Revista de Biologia e Ciências da Terra ISSN: 1519-5228
revbiocieter@yahoo.com.br Universidade Estadual da Paraíba Brasil
dos Santos Martins, Flaviano; Ferreira Barbosa, Flávio Henrique; Penna, Francisco José; Rosa, Carlos Augusto; Drummond Nardi, Regina Maria; Neves, Maria José; Nicoli, Jacques Robert Estudo do potencial probiótico de linhagens de saccharomyces cerevisiae através de testes in vitro
Revista de Biologia e Ciências da Terra, vol. 5, núm. 2, segundo semestre, 2005, p. 0 Universidade Estadual da Paraíba
Paraíba, Brasil
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REVISTA DE BIOLOGIA E CIÊNCIAS DA TERRA ISSN 1519-5228 Volume 5- Número 2 - 2º Semestre 2005
Estudo do potencial probiótico de linhagens de saccharomyces
cerevisiae através de testes in vitro
Flaviano dos Santos Martins1, Flávio Henrique Ferreira Barbosa2, Francisco José Penna3, Carlos Augusto Rosa4, Regina Maria Drummond Nardi5, Maria José Neves6, Jacques Robert Nicoli7
RESUMO
Probióticos são definidos como microrganismos viáveis que exibem um efeito benéfico na saúde do hospedeiro quando eles são ingeridos. Atualmente a única levedura utilizada em vários países como probiótico é a Saccharomyces boulardii. Neste trabalho, doze linhagens de Saccharomyces cerevisiae isoladas de diferentes fontes (insetos, frutos tropicais, queijo, estuário e alambique de cachaça) foram testadas in vitro para avaliar uma possível capacidade probiótica. Nossos testes mostraram que a maioria das leveduras foi capaz de resistir a quase todos os estresses que um microrganismo com esta finalidade deve suportar no trato digestivo e que leveduras com um mesmo perfil molecular geralmente possuem um comportamento semelhante. Não foi observado antagonismo in vitro dos patógenos pelas leveduras.
Palavras-chave: leveduras, Saccharomyces cerevisiae, probiótico, testes in vitro.
ABSTRACT
Probiotics are defined as viable microorganisms that exhibit a beneficial effect on the host health when ingested. Nowadays Saccharomyces boulardii is the only yeast used in many countries as probiotic. In this work 12 Saccharomyces cerevisiae strains isolated from different micro-habitats (insect association, tropical fruit, cheese, estuary and “aguardente” production) were tested in vitro for the evaluation of a possible probiotic property. Our results showed that the majority of the yeasts were able to resist to almost all stress that a probiotic must support in the digestive tract. The yeasts with the same molecular profile generally presented the same comportment. No antagonisms in vitro against pathogens were observed.
Keywords: yeasts, Saccharomyces cerevisiae, probiotic, in vitro assay.
1- INTRODUÇÃO
Probióticos são definidos como microrganismos vivos (bactérias ou leveduras) que, quando ingeridos, exercem um efeito benéfico no hospedeiro (FULLER, 1989), ou mais recentemente, “uma preparação ou produto contendo determinado(s) microrganismo(s) viável(eis), em quantidades suficientes, que alteram a microbiota em um determinado compartimento do hospedeiro exercendo, deste modo pelo menos um efeito benéfico” (SCHREZENMEIR & DE VRESE, 2001). Estes microrganismos são mundialmente utilizados como preparações farmacêuticas ou produtos fermentados. Em adição ao seu
valor nutritivo, as leveduras parecem modular beneficamente os distúrbios do ecossistema gastrointestinal.
Saccharomyces boulardii é uma levedura não patogênica que tem sido extremamente
usada tanto como agente terapêutico quanto preventivo no tratamento de uma variedade de diarréias. Ela foi isolada de um pequeno fruto tropical (lichia) no Vietnam e, hoje em dia, é a única levedura mundialmente utilizada como probiótico de uso humano. Ela possui um ótimo crescimento a 37ºC e é utilizada principalmente em diarréias associadas ao uso de antibiótico (MCFARLAND & BERNASCONI, 1993). Ela tem sido usada no tratamento de diferentes tipos de diarréia como: diarréia associada ao uso de antibióticos (MCFARLAND et al., 1995), diarréia associada ao Clostridium difficile (ELMER et al., 1999; MCFARLAND et al., 1994; SURAWICZ et al., 1989; SURAWICZ et al., 2000), diarréia do viajante (SCARPIGNATO & RAMPAL, 1995), diarréia em pacientes com HIV (BORN et al., 1993; SAINT-MARC et al., 1991), por diversos mecanismos de ação (BRANDÃO et al., 1998; BUTS et al., 1990; CASTAGLIUOLO et al., 1999; CZERUCKA et
al., 1989; CZERUCKA et al., 1994; CZERUCKA & RAMPAL, 1999; GEDEK, 1999; NEVES et al., 2002; RODRIGUES et al., 2000).
Nas últimas décadas, muita atenção tem sido dada à modulação da microbiota intestinal normal por adjuvantes microbianos vivos chamados de probióticos. A grande vantagem da terapia com os probióticos é a ausência de efeitos secundários, como a seleção de bactérias resistentes. Os efeitos benéficos destes microrganismos são basicamente os mesmos da microbiota normal do corpo humano. O que se faz neste caso é a utilização, em grande quantidade, daqueles que possuem eficácia comprovada, podendo ser constituintes normais da microbiota, como é o caso das bifidobactérias e dos lactobacilos, ou não, como a levedura S. boulardii. Além do mais, uma das principais preocupações da Organização Mundial da Saúde é a implementação de novas terapias que não atuem como uma forte pressão seletiva, propiciando a geração de patógenos cada vez mais agressivos e resistentes.
Todos os fatos acima citados, somados ao fato de existirem alguns trabalhos (CHIA et al., 1995; IZADNIA et al., 1998; KOVACS & BERK, 2000; SCHELLENBERG et al., 1994) mostrando a eficácia de leveduras de cervejaria e panificação, tanto em ensaios laboratoriais como em pacientes humanos, no combate às diarréias, nos fazem considerar que existe um grande espaço para um novo probiótico.
Neste trabalho, doze linhagens de Saccharomyces cerevisiae isoladas de diferentes fontes (insetos, frutos tropicais, queijo, estuário e alambique de cachaça) foram testadas
in vitro para avaliar uma possível capacidade probiótica.
2- MATERIAIS E MÉTODOS 2.1- Microrganismos
2.1.1- Linhagens bacterianas
As linhagens de Salmonella enterica serovar Typhimurium, Shigella flexneri e Escherichia
coli enteroinvasiva pertencem ao Laboratório de Ecologia e Fisiologia de Microrganismos
do Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG. As linhagens de Vibrio cholerae (ATCC 9458), Clostridium perfringens tipo A (ATCC 13124) e Clostridium difficile (ATCC 9689)
foram cedidas pelo Laboratório de Materiais de Referência, do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, RJ.
As linhagens bacterianas (S. Typhimurium, S. flexneri, E. coli patogênica e V. cholerae) foram conservadas em 0,2 ml de glicerina, esterilizada por calor seco, com 1ml da cultura de 18 horas crescida em caldo BHI (Brain Heart Infusion, DIFCO, Detroit, USA) a 37ºC. As bactérias C. difficile e C. perfringens foram crescidas durante 24-48 horas a 37ºC em caldo BHI-S (BHI suplementado com 0,5% de extrato de levedura, 0,1% de hemina e 0,1% de menadiona – HOLDMAN et al., 1977). Um ml desta cultura foi acrescido de 0,2 ml de glicerina estéril. Todas as amostras foram estocadas em tubos criogênicos de 2 ml a -86ºC.
2.1.2- Leveduras
As leveduras testadas foram gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Carlos Augusto Rosa e colaboradores, do Laboratório de Ecologia e Biotecnologia de Leveduras (Departamento de Microbiologia/ICB/UFMG) isoladas de diferentes fontes como Mata Atlântica (frutas e
Drosophila), queijo, alambiques de cachaça, estuários e quironomídeo. Todas
identificadas e classificadas como Saccharomyces cerevisiae (Quadro 1).
As linhagens foram mantidas em meio contendo 1% de extrato de levedura, 2% de peptona e 25% de glicerol e mantidas em freezer a -86°C em tubos criogênicos de 2 ml.
Quadro 1. Linhagens de Saccharomyces cerevisiae, isoladas de diferentes fontes, que foram utilizadas nos experimentos.
Linhagem de S. cerevisiae1 Microhabitat Referência
01 UFMG 20
02 UFMG 21
03 UFMG 22
Drosophila2
04 UFMG 23 Fruto tropical3
05 UFMG 24 Estuário4 MORAIS et al., 1992; RIBEIRO et al., 1999. 06 UFMG 829 07 UFMG 905 08 UFMG 2105 09 UFMG 2439 10 UFMG 2469
Alambique de cachaça5 PATARO, 2000.
11 UFMG B99.32.9 Queijo Canastra6 BORELLI, 2002.
12 UFMG CH4 Quironomídeo7
1
Todas as linhagens recebidas foram isoladas segundo métodos descritos por MORAIS et al. (1997) e PATARO et al. (2000), caracterizadas por métodos padrão (YARROW, 1998) e identificadas utilizando as
chaves de KURTZMAN & FELL (1998). 2Isoladas da Floresta Tropical e da Floresta da Tijuca, RJ. 3Isolada
de um pequeno fruto suculento coletado na Mata Atlântica, RJ. 4Isolada de estuário no Rio de Janeiro, RJ.
5
Isoladas de alambiques de cachaça do estado de Minas Gerais. 6Isolada de queijo minas curado produzido
na Serra da Canastra, MG. 7Larva de mosca.
2.2- Testes in vitro para seleção das leveduras 2.2.1- Simulação do ambiente gástrico
As células foram crescidas em caldo YPG (1% de extrato de levedura, 2% de peptona e 2% de glicose) a 30°C a 150 rpm. As células foram c oletadas na fase estacionária por
centrifugação (5 minutos a 3000 rpm), lavadas 2 vezes com salina tamponada estéril e incubadas no meio gástrico simulado a 37ºC a 150 rpm. Esta simulação foi feita utilizando pepsina (3g/l), NaCl (5g/l) e pH ajustado para 2,0 utilizando HCl 1M, conforme o método descrito por CHARTERIS et al. (1998). Foi mantido um controle em salina tamponada estéril nas mesmas condições (37ºC a 150 rpm). A simulação foi feita durante 60 minutos e, ao final uma alíquota foi retirada, diluída, plaqueada e incubada a 37ºC por 48-72 horas para contagem dos sobreviventes. Os resultados foram comparados com seus respectivos controles.
2.2.2- Resistência aos sais biliares
As células foram crescidas em agar Sabouraud Dextrose (DIFCO, Detroit, USA) a 30°C por 48 horas. Uma alíquota de cada amostra foi retirada, ressuspendida em salina tamponada estéril e replicada em placas de Petri contendo agar YPG suplementado com diferentes concentrações de sais biliares (0,01 mg/ml; 0,05 mg/ml; 0,10 mg/ml; 0,15 mg/ml; 0,20 mg/ml; 0,50 mg/ml; 1,00 mg/ml; 2,00 mg/ml; 5,00 mg/ml; 10,00 mg/ml) contendo 50% colato de sódio e 50% deoxicolato de sódio (SIGMA Chemical Co., St. Louis, USA) e incubadas a 30ºC e 37ºC durante 48-72 horas. Ao final, a resistência foi avaliada utilizando um fator que variava de 0 (ausência de crescimento) até 3 (crescimento intenso).
2.3- Curva de crescimento das leveduras
Para a curva de crescimento das leveduras, um pré-inóculo de cada linhagem foi crescido por 18 horas a 30ºC, 150 rpm, em meio YPG. A densidade ótica (D.O.) foi medida em espectrofotômetro e uma alíquota foi adicionada em 100 ml de meio YPG e a DO acertada para 0,15. A curva foi realizada em duas temperaturas (30ºC e 37ºC) a 150 rpm durante 48 horas e amostras foram retiradas em intervalos pré-determinados e diluições foram feitas, quando necessário, de modo que a leitura da D.O. flutuasse entre 0,2 e 0,8. 2.4- Amplificação aleatória de genomas polimórficos pela reação em cadeia da polimerase (RAPD-PCR)
Para obter a preparação de DNA, as leveduras foram crescidas em agar Sabouraud Dextrose (DIFCO, Detroit, USA) a 37ºC por 48-72 horas e estocadas a 4ºC overnight. As leveduras foram ressuspendidas em 100 µl de água MiliQ estéril (SIGMA Chemical Co., St. Louis, USA), congeladas em nitrogênio líquido e fervidas a 100ºC durante 10 minutos. As reações de PCR foram conduzidas em um termo-ciclador (PTC 100, MJ Research Inc., Watertown, USA). O primer EI1 usado continha seqüências complementares aos locais de splice do intron que tem como alvo regiões mutáveis do genoma de Saccharomyces. A seqüência de nucleotídeos usada foi 5'-CTGGCTTGGTGTATGT-3', onde os nucleotídeos sublinhados são conservados no local de splice do intron (BARROS LOPES et al., 1996). Cada PCR foi realizado em uma mistura de 30 µl contendo 1 µl de DNA, 3 µl de primer (10 µmol l-1) EI1, 3 µl do tampão de PCR 10X, 1,5 µl de dNTPs (2,5 mmol l-1 cada), e 0,6 µl de Taq DNA polimerase (5 U µl-1). As condições do PCR foram: 5 minutos a 95ºC, seguidos de 2 ciclos a 30ºC por 2 minutos, extensão por 30 segundos a 72ºC e desnaturação de 30 segundos a 95ºC. Após isso, 32 ciclos de anelamento durante 2 minutos a 40ºC, extensão por 30 segundos a 72ºC e desnaturação por 30 segundos a 95ºC. Após o último ciclo, houve um ciclo de anelamento por 2 minutos a 40ºC e um de extensão durante 5 minutos a 72ºC. Os produtos do PCR foram analisados em um gel de agarose a 1% em tampão TBE (Tris base 90 mmol l-1, ácido bórico 89 mmol l-1 e EDTA 2 mmol l-1) a 100 V por 1,5 hora. O gel foi corado com brometo de etídio e visualizado em
luz UV e escaneado (PATARO et al., 2000). A levedura S. cerevisiae S288c foi usada como padrão comparativo.
2.5- Teste de inibição in vitro
O teste in vitro para verificar a produção de substâncias inibitórias difusíveis foi realizado pelo método da dupla camada, adaptado a partir de NARDI et al. (1999) e SILVA et al. (2001). Um “spot” de 5 µl da cultura da levedura crescida em caldo YPG durante 24 horas, a 37ºC, foi colocado no centro da placa contendo agar Sabouraud Dextrose (DIFCO, Detroit, USA). Após incubação, a 37ºC, por 48 horas, em aerobiose, as placas foram colocadas em posição invertida e em cada tampa foi colocado 1 ml de clorofórmio. Depois de 30 minutos, as placas foram abertas para evaporação do clorofórmio residual e uma sobrecamada de 3,5 ml de agar BHI ou BHI-S (quando utilizada uma bactéria anaeróbica como reveladora) semi-sólido (0,7% de agar) acrescido de 10 µl de uma cultura da bactéria reveladora crescida por 18 a 24 horas a 37ºC em BHI ou BHI-S foi colocada sobre o agar. Após incubação a 37ºC por 24 horas, efetuou-se a leitura de possíveis halos de inibição. O critério de determinação dos resultados foi a presença ou ausência do halo de inibição, independente do seu tamanho. Todos os testes foram realizados em triplicatas.
3- RESULTADOS E DISCUSSÃO
A primeira barreira que um microrganismo deve atravessar após ser ingerido é o pH extremamente baixo do conteúdo intestinal. O efeito do suco gástrico simulado na viabilidade das leveduras está apresentado na Tabela 1. Todas as linhagens testadas apresentaram uma alta viabilidade (variando de 94 a 109%) quando comparadas com seus controles.
Tabela 1. Simulação gástrica realizada durante 1 hora, a 37ºC, em salina tamponada (controle) ou meio gástrico simulado (experimental).
Número de células viáveis (log10 UFC/ml) durante a simulação gástrica e de viabilidade (%)
Linhagem
Controle* Experimental % Viabilidade
UFMG 20 5,83 5,88 107 UFMG 21 5,66 6,15 108 UFMG 22 5,82 5,98 103 UFMG 23 5,34 5,90 109 UFMG 24 6,15 6,06 99 UFMG 829 6,00 6,03 105 UFMG 905 6,01 5,92 98 UFMG 2105 5,79 5,64 97 UFMG 2439 5,80 5,90 102 UFMG 2469 6,03 5,90 98 UFMG B99.32.9 5,96 5,94 98 UFMG CH4 5,88 5,57 94
As leveduras foram crescidas, a 30ºC, durante 24 horas, a 150 rpm. Cem µl foi transferido para 10 ml de
salina ou meio gástrico simulado, incubado a 37ºC, durante 1 hora, a 150 rpm. * Salina tamponada.
Aproximadamente 2,5 litros de suco gástrico é secretado diariamente, com um pH de aproximadamente 2,0 e uma concentração de sal em torno 0,5% p/v (HILL, 1990). Essa secreção apresenta uma barreira enzimática e de pH que é letal à maioria dos microrganismos ingeridos durante a digestão e, age em conjunto com o suco pancreático, a bile e o peristaltismo, de modo a garantir que o restante do intestino delgado seja maciçamente colonizado apenas em condições de estase.
A Tabela 2 mostra a resistência das leveduras a diversas concentrações de sais biliares. As linhagens UFMG 905 e UFMG 2105 foram as que suportaram as maiores concentrações de sais biliares, a 37ºC. No entanto, essa diferença foi muito pequena quando comparada com a maioria das outras leveduras. Curiosamente, as linhagens UFMG 20 e UFMG 22 também suportaram a toxicidade dos sais biliares, mas apenas a 30ºC. À temperatura de 37ºC, as duas linhagens não apresentaram nenhum crescimento, mostrando que, neste caso, pode ter sido a temperatura, e não a presença dos sais biliares que inibiu o crescimento das duas linhagens. Este dado foi confirmado após realização de curvas de crescimento a 30ºC e a 37ºC (dados não mostrados), onde foi demonstrado que essas duas linhagens apresentaram apenas um pequeno crescimento à 37ºC. Este dado foi confirmado pela incapacidade de sobreviver no trato digestivo de camundongos isentos de germes (MARTINS et al., 2005). Entretanto deve-se ressaltar que em temperaturas mais elevadas, como a temperatura corporal dos mamíferos, a fluidez das membranas aumenta permitindo a entrada de maiores concentrações de sais biliares, o que também poderia explicar o fato de não haver crescimento destas duas linhagens. O mais provável é que esses dois fatores em conjunto tenham contribuído para a ausência de crescimento das duas linhagens.
O mecanismo de tolerância aos sais biliares ainda não é bem entendido e é difícil definir uma concentração máxima a que um microrganismo deva suportar para ser considerado bile-resistente, uma vez que a concentração desta substância não é estática, ela varia em função do tempo e em diferentes partes do intestino (MARTEAU et al. 1997). Após uma refeição, a concentração de sais biliares aumenta rapidamente no duodeno, alcançando uma concentração de aproximadamente 15 mmol/L e vai diminuindo progressivamente até 5 mmol/L. No jejuno, a concentração de sais biliares é de aproximadamente 10 mmol/L e, no íleo, cai para 4 mmol/L devido à sua absorção ativa nesta porção intestinal (HEATON, 1985; NORTHFIELD & MCCOLL, 1973). SUNG et al. (1993) argumentam que os sais biliares formam micelas com os fosfolipídios e, deste modo, possuem uma menor atividade antibacteriana que as soluções artificiais de sais biliares puras. Deste modo, torna-se perigoso tentar extrapolar os resultados encontrados in vitro para in vivo, pois os estresses sucessivos (suco gástrico, pH, sais biliares, temperatura, suco pancreático) agem em conjunto para exercer um efeito antimicrobiano mais potente que apenas um destes parâmetros analisados individualmente em experimentos in vitro.
Após a realização de um RAPD-PCR de todas as linhagens (Figura 1), foi observado que as linhagens UFMG 20 e UFMG 22 apresentaram um perfil semelhante e, curiosamente, essas duas leveduras têm um comportamento muito parecido nos experimentos in vitro, além de suas incapacidades de crescerem a 37ºC (apesar de resistirem a esta temperatura) e de colonizarem animais isentos de germes (MARTINS et al., 2005). As linhagens UFMG 21 e UFMG 23 também apresentaram um perfil muito parecido assim como as linhagens UFMG 829, UFMG 905, UFMG 2105, UFMG 2439 e UFMG 2469 entre si, que foram isoladas da mesma fonte. As linhagens UFMG B.99.32.9 e UFMG CH4 também apresentaram um perfil muito semelhante entre si e com as linhagens isoladas de alambique de cachaça, apesar de terem sido isoladas de fontes completamente diferentes. Apesar das linhagens UFMG 20, UFMG 21, UFMG 22 e UFMG 23 terem sido classificadas, por métodos convencionais, como S. cerevisiae, o RAPD-PCR mostrou que estas quatro linhagens apresentam um perfil diferente da S. cerevisiae S288c, que foi usada como padrão comparativo. A linhagem UFMG 24 também apresentou um perfil de bandas distinto.
T a b e la 2 . R e s is tê n c ia d a s l in h a g e n s d e l e v e d u ra s u ti liz a d a s n e s te e x p e ri m e n to à s d iv e rs a s c o n c e n tr a ç õ e s d e s a is b ili a re s . C o n c e n tr a ç ã o d e s a is b il ia re s ( e m m g /m l) 3 0 ºC 3 7 ºC L in h a g e m : 0 ,0 1 0 ,0 5 0 ,1 0 0 ,1 5 0 ,2 0 0 ,5 0 1 ,0 0 2 ,0 0 5 ,0 0 1 0 ,0 0 ,0 1 0 ,0 5 0 ,1 0 0 ,1 5 0 ,2 0 0 ,5 0 1 ,0 0 2 ,0 0 5 ,0 0 1 0 ,0 U F M G 2 0 3 3 3 3 2 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 U F M G 2 1 3 3 3 3 3 3 2 1 2 1 3 3 3 3 3 3 2 0 0 0 U F M G 2 2 2 2 2 2 2 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 U F M G 2 3 3 3 3 3 3 3 2 1 2 1 3 3 3 3 2 2 2 0 0 0 U F M G 2 4 3 3 3 3 3 3 0 0 0 0 3 3 3 3 3 3 0 0 0 0 U F M G 8 2 9 3 3 3 3 3 3 2 0 0 0 3 3 3 3 3 3 3 0 0 0 U F M G 9 0 5 3 3 3 3 3 2 2 2 2 1 3 3 3 3 3 3 2 1 0 0 U F M G 2 1 0 5 3 3 3 3 3 2 1 0 0 0 3 3 3 3 3 3 3 1 0 0 U F M G 2 4 3 9 3 3 3 3 2 2 0 0 0 0 3 3 3 3 3 3 2 0 0 0 U F M G 2 4 6 9 3 3 3 3 3 3 2 0 0 0 3 3 3 3 3 3 3 0 0 0 U F M G B 9 9 .3 2 .9 3 3 3 3 3 1 0 0 0 0 2 2 2 2 2 2 0 0 0 0 U F M G C H 4 3 3 3 3 3 2 0 0 0 0 3 3 3 3 3 3 2 0 0 0 P a ra a v a lia r o c re s c im e n to , u ti liz o u -s e u m a e s c a la v is u a l q u e v a ri a v a d e 0 ( a u s ê n c ia d e c re s c im e n to ) a 3 ( c re s c im e n to i n te n s o ).
Figura 1. RAPD-PCR, utilizando o primer EI1, das 12 leveduras testadas. Da esquerda para a direita, as bandas mostram: (PM) padrão de peso molecular (1 Kb ladder), (1) S. cerevisiae S288c, (2) UFMG 20, (3) UFMG 21, (4) UFMG 22, (5) UFMG 23, (6) UFMG 24, (7) UFMG 829, (8) UFMG 905, (9) UFMG 2105, (10) UFMG 2439, (11) UFMG 2469, (12) UFMG B.99.32.9 e (13) UFMG CH4.
O resultado dos testes de inibição do crescimento in vitro de patógenos pelas leveduras mostrou que não houve produção de nenhuma substância que inibisse o crescimento dos patógenos S. Typhimurium, S. flexneri, E. coli enteroinvasiva, Vibrio cholerae, C. difficile e
C. perfringens. Ao contrário do que é observado para alguns gêneros bacterianos, como
os Lactobacillus spp. (NARDI et al.,1999), Peptostreptococcus spp. (NICOLI & RAIBAUD, 1990; RAMARE et al., 1993; SILVA et al., 2001) e alguns outros gêneros (SILVA et al., 2001), as leveduras utilizadas como probióticos não possuem como mecanismo de ação, a inibição do crescimento de patógenos. Entretanto BACH et al. (2003) observaram que a
S. boulardii foi capaz de inibir o crescimento de E. coli O157:H7 em um fluido ruminal in vitro. ZBINDEN et al. (1999), utilizando culturas de células HeLa, observaram que S. boulardii foi capaz de reduzir consideravelmente o crescimento de S. typhimurium e de
inibir completamente a multiplicação de Yersinia enterocolitica. TASTEYRE et al. (2002), utilizando células VERO, também observaram inibição da aderência de C. difficile pela S.
boulardii.
Os principais mecanismos propostos para a ação da S. boulardii, a principal levedura utilizada como probiótico atualmente, são a imunomodulação (BUTS et al., 1990; CAETANO et al., 1986; QAMAR et al., 2001; RODRIGUES et al., 2000) e inibição da ação de toxinas (BRANDÃO et al., 1998; CASTAGLIUOLO et al., 1996; CASTAGLIUOLO et al., 1999; NEVES et al., 2002; POTHOULAKIS et al., 1993).
4- CONCLUSÕES
Dez das 12 linhagens testadas apresentaram uma alta viabilidade frente aos estresses in
vitro. Estes resultados serviram de base para a escolha de uma levedura para testes in vivo (MARTINS et al., 2005), onde foram observados capacidade de colonização de
animais e de proteção contra desafios com bactérias patogênicas. Atualmente estudos PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
vêm sendo realizados para desvendar os mecanismos de ação da levedura selecionada. Devido à escassez de trabalhos nacionais mostrando a utilização e a eficácia de probióticos, nosso grupo de pesquisa vem investindo há vários anos nesta linha de estudo, procurando estudar os componentes da microbiota com potencial probiótico e a utilização de microrganismos ambientais para a mesma finalidade.
4- BIBLIOGRAFIA
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________________________________________________________________________ [1] MSc, Doutorando, Departamento de Pediatria, Faculdade de Medicina, Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biológicas, UFMG, CDTN/CNEN. E-mail: flavianosmartins@yahoo.fr.
[2] Mestrando, Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biológicas, UFMG. [3] Doutor, Professor Titular, Departamento de Pediatria, Faculdade de Medicina, UFMG. [4] Doutor, Professor Adjunto, Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biológicas, UFMG.
[5] Doutor, Professor Adjunto, Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biológicas, UFMG.
[6] Doutor, Pesquisador Titular, Laboratório de Radiobiologia, Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear/Comissão Nacional de Energia Nuclear (CDTN/CNEN).
[7] Doutor, Professor Titular, Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biológicas, UFMG.
