Carbamato de etilo em vinhos portugueses

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(1)UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE FARMÁCIA. Carbamato de Etilo em Vinhos Portugueses. Alberto Alexandre Ferreira de Castro Serra Mosqueira. Mestrado em Controlo da Qualidade e Toxicologia dos Alimentos. 2007.

(2) UNIVERSIDADE DE LISBOA FACULDADE DE FARMÁCIA. Carbamato de Etilo em Vinhos Portugueses. Alberto Alexandre Ferreira de Castro Serra Mosqueira. Dissertação orientada pela Profa. Doutora Maria do Rosário Bronze e co-orientada pelo Prof. Doutor Luís Vilas Boas. Mestrado em Controlo da Qualidade e Toxicologia dos Alimentos. 2007.

(3) Resumo Pretendeu-se com este trabalho efectuar o estudo da ocorrência do carbamato de etilo (CE) em vinhos portugueses, utilizando diferentes métodos de pré-tratamento de amostras e de ensaio. Desta forma foram utilizados 3 métodos de pré-tratamento de amostras, nomeadamente a extracção em fase sólida (SPE) (técnica utilizada no Método Oficial para a análise do composto), a microextracção em fase sólida (SPME) e o método QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe), associados à análise por cromatogafia gasosa / espectroscopia de massa (GC/MS) (também utilizada no Método Oficial). Como método de análise alternativo foi utilizada a cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por fluorescência (HPLC-FLD). Neste caso o composto em análise foi previamente sujeito a uma reacção de derivatização com o xantidrol. No caso das determinações efectuadas por GC/MS com as 3 formas de pré-tratamento de amostras utilizadas, verificou-se a presença de fenómenos de interferência em relação a uma das massas necessárias para a identificação do composto. No caso da HPLC-FLD foram encontradas dificuldades do ponto de vista instrumental na implementação da técnica. Utilizando a GC/MS e o prétratamento por SPE e QuEChERS foi possível identificar presuntivamente a presença de CE em algumas amostras de vinho. Verificou-se que nestas amostras os teores estimados do composto foram inferiores aos limites legais ou voluntários presentemente em vigor em alguns países – Canadá e Estados Unidos da América, respectivamente. Como conclusão do trabalho são apresentadas para duas das amostras, com base nos respectivos dados de viticultura e vinificação, algumas das razões que poderão explicar os teores de CE encontrados, sendo também sugeridos algumas propostas de trabalhos futuros a efectuar para a análise deste composto.. Palavras-chave: carbamato de etilo, vinhos, portugueses, SPE, SPME, QuEChERS GC/MS, HPLC-FLD.. i.

(4) Abstract The purpose of this work was to study the occurrence of ethyl carbamate (CE) in Portuguese wines, using different sample preparation and analysis methods. In this way 3 sample preparation methods were used, namely solid phase extraction (SPE), (technique used in the Official Method for determining the substance), solid phase micro extraction (SPME) and the QuEChERS method (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe), combined with gas chromatography / mass spectrometry (also used in the Official Method). As an alternative method high efficiency liquid chromatography with fluorescence detection (HPLC-FLD) was used. In this case the substance was previously subjected to a derivatization reaction with xanthydrol. In the case of the determinations preformed by GC/MS with the 3 sample preparation methods used, interference phenomena related to one of the masses needed for the identification of the substance occurred. In the case of HPLC-FLD, instrumental difficulties concerning the implementation of the method occurred. It was possible to presumptively identify the substance in some wine samples using GC/MS and sample preparation by SPE and QuEChERS. In these samples the estimated amounts of substance detected were inferior to legal or voluntary limits presently in force in some countries, namely Canada and the United States of America. As a conclusion of this work, some explanations for the amounts of CE found on two of the samples are presented, based on the corresponding viticulture and vinification data, as well as some future work proposals for the analysis of this substance.. Keywords: ethyl carbamate, wines, Portuguese, SPE, SPME, QuEChERS GC/MS, HPLC-FLD.. ii.

(5) Agradecimentos Após a conclusão deste trabalho gostaria de transmitir os meus agradecimentos a todos aqueles que contribuíram para a sua realização, particularmente. Aos meus orientadores Profa. Doutora Maria do Rosário Bronze e Prof. Doutor Luís Vilas Boas por todo o trabalho de orientação, tempo dispendido e apoio prestado.. À Profa. Doutora Matilde Castro, coordenadora do mestrado por todo o empenho e apoio demonstrado para a realização deste curso.. A todos os colegas dos laboratórios do Instituto de Tecnologia Química e Biológica/ Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica.. Ao Director do Instituto Português de Acreditação, Eng. Leopoldo Cortez por me ter permitido a conciliação deste trabalho com as minhas restantes obrigações profissionais.. Finalmente quero deixar um agradecimento muito especial aos meus Pais por todo o apoio e compreensão incondicionais que sempre me transmitiram ao longo da minha vida.. iii.

(6) Índice Resumo. i. Abstract. ii. Índice. iv. Índice de Figuras. vi. Índice de Tabelas. vii. Índice de Equações. viii. Índice de Apêndices. ix. Símbolos e Abreviaturas. x. 1. Introdução. 1. 1.1 Carbamato de Etilo – Aspectos toxicológicos, metabolização e regulamentação em vinhos. 1. 1.2 Mecanismos de formação do CE em vinhos e metodologias para o seu controlo. 4. 1.3 Objectivos do trabalho. 10. 1.4 Análise do carbamato de etilo. 10. 1.4.1 Cromatografia gasosa / espectroscopia de massa. 12. 1.4.2 Cromatografia líquida de alta eficiência / detecção por fluorescência. 14. 2. Materiais e métodos. 16. 2.1 Padrões, solventes, eluentes, reagentes, gases e água. 16. 2.2 Materiais utilizados no pré-tratamento das amostras. 17. 2.3 Equipamento. 17. 2.3 Modo de preparação das soluções. 18. 2.3.1 Solução padrão de carbamato de etilo para GC/MS – 0,013 mol/L. 18. 2.3.2 Solução padrão de carbamato de etilo para HPLC-FLD – 0,012 mol/L. 18. 2.3.3 Solução saturada com cloreto de sódio ou com sulfato de sódio para SPME. 18. 2.3.4 Solução de acetonitrilo a 1 % (v/v) de ácido acético para utilização no método QueChERS. 18. 2.3.5 Solulução aquosa de ácido clorídrico (HCl) 1,5 mol/L. 18. 2.3.7 Solução aquosa de acetato de sódio 20 mM – eluente HPLC-FLD. 19. 2.3.8 Soluções aquosas de etanol a 20 % e a 24 % para diluição das amostras em HPLC-FLD. 19. 2.4 Pré-tratamento das amostras. 19. 2.4.1 SPME. 19. 2.4.2 SPE. 19. 2.4.3 QuEChERS. 20. 2.4.4 HPLC-FLD. 21. 2.6 Condições instrumentais. 21. 2.6.1 Condições em GC/MS. 21. 2.6.2 Condições em HPLC-FLD. 22. 2.7 Amostras analisadas. 23. 3.1 Análise por cromatografia gasosa / espectroscopia de massa. 24. 3.1.1 Cromatograma e espectro de massa do carbamato de etilo. 24. iv.

(7) 3.1.2 Escolha do tipo de coluna para a realização dos ensaios. 26. 3.1.2 Especificidade do método / presença de interferências. 28. 3.1.3 Método Oficial modificado. 32. 3.1.4 Resposta de padrões de CE a várias concentrações, estudo da linearidade e de limites de detecção e quantificação e escolha de padrão interno. 33. 3.1.5 Estudo do comportamento de padrões de CE com diferentes técnicas de pré-tratamento de amostras e estudo de alguns parâmetros para estas técnicas 37 3.2 Análise por cromatografia líquida de alta eficiência / detecção por fluorescência. 40. 3.3 Amostras em que foi detectado CE. 42. 4. Conclusões. 47. 5. Bibliografia. 49. 6. Apêndices. 62. v.

(8) Índice de Figuras Figura 1 – Mecanismo proposto para a metabolização do CE. 1. Figura 2 – Principais vias de formação do CE em vinhos. 4. Figura 3 – Cromatograma de padrão de CE a 1000 ppb. 24. Figura 4 – Espectro de massa do CE obtido pela análise de padrão a 1000 ppb. 24. Figura 5 – Reacção “McLafferty +1” para o carbamato de etilo. 25. Figura 6 – Cromatograma de padrão de CE a 1 ppm. 26. Figura 7 - Cromatograma de amostra B com pré-tratamento por SPME. 27. Figura 8 - Cromatograma de amostra A4 com pré-tratamento por SPE. 27. Figura 9 - Cromatogama de amostra A3 fortificada a 1 ppm com CE com pré-tratamento por SPME 28 Figura 10 – Cromatograma de amostra C com pré-tratamento por SPME. 29. Figura 11 – Cromatograma de amostra E com pré-tratamento por SPE. 29. Figura 12 – Cromatograma de amostra D com pré-tratamento por QuEChERS. 30. Figura 13 - Espectro de massa do composto não identificado. 30. Figura 14 – Representação da zona de interferência causada por pico de massa 74 em amostra B com pré-tratamento por SPME 30 Figura 15 - Representação da zona de interferência causada por pico de massa 74 em amostra E com pré-tratamento por SPE 31 Figura 16 – Representação da zona de interferência causada por pico de massa 74em amostra B com pré-tratamento por SPE e fortificação a 60 ppb de CE 32 Figura 17 - Comparação de cromatogramas da amostra E obtidos com o Método Oficial e com o Método Oficial modificado. 33. Figura 18 - Curva de calibração obtida com padrões de CE. 33. Figura 19 – Cromatograma de solução de 10 % de isoctano em diclorometano. 36. Figura 20 - Cromatograma de amostra D após pré-tratamento pelo método QuEChERS. 36. Figura 21 - Cromatograma de amostra B após pré-tratamento da amostra por SPE com adição de 10 % isoctano (v/v) 37 Figura 22 - Influência da saturação com sais nas áreas obtidas em duplicados de padrões aquosos de CE a 60 ppb 38 Figura 23 - Influência da utilização de diferentes tempos de pré-tratamento nas áreas obtidas em padrões de CE a 60ppb saturados com NaCl 38 Figura 24 – Comparação das respostas obtidas com padrões de CE a 1000 ppb por injecção directa e pelo método QuEChERS 39 Figura 25 - Comparação de cromatograma de ensaio em branco e padrão de CE a 100 ppb obtidos por HPLC-FLD 40 Figura 26- Curva de calibração padrões CE em determinações por HPLC-FLD. 40. Figura 27- Variação dos tempos de retenção do pico de CE nas determinações efectuadas por HPLCFLD 42 Figura 28 - Cromatograma de amostra B com pré-tratamento por SPE. 43. Figura 29 - Cromatograma de amostra C com pré-tratamento por SPE. 43. Figura 30 – Cromatograma de amostra D com pré-tratamento por QuEChERS. 44. Figura 31 – Cromatogramas das amostras B e C com sobrecarga com padrão de CE. 44. vi.

(9) Índice de Tabelas Tabela 1 - Limites legais em vigor no Canadá para o CE em diversas bebidas alcoólicas. 2. Tabela 2 – Número de laboratórios acreditados para a análise do CE. 3. Tabela 3 – Teores de CE encontrados em vinhos portugueses. 9. Tabela 4 – Técnicas de pré-tratamento e métodos utilizados para a análise do CE. 11. Tabela 5 - Comparação da GC/MS e HPLC-FLD na análise do CE em amostras de vinho. 15. Tabela 6 - Programa de temperaturas do cromatógrafo gasoso. 21. Tabela 7 – Programa de eluentes utilzado na HPLC-FLD. 22. Tabela 8 – Identificação das amostras analisadas. 23. Tabela 9 - Relações sinal-ruído (S/N) obtidas pelo método RMS na análise de padrões de CE com concentrações ente 1-50 ppb. 34. Tabela 10 - Relações sinal-ruído (S/N) obtidas pelo método peak to peak na análise de padrões de CE com concentrações ente 1-50 ppb 34 Tabela 11 - Relações sinal-ruído (S/N) obtidas pelo método peak to peak segmentado na análise de padrões de CE com concentrações ente 1-50 ppb 34 Tabela 12– Estudo da linearidade das respostas de padrões de CE. 35. Tabela 13– Estimativa dos limites de detecção e quantificação em GC/MS. 35. Tabela 14 – Repetibilidade obtida no ensaio de padrões de CE a 10 e 50 ppb adicionados de isoctano a 10% (v/v) 37 Tabela 15 - Áreas e repetibilidade obtidas na análise de padrões de CE a 60 ppb saturados com NaCl 39 Tabela 16 - Estudo da linearidade das respostas de padrões de CE. 41. Tabela 17 – Estimativa dos limites de detecção e quantificação em HPLC-FLD. 41. vii.

(10) Índice de Equações Equação 1 – Formação de CE através da reacção do dietildicarbonato/dietilpirocarbonato com a amónia. 6. Equação 2 – Reaccção do xantidrol com o CE. 14. Equação 3 – Limite de detecção. 35. Equação 4 – Limite de quantificação. 35. viii.

(11) Índice de Apêndices Apêndice 1 - Equação para a formação do CE considerando o etanol, a ureia, a arginina e a citrulina 62 Apêndice 2 – Espectro de massa de padrão de CE a 1000 ppb e comparação com espectro da biblioteca de massas. 62. Apêndice 3 - Comparação dos espectros de massa obtidos pela análise de diversas amostras com os espectros de massas das bibliotecas do GC/MS 63 Apêndice 4 – Cromatograma e comparação do espectro de massa de padrão de α-terpineol com espectro de massa das bibliotecas do GC/MS. 65. Apêndice 5 – GC/MS. 65. Apêndice 6 – Utilização do isoctano como padrão interno. 69. Apêndice 7 - SPME. 70. Apêndice 8 – HPLC-FLD. 70. ix.

(12) Símbolos e Abreviaturas Alc. – Álcool CE – Carbamato de Etilo CW – Carbowax DP – Desvio padrão DPR % - Desvio padrão relativo percentual DVB - Divinilbenzeno FML – Fermentação malo-láctica GC/MS - Cromatografia gasosa/espectroscopia de massa HPLC-FLD – Cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por fluorescência M/Z – massa/carga QuEChERS - Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe – Rápido, Fácil, Económico, Eficaz, Robusto e Seguro SCAN – Modo de varrimento contínuo SIM – Monitorização selectiva de iões SPE - Extracção em fase sólida SPME – Microextracção em fase sólida. x.

(13) 1. Introdução 1.1 Carbamato de Etilo – Aspectos toxicológicos, metabolização e regulamentação em vinhos. O carbamato de etilo (CE), também designado por uretano, é um éster do ácido carbâmico que ocorre naturalmente em produtos fermentados. Deste modo é possível a sua presença em vários produtos alimentares, entre os quais os vinhos.. O carbamato de etilo está classificado pela IARC - International Agency for Research on Cancer, na classe 2B, ou seja, possivelmente carcinogénico para o homem [1,2]. Esta agência está a preparar uma nova monografia intitulada - Vol. 96, Alcoholic Beverage Consumption, Acetaldehyde and Urethane, cujo grupo de trabalho se reuniu em Fevereiro de 2007. Esta nova monografia visa actualizar a última informação publicada por esta agência sobre o composto que data de 1974 [3]. O CE apresenta uma toxicidade aguda relativamente baixa, sendo a LD50 na ordem dos 2,5 g/Kg de peso corporal [4]. O CE não é directamente carcinogénico nem mutagénico, mas sua a activação pelo citocromo P-450, origina metabolitos que já exibem toxicidade [5,6].. O metabolismo do CE é mediado pelo menos através de 3 vias (Figura 1). Na primeira via o CE pode ser hidrolizado a etanol, amónia e dióxido de carbono por uma esterase hepática. Na segunda via o CE é convertido pelo citocromo P-450 em N-hidroxiuretano. Na terceira via, que também envolve o citocromo P-450, o CE é convertido primeiramente em carbamato de vinilo e depois em carbamato de vinilo epóxido. Os metabolitos do CE podem danificar o material genético através da formação de aductos com o ADN, oxidação ou depurinação. Os mecanismos propostos indicam que o cobre desempenhará um papel importante nestas reacções [7,19].. Figura 1 – Mecanismo proposto para a metabolização do CE [19]. 1.

(14) Uma vez que a principal via de exposição da população em geral ao CE resulta do consumo de bebidas alcoólicas [8], tem sido também estudada qual a influência do consumo de etanol na metabolização do CE. Os resultados obtidos nestes estudos não têm sido consensuais, uma vez que foi reportado quer o aumento da actividade do citocromo P450, o que levaria a um aumento da oxidação do CE ao seu derivado epoxídico, quer uma diminuição da actividade do mesmo citocromo. Quer o CE quer o etanol parecem competir como substratos para serem metabolizados por este citocromo. A obtenção de resultados conclusivos é ainda dificultada, segundo os autores, pelo facto do acetaldeído, resultante da oxidação do etanol, ser um potente inibidor da metabolização do CE e também um substrato para o citocromo P450 [1,9, 10, 11].. A toxicidade do CE continua a ser presentemente estudada, quer através de ensaios in vitro quer in vivo [1,5,12-32].. Em 1976 demonstrou-se a formação do CE durante as etapas de fermentação utilizadas para a produção diversos alimentos e bebidas alcoólicas [33]. No entanto, os níveis de CE encontrados na altura foram na ordem das poucas partes por bilião (ppb), não tendo sido a presença deste composto considerada preocupante pelas autoridades oficiais. No entanto, em 1985, em análises efectuadas pelas autoridades Canadianas em bebidas alcoólicas, foram determinados valores de CE consideravelmente superiores, na ordem das partes por milhão (ppm), o que levou a um interesse renovado pelo composto, tendo sido estabelecidos em alguns países limites de cumprimento voluntário, no caso dos Estados Unidos da América, ou mesmo de cumprimento legal, no caso do Canadá (Tabela 1): Tabela 1 - Limites legais em vigor no Canadá para o CE em diversas bebidas alcoólicas [139] Tipo de bebida alcoólica. Concentração de CE (ppb). Cerveja (≤ 8,5 % alc.). 15. Cerveja (> 8,5 % alc.). 30. Cidra (% de alc. não indicada). 30. Vinho de mesa (< 14,0 % alc.). 30. Vinho licoroso (≥ 14,0 % alc.). 100. Bebidas espirituosas (≥ 21,0 % alc.). 150. Saké (% de alc. não indicada). 200. Licores de frutos (% de alc. não indicada). 400. No caso dos E.U.A. foi proposto à FDA – Food and Drug Administration, pelas associações de produtores de vinhos americanas, um plano para redução dos teores de CE em vinhos de mesa e vinhos licorosos. O acordo indicava que os vinhos de mesa não deveriam conter por lote, em média, mais de 15 ppb de CE, sendo no entanto permitidos pontualmente valores superiores, enquanto que para os vinhos licorosos, este valor não deveria ser superior a 60 ppb. Os objectivos deste plano seriam, a partir da produção de 1995, que apenas 1 % do total de vinhos de mesa e licorosos apresentassem teores de CE superiores a 25 e 90 ppb, respectivamente [35]. Em 2005 o Brasil fixou. 2.

(15) um prazo de 5 anos para os produtores de cachaça cumprirem os mesmos limites legais existentes no Canadá [36].. Em 2005, na sequência da 64ª Reunião do JECFA/WHO/FAO – Joint Expert Committe on Food Additives / World Health Organization / Food and Agriculture Organization das Nações Unidas, foi publicado um relatório da avaliação de risco do CE nos alimentos. Segundo este Comité a exposição ao CE a partir da alimentação e bebidas alcoólicas é relevante, devendo ser continuada a implementação de medidas para a redução do teor deste composto nos alimentos. Este relatório foi apresentado para análise à Comissão do Codex Alimentarius [8]. Quer a nível nacional quer a nível europeu, as diversas agências com competência na área alimentar continuam presentemente a estudar a ocorrência deste composto nos vários alimentos. Em Janeiro de 2007 foi publicado um estudo da Food Standards Agency do Reino Unido sobre a ocorrência do CE em vários alimentos fermentados [113,114]. Está também em curso na European Food Safety Authority (EFSA) uma reavaliação do risco do composto, de forma a considerar-se a necessidade do estabelecimento de limites legais para a sua presença em alimentos, incluindo vinhos [37].. Em Portugal não existem presentemente laboratórios acreditados para a pesquisa de CE em vinhos. Existe no entanto um laboratório acreditado para a análise do composto em aguardentes [126]. A nível europeu e internacional o número de laboratórios como capacidade reconhecida para a realização desta análise é também consideravelmente reduzido, como se pode verificar pela seguinte tabela (Tabela 2) [107,126-130]: Tabela 2 – Número de laboratórios acreditados para a análise do CE Europa (Alemanha, Bélgica, Dinamarca, Eslováquia, Espanha, Finlândia, França, Grécia, Holanda, Itália, Irlanda, Reino Unido, República Checa) Laboratórios acreditados para a análise do CE Laboratórios acreditados para a análise do CE em vinhos Laboratórios Método. Oficial. que. América (Brasil, Canadá, E.U.A.). 9. 5. 8. 3. 1. -. utilizam. (Regulamento. (CE) N.º 761/1999) [95]. 3.

(16) 1.2 Mecanismos de formação do CE em vinhos e metodologias para o seu controlo Em 1930 foi demonstrada a produção de ésteres carbâmicos após o aquecimento da ureia e etanol entre 175 e 190ºC [38]. Foi também demonstrada por Ough, em 1976, a formação de CE em 72 horas, a partir da ureia e de soluções de etanol diluídas (11,5 %), sem a necessidade de aquecimento [33], ou seja, em condições muito semelhantes às existentes nos vinhos. Estudos subsequentes correlacionaram os teores de CE nos vinhos com a quantidade de ureia e outros precursores biológicos neles existentes e ainda com o aumento da temperatura, quer de fabrico, quer de armazenamento, dos mesmos. Desta forma, caso as condições do meio sejam propícias, é possível a formação de CE através de várias reacções não enzimáticas com o etanol [39] (Figura 2):. Figura 2 – Principais vias de formação do CE em vinhos. A Figura 2 representa as principais vias de formação de precursores de CE durante os processos de fermentação que ocorrem durante a produção dos vinhos. A ureia é geralmente produzida pelas leveduras durante as fases inicial e intermédia da fermentação alcoólica, pela metabolização dos diversos aminoácidos existentes no sumo de uva, de entre os quais a arginina é a mais abundante, numa concentração que varia nos mostos entre 100 mg/L e 2,5 g/L, dependendo da casta da uva, do solo e dos métodos de vinificação utilizados.. 4.

(17) Durante os processos de fermentação, quando é acumulado um excesso de ureia no citoplasma das células, esta é libertada para o meio exterior, neste caso o mosto. Estirpes de leveduras que tenham uma elevada capacidade de degradação da arginina, mas uma reduzida capacidade de utilização da ureia, tenderão a libertar para o meio maiores quantidades de ureia. A ureia resultante da metabolização da arginina pela arginase, constitui o principal precursor para a formação de CE, contribuindo com aproximadamente com 50 % do total de precursores que reagem com o etanol para formarem o composto. A metabolização da arginina é catalisada pela arginina dehidrogenase, dando origem a citrulina que também pode reagir não enzimaticamente com o etanol, formando CE. Por sua vez a citrulina é metabolizada numa reacção catalisada pela ornitina transcarbamilase, dando origem a ornitina. Nesta reacção também é formado fosfato carbamílico, numa reacção catabolizada pela carbamato cinase. O fosfato carbamílico, reagindo com o etanol, também poderá formar CE. A fermentação maloláctica (FML), também efectuada como parte do processo de fabricação dos vinhos, pode contribuir para a formação de precursores do CE, uma vez que alguns microrganismos utilizados nesta etapa (essencialmente bactérias malo-lácticas), possuem vias metabólicas idênticas às descritas para as leveduras utilizadas na fermentação alcoólica. A arginina não é totalmente metabolizada pelas leveduras durante a fermentação alcoólica, podendo ser utilizada como substrato na FML o que irá originar mais precursores do CE. Este mecanismo foi descrito para algumas estirpes de Oenococcus e de Lactobacillus [34,40-44,46-52,115].. Desta forma quer a realização da fermentação alcoólica, que a realização da fermentação malo-láctica potenciam a formação de precursores que podem reagir com o etanol para dar origem a CE.. Não obstante os mecanismos acima descritos constituírem as principais vias de formação do CE, existem outras mecanismos possíveis para formação do composto ainda não completamente estudados, uma vez que também foi reportada a presença de CE quer em sumos de uva não fermentados. Também foi reportada a presença de CE em vinhos após engarrafamento, em alguns casos com teores superiores a 100 ppb, nos quais não tinha sido detectada a presença de ureia, arginina, e citrulina. No caso dos vinhos após engarrafamento, uma das explicações apresentadas foi a de que a ureia se encontra presente no meio, mas ligada a outros compostos azotados formados durante os processos de fermentação. Estes compostos tendem a sofrer uma hidrólise com a passagem do tempo, libertando ureia que pode reagir com o etanol formando CE. São mencionados como exemplo, ensaios de envelhecimento forçado em vinhos, aos quais foi adicionado o composto 3a,6adimetilglycouril, o qual causou um aumento nos teores de CE detectados [70].. Também têm sido desenvolvidos estudos que permitem correlacionar a presença de CE com outros constituintes do vinho. Uthurry determinou diversos parâmetros analíticos em vinhos [69] para além. 5.

(18) do CE, nomeadamente, lactato de etilo, ácido láctico, potássio, acidez volátil, ureia, amónia e acidez total, os quais foram sujeitos a uma análise de componentes principais, a qual permitiu a determinação de coeficientes de correlação entre o CE e o lactato de etilo e a acidez volátil. Segundo os autores, esta correlação seria indicativa da existência de uma relação entre a presença de CE e determinados processos microbiológicos que aumentassem a acidez volátil e a concentração de ésteres, tais como a FML, e/ou determinados processos de degradação que produzissem ácido láctico a partir de açúcares residuais.. Em 1976 também foi comprovada a formação de CE, através de uma reacção com a amónia, a partir de um aditivo (DEDC - dietildicarbonato também designado por DEPC - dietilpirocarbonato), utilizado como inibidor do crescimento das leveduras [63,64] (Equação 1):. O(CO2C2H5)2 DEDC/DEPC. + NH3 Amónia. H2NCO2C2H5. +. CO2. Carbamato de Etilo Dióxido de Carbono. +. C2H5OH Etanol. Equação 1 – Formação de CE através da reacção do dietildicarbonato/dietilpirocarbonato com a amónia. A utilização deste aditivo foi posteriormente proibida em alguns países, incluindo a Europa. Como alternativas a este composto foi estudado o DMDC – dimetildicarbonato, e a possível formação de compostos semelhantes ao CE, nomeadamente o carbamato de metilo [65,66]. Em finais de 2005 foi autorizado pela União Europeia a utilização deste composto nos vinhos [67].. Nas bebidas alcoólicas destiladas preparadas a partir de matérias primas com teores naturalmente elevados em glicósidos cianogénicos, por exemplo a amigdalina presente em alguns frutos - cerejas, ameixas, pêssegos ou ginjas, ou a epiheterodendrina no caso do centeio, existem outros mecanismos adicionais para a formação do CE. Nas bebidas preparadas a partir destes produtos, o cianeto libertado por hidrólise térmica ou enzimática durante o processo produtivo reage com o etanol presente no meio, dando também origem a CE num mecanismo semelhante ao verificado nos vinhos. Este mecanismo de formação também foi descrito para a cachaça obtida a partir da cana do açúcar, mas a fonte de cianeto neste produto ainda não foi identificada. Para além da catálise enzimática, nos casos das bebidas destiladas, a hidrólise não enzimática dos precursores cianogénicos passa por outros dois mecanismos, um deles através de reacções catalisadas pelo ião Cu2+ presente na generalidade do material utilizado nos equipamentos de destilação - alambiques e tubagens - e outro, cujas reacções específicas ainda estão a ser estudadas, pela formação de radicais livres por exposição a luz ultravioleta. [59,71-73,83,118-120].. Existem ainda outros mecanismos propostos para a formação do CE em bebidas destiladas, nomeadamente através da reacção de algumas proteínas com o etanol, com catálise pelo cobre [71,74].. 6.

(19) A formação do CE noutros alimentos também foi estudada, nomeadamente em pão e molho de soja, [33,75-77, 131]. No caso do molho de soja considera-se que o principal precursor seja a citrulina em vez da ureia e que uma deficiente fermentação láctica durante o processo de fabrico possa permitir um aumento desta e, por conseguinte, dos teores de CE presentes no produto final.. Também foi sugerido que a azodicarbonamida utilizada como antioxidante em garrafas de cerveja e também como agente de expansão da massa do pão, pudesse contribuir para a formação de CE [72,78]. No entanto os baixos teores de CE ( <10 ppb) encontrados nestes alimentos indicam que a contribuição deste composto para os teores totais do composto será muito provavelmente desprezável. O mecanismo específico de formação do CE no pão não foi especificamente estudado. No entanto considera-se que os mecanismos envolvidos serão muito semelhantes aos verificados nos processos fermentativos de outros alimentos [59].. Uma vez que os teores de CE presentes nos vinhos podem ser influenciados por todas as etapas do seu processo produtivo, desde as etapas de viticultura até ao envelhecimento em garrafa, importa indicar algumas boas práticas e medidas que podem ser adoptadas de forma a diminuir o potencial de formação do composto.. A utilização de leguminosas como cobertura nos terrenos das vinhas no Inverno, poderá adicionar uma quantidade significativa de azoto ao solo, na ordem dos 40 kg/hectare, o que constitui cerca do dobro do valor obtido através da utilização de fertilizantes sintéticos, os quais não devem ser utilizados em quantidades superiores de azoto a 110 kg/hectare. Este excesso de azoto disponível no solo traduzir-se-á numa maior quantidade de substratos, particularmente arginina, passíveis de serem utilizados pelas leveduras e/ou bactérias e por conseguinte aumentar a quantidade de precursores de CE. As diferentes combinações de bacelo e porta-enxerto das vinhas, também influenciam os teores de ureia que virão a ser encontrados nos vinhos. Geralmente a quantidade de azoto assimilada do solo é dependente do porta-enxerto. No entanto utilizando o mesmo enxerto e diferentes bacelos, poderá verificar-se uma variação de mais de 10 vezes nos teores de azoto detectados em análise foliar, geralmente considerados como bons indicadores dos teores que irão ser encontrados nos mostos [45,52,60,61].. Antes do início da fermentação será importante saber qual a quantidade de azoto assimilável disponível no mosto. Esta não deverá exceder os 250-700 mg/L. A concentração de arginina deverá ser inferior a 1 g/L e os teores de ureia não deverão ultrapassar os 3-5 mg/L, sendo os valores normais encontrados nos vinhos entre 0,1-10 mg/L [52,62].. A selecção de microrganismos apropriados, ou seja leveduras e/ou bactérias que não sejam exigentes relativamente à quantidade de azoto assimilável disponível no meio, e que não libertem quantidades significativas de precursores, pode contribuir para minimizar a formação de carbamato. 7.

(20) de etilo [44,45]. Isto pode ser conseguido através de leveduras que naturalmente possuam essa característica (Lallemand 71B®, Red Star SC1120® ou Premier Cuvée PdM®, por exemplo [52]), ou mesmo através da sua manipulação genética e metabólica [54,55,83,121]. A ocorrência de fermentações espontâneas com microrganismos nativos existentes nos mostos é portanto desaconselhada, uma vez que neste caso se desconhecem as suas características.. Caso os teores de ureia encontrados nos mostos sejam superiores aos recomendados, é possível a utilização de ureases, enzimas específicas para cada substrato, de forma a catalisar a hidrólise da ureia [51,56]. No entanto, a maioria das ureases utilizadas comercialmente é obtida a partir de fontes não vinícolas, (p. ex. feijões) e são desadequadas para serem utilizadas em vinhos, cujo pH é geralmente inferior ao pH de actividade máxima destas enzimas [51]. As ureases obtidas a partir de bactérias que realizam a FML têm sido investigadas como alternativas para a remoção do excesso de ureia nos vinhos. As ureases ácidas produzidas pelo Lactobacillus fermemtum e Lactobacillus reuteri são bastante eficazes entre os pH 2,0 a 4,0 , o que abrange os valores mais frequentemente encontrados nos vinhos. No entanto alguns dos compostos do vinho, por exemplo compostos fenólicos (taninos das grainhas das uvas), dióxido de enxofre, etanol e ácidos orgânicos (p. ex. málico, láctico, e pirúvico) inibem a actividade da urease obtida a partir do L. fermemtum [57]. No entanto, pelo facto de serem necessárias quantidades significativas de enzimas para aplicação à escala industrial, e pelo facto destas enzimas não terem um efeito sobre os outros precursores do CE, a sua utilização não constitui uma solução total para o controlo dos teores do composto [42].. Algumas práticas enológicas também poderão influenciar os teores de CE encontrados nos vinhos. No caso dos vinhos licorosos os processos de fermentação são parados pela adição de etanol numa fase em que a produção de ureia pelas leveduras é elevada. Desta forma, a quantidade de ureia disponível para formar CE será superior face a um processo de fermentação mais longo. Também é indicado que o estágio, sur lie, ou seja a colocação de vinhos em barricas sem a remoção das massas de fermentação, poderá influenciar nos teores de CE, apesar de não existir uma opinião consensual sobre este prática enológica [52,53]. Uma vez que os processos de formação do CE não são enzimáticos, sendo favorecidos pelo aumento da temperatura e pela concentração dos respectivos precursores e etanol, será também importante controlar as temperaturas, quer ao longo da fermentação quer também as de armazenamento dos produtos após o seu engarrafamento [51,62]. Outra metodologia possível para o controlo dos teores de CE presentes nos vinhos poderá passar pela utilização de microrganismos com capacidade para produzirem enzimas que degradarem o próprio composto nas bebidas alcoólicas. Tal aplicação foi já alvo de registo de patente nos E.U.A. [58].. A presença inevitável de compostos com potencial para a formação de CE nos vinhos, e o facto dos processos para a formação do CE serem não enzimáticos, levou a que fossem efectuados estudos que, partindo de análises efectuadas aos vinhos imediatamente antes do seu engarrafamento,. 8.

(21) permitissem a construção de um modelo que estimasse a quantidade máxima de CE passível de ser formada após esta etapa. Os estudos efectuados permitiram a definição de equações (Apêndice 1), para um modelo que contempla o etanol, a ureia, a arginina e a citrulina presentes nos vinhos [68]. Estas conclusões confirmaram as estimativas dos estudos anteriormente efectuados por Kodama [51], nos quais foram avaliados os teores de CE presentes em vinhos armazenados a diferentes temperaturas, durante 2 anos. É no entanto referida pelos autores a necessidade de serem efectuados mais estudos desta natureza, para que sejam aperfeiçoados os valores calculados para as constantes das referidas equações.. Tendo em conta o modo de formação do CE é portanto possível indicar tipos de vinhos nos quais, devido ao tipo de práticas enológicas adoptadas, a probabilidade do composto se formar será maior, nomeadamente [51,68]: - Vinhos em que é efectuada a FML; - Vinhos licorosos face a vinhos de mesa, uma vez que a fermentação é parada antes do seu término, ou seja numa fase que em existe produção de ureia. Esta paragem é conseguida através da adição de etanol, o que por sua vez também aumenta a probabilidade de formação de precursores do CE. (p. ex. Vinhos do Porto, Vinhos Moscatel). A adição de etanol também pode favorecer a lise das células, o que aumentará a quantidade de precursores libertados para o meio; - Vinhos sujeitos a temperaturas elevadas, quer como forma de esterilização, quer como parte do seu processo de fabrico (p. ex. Vinhos da Madeira); - Quanto mais velho for um vinho maior será o teor de CE encontrado. Deste modo, vinhos com longos períodos de estágio em barrica e/ou garrafa terão uma maior quantidade de CE;. É possível encontrar na literatura algumas referências aos teores de CE em vinhos Portugueses (Tabela 3): Tabela 3 – Teores de CE encontrados em vinhos portugueses Referência. Vinho. N.º de amostras. Valor médio de CE (ppb) Antes de. [79]. Madeira. 3. Após estufagem. estufagem 38,6. [80]. [81] [85]. [113,114]. Origem. Portuguesa. 52,5. Alentejo. 8. 3,2. Madeira. 12. 33,5. Porto. 9. 31,9. Portuguesa. Brandies. 13. 91,2. tipo Porto. 4. 30,9. n.e.. tipo Madeira / tipo Porto. 4. 54,5. n.e.. Xerez. 2. 4. Portuguesa. Porto. 5. 27,8. Portuguesa. Madeira. 2. 39. Portuguesa. [116]. tipo Porto. 8. 30. n.e.. [139]. tipo Porto. 7. 2 amostras entre 50 e 100 ppb. 2 amostras entre 20 e 50 ppb n.e.. 1 amostra entre 100 e 500 ppb Legenda: n.e. – não especificada.. 9.

(22) Em algumas das amostras o vinho é apenas indicado pelo seu tipo, não sendo especificamente indicado o país de origem. Estas amostras poderão não ter sido produzidas em Portugal.. Da análise dos dados disponíveis é possível constatar que a maioria dos valores reportados se refere essencialmente a vinhos da Madeira e do Porto. Relativamente aos vinhos de mesa, existe apenas uma referência à análise de 8 amostras de vinho provenientes da Região do Alentejo. Estas amostras foram analisadas pela técnica de HPLC-FLD (2.4.4) também utilizada neste trabalho.. Quando são comparados os valores indicados na tabela com os limites legais existentes (tomam-se como referência os valores em vigor no Canadá indicados na Tabela 1), é possível verificar que a maioria das amostras cumpre na generalidade estes limites.. 1.3 Objectivos do trabalho Os objectivos deste trabalho consistiram na análise de amostras de vinhos através do Método Oficial para a análise do CE [95], efectuando o pré-tratamento de amostras por extracção em fase sólida (SPE) e a análise por cromatografia gasosa/espectroscopia de massa (CG/MS), e também na utilização de outras técnicas de pré-tratamento de amostras mais expeditas, nomeadamente a microextracção em fase sólida (SPME), e o método QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe), também com análise por CG/MS e finalmente na utilização de uma outro método de análise, por HPLC-FLD.. 1.4 Análise do carbamato de etilo Para proceder à análise do CE é necessário, na generalidade dos casos, a realização de diversas etapas de pré-tratamento da amostra, dada a complexidade das matrizes em causa, antes de ser possível efectuar a análise em si. Estas etapas contemplam fundamentalmente a extracção do analito da matriz, mas também a sua limpeza ou fraccionamento, concentração e em certos casos derivatização, tendo em conta todas as vantagens analíticas inerentes a cada processo em particular, podendo estes procedimentos envolver até cerca de 80% do tempo analítico dispendido [82]. Os critérios para análise. A literatura refere diversas técnicas para a análise do CE. São indicadas na Tabela 4 as técnicas de pré-tratamento e métodos de análise mais frequentemente citados.. 10.

(23) Tabela 4 – Técnicas de pré-tratamento e métodos utilizados para a análise do CE Autores Cairns et al. (1987) [84] Conacher et al. (1987) [85] Mildau et al. (1987) [86] Brumley et al. (1988) [81] Mossoba et al. (1988) [87] / Clegg e Frank (1988) [88] Giachetti et al. (1991) [89] Ferreira e Fernandes (1992) [79] Ma et al. (1995) [132] Herbert et al. (2002) [80] Jagerdeo et al. (2002) [116] Whiton et al. (2002) [90] Lachenmeirer et al. (2004) [91,110] Tat et al. (2004) [92] Mirzoian e Mabud (2006) [94]. Pré-tratamento da amostra. Método de análise. Ext. Líq./Líq. c/ acetona/diclorometano/éter de petróleo + Florisil + éter etílico/éter de petróleo + acetona. GC/HECD, GC/MS/MS. Ext. Líq./Líq. c/ diclorometano + centrifugação + acetato e etilo Ext. Extrelut + pentano + diclorometano. GC/HECD, GC/ MS CG/MS. Ext. Líq./Líq. c/ diclorometano + centrifugação + acetato de etilo. CG/MS/MS. Ext. Líq./Líq. c/ diclorometano + centrifugação + acetato de etilo. CG/MI/FTIR. Ext. Líq./Líq. c/diclorometano/acetato de etilo + derivatização com xantidrol. GC/MS. Ext. Líq./Líq. c/ éter etílico + acetato de etilo. GC/MS. Ext. Liq./Liq. c/diclorometano + acetato de etilo. GC/TSD. Derivatização com xantidrol. HPLC-FLD. SPE c/ENV+ + centrifugação + acetato de etilo. GC/GC/MS. SPME SPE c/Extrelut + pentano + diclorometano SPME SPE c/ENV+ + acetato de etilo. GC/MS GC/MS/MS GC/FID GC/MS CG/MS. Legenda: ENV+ - copolímero hidroxilado de poliestireno-divinilbenzeno; FID – detector por ionização com chama; FTIR - espectrometria de infravermelhos com a transformada de Fourrier; HECD - detector de condutividade electrolítica de Hall; TSD – detecção termiónica específica.. 11.

(24) Analisando os dados listados na Tabela 4 pode concluir-se que a técnica de pré-tratamento mais frequentemente utilizada é a extracção líquido/líquido. Devido ao tempo necessário para a sua realização e aos respectivos custos quer económicos, quer ecológicos, decorrentes da utilização de elevadas quantidades de solventes, não se optou pela utilização desta técnica de pré-tratamento de amostras. Em primeiro lugar pretendeu-se aplicar a técnica de análise indicada no Método Oficial (SPE + GC/MS). O pré-tratamento por SPME e pelo método QuEChERS foram seleccionados pela sua rapidez e simplicidade de execução, face ao pré-tratamento por SPE. A utilização da GC/MS/MS também é citada por alguns autores. Uma vez que não se dispunha de um equipamento deste tipo, este método não foi utilizado. O método de HPLC-FLD foi seleccionado pela rapidez do pré-tratamento das amostras, e também pelo facto de utilizar uma reacção específica de derivatização, o que permitira a diminuição da ocorrência de fenómenos de interferência.. 1.4.1 Cromatografia gasosa / espectroscopia de massa. Pré-tratamento da amostra por extracção em fase sólida. Nos últimos anos a SPE tem vindo a substituir quase por completo a extracção líquido-líquido, uma vez ter provado ser uma técnica muito poderosa no pré-tratamento de amostras para análise cromatográfica, sendo comparativamente mais rápida e de fácil execução, precisa, consumindo quantidades reduzidas de solventes orgânicos, não envolvendo material de custo oneroso e não formando emulsões.. Apesar das vantagens inerentes à SPE, o pré-tratamento de amostras para análise cromatográfica direcciona-se cada vez mais no sentido da diminuição do volume de amostra, redução do número de passos analíticos e tempo envolvidos, isenção de solventes orgânicos tóxicos e miniaturização dos sistemas extractivos, fundamentalmente com recurso às técnicas de extracção sorptiva. O Método Oficial para análise do CE [95], determina o pré-tratamento das amostras de vinho por SPE, utilizando-se uma coluna com enchimento de terras de diatomáceas com um volume de 50 ml. A literatura reporta a utilização de diversos tipos de colunas (Tabela 4) para a análise do CE.. Pré-tratamento da amostra por microextracção em fase sólida. A microextracção em fase sólida consiste numa técnica para pré-tratamento de amostras que utiliza uma fibra de sílica fundida que suporta uma fase estacionária, geralmente um polímero não volátil, para a extracção de compostos orgânicos, directamente de amostras aquosas ou no headspace em equilíbrio com a amostra. Ao expor-se a fibra à amostra verifica-se uma partição entre os componentes voláteis da amostra e a sua fase líquida [96].. Os materiais da fase estacionária podem ser utilizados isoladamente (PDMS – polidimetilsiloxano ou PA – poliacrilato) ou combinados com outros (p. ex. CW - carbowax, DVB - divinilbenzeno) de forma a. 12.

(25) ser obtido uma material que combine as propriedades de adsorção de ambos. O composto a analisar é então desorvido no injector do cromatógrafo. A fibra é montada num suporte semelhante a uma seringa [97].. A aplicação desta técnica para a análise do CE em bebidas alcoólicas já foi estudada. Alguns autores referem que as fibras mais adequadas serão as CW/DVB [90,110]. Outros autores referem a obtenção de melhores resultados com fibras de CW/PDMS [98]. Optou-se neste trabalho por utilizar as fibras de CW/DVB uma vez que é referido que estas permitiram uma menor adsorção de componentes da matriz de bebidas alcoólicas [110].. Pré-tratamento da amostra por QuEChERS. Uma outra técnica para o pré-tratamento de amostras recentemente desenvolvida, designa-se por QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe). Esta técnica foi apresentada em 2003 por Anastassiades e seus colaboradores [99,100], sendo desenvolvida com o objectivo de se obter um método que permitisse a análise simultânea de diversos resíduos de pesticidas presentes numa amostra e que fosse simultaneamente fácil e rápida de efectuar, com baixos custos, uma vez que outras técnicas de pré-tratamento de amostras, nomeadamente a SPME não substituíram com sucesso a abordagem multi-resíduos tradicional.. Este método compreende 2 fases: uma extracção líquido-líquido, seguida de uma etapa de limpeza, denominada extracção em fase sólida dispersiva, efectuada directamente na amostra à qual é adicionado simultaneamente um material sorvente.. Desde a divulgação do método original, este tem sofrido algumas modificações e adaptações, necessárias para a análise de compostos que sejam susceptíveis a degradação nas condições de extracção descritas no método inicial (p.ex. pesticidas susceptíveis a ácidos e bases) e também como forma a alargar a gama de matrizes alimentares abrangidas por este método [101]. O método de análise original foi sujeito a validação através de ensaios interlaboratoriais, encontrando-se presentemente em discussão uma Norma Europeia (prEN 15662) [102], que descreve esta técnica, com data de publicação prevista em 2009. Este método também se encontra em discussão para adopção pela AOAC – American Organization of Analytical Chemists [103,104].. Uma vez que é referida a utilização deste método para a pesquisa de diversos pesticidas carbamatos, considerou-se que poderia ser interessante a sua utilização para a pesquisa do CE. Na pesquisa efectuada na literatura não foram encontradas referências específicas à sua aplicação para este composto.. 13.

(26) 1.4.2 Cromatografia líquida de alta eficiência / detecção por fluorescência. Também é referida na literatura uma técnica de análise para o CE desenvolvida em Portugal, especificamente por HPLC-FLD. Nesta técnica analítica é utilizada a reacção do xantidrol para a identificação de amidas [106], através de uma reacção de substituição nucleofílica com o xantidrol em meio ácido, em que o grupo amina do CE se comporta como um nucleófilo, dando origem a xantiluretano, composto que apresenta fluorescência (Equação 2) [77,80].. Xantidrol. Carbamato de etilo. Xantiluretano. Equação 2 – Reaccção do xantidrol com o CE [77,80]. Esta reacção apresenta um alto rendimento (> 95 %) sendo relativamente fácil a obtenção do derivado fluorescente. A literatura também refere a análise do xantiluretano por GC/MS, pela análise de 7 fragmentos resultantes da ionização do composto por impacto electrónico, com fragmentos com massas compreendidas entre 77 e 269 [89].. A especificidade desta reacção foi avaliada através de ensaios com diversos aminoácidos [80]. Desta forma, segundo os autores, pretendeu-se desenvolver uma técnica que não apresentasse os inconvenientes dos métodos de referência (tempos de análise elevados e incertezas associadas a diversas etapas de limpeza da amostra) e que permitisse a análise de um número elevado de amostras por dia, condição normalmente existente em laboratórios envolvidos em actividades de controlo da qualidade.. Esta técnica permite efectuar a quantificação do CE directamente em amostras de vinho, sem numerosas etapas de pré-tratamento da amostra, sendo apenas necessário efectuar uma diluição inicial da amostra em solução aquosa de etanol e a reacção de derivatização propriamente dita.. Posteriormente ao seu desenvolvimento, o método foi avaliado em ensaios interlaboratoriais [108], em que estiveram envolvidos 6 laboratórios que usaram os 2 métodos aqui apresentados (GC e HPLC) tendo os resultados obtidos nos laboratórios participantes permitido, de acordo com os autores, estabelecer uma boa correlação entre os métodos.. Apesar dos limites de detecção para esta técnica serem ligeiramente superiores aos indicados para o método oficial (Tabela 5), esta técnica, segundo os autores, pode ser usada como forma de despistagem do CE em vinhos, sendo as amostras positivas confirmadas por GC/MS. Alguma literatura. 14.

(27) publicada em 2007 [77] indica, para produtos de soja fermentados, limites de detecção 5 vezes superiores aos inicialmente reportados.. Tabela 5 - Comparação da GC/MS e HPLC-FLD na análise do CE em amostras de vinho [108] Parâmetro. GC-MS (método oficial). HPLC-FLD. Validação Interferências. Existem compostos com massas comuns ao. O reagente de derivatização também pode. CE com tempos de retenção próximos. reagir com aminas e amidas. Pré-tratamento da amostra. Laborioso para amostras de vinho. Gama de linearidade. 5 – 320 µg / L. Apenas diluição e derivatização da amostra 5 – 500 µg / L. Limites de detecção. Aprox. 3ppb. 4,2 ppb. Limite de quantificação. 10 ppb. Aprox. 14 ppb. Precisão. 4,7 %. 6,3 %. 91 %. 96 %. Exactidão. Apreciação qualitativa Quantidade de trabalho laboratorial Duração da análise (incluindo. pré-. tratamento da amostra e cromatografia) Custos da instrumentação. Extensa tendo em conta a extracção. Diluição da amostra e tempo da reacção de derivatização. ≈ 3 horas. ≈ 40 minutos. Elevados (GC/MS ou MS/MS). Médios (HPLC-FLD). Técnica do analista. Elevada. Média. Presença de interferentes. Possível. Possível. 15.

(28) 2. Materiais e métodos 2.1 Padrões, solventes, eluentes, reagentes, gases e água Padrões - Carbamato de Etilo – Assay - Fluka - Isoctano – Uvasol – Merck - α-terpineol – 98 % - Sigma. Solventes - Ácido acético – P.A. – Panreac - Ácido clorídrico 37% (v/v)- P.A. – Panreac - Diclorometano – Reagent Analytical Grade - LabScan, Sigma, Ridel-de-Haen, Aldrich - Etanol – A.C.S. - Panreac - Metanol – HPLC - Fischer Scientific - Propan-1-ol – HPLC - LabScan - Propan-2-ol – HPLC - LabScan. Eluentes - Acetato de sódio – A.C.S. - Aldrich - Acetonitrilo – HPLC Grade - LabScan, Ridel-de-Haen, LabScan - Diclorometano – Analytical Regent Grade - LabScan, Sigma, Ridel-de-Haen, Aldrich. Regentes - “PSA Bonded Silica” – Supelco - Sulfato de magnésio – Reagent Plus – Aldrich - Sulfato de sódio – P.A. - Panreac - Xantidrol – 98% - Aldrich - Cloreto de sódio – A.C.S. - Ridel-de-Haen - Sulfato de sódio – A.C.S - Ridel-de-Haen. Gases - Azoto para GC - Air Liquide - Hélio para GC – Air Liquide. Água Toda a água utilizada foi purificada num sistema Mili-Q – Milipore. 16.

(29) 2.2 Materiais utilizados no pré-tratamento das amostras - Agitadores magnéticos – 10 mm – Supelco - Balança MC1 Analytic AC 210P - Sartorius - Banho de ultra sons - SonoRex - Bomba de vácuo - 169 – Buchi - Centrífuga 5804 R – Eppendorf - Colunas Chemelut de 50 ml – Varian - Colunas de 6ml (ENV+) – Supelco - Colunas de plástico de 20 ml - Fibras – Carbowax/Divinilbenzeno – 70 µm – Supelco - Lã de vidro – QP - Panreac - Medidor de pH – Microph 2002 - Crison - Medidor e sonda de temperatura – P-500 e PI-100 – DOSTMANN - Micropipetas de 100 µL, 500 µL e 1000 µL – Eppendorf - Microseringa de 10µL – Hamilton Co. - Placa de agitação 34532 – Snijders - Rotavapor – RE 11-B - Buchi - Septos 11mm (borracha/teflon) - BSB Analytic - Seringa para SPME de uso manual – Supelco - Sistema de obtenção de água Mili-Q – Milipore - Sistema de vácuo VisiPump – Supelco - Tampões de pH 4,00 e 7,02 – Crison - Terra de diatomáceas – Grau industrial – Celatom Fw50 e Celatom Fw12 - Tubos de polietileno de 30 ml para centrífuga - TurboVap LV Evaporator – Zymark - Vials 1,5ml – VWR - Vials de 15ml (21 mm × 70 mm) com septos de borracha/teflon – Supelco. 2.3 Equipamento Para a GC/MS foi utilizado um cromatógrafo gasoso / espectrómetro de massa QP 2010 da Shimadzu, com o qual foram utilizadas alternadamente 2 colunas capilares: DB5-MS – (30m x 0,32mm x 0,25µm) - J & W e Supelcowax – (30m x 0,32mm x 0,25µm) – Supelco. O software de análise utilizado foi o GCMSolutions V. 2.10 – LabSolutions também da Shimadzu. O espectrómetro de massa dispunha das seguintes bibliotecas de espectros de massas: NIST 12, NIST 27, NIST 62, NIST 147 e WILEY 229.. 17.

(30) Para a HPLC-FLD foi utilizado um cromatógafo Surveyor Plus da ThermoFinnigan com amostrador automático. Foi utilizada uma coluna RP-18 (5µm) LiChroCART 250 x 4 mm e uma pré-coluna RP-18 (5µm) LiChroCART 4 x 4 mm, ambas da Merck. O software de HPLC utilizado foi o ChromQuest v. 4.0 da ThermoFinnigan. Utilizou-se um detector de fluorescência FL3000 também da ThermoFinnigan com o software 4880 da ATI Unicam.. 2.3 Modo de preparação das soluções 2.3.1 Solução padrão de carbamato de etilo para GC/MS – 0,013 mol/L Para as determinações em GC/MS todas as soluções padrão de CE foram preparadas dissolvendo 0,1159 g do sólido em água, acetona ou diclorometano, para um volume final de 100 ml, efectuando-se diluições subsequentes para as restantes soluções de trabalho. A solução mãe e restantes soluções foram armazenadas em frascos herméticos de vidro escuro em refrigeração (5-8ºC).. 2.3.2 Solução padrão de carbamato de etilo para HPLC-FLD – 0,012 mol/L Para as determinações em HPLC-FLD foi preparada uma solução padrão de CE, dissolvendo 0,1158 g do sólido numa solução aquosa de etanol a 20 %, conforme indicado na literatura [81], para um volume final de 100 ml, efectuando-se diluições subsequentes para as restantes soluções de trabalho. A solução mãe e restantes soluções foram armazenadas em frascos herméticos de vidro escuro em refrigeração (5-8ºC).. 2.3.3 Solução saturada com cloreto de sódio ou com sulfato de sódio para SPME Para a obtenção de soluções saturadas procedeu-se à adição de aproximadamente 2,5 g de cloreto de sódio ou de 1,3 g de sulfato de sódio a cada vial, para um volume final de padrão de CE ou de amostra de vinho de 7 ml.. 2.3.4 Solução de acetonitrilo a 1 % (v/v) de ácido acético para utilização no método QueChERS Num balão volumétrico de 100 ml foram adicionados 1 ml de ácido acético a 99 ml de acetonitrilo.. 2.3.5 Solulução aquosa de ácido clorídrico (HCl) 1,5 mol/L Para a preparação da solução aquosa de HCl foram diluídos 6,26 ml de ácido a 37 % com água para um volume final de 50 ml.. 2.3.6 Solução de reagente de derivatização – xantidrol – 0,02 mol/L Para a preparação da solução foram dissolvidos 0,1982 g de xantidrol em 1-propanol para um volume final de 50 ml. Esta solução foi armazenada em refrigeração (5-8ºC), em frascos. 18.

(31) herméticos de vidro escuro, cobertos por filme de alumínio de modo a evitar a exposição da solução à luz.. 2.3.7 Solução aquosa de acetato de sódio 20 mM – eluente HPLC-FLD Para a preparação do eluente foram dissolvidos 1,641 g de acetato de sódio num volume de 2 litros de água.. 2.3.8 Soluções aquosas de etanol a 20 % e a 24 % para diluição das amostras em HPLC-FLD Para a preparação de soluções aquosas de etanol a 20 e 24 % foram diluídos 20 ou 24 ml de etanol com água num volume final de 100 ml.. 2.4 Pré-tratamento das amostras. 2.4.1 SPME a) Previamente à primeira utilização, cada fibra foi condicionada conforme instruções do fabricante [108], pela exposição a 220ºC durante 30 minutos no injector do CG sem execução de programa. Após o condicionamento de cada fibra foi verificada a ausência de picos interferentes através da realização de um ensaio em branco no CG/MS com o mesmo programa utilizado para as amostras. b) Foram colocados 2,5 g de cloreto de sódio e um agitador magnético dentro de um vial de 15ml; c) Foram transferidos 7ml de amostra para dentro do vial; d) O vial foi de seguida fechado com a respectiva tampa de rosca; e) Foi efectuada a imersão parcial do vial, a metade da altura deste, em banho de água termostatizado por placa de aquecimento e temperatura medida por sonda de temperatura. f) A fibra foi imediatamente inserida no vial, sem imersão através do septo da tampa; g) A fibra foi exposta à amostra durante 20 minutos com agitação constante; h) Terminado este tempo a fibra foi recolhida e foi efectuada a injecção imediata da amostra no CG/MS.. 2.4.2 SPE 2.4.2.1 Método Oficial [95]: a.1) Para vinhos com mais de 14 % alc. Foi efectuada a diluição de 1:8 de amostra com água até um volume final de 40 ml, conforme indicado no Método Oficial; a.2) Para vinhos com menos de 14 % alc. Foi efectuada a diluição de 1:2 de amostra com água até um volume final de 40 ml, conforme indicado no Método Oficial; b) Após a diluição da amostra esta foi transferida para a coluna de extracção. c) O recipiente que continha a amostra foi lavado com 10 ml de água e água de lavagem foi também transferida para a coluna. d) A amostra foi deixada em contacto com a coluna durante 4 minutos;. 19.

(32) e) De seguida foi efectuada uma extracção da amostra, efectuando-se a eluição pela adição de 80 ml + 80 ml de diclorometano; f) O eluído foi recolhido em balão e foi concentrado em rotavapor a 30ºC até um volume de aproximadamente 3-4 ml; g) O balão foi lavado com 1 ml de diclorometano e transferiu-se o extracto para um tubo de ensaio; h) A amostra foi colocada no evaporador e foi concentrada em corrente de azoto até um volume final de 1 ml; i) De seguida a amostra foi analisada por GC/MS.. 2.4.2.2 Método Oficial modificado [44, 69, 123] com base no Procedimiento Normalizado de Trabajo (PNT) utilizado no laboratório de controlo oficial em Espanha – idêntico a 2.4.2.1 excepto pelos seguintes pontos: a) São adicionados de 10 g de cloreto de sódio à amostra antes da transferência para a coluna. Não é efectuada a lavagem do recipiente da amostra com 10 ml de água; b) O tempo de contacto da amostra na coluna é de 5 minutos; c) Não é efectuada a concentração final em corrente de azoto, efectuando-se a concentração até um volume final de aproximadamente 1 ml no rotavapor.. No caso das colunas preparadas manualmente foi colocada lã de vidro no interior da base da coluna de plástico de 20 ml de forma a ser obtida uma altura de aproximadamente 0,5 cm. As colunas foram enchidas com terras de diatomáceas de ganulomeria intermédia (Fw12) ou fina (Fw50) até cerca de 1 cm do topo. Devido à pequena granulometria do material de enchimento utilizado, o caudal de diclorometano foi aumentado pela utilização de um sistema de vácuo (Visipump).. No caso das colunas ENV+ estas foram activadas pela passagem de 5ml de metanol seguida da passagem de 2 ml de água e novamente 5 ml de metanol. A coluna foi deixada a secar à temperatura ambiente durante 20 min. De seguida foram colocados de 6 ml de amostra não diluída na coluna e efectuada a eluição com 5 ml de metanol.. 2.4.3 QuEChERS [109]: a) Foram adicionados 15 ml de amostra a 15 ml da solução de acetonitrilo (2.3.4) num tubo para centrífuga de 30 ml; b) Foram adicionados 6 g de sulfato de magnésio e 1,5 g de acetato de sódio; c) O tubo foi agitado manualmente durante 1 minuto; d) A amostra foi centrifugada a 3500 r.p.m. (rotações por minuto) durante 1 minuto; e) Foi recolhido 1 ml do sobrenadante e este foi transferido para um novo tubo de centrífuga de 10 ml; f) Foram adicionados 50 mg de sílica ligada PSA e 150 mg de sulfato de magnésio; g) O tubo foi agitado manualmente durante 20 segundos;. 20.

(33) h) A amostra foi centrifugada a 3500 r.p.m durante 1 minuto; i) O sobrenadante foi recolhido e foi efectuada a análise deste por GC/MS.. 2.4.4 HPLC-FLD [80]: a.1) Para vinhos com mais de 14 % alc. (v/v) foi efectuada uma diluição 1:8 de 5 ml de amostra com solução aquosa de etanol a 20 %; a.2) Para vinhos com menos de 14 % alc. (v/v) foi efectuada uma diluição 1:8 de 5 ml de amostra com solução aquosa de etanol a 24 %; b) Foram introduzidos 500 µL de amostra num vial de 1,5 ml; c) Foram de seguida adicionados 100 µL da solução de xantidrol (2.3.5) e 50 µL da solução de HCl (2.3.4); d) O vial foi selado com o respectivo septo e agitado manualmente durante e 10 segundos; e) A reacção foi desenvolvida na obscuridade durante 5 minutos após os quais a amostra foi analisada.. A diluição dos vinhos, consoante o seu teor alcoólico, com soluções de etanol de diferente concentração, é utilizada para normalizar o teor de etanol presente na amostra, para que as condições da reacção de derivatização se mantenham semelhantes.. 2.6 Condições instrumentais 2.6.1 Condições em GC/MS [95]: a) Condições do GC Colunas: Coluna capilar DB5 (30m x 0,32mm x 0,25µm); Coluna capilar Carbowax (30m x 0,32mm x 0,25µm) – Coluna indicada no Método Oficial; Volume de injecção: 0,5µL; Gás transportador: Hélio; Temperatura inicial do forno a coluna: 40ºC; Temperatura de injecção: 180ºC; Modo de injecção: Splitless; Tempo de corte do solvente: 3 min.. Tabela 6 - Programa de temperaturas do cromatógrafo gasoso Tempo de. Incremento. Temperatura. (ºC/min.). final (ºC). -. 40,0. 0,70. 3,00. 125,0. -. 35,00. 220,0. 5,25. 250. da temp. (min.). Temperatura (ºC). manutenção. 200 150 100 50 0 0. 5. 10. 15. 20. 25. 30. 35. Tempo (min.). 21.

(34) b) Condições do MS: Temperatura da fonte iónica: 250ºC; Temperatura da interface: 220ºC; Início da aquisição: 3 min.; Fim aquisição: 36 min.; Fragmentação por impacto electrónico (70 eV); Modo SCAN: Intervalo 0,5 seg.; Velocidade de SCAN: 555; Massas adquiridas: 30,00-300,00; Modo SIM: Intervalo 0,2 seg.; Massas adquiridas: 62,00; 74,00 e 89,00; Limiar de detecção (Threshold) 1000.. 2.6.2 Condições em HPLC-FLD [80] a) Condições do HPLC: Eluentes: A – Solução aquosa de acetato de sódio (2.3.6); B - Acetonitrilo puro; Injecção de loop total - 20 µl.. A coluna indicada no método [80] é uma AminoQuant II 200 x 2.1 mm com partículas de 5 mm Hewlett-Packard. Através da pesquisa no site do actual fabricante (Zorbax - Agilent) foi verificada a semelhança com as colunas utilizadas nas determinações deste trabalho - LiChroCART – Merk). Os fluxos de eluentes foram adaptados face ao indicado no método original (Tabela 7), tendo em conta as maiores dimensões das colunas (2.2.6) utilizadas nas determinações. Tabela 7 – Programa de eluentes utilzado na HPLC-FLD Tempo (min.). Eluente A (%). Eluente B (%). Fluxo (mL/min.). 0,01. 55,00. 45,0. 0,900. 36,00. 50,00. 50,00. 0,900. 38,00. 0,00. 100,00. 1,200. 40,00. 0,00. 100,00. 1,600. 52,00. 0,00. 100,00. 1,600. 56,00. 55,00. 45,00. 0,900. 58,00. 55,00. 45,00. 0,900. 120 Eluente A (%). Eluentes (%). 100. Eluente B (%). 80 60 40 20 0 0. 10. 20. 30 Tempo (min.). 40. 50. 22.

(35) b) Condições do detector de fluorescência Comprimento de onda de excitação: 234 nm Comprimento de onda de emissão: 600 nm. 2.7 Amostras analisadas As diferentes amostras analisadas foram identificadas do seguinte modo (Tabela 8):. Tabela 8 – Identificação das amostras analisadas Codificação A1-A6. Tipo de amostra. Região. Mosto de vinho branco de em diversas. Ano 2005. Bucelas. fases de fermentação. (Vindima). B. Vinho branco D.O.C.. C. Vinho tinto D.O.C.. D. Vinho de mesa tinto comercial n.º 1. n.a.. Vinho de mesa branco comercial n.º 1. n.a.. E F. Bucelas. 2004. Estremadura. 2003. Vinho branco D.O.C. resultante dos. Bucelas. 2005. Douro. n.a.. Beira Interior. 1999. mostos A1-A6. G. Vinho licoroso comercial. H. Vinho tinto Regional. I. Vinho tinto D.O.C. Setúbal. 1998. J. Vinho tinto Regional. Estremadura. 2002. K. Vinho branco Regional. Estremadura. 2002. L. Vinho licoroso D.O.C.. Setúbal. 2002. M. Vinho de mesa branco comercial n.º 2. n.a.. N. Vinho tinto D.O.C. Beira Interior. 2000. O. Vinho tinto Regional. Estremadura. 1999. P. Vinho de mesa tinto comercial nº2. Douro. n.a.. n.a. – não aplicável – na rotulagem dos vinhos de mesa geralmente não é indicada a região de origem nem o ano de produção.. - As amostras A1 a A6 foram recolhidas durante a vindima de 2005 junto do produtor, sendo congeladas a -18ºC imediatamente após a sua recolha até ao momento de análise.. - As amostras D, E e G foram adquiridas em grandes superfícies no Distrito de Lisboa.. - A amostra L foi cedida pelo Laboratório de Química do Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica / Instituto de Tecnologia Química e Biológica.. - As restantes amostras de vinho foram adquiridas em loja própria do produtor.. - Todas as amostras de vinhos analisadas foram obtidas a partir de produtos já engarrafados ou embalados, nas mesmas condições de venda ao público em geral.. 23.