PROSUL
Programa Sul-Americano de Apoio às Atividades de Cooperação em Ciência e Tecnologia
Edital CNPq No. 005/2007
Chamada I I – Projetos Conjuntos em C&T&I
RELATÓRIO FINAL DE ATIVIDADES PROCESSO NO 490686/2007-9
Diversidade genética e potencial toxigênico em populações de Fusarium graminearum, agente causal da giberela do trigo na América do Sul
Beneficiário
Prof. Dr. Emerson Del Ponte
Instituições UFRGS e UEM (Brasil)
UNRC (Argentina) INIa (Chile)
Período de atividades
Dezembro de 2007 a Dezembro de 2011
1. Apresentação
Este relatório tem o objetivo de apresentar de forma sumarizada as atividades, as missões de trabalho e os produtos obtidos com o desenvolvimento do Projeto Prosul (490686/2007-9). O projeto foi conduzido no período inicial de 24 meses (28 de dezembro de 2007 a 28 de dezembro de 2009), tendo obtido uma prorrogação de 12 meses, totalizando 36 meses do projeto. Durante o seu desenvolvimento, houve uma substituição de membros da equipe com a inclusão de pesquisador de outra instituição do Brasil, localizada em outro Estado da federação, o que justificou viagens nacionais. O projeto apoiado nesse Edital foi proposto com diferentes etapas/objetivos que foram desenvolvidos em sua plenitude e cujas metas, em sua maioria, foram atingidas durante o período de seu desenvolvimento.
O relatório apresenta os seguintes itens, na sequencia:
2) Sumário do desenvolvimento e avaliação dos objetivos específicos propostos;
3) Cronograma, período e descrição das atividades conduzidas em cada missão (viagens) de planejamento, discussão ou de trabalho;
4) Desenvolvimento e resultados de atividades selecionadas; 5) Produção científica e participação em eventos;
6) Considerações gerais, avanços e dificuldades; 7) Considerações sobre a relevância da pesquisa.
2. DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DOS OBJETIVOS
Cinco objetivos específicos foram propostos no projeto inicial, para os quais se apresenta na sequencia uma síntese do desenvolvimento e avaliação dos resultados obtidos em cada objetivo.
2.1. Objetivo 1. Levantar dados de observação da doença e obtenção de espigas sintomáticas e grãos com danos de giberela em um conjunto de lavouras de trigo monitoradas em zonas agroecológicas em importantes regiões produtoras da Argentina, Brasil e do Chile
Desenvolvimento: No Brasil, amostras (de 500g) de grãos de trigo foram recebidas da safra 2007 (safra anterior ao início do projeto) oriundas de três regiões de produção no Estado do Rio Grande do Sul. Além das amostras de grãos, lavouras de trigo das regiões do Estado foram visitadas na região produtora do norte do Estado do Rio Grande do Sul, em dois anos (2008 e 2009 e 2010) durante a fase de formação de grãos para avaliação da incidência e severidade das epidemias de giberela. Na Argentina, amostras de trigo foram coletadas em três lavouras comerciais, duas da província de Córdoba (Marcos Juarez e Villa Maria) e uma de Buenos Aires (Pergamino), durante a safra 2007. No Chile, foram coletadas espigas e colmos de trigo
sintomáticos de uma lavoura onde foram identificados sintomas semelhantes a giberela, na safras 2008.
Avaliação: Atingido. No decorrer das safras agrícolas, foram recebidas 53 amostras de grãos de trigo de 28 diferentes municípios do Rio Grande do Sul. Nos anos de 2008, 2009 e 2010 pelo menos 50 lavouras de foram visitadas no Estado do Rio Grande do Sul, de onde foram obtidos o material para os isolamento dos fungos associados com os sintomas de giberela. As amostras obtidas da Argentina e Chile foram suficientes para os trabalhos posteriores. Além disso, as condições de seca que ocorreu durante as safras 2008 e 2009 na Argentina levaram a não ocorrência de epidemias naquela região, não justificando a coleta de material no campo nesses outros anos.
2.2. Objetivo 2. Analisar amostras de grãos e de espigas provenientes das lavouras monitoradas quanto à ocorrência do fungo
Desenvolvimento: as amostras recebidas ou provenientes das lavouras que foram visitadas pelos pesquisadores foram avaliadas quanto a ocorrência de Fusarium spp. associados com os sintomas tanto em grãos quanto em espigas.
Avaliação: Atingido. Todas as amostras foram devidamente analisadas no laboratório de onde se selecionou aquelas com ocorrência do patógeno para os trabalhos posteriores.
2.3. Objetivo 3. Estabelecer uma coleção de isolados do patógeno amostrado nas diferentes regiões
Desenvolvimento: do total de amostras recebidas, foram procedidos os isolamentos e purificação das colônias típicas de F. graminearum associadas aos grãos maduros ou obtidos das espigas sintomáticas.
Avaliação: Atingido. A coleção resultante dos isolamentos do patógeno das amostras de trigo do Brasil nos três anos consta de 632 isolados de trigo. Do trigo, são 400 isolados da safra 2007, 80 da safra de 2008 e 152 da safra 2009. A coleção de isolados obtida na safra 2010 está ainda em processamento, mas com previsão de ter pelo menos 150 isolados. Da Argentina foram isolados um total de 150 cepas oriundas da safra 2007, das três lavouras. Do Chile, foram analisados um total de 50 isolados recuperados ao longo dos dois anos e alguns provenientes de coletas anteriores. Todos os isolados estão depositados na coleção do Laboratório de Epidemiologia de Plantas da UFRGS.
2.4. Objetivo 4. Avaliar a diversidade genética no nível de espécie e dentro de espécie e dos quimiotipos do patógeno com o uso de técnicas químicas e moleculares
Desenvolvimento: A coleção de isolados foi caracterizada em nível de espécie por meio de PCR utilizando-se um primer específico cujas amplificações permitem identificar a espécie como F.
graminearum. Para a genotipagem dos isolados para a produção de tricotecenos, essa foi feita por métodos moleculares para a identificação dos três tipos químicos de tricotecenos: 3-acetil-deoxinivalenol (3ADON), 15-3-acetil-deoxinivalenol (3ADON) e nivalenol (NIV). Todos os isolados da coleção foram caracterizados pela técnica molecular quanto ao quimiotipo, nesse caso, o genótipo tricoteceno, utilizando-se primers específicos para genes preditivos das síntese dessas toxinas, Tri3 e Tri12. A diversidade genética foi analisada por meio de marcadores AFLP, atividade conduzida na Universidade de Rio Cuarto.
Avaliação: Plenamente atingido. Foi caracterizado ao nível de espécie e quimotipo um total de 200 isolados de trigo do Brasil, 150 isolados da Argentina e 50 isolados do Chile. Quanto as análises AFLP, foram analisadas 4 populações do Brasil (3 de 007 e 1 de 2008), 3 populações da Argentina e 1 população do Chile.
2.5. Objetivo 5. 1. Estabelecer e fortalecer uma integração de atividades através da realização de visitas técnicas, workshops e treinamentos dos participantes dos projetos nos diversos laboratórios
Desenvolvimento: Visitas de intercâmbio foram realizadas com enfoque no planejamento e condução das atividades pelos pesquisadores envolvidos.
Resultado: Atingido. Foram realizadas três reuniões conjuntas de planejamento, avaliação e avaliação final e uma série de missões individuais de trabalho por pesquisadores do Brasil para a Argentina e da Argentina para o Brasil. A reunião final foi realizada no Chile. Destaca-se que foi necessário a realização de visitas dentro do país uma vez que os dois grupos brasileiros estão localizados em dois Estados do país.
3. MISSÕES (VIAGENS) DE PLANEJAMENTO/TRABALHO/DISCUSSÃO
Das viagens programadas, foram conduzidas 10 missões no total, contemplando a vinda de pesquisadores estrangeiros ao Brasil para visitas de planejamento bem como a ida de membros da equipe brasileira à um dos países ou visitas dentro do país uma vez que dois grupos brasileiros estão envolvidos e localizados em Estados diferentes. Abaixo, um sumário com informações sobre o período da missão e atividades conduzidas.
Missão 1- 21 a 23 de maio de 2008
Reunião de planejamento na UFRGS (Brasil)
A primeira reunião de planejamento foi feita na UFRGS, representada pelo grupo da Instituição, um pesquisador do grupo da Argentina (Dra. Maria Laura Ramirez) e o pesquisador do Chile (Dr. Ricardo Madariaga). Na ocasião foram feitas apresentações dos trabalhos e experiência de cada grupo na temática; planejamento dos trabalhos de coleta de dados de campo nos três países para a safra de 2008 e discutidos os detalhes dos trabalhos de
isolamentos dos fungos das amostras de campo. Participaram da reunião: Emerson Del Ponte, Marcelo Gravina de Moraes, Paula Astolfi, Leonardo Scoz, Maria Laura Ramires (Argentina), Ricardo Madariaga (Chile).
Fig.1 Visita de planejamento na UFRGS pelos pesquisadores R. Madariaga e M. Ramirez (da esquerda para a direira).
Missão 2 - 2 a 6 de novembro de 2008
Reunião de discussão e planejamento e workshop na UNRC (Argentina)
A segunda reunião do grupo ocorreu na semana de 2 a 6 de novembro. Estiveram presentes três pesquisadores do Brasil (Prof. Emerson Del Ponte, Prof. Dauri José Tessmann e a pesquisadora Paula Astolfi), um pesquisador do Chile (Dr. Ricardo Madariaga) e todos os membros integrantes da equipe liderada pela Profa. Sofia Chulze. A reunião teve como propósito reunir o grupo de lideranças dos três países para a discussão de resultados preliminares e planejamento do trabalho para o ano de 2008. A reunião ocorreu em paralelo com um evento organizado pelo grupo da UNRC, que era um Workshop Latino Americano de Fusarium, o qual foi acompanhado por todos os integrantes do projeto. O evento é específico na temática do projeto sendo coordenado pela Profa. Sofia N. Chulze, reconhecida autoridade na temática taxonomia e toxicologia de fungos, especialmente no gênero Fusarium. Os trabalhos conduzidos até então pelo grupo brasileiro na questão da coleta de dados de campo e estudos em laboratório para preparação dos materiais para outras análises foram apresentados. Foi feito um planejamento para visita de membro da equipe brasileira no laboratório da Argentina para condução de algumas análises.
Fig.2 Workshop Latino Americano de Fusarium realizado na Universidade de Rio Cuarto, Argentina, concomitante a reunião de avaliação do primeiro ano do projeto Prosul.
Missão 3 - 16 a 21 de fevereiro de 2009
Missão de trabalho na UEM (Brasil)
Uma primeira viagem dentro do país foi necessária e realizada por membro (pesquisadora. Paula Astolfi) do laboratório da UFRGS (Porto Alegre, RS) para condução de trabalho na UEM (Maringá, PR) referente às análises moleculares de responsabilidade do grupo do Prof. Dauri J. Tessmann. Na ocasião foram conduzidas as primeiras análises dos isolados do Brasil recuperados das coletas feitas no ano de 2007 e 2008.
Missão 4 - 2 a 14 de março de 2009
Missão de trabalho na UEM (Brasil)
Uma segunda viagem foi feita pela pesquisadora Paula Astolfi ao laboratório da UEM para complementação das análises iniciadas na primeira visita de trabalho. Na ocasião foram concluídas as análises moleculares quanto aos quimiotipos presentes na população de fungos, por meio da técnica PCR.
Missão 5 - 25 de maio a 25 de junho de 2009
Missão de trabalho de pesquisador brasileiro na UNRC (Argentina)
A primeira missão de trabalho de membro brasileiro no exterior foi realizada pela pesquisadora Paula Astolfi que conduziu atividades no laboratório da Profa. Chulze. Na ocasião foram conduzidas as reações para o conhecimento da diversidade genética das populações do Brasil e também das populações de Fusarium da Argentina, por meio da técnica AFLP. A pesquisadora recebeu o treinamento nas técnicas específicas bem como acompanhou
os trabalhos conduzidos naquele grupo para as outras etapas que seriam conduzidas posteriormente.
Missão 6 - 20 de setembro a 3 de outubro de 2009
Missão de trabalho de pesquisador Brasileiro na UNRC (Argentina)
Uma segunda missão de trabalho foi feita ao laboratório da Argentina pela pesquisadora Paula Astolfi para finalizar as análises e interpretação dos resultados dos dados coletados na primeira visita. Ainda, foram iniciados os trabalhos de caracterização dos isolados da população de fungos da Argentina com a participação da equipe brasileira.
Missão 7 - 22 de novembro a 15 de dezembro de 2009
Missão de trabalho de pesquisador Brasileiro na UNRC (Argentina)
A terceira missão de trabalho foi feita pela pesquisadora Paula Astolfi oportunizou a anãlises dos dados dos trabalhos iniciados na visita anterior, que foi a caracterização das populações da Argentina, além de iniciar as análises com os isolados provenientes do Chile.
Missão 8 - 31 de agosto a 18 de setembro de 2010
Missão de trabalho de pesquisador Brasileiro na UNRC (Argentina)
Finalmente, a quarta missão individual foi necessária para a pesquisadora Paula Astolfi conduzir os trabalhos de caracterização de uma população de fungos obtida no ano de 2008 e 2009 cujas análises foram conduzidas no primeiro semestre de 2010 no Brasil.
Missão 9 - 4 a 9 de outubro de 2010
Missão de trabalho de pesquisador da argentina na UFRGS (Brasil)
A pesquisadora Maria Marta Reynoso realizou missão de 5 dias de trabalho na UFRGS para trabalhar junto a equipe da UFRGS na análise final dos dados e preparação do manuscrito com os resultados da análise das populações do Brasil.
Fig. 3. Visita da pesquisadora MM Reynoso (centro) na UFRGS em novembro de 2010.
Missão 10- 15 a 18 de dezembro de 2010
Missão conjunta para reunião final do projeto no INIA (Chile)
Em dezembro de 2010 foi realizado o encontro final do projeto que envolveu dois pesquisadores da Argentina (Profa. Sofia Chulze e Dra. Adriana Torres da UNRC), dois do Brasil (o coordenador, Prof. Emerson Del Ponte da UFRGS, e o Prof. Dauri J. Tessmann da UEM). A visita foi organizada pelo Dr. Ricardo Madariaga nas instalações do INIA no município de Chilán, na região centro-sul do Chile. Na oportunidade foram feitas visitas de campo para o conhecimento da situação da produção e pesquisa com doenças do trigo no Chile, conduzidas no INIA, seguido da reunião formal para a apresentação dos resultados obtidos no âmbito do projeto Prosul e oportunidades de novas parcerias de trabalho entre os grupos. Participaram da reunião, além dos membros formais do projeto, pesquisadores do INIA e da Universidade local envolvidos com a temática Fusarium e micotoxinas em alimentos (Figura 4). Ata é apresentada no ANEXO 2.
Fig. 3. Visita de campo na região produtora de trigo em Chilán (esquerda) e participantes da reunião final do projeto Prosul realizada no INIA, Chilán, Chile de 15 a 18 de dezembro de
4. DESENVOLVIMENTO E RESULTADOS DE ATIVIDADES SELECIONADAS 4.1. Amostragem de amostras de grãos maduros colhidos no RS
Foram recebidas 53 amostras de 28 municípios onde as lavouras de trigo estavam localizadas. A tabela 1 apresenta o número de amostras recebidas por município e por ano de amostragem para trigo.
Tabela 1. Número de amostras de trigo por município e safra agrícola, recebidos para análise de fungos, grãos giberelados e recuperação de isolados de F. graminearum
Município Safra agrícola
2007 2008 2009 Total
Boa Vista do Incra 1 1 - 2
Carazinho - - 1 1 Ciríaco 2 - - 2 Cruz Alta 3 5 - 8 Entre Ijuís 1 - - 1 Erebango - 1 - 1 Erechim - 1 - 1 Gentil 1 - - 1 Getúlio Vargas - 1 - 1 Giruá 1 - - 1 Ibiaçá 2 - 1 3 Júlio de Castilhos 2 - - 2 Machadinho - 4 - 4 Nonoai 2 - 1 3
Nova Boa Vista 1 - - 1
Passo Fundo - - 1 1
Paulo Bento - 1 - 1
Pontão 1 - - 1
Quatro Irmãos - 1 - 1
Rio das Índias 1 - - 1
Ronda Alta 1 - - 1
Sananduva - - 2 2
São Gabriel - - 2 2
São José do Ouro - 1 - 1
Três Palmeiras 2 - - 2
Trindade do Sul - - 2 2
Tupanciretã - 1 3 4
Vacaria 2 - - 2
4.2. Levantamento da incidência de giberela e coleta de material em lavouras
Entre os meses de outubro e novembro, nas safras de 2008 a 2010, foram feitas diversas viagens para observação da doença e coleta de material em quatro regiões produtoras denominadas: Santa Rosa, Cruz Alta, Passo Fundo e Vacaria. As lavouras foram visitadas quando se encontravam no estágio de enchimento de grãos. Em cada lavoura, foram anotadas informações referentes ao estágio da cultura, presença de resíduo no interior da cultura, doenças foliares e incidência de giberela. Foram definidos 20 pontos de amostragem em cada lavoura, de onde foram coletados 10 espigas por ponto. As espigas foram coletadas ao acaso e trazidas para o laboratório para posterior avaliação. A coordenada geográfica de cada lavoura foi anotada com o auxílio de um GPS portátil, para a geração de um mapa dos pontos amostrados. A doença não foi encontrada em algumas lavouras devido ao fato de ainda estarem em estágio anterior ao da expressão da doença. A Figura 2 apresenta a localização e a incidência de giberela nas lavouras visitadas na safra 2009, além da indicação da cultura anterior com base na avaliação do resto cultural. De maneira geral, as epidemias foram mais severas na região centro e norte Estado com menores valores na nordeste. Os dados levantados na safra 2010 estão sendo analisados.
Figura 2. Localização geográfica de lavouras de trigo visitadas no Estado do Rio Grande do Sul, safra 2009, para avaliação da incidência de giberela.
4.3. Isolamento, extração de DNA e PCR
Isolamentos fúngicos a partir de grãos de trigo foram feitos com o cultivo em meio semi-seletivo para crescimento de Fusarium, descrito por Nash e Snyder (1962) com modificações de Nelson et al. (1983), por 3 a 5 dias, a 25°C sob fotoperíodo de 12h luz/12h escuro (Leslie e Summerell, 2006). Aqueles caracterizados como F. graminearum durante cultivo monospórico, foram crescidos em meio agarizado SNA e mantidos pelo método Castellani e em papel de filtro esterilizado. Estes foram catalogados com o código que identifica a safra, o número da lavoura e do isolado e depositados em uma coleção. Dos grãos que apresentaram colônias típicas de F. graminearum, foi coletado um fragmento de micélio para o isolamento monospórico (Figura 3).
Figura 3. Procedimento para obtenção de isolado monospórico (esquema a esquerda); placas com colônias de F. graminearum da coleção (centro) e preparação do micélio produzido em meio líquido para extração de DNA (direita).
As extrações de DNA genômico foram realizadas em duplicatas pelo método CTAB 2%. Para isso, triturou-se o micélio produzido em nitrogênio líquido. Utilizaram-se 250-300 mg de tecido por tubo de reação. Adicionou-se ao micélio triturado, 750 µl de tampão de extração CTAB 2%. O DNA precipitado ao final do processo de extração foi colocado em tubos em papel toalha. Após seco, este foi ressuspendido em 50-100 µl de água bidestilada estéril e mantido a -20°C. A quantidade e qualidade do DNA extraído foi estimada através de leitura em um fluorômetro Qubittm (Invitrogen) e o DNA armazenado a -20 ºC. Cada isolado foi submetido a análises de PCR (polymerase chain reaction) para confirmação da espécie F. graminearum através de um Singleplex-PCR utilizando o primer Fg16 (Fg16F CTC CGG ATA TGT TGC GTC AA/ Fg16R GGT AGG TAT CCG ACA TGG CAA) (Nicholson et al., 1998). Por meio de Multiplex-PCR das regiões dos genes Tri3 e Tri12, foram determinados três tipos tricotecenos: NIV, 3ADON e 15ADON (Ward et al., 2002). Como estratégia de confirmação da distinção entre DON e NIV também se utilizou o primer Tri13F/R através de um Singleplex-PCR. Esta reação é capaz de distinguir apenas NIV de DON.
4.4. Caracterização de F. graminearum do trigo quanto ao quimiotipo
A análise de DNA mostrou que o quimiotipo predominante nas três populações foi o 15ADON, em 91% dos isolados (Fig 4). O tipo NIV foi detectado nas três populações, com destaque para a população Nonoai com 9 isolados NIV (Fig. 14). O 3ADON foi detectado em 1 isolado da população Cruz Alta.
Figura 4. Locais de procedência das amostras de grãos de trigo e tipos químicos (número de isolados) de F. graminearum analisados por PCR
Foi encontrado polimorfismo na reação com Fg16 (Fig. 5) correlacionado com os genes preditivos de DON e NIV (Fig. 5). Estudos anteriores, haviam demonstrado que isolados NIV, com o mesmo polimorfismo com Fg16, corresponderam à linhagem 2 (F. meridionale), por seqüenciamento genético.
Figura 5. Amplificação espécie-específica Fg16F/R para F. graminearum (a); Multiplex-PCR tri3 para determinar 3-ADON (243 bp), 15-ADON (610 bp) e NIV (840 bp) (b);. Marcador de peso molecular de 100 bp em cada extremidade, quatro primeiras amostras correspondem ao controle negativo (C), controle 3-ADON (3A), controle Nivalenol (NIV) e controle 15-ADON (15A).
4.5. Análise AFLP de populações de isolados de Fusarium graminearum do Brasil - conduzidas na UNRC (Argentina)
Das populações de Fusarium de trigo do Brasil foram analisadas 19 isolados de Cruz Alta (CA), 19 de Ernestina (ER) e 17 de Nonoai (NO). Um total de 150 bandas de AFLP foram identificada na faixa de 200-500 pb de 55 isolados analisados com o uso de três combinações de primers (Tabela 1). De 150 loci AFLP, 73% foram polimórficos para CA, 6% para ER e 75% para NO (Tabela 2). Os isolados agruparam com linhagens 2, e 7 segundo O’Donnel (2004), sugerindo haver pelo menos 2 espécies filogenéticas no complexo Fg no Brasil. Para o conjunto de 148 locus, a diversidade genetica media foi 0.2 para todos os isolados, 0.144 para os isolados CA, 0.13 para ER e 0.238 para os isolados NO (Tabela). A alta diversidade genetica na população de NO pode ser devido ao alto número de locus polimórficos (111 locus) observado naquela população em comparação com a população ER (100 locus). Para o conjunto complete de 148 locus, os valores de GST (índice de fixação ou diferenciação entre as populaces devido a divisão da população) para locus individual variou de zero, ou seja, ou não divergência ou frequencia de alelo igual, até um máximo de 0.85 (Tabela 3). O GST médio para os 148 locus foi 0.146 (Nm >3 nos 148 locusi) (Table II). Quanto ao “linkage disequilibria” foi rejeitada a hipótese nula de dois locus em linkage equilibrium (P<0.01) em favor da hipótese alternativa de dois locus em desequilíbrio para 100 pares de locus (0.92%) para CA, para 37 pares de locus (0.34%) para ER e para 239 pares de locus (2.2%) para NO.
Tabela 1. Comparação de populações de Gibberella zeae populations isolada de campos de trigo em Cruz Alta, Ernestina e Nonoai, Brasil.
População Cruz Alta Ernestina Nonoai
Tamanho da amostra 19 19 17
Percentual de locus polimórficos 73 68 75
Número de haplótipos 19 19 17
Número de alelos privados 13 9 15
Frequencia media de alelos privados 0.117 0.058 0.184 Amplitude dos alelos privados 0.053 – 0.895 0.053 – 0.105 0.053 – 0.412 Diversidade genetic médiaa
148 locus 0.144 0.137 0.238
103 locus 0.183 0.175 0.325
5. PRODUÇÃO CIENTÍFICA E PARTICIPAÇÃO EM EVENTOS 5.1. Resumos em anais de evento
1. DEL PONTE, EM ; SPOLTI, P. ; SANTOS, J. ; STUMPF, R. ; GOMES, L. B. ; ASTOLFI, P. ; SILVA, C.N. ; TESSMANN, D. J. Variabilidade populacional de Fusarium graminearum implicações na epidemiologia e manejo de risco. In: III Workshop de Epidemiologia de Doenças de Plantas, 2010, Bento Gonçalves, RS. Anais do III Workshop de Epidemiologia de Doenças de Plantas, 2010.
2. Del Ponte, E. M. ; ASTOLFI, P. ; SANTOS, J. ; SIMON, L. L. ; GOMES, L. B. ; SILVA, C.N. ; TESSMANN, D. J. . Trichothecene-B types of Fusarium graminearum Complex populations from wheat and barley in southern Brazil. In: 11th European Fusarium Seminar, 2010, Varsóvia. Book of Abstracts. Radzików, Poland : Plant Breeding and Acclimatization Institute, 2010. p. 127-128.
3. DEL PONTE, E.M. ; SIMON, L. L. ; ASTOLFI, P. ; SPOLTI, P. ; SANTOS, J. ; BARROS, N. C. ; SOUZA, M. ; BUFFON, J. G. ; FURLONG, E.B. . Multi-year surveys on Fusarium head blight and mycotoxins in commercial wheat grains from Rio Grande do Sul state, Brasil. In: 2009 National Fusarium Head Blight Forum, 2009, Orlando. Proceedings of the 2009 National Fusarium head bliight Forum. Lexington : University of Kentucky, 2009. p. 8-8. 4. SPOLTI, P. ; SIMON, L. L. ; BARROS, N. C. ; DEL PONTE, Emerson Medeiros . Spatial patterns and incidence-severity relationships of Fusarium head blight epidemics on wheat crops following soybean or maize in Rio Grande do Sul, Brazil. In: 2009 National Fusarium Head Blight Forum, 2009, Orlando. Proceedings of the 2009 National Fusarium head bliight Forum. Lexington : University of Kentucky, 2009. p. 85-85. 5. ASTOLFI, P. ; SCHNEIDER, L. ; SIMON, L. L. ; DEL PONTE, Emerson Medeiros ; ALVES, T.
C. A. ; TESSMANN, D. J. ; REYNOSO, M. M. ; RAMIREZ, L. ; TORRES, A. ; FARNOCHI, M. C. ; CHULZE, S. N. . Studies on the Fusarium graminearum complex affecting wheat in southern Brazil suggest a phylogenetic species-specific B-trichothecene profile. In: 2009 National Fusarium Head Blight Forum, 2009, Orlando. Proceedings of the 2009 National Fusarium head bliight Forum. Lexington : University of Kentucky, 2009. p. 171-171.
6. ASTOLFI, P. ; SIMON, L. L. ; SCHNEIDER, L. ; ALVES, T. C. A. ; TESSMANN, D. J. ; DEL PONTE, Emerson Medeiros . Within-field patterns of B-trichothecene genotypes in the Fusarium graminearum complex affecting wheat in Southern Brazil. In: 2009 National Fusarium Head Blight Forum, 2009, Orlando. Proceedings of the 2009 National Fusarium head bliight Forum. Lexington : University of Kentucky, 2009. p. 171-171. 7. Schneider, L., Simon, L.L., Astolfi, P., Tessmann, D.J., Del Ponte, E.M. Características
genéticas e toxigênicas de populações de Fusarium graminearum, agente causal da giberela do trigo no sul do Brasil. In: I Encontro Gaucho de Micologia, 2008, Porto Alegre. I Encontro Gaúcho de Micologia. Porto Alegre, 2008.
8. Schneider, L., Astolfi, P., Simon, L.L., Alves, T.C.A., Tessmann, D.J., Del Ponte, E.M. Caracterização da variabilidade genotípica de três populações de Fusarium graminearum do trigo quanto ao tipo químico. Tropical Plant Pathology, v. 34 (suplemento), p. S129, 2009 (Resumo).
5.2. Artigos publicados em revistas com corpo editorial
1. ASTOLFI, P.; SANTOS, J.; SPOLTI, P.; TESSMANN, D. J. ; DEL PONTE, Emerson Medeiros. Complexo Fusarium graminearum: taxonomia, perfil toxigênico e genética populacional na era molecular. Revisão Anual de Patologia de Plantas, v. 18, p. 119-161, 2010
5.3. Artigos submetidos para publicação em revista com corpo editorial
1. Astolfi, P., Reynoso, M.M., Ramirez, M.M., Chulze, S.N., Tessmann, D.J., Del Ponte, E.M. Genetic population structure and trichothecene genotypes of Fusarium graminearum isolated from wheat in Southern Brazil. Submetido para a Plant Pathology (ANEXO 3)
5.4. Artigos em revista Magazine
1. DEL PONTE, Emerson Medeiros ; ASTOLFI, P. ; SOARES, W. ; SIMON, L. L. . Trigo depreciado. Cultivar Grandes Culturas, Pelotas, RS, p. 36 - 40, 01 ago. 2008.
5. 5. Participação em eventos com apresentação dos trabalhos 1. 2010 APS Annual Meeting. 2010. (Congresso).
2. 11th European Fusarium Seminar. 2010. (Seminário).
3. III Workshop de Epidemiologia de Doenças de Plantas. poster. 2010. (Simpósio). 4. XLII Congresso Brasileiro de Fitopatologia. Potencial e desafios da previsão sazonal de
risco de doenças em larga escala. 2009. (Congresso).
5. 2009 National Fusarium Head Blight Forum.6 posteres apresentados no evento. 2009. (Simpósio).
5. AVALIAÇÃO GERAL, AVANÇOS E DIFICULDADES
Considero que a condução do projeto Prosul constituiu uma excelente oportunidade de colaboração, mas principalmente de aproximação entre os grupos dos três países que já desenvolviam atividades independentes na temática. De forma particular, foi bastante proveitosa a interação estabelecida com o grupo de pesquisa da UNRC (Argentina) onde alguns trabalhos que não eram da experiência prévia do grupo brasileiro como as análises de estrutura de populações de fungos. Além das relações internacionais, foco principal do Prosul, a possibilidade de ter agregado outro grupo brasileiro, liderado pelo Prof. Dauri J. Tessmann da UEM, foi decisivo para que se pudessem cumprir algumas das metas estabelecidas na proposta original. Lembrando que a inclusão do Prof. Dauri J. Tessmann no projeto ocorreu durante a metade do primeiro ano do projeto uma vez que houve a solicitação de afastamento da equipe do projeto por dois membros da equipe original que contemplava apenas a UFRGS. A experiência prévia do Prof. Tessmann na temática e sua perspectiva e dedicação para participar do projeto e assim estreitar os laços de colaboração com a UFRGS e com os grupos dos outros países foi decisiva para a obtenção dos resultados preliminares.
A liderança do coordenador e desenvolvimentos oportunizados pelo projeto Prosul tem permitido um crescimento excepcional dos grupos brasileiros. Para exemplificar, em agosto de 2008 foram contempladas duas bolsas de Iniciação Científica para alunos atuarem diretamente no projeto. Em novembro de 2008, o coordenador foi contemplado no Edital Universal 2008, com um projeto componente inserido no âmbito do Projeto Prosul. A parceria com o Prof. DJ Tessmann resultou de uma proposta que foi agraciada no Edital 64-MAPA, sob a coordenação do grupo da UEM, para estudar fungos do gênero Fusarium na cultura do milho, sendo que diversas das técnicas foram desenvolvidas no âmbito do projeto Prosul. Em agosto de 2009, por meio de parceria com o Prof. Dauri J. Tessmann, foi integrado ao grupo da UFRGS um bolsista Posdoc Júnior com projeto aprovado na temática Fusarium em trigo e milho. Ainda, uma nova bolsa de Iniciação científica na UFRGS foi contemplada em 2009 até 2010 para a continuidade das atividades do projeto Fusarium em trigo. A experiência do grupo tem levado a ampliação das atividades para outras culturas em que o fungo Fusarium graminearum é importante, como a cultura da cevada.
Um trabalho de mestrado, conduzido pela pesquisadora Paula Astolfi, foi um resultado direto da parceria no projeto Prosul, uma vez que todos os trabalhos da dissertação foram conduzidos integralmente pela interação dos grupos brasileiros (trabalhos conduzidos nas duas Instituições do Brasil oportunizado pelas missões de trabalho) e destes com o grupo da Argentina, principalmente, que foi decisivo na capacitação da pesquisadora em formação. Os resultados preliminares foram e estarão sendo apresentados em eventos e assim que forem concluídos os trabalhos são esperadas diversas publicações em revistas internacionais. Resultados preliminares, principalmente os das análises do material do Brasil, foram apresentados no Congresso Brasileiro de Fitopatologia de 2009, no 2009 Fusarium head blight Forum, evento tradicional sobre a giberela do trigo realizado anualmente nos Estados Unidos, e também no European Fusarium Seminar realizado na Polônia em setembro de 2010, com a participação do Coordenador, Prof. Emerson Del Ponte e do Prof. Dauri Tessmann. Os
trabalhos com os isolados da Argentina e do Chile estão na fase de elaboração dos artigos científicos pois as atividades já foram conduzidas pelo grupo da Argentina (ANEXO 1).
Um dos pontos negativos verificados durante a execução do projeto foi uma relativa falta de balanço, das visitas de trabalhos entre pesquisadores dos três países. No momento da construção da proposta não havia uma interação prévia e consolidada de trabalho entre os grupos, o que teve que ser construído ao longo do tempo, principalmente considerando que o grupo argentino já possuía maior experiência prévia na temática geral, com uma natural posição de liderança no cenário da América do Sul com certo desconhecimento dos trabalhos no Brasil. O grupo da UFRGS está se estabelecendo e, em parceria com a UEM, tem obtido avanços notáveis e adquirindo confiança na relação de trabalho com o grupo argentino. Embora tenham sido propostas outras reuniões no Brasil ainda foram poucas as vindas de pesquisadores argentinos, apenas em duas ocasiões.
Outras limitações foram impostas por fatores que não se pode controlar como por exemplo a ausência da doença no campo em função de condições climáticas desfavoráveis em uma safra (por exemplo, as secas nos dois países) que dificultou a obtenção de material de campo. Outra dificuldade encontrada foi quanto à questão burocrática para envio de isolados fúngicos de um país para outro, no caso do Chile para a Argentina. No caso do Brasil não houve barreiras para a saída de material uma vez que no Brasil foi realizada a extração de DNA dos fungos, sendo levado apenas o DNA e não os fungos para a Argentina. No Brasil, a safra de 2009 tem se caracterizado com uma de epidemias de giberela o que tem oportunizado coletas de material no campo no RS e no PR em regiões em que comumente não ocorrem tantas epidemias, como no norte do PR. As atividades ainda em fase de finalização permitirá agregar informações importantes para o entendimento da dinâmica das populações do fungo em diferentes regiões do país.
9. CONSIDERAÇÕES SOBRE A RELEVÂNCIA DA PESQUISA
A condução do projeto e seus resultados têm contribuído significativamente com conhecimento inédito em estudos taxonômicos e toxigênicos das populações de F. graminearum causador da giberela do trigo na América do Sul. O conhecimento gerado tem permitido aprofundar sobre aspectos epidemiológicos e da genética da interação planta-patógeno de um fungo patogênico ao trigo e de importância no contexto atual no Brasil e no mundo. Sob o ponto de vista de políticas de saúde pública, o monitoramento de toxinas em alimentos ainda não é prevista em legislação e análises de risco que ainda não levam em conta o perfil toxigênico das populações uma vez que apenas DON tem sido considerada toxina-alvo em trigo e cevada. Os resultados alcançados até o momento mostram que outras toxinas de implicações toxicológicas mais sérias do que DON estão presente na região e os compostos sendo encontrados em grãos de trigo. O avanço no conhecimento dos aspectos epidemiológicos e genética populacional será importante para subsidiar estratégias de pesquisa e monitoramento de toxinas alvo por laboratórios de análises químicas e de qualidade de cereais de inverno e de verão. Estratégias de defesa sanitária vegetal do país, especialmente a cadeia de produção e comercialização dos respectivos cereais serão beneficiadas.
ANEXO 1
SUMÁRIO DAS ATIVIDADES CONDUZIDAS NA UNIVERSIDADE NACIONAL DE RIO CUARTO ENVIADO PELA PROFA. SOFIA CHULZE EM JANEIRO DE 2010.
Report of Activities done by the Argentinean group related to the PROSUL Project Activities done with the Argentinean strains
1. Isolation and Identification of Fusarium species from wheat samples with Fusarium head blight. The samples were collected from three commercial fields, two from Córdoba Province (Marcos Juarez and Villa Maria) and one from Buenos Aires Province (Pergamino), during the harvest season 2007.
2. Identification of the species belonging to Fusarium graminearum complex using specific primers (Fg16F/Fg16R)
3. Determination of the ability of the strains to produce deoxynivalenol (DON) and 3-acetyl Deoxynivalenol (3-ADON), 15-Acetyl Deoxynivalenol (15-ADON) and Nivalenol (NIV) by chemical analysis (HPLC and TLC)
4. Determination of the genotype of Fusarium graminearum strains to produce trichothecens using specific primers of the trichothecen biosynthetic pathway by PCR (genes Tri3, Tri5 and Tri7)
5. Study of the genetic diversity and population parameters estimation. Molecular markers generation.
Activities done with the Chilean strains
1. Identification of the species belonging to Fusarium graminearum complex using specific primers (Fg16F/Fg16R)
2. Determination of the ability of the strains to produce deoxynivalenol (DON) and 3-acetyl Deoxynivalenol (3-ADON), 15-Acetyl Deoxynivalenol (15-ADON) and Nivalenol (NIV) by chemical analysis (HPLC and TLC)
3. Determination of the genotype of Fusarium graminearum strains to produce trichothecens using specific primers of the trichothecen biosynthetic pathway by PCR (genes Tri3, Tri5 and Tri7)
4. Molecular markers generation (AFLP) Activities done with the Brasilian strains
1. Molecular markers generation (AFLP): genetic similarities and population parameters estimation.
ANEXO 2
ATA DA REUNIÃO FINAL DO PROJETO REALIZADO NO CHILE, PREPARADA PELO DR. RICARDO MADARIAGA
Tercera reunión y final, del Proyecto PROSUL realizada en Chillán , Chile, 15 al 18 de Diciembre de 2010.
Fuente de Finaciamiento , Prosul Project [Brasil] : Programa Sul-Americano de Apoio às Atividades de Cooperação em Ciência e Tecnologia
Título del Proyecto: “Diversidade genética e potencial toxigênico em populações de Fusarium graminearum,
agente causal da giberela do trigo na América do Sul”
>> Diversidad genética y potencial toxicogénico en poblaciones de Fusarium graminearum, agente causal de la giberelosis del trigo en América del Sur <<
Asistentes:
Pais Participante correo
Argentina Dra. Sofía Noemí Schulze Universidad de Rio Cuarto Argentina sofiachulze@yahoo.com
Dra. Adriana Torres Universidad de Rio Cuarto Argentina atorres@exa.unrc.edu.ar
Brasil Dr. Emerson del Ponte Universidad de Puerto Alegre emerson.delponte@ufrgs.br Dr. Daurí Jose Tessman Universidad de Maringa djtessmann@uem.br
Chile Dr. Ivan Matus Investigador INIA imatus@inia.cl
M.Sc. Mario Vega Profesor Universidad de Concepción mveha@udec.cl
Dra. Gisela Rios Profesora Universidad de Concepción grios@udec.cl Dr. Ernesto Moya Profesor Universidad Austral de Chile ernestomoya@uach.cl
Dr. Ricardo Madariaga Investigador INIA rmadaria@inia.cl
Nota:
La enfermedad Fusariosis de la Espiga conocida como “Golpe Blanco” en Argentina y Giberellosis en Brasil se ha informado como de ocurrencia solo ocasional en Chile. Sus capacidades destructivas de siembras de cereales se acentúan al contaminar con micotoxinas, venenos de hongos, la cosecha de las siembras dañadas. Por tres años se realizó un trabajo conjunto con estos países, donde se estudió diversos aspectos
epidemiológicos y filogenéticos en el Cono Sur de América. La Universidad de Rio Cuarto en Argentina se encuentra analizando la colección de aislamientos de Fusarium graminearum/ pseudograminearum/
culmorum de Chile, la ausencia de formación de peritecios, la nula amplificación con el primer especifico Fg16 de Fusarium graminearum sugiere que efectivamente la especie presente en Chile no corresponde a
Fusarium graminearum. No obstante, 30 aislamientos monoconidiales amplificaron el fragmento correspondiente a los genes Tri 3 y Tri 7. De ellos 23 corresponden al genotipo 15 acetyl DON y 7 al genotipo 3 acetyl DON.
ANEXO 3
