinois, USA). A normalidade e homogeneidade da amostra foi aferida por meio do teste de Kolmogorov-Smirnov e análise descritiva foi realizada para dureza, módulo de elasticidade e recuperação elástica do recobrimento estético. Os valores de dureza e módulo de elasticidade para cada grupo foram submetidos ao teste One-Way ANOVA e pelo teste de comparações múltiplas de Tukey para identificar diferenças intergrupos ao nível de significância de 5%.
3.2 METODOLOGIA APLICADA NOS ARTIGOS 2 E 3
3.2.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
Quatro marcas de fios metálicos com recobrimento estético e seus respectivos fios controle (fios convencionais de aço inoxidável e níquel titânio) foram avaliadas (Tabela 2).
Tabela 2 Características dos fios metálicos com recobrimento estético e dos seus respectivos fios controle
Grupo Fabricante Dimensões Composição Recobrimento
OO Ortho Organizers, São Marcos, CA, USA Convencional: Pro Form Shiny Bright 0,018”x 0,025” Aço Inoxidável (CrNi) - Estético: Tooth Tone Plastic Coated 0,018”x 0,024” Todas as faces TP TP Orthodontics, La Porte, Ind, USA Convencional: Shiny Bright 0,018”x 0,025” Aço Inoxidável (CrNi) - Estético: Aesthetic Shiny Bright 0,018”x 0,025” Vestibular OM Orthometric, Haidian, Beijing, China Convencional: Flexy Super Elastic 0,018”x 0,025” NiTi - Estético: Esthetic Flexy Super Elastic 0,018”x 0,025” Vestibular TN Trianeiro, Rio Claro, SP, Brazil Convencional: NiTi wire 0,016”x 0,022” NiTi - Estético: Coated wire NiTi 0,018”x 0,024” Todas as faces 3.2.2 FASE CLÍNICA
Baseado nos resultados de estudo piloto e na realização de cálculo amostral para cada ensaio, a amostra foi constituída por doze indivíduos, com média de idade de 24 anos, boa higiene bucal, sem lesões de cárie e sem alterações sistêmicas. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de Saúde Coletiva da Universidade Federal do Rio de Janeiro (processo #0034.0.239.000-11) (Anexo 1). Todos os indivíduos que concordaram com a participação na pesquisa assinaram termo de consentimento livre e esclarecido.
Dois bráquetes metálicos (Morelli, Sorocaba, SP, Brasil) foram colados em cada hemiarco de tal maneira que os fios ficassem passivos com uma distância de pelo menos 20 mm entre a extremidade distal do bráquete colado mais distal e a extremidade mesial do bráquete colado mais mesial. Dessa forma, os fios apresentavam pelo menos 20 mm de comprimento, totalizando uma amostra de 96 segmentos de fios (48 fios estéticos e 48 fios controles). O fio estético foi amarrado no slot do bráquete com fio de amarrilho metálico 0.010” (Morelli, Sorocaba, SP, Brasil) e o fio controle do mesmo grupo foi amarrado justaposto às aletas superiores do bráquete (Figura 4). O design Split
Mouth foi utilizado e os grupos foram alocados em cada hemiarco
aleatoriamente através da utilização de tabelas numéricas aleatórias. O criador e o executor da randomização foram pessoas diferentes.
Figura 2 Fotografias ilustrativas da disposição e amarração dos segmentos de fios no meio bucal: A) vista frontal; B) vista lateral aproximada; C - segmento de fio controle, grupo TP; E - segmento de fio estético, grupo TP
Os participantes receberam instruções quanto à higiene bucal e foram orientados a utilizar, durante todo o estudo, somente a escova de dentes, o creme dental e o fio dental fornecidos. Além disso, os mesmos não utilizaram qualquer tipo de enxaguatório bucal durante o estudo. A cada 7 dias, os indivíduos foram submetidos ao exame clínico, sendo realizadas fotografias
intrabucais e instrução de higiene bucal. Somente os indivíduos que mantiveram os dispositivos íntegros (sem descolagem de bráquetes e/ou perda de amarrilho) em todos os quadrantes compuseram a amostra.
Em todos os participantes, os segmentos de fios foram posicionados e removidos pelo mesmo operador (DLS). Os indivíduos não sabiam qual grupo estava localizado em cada quadrante do meio bucal. Como a cor dos fios estéticos entre os grupos era suavemente diferente, não foi possível “cegar” o operador quanto ao grupo utilizado em cada quadrante.
Após 21 dias de exposição ao meio bucal, os segmentos de fios de cada hemiarco foram removidos, acondicionados individualmente em tubos eppendorf e lavados com detergente multiuso (Amway, Ada, Mich) (IZQUIERDO et al., 2010), na proporção 10:1 (dez partes de água destilada para uma parte de detergente) por 30 minutos em cuba ultrassônica (Cristófoli LTDA; Campo Mourão, PR, Brasil). O mesmo procedimento foi realizado nas amostras como recebidas do fabricante de todos os grupos. A escolha por esse método de lavagem só foi realizada após estudo piloto, onde não foram observadas, através de micrografias eletrônica de varredura, alterações na superfície dos fios. Após este procedimento, as amostras foram submetidas às análises de microscopia eletrônica de varredura, citotoxicidade e liberação de metais/corrosão.
3.2.3 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
O registro inicial da topografia de superfície de seis espécimes por grupo (três segmentos de fios estéticos e três segmentos de fios controle) foi avaliado por análise em microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os espécimes
foram montados em stubs de alumínio, por pulverização catódica, sendo os fios estéticos revestidos com ouro e examinados em microscópio eletrônico de varredura (JEOL-JSM, 6460LV, Tóquio, Japão). Para a realização da análise, foi utilizada a tensão de 20 kV e ampliação de 90x, 200x e 500x. A análise da superfície dos fios foi feita de forma qualitativa e descritiva. Procurou-se observar a presença de corrosão, desgastes e alterações na morfologia superficial dos fios estéticos e dos fios controle.
Após a exposição ao meio bucal, um segmento de fio de 4 mm de comprimento do espaço interbráquete, foi selecionado por amostra. Desta forma, doze espécimes por grupo (seis segmentos de fios estéticos e seis segmentos de fios controle) foram analisados em microscopia eletrônica de varredura, sob condições de análise similares ao registro inicial.
3.2.4 AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE 3.2.4.1 Cultura de células
A linhagem celular utilizada foi L929, por conta da excelente reprodutibilidade essas células foram consideradas preferíveis (Schedle et al., 1998; Schmid-Schwap et al., 2009), obtida do American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD - fibroblasto de camundongo), cultivada em meio mínimo essencial de Eagle (MEM) (Cultilab, Campinas, São Paulo, Brasil), suplementado com 2 mM de L-glutamina (Sigma, St. Louis, Missouri, USA), 50 g/ml de gentamicina (Schering Plough, Kenilworth, New Jersey, USA), 2,5 g/ml de fungizona (Bristol-Myers-Squibb, New York, USA), 0,25ml solução de bicarbonato de sódio (Merck, Darmstadt, Germany), 10 mM of HEPES (Sigma, St. Louis, Missouri, USA) e 10% de soro fetal bovino (SFB) (Cultilab, Campinas,
São Paulo, Brasil) e mantida a 37oC em ambiente contendo 5% de CO2.
3.2.4.2 Ensaio de citotoxicidade
Os segmentos de fios foram previamente esterilizados por exposição à luz UV (Labconco, Kansas, Missouri, USA) durante 1 hora. Todas as manipulações dos corpos de prova foram realizadas pelo mesmo operador (DLS) e dentro de capela microbiológica de fluxo laminar projetada para criar áreas de trabalho estéreis para a manipulação com segurança de materiais biológicos ou estéreis. Em seguida, os corpos de prova pertencentes a cada grupo foram colocados em placas de 24 poços, contendo 1 ml de MEM em cada poço.
A cada 24 horas, o meio de cultura foi substituído por novo e as alíquotas dos sobrenadantes de cada grupo recolhidas após 0, 24, 48, 72 horas e 7, 14, 21 e 60 dias. Essas alíquotas foram colocadas, em triplicata em placa de 96 poços contendo monocamada confluente de células L929 e incubadas por 24 horas a 37oC em ambiente contendo 5% de CO2. Para
verificar a resposta celular frente aos extremos foram inseridos dois grupos controles: Grupo CC (controle celular, no qual as células foram expostas ao meio de cultura sem adição de outro material) e Grupo C+ (controle positivo, constituído por células expostas ao detergente citotóxico Tween 80 (Polioxietileno-20-Sorbitan à 10% em meio de cultura).
O confluente de células L929 foi obtido pelo processo de tripsinização, ocorrendo a dispersão da monocamada celular previamente cultivada em garrafas. A passagem de células de um frasco para o outro implicou em subdivisão da população celular proliferativa, capaz de perpetuar as
características da mesma linhagem celular.
3.2.4.3 Análise da morfologia celular
Após o período de incubação, as células contidas na placa foram analisadas em microscopia de luz (microscópio Nikon Eclipse E600, aumento de 4x e 10x). Os resultados foram anotados em fichas específicas caracterizando a morfologia das células da cultura.
Na análise celular qualitativa, o Grupo CC (demonstrou maior número de células fusiformes, típicas do desenvolvimento normal de fibroblastos (Figura 3 A). Por outro lado, o Grupo C+ demonstrou inibição severa da proliferação e crescimento celular, com alterações significativas indicadas pelo maior número de células redondas, granulares, sugerindo lise e apoptose celular (Figura 3 B).
Figura 3 Fotomicrografias da morfologia celular, antes e após a incorporação do vermelho neutro. Antes: A) Grupo CC e B) Grupo C+. Depois: C) Grupo CC e D) Grupo C+. A B C D 100 nm 100 nm 100 nm 100 nm
3.2.4.4 Análise da viabilidade celular
A viabilidade celular foi determinada através da técnica dye-uptake, descrita por Borenfreund e Puerner (1985) com pequenas modificações. Após 24 horas de incubação das células, foram adicionados 100 μl de vermelho neutro a 0,01% (Sigma, St. Louis, Missouri, USA), em meio de cultura, em cada poço das microplacas e estas foram incubadas a 37oC por 3 horas, para
penetração do corante nas células vivas. Passado esse período, após desprezar o corante, foram adicionados 200 μl de solução de PBS para lavagem dos poços e remoção do excesso do corante das paredes dos poços. Logo após desprezar o PBS, foram adicionados 100 μl de solução de formaldeído (Reagen) a 4% em PBS (NaCl 130 mM; KCl 2 mM; Na2HPO4 2H2O
6 mM; K2HPO4 1mM, pH 7,2) por 5 minutos para promover a fixação das
células às placas. Em seguida, para interromper as reações químicas e realizar a extração do corante, foram adicionados 100 μl de solução de ácido acético a 1% (Vetec, Rio de Janeiro, Brasil) com metanol a 50% (Reagen, Rio de Janeiro, Brasil). Após 20 minutos, a leitura da densidade ótica (absorção do vermelho neutro) foi realizada em espectrofotômetro (BioTek, Winooski, Vermont, USA), com comprimento de onda de 492 nm (λ= 492 nm).
Os valores obtidos foram comparados à análise da morfologia celular para a comprovação de que a incorporação do vermelho neutro não interferiu na quantidade de células viáveis. Considerando-se que a densidade óptica do controle celular equivaleria a 100%, a viabilidade foi determinada para cada grupo em cada tempo através da seguinte fórmula:
A B
Viabilidade celular (%) = Densidade óptica do grupo testado Densidade óptica do grupo controle celular
3.2.4.5 Análise estatística
Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística no Programa
Statistical Package for the Social Science (versão 16, SPSS Inc. Chicago,
Illinois, USA). A verificação da normalidade e da homogeneidade da amostra foi realizada por meio do teste de Kolmogorov-Smirnov, ao nível de significância de 0,05. Os valores de viabilidade celular de cada grupo foram submetidos ao teste One-way ANOVA e pelo teste de comparações múltiplas de Tukey para identificar diferenças intergrupos ao nível de significância de 5%.
3.2.5 AVALIAÇÃO DA LIBERAÇÃO DE METAIS
Foram avaliados dez segmentos de fios de cada grupo de 10 mm de comprimento (cinco segmentos de fios estéticos e cinco segmentos dos seus respectivos fios metálicos convencionais). Os corpos de prova foram imersos em tubos de ensaio com 2ml de solução salina estéril (NaCl 0,9%, Departamento de Bioquímica da UFRJ) e 20 µl de ácido nítrico e submetidos a
um processo de “envelhecimento químico-mecânico. Os fios permaneceram sob agitação por 8 horas diárias, com temperatura constante de 37°C ± 1° (Banho Dubnoff, Nova Técnica r), por um período de até 28 dias. A cada 7 dias ± 1 hora, os espécimes foram removidos e transferidos para outro recipiente com solução nova (GRIMSDOTTIR et al.,1992; BARRETT et al., 1993). As
soluções remanescentes em cada recipiente, ao final de cada período experimental (7, 14, 21 e 28 dias), foram identificadas e armazenadas em tubos Falcon estéreis. Estes tubos foram mantidos em refrigerador até ser realizada a análise, para prevenir a proliferação de microrganismos.
Para a determinação das concentrações de cobalto, cromo, ferro, manganês, níquel e titânio, utilizou-se um espectrômetro de emissão óptica com fonte de plasma indutivamente acoplado (ICP OES) (Thermo Scientific, modelo iCAP 6300, Cambridge, Inglaterra), com configuração de visão dupla (axial e radial), equipado com câmara de nebulização ciclônica, nebulizador do tipo MiraMist (Mira Mist CE, Burgener Research Inc., Ontario, Canadá), detector do tipo dispositivo de carga acoplado (CCD) e software operacional iTEVA 2.0 para aquisição de dados.
As determinações dos íons metálicos foram realizadas na vista axial, utilizando curvas analíticas com sete soluções-padrão para a calibração e a quantificação foi realizada por interpolação. As soluções para a calibração do instrumento foram geradas a partir de diluição de soluções-padrão estoque mono elementares SpecSol de concentração igual a 1.000 mg L-1 (Quimlab Química & Metrologia®, Jardim Califórnia, Jacareí, São Paulo, Brasil), até
obtenção das concentrações desejadas utilizando água ultrapura obtida de um sistema Milli-Q® (Merck Millipore, modelo Direct 8, Billerica, Massahusetts, EUA). As condições operacionais do instrumento são apresentadas na Tabela 3.
Tabela 3 Condições operacionais para o ICP OES utilizadas na determinação de cobalto, cromo, ferro, manganês, níquel e titânio nas amostras.
Parâmetro Valor
Potência incidente (W) 1350
Vazão de gás do plasma (L min-1) 15
Vazão de gás auxiliar (L min-1) 1,5
Pressão do nebulizador (bar) 0,19
Velocidade de rotação da bomba peristáltica durante
a aquisição de dados (rpm) 50
Tempo de integração (s) 1
Número de replicatas de leitura 3
Comprimento de onda (nm) Cobre: λ = 238,892 Cromo: λ = 283,563 Ferro: λ = 259,940 Manganês: λ = 257,610 Níquel: λ = 221,647 Titânio: λ =334,941 3.2.5.1 Análise estatística
Os dados foram submetidos à análise estatística no Programa Statistical
Package for the Social Science (versão 16, SPSS Inc. Chicago, Illinois, USA). A
verificação da normalidade e da homogeneidade da amostra foi realizada por meio do teste de Kolmogorov-Smirnov. As diferenças na quantidade de íons metálicos liberados entre cada fio estético e seu fio convencional controle e entre cada fio e o controle negativo do meio foram testadas pelo teste Mann-Whitney. As diferenças entre os tempos para cada grupo foram testadas com o teste de Wilcoxon. O nível de significância estatística foi de 5%.
4 DESENVOLVIMENTO DA PESQUISA
4.1 ARTIGO 1
SILVA, D. L.; SANTOS, E. J.; CAMARGO, S. S. J.; RUELLAS, A. C. O. Infrared spectroscopy, nano-mechanical properties, and scratch resistance of esthetic orthodontic coated archwires. Angle Orthod. 2015; 85: 777-783.
4.2 ARTIGO 2
SILVA, D. L.; MATTOS, C. T.; ROMANOS, M. T. V.; RUELLAS, A. C. O. Cytotoxicity of esthetic orthodontic coated archwires. Artigo submetido para publicação no American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics.
4.3 ARTIGO 3
SILVA, D. L.; MATTOS, C. T.; FREIRE, A. S.; RUELLAS, A. C. O. Release of metals ions from retrieved esthetic coated and conventional orthodontic archwires. Artigo submetido para publicação no American Journal of
4.2 ARTIGO 2
Cytotoxicity of esthetic orthodontic coated archwires Dayanne Lopes da Silva; Claudia Trindade Mattos; Maria Teresa Villela Romanos;
Antônio Carlos de Oliveira Ruellas
ABSTRACT
Objective: to evaluate the cytotoxicity of four brands of esthetic coated archwires as
received and after 21 days of oral exposure compared to those of conventional stainless steel and nickel titanium (NiTi) ones. Materials and Methods: The cytotoxicity assay was performed incubating each type of wire in Eagle’s essential medium (MEM), removing the supernatant after 0 hour, 1, 2, 3, 7, 14, 21, 28 and 60 days and adding it to cultures of L929 mouse fibroblasts. In each time of incubating the cell viability was determined with neutral red (dye-uptake method). The labial surface of wires was observed with a scanning electron microscope. Data were analyzed by One-way ANOVA with a Tukey’s post-hoc test. Results: At T0, T2, T21 e T60 no statistically significant difference was seen in cell viability of esthetic wires and their respect control wires, as received and after clinical use. At T1, T3 and T28 the post clinical esthetic wires of TP group showed significant lower cell viability than their control wire. TN post clinical wires were the most cytotoxicity at T28. The esthetic coatings presented an irregular surface aspect and peeled off in many areas after oral exposure. Conclusion: all wires seem to present a good biocompatibility for clinical use. However, the applying coating technique, the coating material and the oral environment seem to influence the biocompatibility of esthetic coated wires.
INTRODUCTION
Appearance is one of patients’ main concerns during orthodontic treatment, and the development of materials that present acceptable esthetics for the patients and biocompatibility and adequate clinical performance for clinicians is needed. 1 By the introduction of esthetic brackets made of ceramic or composite, this problem was partially solved. However, esthetic archwires are highly desirable to complement esthetic brackets.
Metallic archwires coated with inorganic or polymeric materials are indeed the existing solution to such esthetic problem.2 Coating materials used are probably plastic resin materials such as synthetic fluorine-containing resin
or epoxy resin composed mainly of polytetrafluoroethylene (PTFE) to simulate tooth color.3 The coating is applied by a deposition process using compressed air as a transport medium for the atomized Teflon that plates the base wire. This process includes some surface pre-treatment of wire, in order to obtain a strong adhesion between the coating and the substrate. 4
The coating layer of esthetic archwires tends to peel off in many areas during oral exposure leaving surface defects. Peeled areas on these wires that exposed the metallic surface underneath presented a higher surface roughness, may be to a surface treatment for improve the mechanical adhesion between coating and metallic substrate.5,6 This clearly affects the esthetic value of these coated wires and could influence their biocompatibility. The surface quality of archwires affects the area of surface contact and influences the esthetic result, the corrosion behavior and the biocompatibility.
However, despite these problems, these wires continue to be marketed and used in clinical practice and little information is available in the orthodontic literature evaluating their cytotoxicity as received and after oral exposure. Therefore, the aim of this research was to investigate the cytotoxicity of esthetic coated archwires as received and after 21 days of oral exposure compared to conventional stainless steel (SS) and nickel titanium (NiTi) ones.
MATERIALS AND METHODS
Sample Preparation
Four brands of coated archwires and their respective control
counterparts (conventional stainless steel and NiTi archwires) were evaluated
recent manufacturing dates, were from the same production lot and came in sealed plastic packages.
The retrieved wire segments were obtained from twelve subjects. Ethical approval was obtained for this investigation from Ethics in Research Committee of the Institute of Public Health Studies from the Federal University of Rio de Janeiro (process #0034.0.239.000-11). An informed consent form was signed by all volunteers. These subjects met the following criteria: good oral hygiene, no caries and no systemic changes.
Two metal edgewise standard brackets (Morelli, Sorocaba, SP, Brazil) were bonded to two teeth on each hemiarch of volunteers in a way that an archwire of at least 20 mm in length could be inserted in the slot passively. The coated wire segment was tied into the slot and its control wire segment was tied juxtaposed to the upper base of the brackets’ wings by using stainless steel 0.010-in ligatures (Morelli, Sorocaba, SP, Brazil) and ligature pliers. A split mouth design was used to allocate all groups. The groups were allocated randomly to each hemiarch using random number tables. The generator and executor of the randomization were separate individuals. Oral hygiene instruction was given and the patients used the same type of toothbrush, toothpaste and dental floss throughout the study. The subjects were told not to use any other oral agents, including oral irrigators or antimicrobial mouthrinses.
In every participant, the specimens were placed and removed by the same operator (DLS). The subjects were not aware of which group was placed on each quadrant in the mouth. As the color of coated wire differed slightly from
brand to brand, it was no possible to blind the operator to the type of coated wire used on each quadrant in the mouth.
After twenty-one days, the wire segments were removed and individually placed in an ultrasound cleaner (Cristófoli LTDA; Campo Mourão, PR, Brazil) immersed in a multiuse detergent (Amway, Ada, Mich) for 30 minutes, so that organic debris could be removed. The same procedure was done to as received specimens. The as received and post clinical exposure wires were then sterilized by exposure to ultraviolet light (Labconco, Kansas,MO, USA) for 30 minutes.7,8 All specimens were prepared by the same operator and handled under aseptic conditions to limit the influence of biologic contamination on the cell culture tests. After in vivo clinical exposure, all samples were subjected to surface characterization and to cytotoxicity test.
Surface Characterization
A scanning electron microscope (SEM) (Jeol JSM 6460 LV, Japan) was used to assess the micromorphological characteristics of the labial surfaces of as received and post-clinical samples. The images were recorded at 90x, 200x and 500x magnification.
Cell Culture
The cell line used for this study was mouse L929 fibroblasts obtained from American Type Culture Collection (TCC, Rockville, MD) and cultivated in Eagle’s minimum essential medium (MEM) (Cultilab, Campinas, São Paulo, Brazil). The cell culture was supplemented with 2 mM of L-glutamine (Sigma, St. Louis, Missouri, USA), 50 μg.ml–1 of gentamicin (Schering Plough, Kenilworth, New Jersey, USA), 2.5 μg.ml–1 of fungizone (Bristol-Myers-Squib,
New York, USA), 0.25 mM of sodium bicarbonate solution (Merck, Darmstadt, Germany), 10 mM of HEPES (Sigma, St. Louis, Missouri, USA), and 10% of foetal bovine serum (FBS) (Cultilab, Campinas, São Paulo, Brazil), were distributed into 96-well microplates and incubated for 48 hours at 37 °C in a 5% CO2 atmosphere. This ensured that the cells adhered to microplates. After 48
hours, the growth medium was replaced with 100 µl of MEM in which the segments wires had been incubated for 0 hour, 1, 2, 3, 7, 14, 21, 28 and 60 days.
To verify the cell response in extreme situations, three additional groups were included in the study: Group CC (cell control), consisting of L-929 cells not exposed to supernatants from the wires; Group C+ (positive control), consisting of Tween 80 (Polyoxyethylene-20-sorbitan, Sigma, St. Louis, MO, USA); Group C- (negative control), consisting of phosphate-buffered saline (PBS) solution. The positive and negative controls were incubated in MEM maintenance medium for 0 hour, 1, 2, 3, 7, 14, 21, 28 and 60 days and the extracted elutes were added to L-929 line cells incubated in the growth medium.
Cell Morphology Evaluation
After the incubation period, morphologic alteration of L929 cells was observed directly using an inverted microscope (E600 Nikon Eclipse, Japan). The results were noted in specific chips characterizing the morphology of the cells in culture.
Cytotoxity assay
Twelve samples of each group (n = 48) were placed in 24-wells plates containing Eagles’ MEM (Cultilab, Campinas, São Paulo, Brazil). The culture medium was replaced with fresh medium every 24 hours to simulate the dilution
by saliva and fluids in oral environment of potentially toxic substances released. The supernatants were collected in triplicate after 0 hour, 1, 2, 3, 7, 14, 21, 28 and 60 days for toxicity analysis to L929 cells. The supernatants were placed in a 96-well plate containing a single layer of L929 cells and then incubated at 37 °C for 24 hours in a 5% CO2 environment. After the incubation period, morphologic alteration of L929 cells was observed directly using an inverted microscope (E600 Nikon Eclipse, Japan). The results were noted in specific chips characterizing the morphology of the cells in culture.
Cell viability was determined using the “dye-uptake” technique described by Neyndorff et al. 9, which was slightly modified. After the 24-hour incubation period, 100 μl of 0.01% neutral-red staining solution (Sigma, St. Louis, Missouri, USA) was added to the medium in each well of the plates, and these were incubated for 3 hours at 37 °C to allow the dye to penetrate the living cells. After this period, the cells were fixed using 100 μl of 4% formaldehyde solution (Reagen, Rio de Janeiro, Brazil)) in PBS (130 mM NaCl; 2 mM KCl; 6 mM Na2HPO4 2H2O; 1 mM K2HPO4, pH = 7.2) for 5 minutes. Next, 100 μl of 1% acetic acid solution (Vetec, Rio de Janeiro, Brazil) with 50% methanol (Reagen, Rio de Janeiro, Brazil) was added to the medium to remove the dye. Absorption was measured after 20 minutes by using a spectrophotometer (BioTek, Winooski, Vermont, USA) at a wave length of 492 nm. The values obtained were compared to the analysis of cell morphology.
Statistical Analyses
A standard software package (SPSS version 17.0, Chicago, Illinois, USA) was used for data analysis. The Kolmogorov-Smirnov was applied to
verify the normality in the results and means and Standard deviations were calculated for descriptive statistical analysis. The values for the amount of viable cells for each group were submitted to a One-way ANOVA with a Tukey’s post-hoc test to identify intergroup differences. The level of statistical significance was at 5%.
RESULTS
The cell viability at different time periods (T: 0 hour, 1, 2, 3, 7, 14, 21, 28 and 60 days) of as received and post clinical wires evaluated are shown in Tables II-IV. Viability was established by comparison with the viability of control cells, which was arbitrarily set at 100%. In cellular analysis, the Group CC showed great number of fusiform cells typical of normal development of fibroblasts. On the other hand, the Group C+ showed severe inhibition of cell proliferation and growth, significant changes indicated by the greater number of round, granular cells, suggesting cell lysis and apoptosis.
At T0, T2, T21 e T60 no statistically significant difference was seen in cell viability of esthetic wires and their respect control wires, as received and before clinical use (Tables II-IV) At T1, T3 and T28 there is no statistically difference in cell viability of as received wires. However, in these times the post clinical esthetic wires of TP group showed significant lower cell viability than their control wire (Tables II-IV).
The TN esthetic wires showed a lower cell viability than control wires as received at T7 and T14 and after clinical use at T3, T7 and T28. Besides, these post clinical wires were the most cytotoxicity at T28 while OM and OO groups presented the higher cell viability (Table IV).
