UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
HERBERT DE SOUSA MAGALHÃES
QUANTIFICAÇÃO DE NORATIRIOL NOS EXTRATOS METANÓLICOS DO CAULE DE Maclura Tinctoria E RAIZ DE
Mangifera indica
FORTALEZA
QUANTIFICAÇÃO DE NORATIRIOL NOS EXTRATOS METANÓLICOS DO CAULE DE Maclura tinctoria E RAIZ DE Mangifera indica
HERBERT DE SOUSA MAGALHAES
Dissertação submetida à coordenação do Programa de Pós-Graduação em Química como requisito para obtenção do título de mestre.
Orientador(a): Maria Teresa Salles Trevisan – UFC
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
RESUMO
Um meio de se evitar a oxidação excessiva das células e, assim, evitar doenças contra o câncer é a ingestão de substâncias chamadas antioxidantes. A mangiferina, tem apresentado um grande potencial antioxidante, bem como o noratiriol, sua aglicona. Daí surge a justificativa para se buscar fontes naturais dessas substâncias. Foram isolados cerca de 30 g de mangiferina da Mangifera indica através de extração a frio com etanol. Com ela foram feitos testes de conversão em noratiriol através de biotransformação porém, mostrando resultados negativos. Foram analisadas por HPLC os extratos metanólicos obtidos à quente de Maclura tinctoria estando o noratiriol presente apenas no caule que foi quantificado dando um valor de 1,56 % de noratiriol em massa. Um estudo paralelo foi realizado com a raiz da Mangifera indica que também apresentou noratiriol, pela primeira vez na espécie, porém em pequena quantidade que pela quantificação apresentou um valor de 0,0035 % de noratiriol em massa. Foram identificadas mais 14 substâncias neste extrato por padrões de HPLC como o ácido gálico, ácido gálico glicosilado, ácido 3,4-dihidroxibenzóico, metil galato, iriflofenona-3-C-β -glicosídeo, iriflofenona-3-C-(2-O-p-hidroxibenzoil)-β-D-glicosídeo, iriflofenona-3-C-(2-O-galoil)-β-D-glicosídeo, mangiferina, isomangiferina, 6-O-(p -hidroxibenzoil)mangiferina, metil mangiferina, naningerina, maclurina 3-C-(2-O -galoil)-β-D-glicosídeo e taxifolina.
ABSTRACT
A way to avoid the excessive oxidation of the cells and, so, avoid diseases like cancer is the intake of substances called antioxidants. Mangiferin has shown a great antioxidant potential, as well as norathyriol, your aglicone. Hence arises the justification for seeking natural sources of these substances. About 30 g of mangiferin were isolated from Mangifera indica through cold extraction with ethanol. Some tests of conversion into norathyriol were performed with it through biotransformation but showed negative results. The hot extracts of Maclura tinctoria parts were analyzed in HPLC, while norathyriol was present only in stem extract which was quantified yielding 1.56 % in mass. A parallel study was performed with the roots of Mangifera indica where was found, also, norathyriol for the first time in specie but in small amount yielding 0.0035 % of norathyriol in mass. Also were identified 14 more substances in this extract by HPLC standards like galic acid, galic acid glucoside, 3,4-dihydroxybenzoic acid, methyl galate, iriflofenone-3-C-β-glucoside, iriflofenone-3-C-(2-O-p-hydroxybenzoil)-β-D-glucoside, iriflofenone-3-C-(2-O-galoil)-β-D-glucoside, mangiferin, isomangiferin, 6-O-(p -hydroxybenzoil)mangiferin, methyl mangiferin, naningerin, maclurin 3-C-(2-O -galoil)-β-D-glucoside e taxifolin.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Conversão de mangiferina em noratiriol. 1 Figura 2 – Fotografia do caule da Maclura tinctoria. 3 Figura 3 – Fotografia de Mangifera indica 4 Figura 4 – Espectro de UV-VIS para o padrão de mangiferina 21 Figura 5 – Espectro de UV-VIS para o padrão de noratiriol 21 Figura 6 - Comparação entre o padrão de mangiferina e a mangiferina obtida 23 Figura 7. Comparação dos espectros de UV-VIS da mangiferina
padrão com a mangiferina obtida. 23
Figura 8 – Cromatogramas dos controles e amostras dos ensaios de biotransformação realizados com mangiferina
e iogurte pelo método MANG2 em 258 nm 32
Figura 9 – Cromatogramas do controle e amostras dos ensaios de biotransformação realizados com mangiferina dissolvida em DMSO, sem leite e
com aumento da quantidade de iogurte pelo método MANG2 em 258 nm. 33 Figura 10 – Cromatogramas do controle e das amostras
dos ensaios de biotransformação da mangiferina com
rúmen de vaca pelo método MANG2 em 258 nm. 34 Figura 11 – Extrato metanólico do caule da Maclura tinctoria
pelo método MANG2 em 258 nm. I: noratiriol. 35
Figura 12 – Cromatograma do extrato metanólico
da raiz da Mangifera indica pelo método MANG2 em 258 nm. I: noratiriol. 36 Figura 13 – Padrão de noratiriol pelo método MANG2 em 258 nm. 36 Figura 14 – Padrão de noratiriol no pelo método REAC em 258 nm. 36 Figura 15 – Compostos identificados no extrato metanólico
da raiz da Mangifera indica
.
37Figura 16 – Cromatograma da fração EECMT-AHA na coluna preparativa com uma injeção de 2 µL
Figura 17 – Cromatograma da coleta do pico de
noratiriol da fração EECMT-AHA no método MANG2
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Flavonoides e xantonas isoladas do gênero Maclura (Chlorophora). 5 Tabela 2 – Modo de preparo dos controles e
das amostras para os ensaios de biotransformação de mangiferina com iogurte. 25 Tabela 3 – Modo de preparo do controle e das amostras para os ensaios de biotransformação de mangiferina com rúmen de vaca. 25 Tabela 4 – Rendimentos do fracionamento de EECMT. 29 Tabela 5 – Frações e rendimentos do fracionamento de EECMT-A. 30 Tabela 6 – Rendimentos dos extratos a quente de Maclura tinctoria e
Mangifera indica. 35
Tabela 7 – Rendimento do noratiriol no caule da Maclura tinctoria e
raiz da Mangifera indica. 39
Tabela 8 – Rendimento de noratiriol na extração a frio do caule
LISTA DE FLUXOGRAMAS
Fluxograma 1 Método de obtenção de Mangiferina. 22 Fluxograma 2 Procedimento para realização dos testes de biotransformação. 26
LISTA DE ABREVIATURAS
AU Absorption Unit DMSO Dimetildulfóxido
ERO Espécies Reativas de Oxigênio
HPLC-DAD High Performance Liquid Chromatography com Diode Array Detector
MANG2 Método de eluição em HPLC
nm Nanômetro
Sumário
1. INTRODUÇÃO ... 1
2. CONSIDERAÇÕES BOTÂNICAS ... 3
2.1 Maclura Tinctoria ... 3
2.2 Mangifera indica ... 4
3. LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO ... 5
4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ... 20
4.1 Condições de operação do HPLC-DAD ... 20
4.2 Obtenção e caracterização da mangiferina ... 22
4.3 Ensaios de biotransformação ... 24
4.3.1 Reação da mangiferina com iogurte natural ... 24
4.3.2 Reação da mangiferina com rúmen de vaca ... 25
4.4 Estudo químico de diferentes partes de Maclura tinctoria e raiz de Mangifera indica ... 26
4.4.1 Preparação dos extratos ... 26
4.4.2 Análise dos constituintes das partes de Maclura tinctoria e Mangifera indica em HPLC-DAD... 28
4.5 Curva analítica e quantificação do norathyriol ... 28
4.6 Fracionamento cromatográfico de EECMT e isolamento do noratiriol ... 29
4.6.1 Métodos cromatográficos ... 29
4.6.2 Fracionamento cromatográfico de EECMT... 29
4.6.3 Fracionamento cromatográfico de EECMT-A ... 30
4.6.4 Isolamento do noratiriol... 30
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 31
5.1 Ensaios de biotransformação de mangiferina com iogurte e rúmen de vaca... 31
5.2 Análise dos extratos metanólicos a quente de Maclura tinctoria e Mangifera indica ... 35
5.2.1 Quantificação do noratiriol nos extratos a quente do caule de Maclura tinctoria e na raiz de Mangifera indica ... 37
5.3 Isolamento e quantificação do noratiriol a partir do extrato EECMT ... 39
1 1. INTRODUÇÃO
O câncer é uma doença que vem se tornando bastante comum hoje em dia e meios de prevenção ou mesmo de combate a esta doença têm se tornado foco de pesquisas no mundo todo. Um dos agentes causadores do câncer são as espécies reativas de oxigênio (ERO) que são moléculas que contem oxigênio na forma de radicais e peróxidos (DEVASAGAYAM et al, 2004). Estas espécies são geradas e eliminadas constantemente no nosso organismo e são importantes para manutenção das vias regulatórias (DICKINSON & CHANG, 2011). O excesso de tais substâncias no organismo provoca o chamado “estresse oxidativo”, que é um estado biológico onde o organismo não consegue conciliar a geração de espécies reativas de oxigênio com sua eliminação. O dano oxidativo dessas biomoléculas pode levar à inativação enzimática, mutação, rompimento de membrana e à morte celular (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999 apud CERQUEIRA et al., 2007).
Uma alternativa para amenizar ou restaurar esse equilíbrio é a ingestão de antioxidantes dietéticos que vão reagir com essas espécies e defender o organismo contra a oxidação causada pelas EROs. Os polifenóis são uma classe de substâncias que atuam como antioxidantes, porém sua biodisponibilidade em humanos é baixa e a atividade de seus metabólitos não foi totalmente esclarecida. A mangiferina é um polifenol glicosilado da classe das xantonas que tem apresentado um alto potencial antioxidante (SELLAMUTHU et al., 2013, ZHANG et al., 2013, LING et al., 2009). Ela pode ser encontrada em várias partes de Mangifera indica (mangueira) (BARRETO et al.,2008) e tem-se mostrado recentemente que sua aglicona, o noratiriol, pode ser obtida através de uma biotransformação pela microflora colônica de humanos saudáveis que faz a desglicosilação da mangiferina (DE SOUZA et al., 2012) (Figura 1).
Figura 1. Conversão de mangiferina em noratiriol.
2 O noratiriol tem apresentado resultados semelhantes aos da mangiferina como um antioxidante (DE SOUZA et al., 2012) mostrando, também, ser um fármaco em potencial relatando outras atividades benéficas como efeitos vaso relaxantes (Ko et al., 1991), supressor do câncer de pele (Li et al., 2011), apoptose de células cancerosas (Fu et al., 2012), etc. Porém, fontes comerciais de noratiriol são muito caras (€ 50.000/g disponível da China) o que causa uma certa inibição em pesquisas com este composto.
O ponto chave deste trabalho é achar uma fonte natural de noratiriol para que suas atividades possam ser estudadas mais a fundo. Utilizou-se mangiferina extraída da Mangifera indica em uma reação experimental com iogurte e rúmen de vaca, afim de que os microrganismos lá presentes pudessem realizar a quebra da ligação glicosídica e obter como produto o noratiriol. Outra forma de se tentar obter o noratiriol é realizar extrações das partes da Maclura tinctoria, um dos materiais botânicos utilizados neste trabalho. A Maclura tinctoria é uma planta da família das Moraceae conhecida como “tatajuba” e, segundo relatos anteriores (GOTTLIEB, et al., 1975), apresenta noratiriol em seu caule. Diversas partes foram analisadas e quantificadas a fim de se obter a melhor fonte de extração de noratiriol.
3 2. CONSIDERAÇÕES BOTÂNICAS
2.1 Maclura Tinctoria
Com um habitat predominantemente tropical, a família Moraceae apresenta cerca de 63 gêneros e 1.500 espécies. No Brasil, foram identificados 28 gêneros com cerca de 340 espécies, incluindo árvores, arbustos, ervas, trepadeiras e lianas (BARROSO et al. 2002 apud BATTILANI et al. 2006). O gênero estudado neste trabalho, a Maclura (também conhecida como Chlorophora), possui 11 espécies de ocorrência exclusivamente tropical. Nas Américas ocorrem 3 espécies, sendo que no Brasil ocorrem apenas duas: M. tinctoria e M. brasiliensis (CARVALHO, 2003 apud BATTILANI et al.)
A espécie Maclura tinctoria, vulgarmente conhecida como amoreira, amora-do-mato, taiúva ou tatajuba é uma espécie arbórea, dióica, espinhenta, lactescente, com 10 a 20 m de altura e 40 a 60 cm de diâmetro (CARVALHO, 2003). É empregado na medicina popular como cicatrizante e nas crises reumáticas utilizando-se a casca do caule e as folhas (BOURDY et al., 2004) e como anti-inflamatório e analgésico, particularmente nas dores de dentes, utilizando-se o látex (BOURDY et al., 2004; SANZ-BISET, 2009).
4 2.2 Mangifera indica
A família botânica Anacardiaceae compreende 70 gêneros e cerca de 700 espécies sendo que no Brasil são encontrados 15 gêneros e cerca de 70 espécies. São conhecidas por serem espécies frutíferas como a manga e caju.
A espécie Mangifera indica, conhecida como mangueira, é a espécie utilizada neste trabalho. Ela ocorre naturalmente ou cultivada em regiões tropicais e subtropicais e tem um dos mais importantes frutos do mundo no ramo comercial citada como sendo o fruto tropical com a segunda maior produção no mundo (JOSEPH & ABOLAJI, 1997). Seu fruto pode ser utilizado como alimento e as suas diversas partes têm propriedades medicinas como antiviral, bactericida, analgésico e anti-inflamatório (MAKARE et al. 2001).
5 3. LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO
No presente capítulo, serão listadas as estruturas de todos os flavonoides e xantonas encontrados no gênero Maclura utilizando o site de internet Scifinder como fonte de pesquisa. Os termos utilizados para as buscas foram: Maclura flavonoids e Chlorophora flavonoids para a busca de compostos da classe dos flavonoides em geral, utilizando os dois sinônimos para o gênero; Maclura xanthones e Chlorophora xanthones para a busca de compostos especificamente desta classe, também utilizando os dois sinônimos. As estruturas podem ser consultadas na Tabela 1.
Tabela 1. Flavonoides e xantonas isoladas do gênero Maclura (Chlorophora).
Nº Flavonoides (Isoflavonas) Espécie Referências
1 Auriculasina Maclura pomifera MONACHE et al., 1994
2 Osajina Maclura pomifera MONACHE et al., 1994
3 Pomiferina Maclura pomifera MONACHE et al., 1994 4 Scandenona Maclura pomifera MONACHE et al., 1994
5
5,4'-dihidroxi-2''-(1-hidroxi-1-metiletil)-3''-metoxifurano (4'',5''
(6,7) isoflavona Maclura pomifera LEE et al., 1998
6
5,7,4',2''-tetrahidroxi-6-[3''-methyl-3''-butenil]-isoflavona Maclura pomifera LEE et al., 1998
7
5,7,4'-trihidroxi-6-[3,3-DMA]-isoflavona Maclura pomifera LEE et al., 1998
8 Alpinum isoflavona Maclura tinctoria OYAMA et al., 2013
9 Derrona Maclura tinctoria OYAMA et al., 2013
10 Orobol Maclura tinctoria EL-SOHLY et al., 1999
11 Orobol 5,3'-di-O-metil-8-C
6
13 Wighteona Maclura tinctoria OYAMA et al., 2013
14
6-(2,2-dimetil-2H -cromen-6-il)- 2-(1-hidroxil-'-metiletil)-2,3-dihidro-5H
-furo[3,2-g]cromen-5-ona
Maclura tinctoria OYAMA et al., 2013
Nº Flavonoides (Flavononóis) Espécie Referências
15 Aromadendrina Maclura tinctoria EL-SOHLY et al., 1999
16 Dihidrokaempferol Maclura (Chlorophora)
tinctoria SANT’ANA et al., 1987
17 Dihidromorina Maclura tinctoria EL-SOHLY et al., 1999
18
4H-1-Benzopiran-4-ona, 2-(2,4-
dihidroxifenil)-3,5,7-trihidroxiflavona
Maclura (Chlorophora)
tinctoria SANT’ANA et al., 1987
19
4H-1-Benzopiran-4-ona, 2,3- dihidro-3,5,7-trihidroxi-2-(4-
hidroxifenil)-6-(3-metil-2-buten-1-il)
Maclura (Chlorophora)
tinctoria SANT’ANA et al., 1987
Nº Flavonoides (Flavonóis) Espécie Referências
20 Morina Maclura cochinchinensis
BUNYAPRAPHATSAR A et al., 2000
21 Licoflavonol Maclura tinctoria OYAMA et al., 2013
Nº Flavonoides (Flavanonas) Espécie Referências
7 24 Eriodictiol 7-O-β
-D-glucopiranosídeo Maclura tinctoria CIOFFI et al.,
25 Naningerina Maclura tinctoria CIOFFI et al.,
26 Naningerina 4'-O-β
-D-glucopiranosídeo Maclura tinctoria CIOFFI et al.,
27 8-Prenilnaringerina Maclura (Chlorophora)
tinctoria SANT’ANA et al., 1987 28 Steppogenina Maclura tinctoria EL-SOHLY et al., 1999
29 Steppogenina 4'-O
-β-D-glucosídeo Maclura tinctoria EL-SOHLY et al., 1999
30 (2S)-5,7-Dihidroxi-6-prenilflavanone
Maclura (Chlorophora)
tinctoria SANT’ANA et al., 1987
Nº Flavonoides (Flavonas) Espécie Referências
31
5,4'-dihidroxi-2''-(1-hidroxi-1-methilethil)-3''-metoxifurano
(4'',5'' (6,7) flavona Maclura pomifera LEE et al., 1998
32
5,7,2',4'-Tetrahidroxi-6-[3''-metilbut-3''-enil]-flavona Maclura pomifera LEE et al., 1998
33
5,7,4',2''-tetrahidroxil-6-[3''-metilbut-3''-enil]-flavona Maclura pomifera LEE et al., 1998
34
5,7,4'-trihidroxi-6,7-[2,2-dimetilcromeno]-flavona Maclura pomifera LEE et al., 1998
35
5,7,4'-trihidroxi-6-[3''-metilbut-3''-enil]-flavona Maclura pomifera LEE et al., 1998
36 6-C-Prenilapigenina Maclura (Chlorophora)
8
Nº Flavonoides (Chalconas) Espécie Referências
37
3'-(3-metil-2-butenil)-4'-O-β -D-
glucopiranosil-4,2'-dihidroxichalcona Maclura tinctoria CIOFFI et al.,
38
4'-O-β -D-(2''-acetil-6''-
cinamoil)glucopiranosil-4,2',3'-trihidroxichalcona Maclura tinctoria CIOFFI et al.,
39
4'-O-β-D-(2''-p
-
cumaroil)glucopiranosil-4,2',3'-trihidroxichalcona Maclura tinctoria CIOFFI et al.,
40
4'-O-β -D-(2''-p-cumaroil-6''-
acetil)glucopiranosil-4,2',3'-trihidroxichalcona
Maclura tinctoria CIOFFI et al.,
Nº Xantonas Espécie Referências
41 Jacareubina Maclura aurantiaca ARTOMONOVA et al., 1989
42 Tovoxantona Maclura aurantiaca ARTOMONOVA et al., 1989
43 Trapezifolixantona Maclura aurantiaca ARTOMONOVA et al., 1989
44 Alvaxantona Maclura aurantiaca
Maclura pomifera
TEIXEIRA, et al., 2005 ARTOMONOVA et al.,
1989
45 Macluraxantona Maclura aurantiaca Maclura pomifera
TEIXEIRA, et al., 2005 ARTOMONOVA et al.,
1989
46 Osajaxantona Maclura pomifera
TEIXEIRA, et al., 2005 DESHPANDE et al.,
9 47 Diacetato de Osajaxantona Maclura pomifera DESHPANDE et al.,
1973
48
Pirano[3,2-a]xanten-12(1H)-ona
2,3-dihidro-5,9,11-trihidroxi-1,1-dimetil Maclura pomifera
DESHPANDE et al., 1973
49
Pirano[3,2-a]xanten-12(1H)-ona
5,9,11-trimetóxi-1,1-dimetil Maclura pomifera DESHPANDE et al., 1973
50 Toxiloxantona B Maclura pomifera DESHPANDE et al., 1973
51 Toxiloxanthona C Maclura pomifera TEIXEIRA, et al., 2005
52 Toxiloxantona D Maclura pomifera DESHPANDE et al., 1973
53
2H,6H -Pirano[3,2-b]xanten-6-ona,
5,10-dimetóxi-2,2-dimetil-(8CI, 9CI) Maclura pomifera
DESHPANDE et al., 1973
54
5H-furo[3,2-b]xanten-5-ona 2,3-
dihidro-4,8,9-trimetoxy-2,3,3-trimetil Maclura pomifera
DESHPANDE et al., 1973
55 8-preniltoxiloxantona Maclura pomifera TEIXEIRA, et al., 2005
56
9H-xanten-9-ona,
1,3,5-trihidroxi-2,4-bis(3-metil-2-buten-1-il) Maclura pomifera DESHPANDE et al., 1973
57 Noratiriol Maclura (Chlorophora)
10
(1)
(2)
(3)
(4)
11
(7) (8)
(9)
(10)
12
(13) (14)
(15)
(16)
13
(19)
(20)
(21)
(22)
(23)
14
(25)
(26)
(27) (28)
15
(31) (32)
(33) (34)
16
(37)
(38)
(39) (40)
(41)
17
(43)
(44)
(45)
(46)
18
(49) (50)
(51) (52)
19
(55)
(56)
20 4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
4.1 Condições de operação do HPLC-DAD
21 Figura 4. Espectro de UV-VIS para um padrão de mangiferina.
Figura 5. Espectro de UV-VIS para um padrão de noratiriol.
258 nm
278 nm 340 nm
278 nm 258 nm
22 4.2 Obtenção e caracterização da mangiferina
A mangiferina utilizada nos ensaios de biotransformação foi obtida através de extração etanólica a frio da casca do caule da Mangifera indica onde esta permaneceu em contato com o solvente por 7 dias para cada extração (Fluxograma 1). Foram feitas 3 extrações (utilizando 7 litros de etanol em cada) para a primeira leva de material (cerca de 15 Kg) e mais 3 extrações para a segunda leva de material (cerca de 15 Kg). Os extratos foram concentrados em evaporador rotativo onde grande parte do solvente foi recuperado podendo ser utilizado em outros experimentos. Ao ser concentrado, o extrato apresentava um precipitado amarelado, que se presumia ser mangiferina, o qual foi lavado com Metanol P.A. e o sobrenadante descartado. Foi feita a caracterização do precipitado amarelo injetando-se uma pequena quantidade de uma solução do mesmo em HPLC e comparando-se o cromatograma com o de um padrão de mangiferina adquirido do German Cancer Research Center (Figura 6). O cromatograma da mangiferina obtida mostrou-se semelhante ao cromatograma do padrão de mangiferina, porém para uma mais acurada caracterização comparou-se o espectro de UV-VIS da mangiferina padrão (Figura 4) com o da mangiferina obtida (Figura 7).
Fluxograma 1. Método de obtenção de Mangiferina a partir da casca do caule de Mangifera indica.
30 kg de material 7 L de etanol
7 dias Filtração Evaporação do
solvente à pressão reduzida em sistema
rotativo
Descarte do sobrenadante e lavagem do ppt com
metanol P.A. Casca do caule
23 Figura 6. Comparação entre o padrão de mangiferina e a mangiferina obtida.
Figura 7. Comparação dos espectros de UV-VIS da mangiferina padrão com a mangiferina obtida.
Padrão de a giferi a
Ma giferi a obtida
Mangiferina padrão de
24 4.3 Ensaios de biotransformação
4.3.1 Reação da mangiferina com iogurte natural
Foram preparados 4 controles e 3 amostras em triplicata em tubos Falcon para o ensaio de biotransformação da mangiferina com iogurte. O controle 1-CI foi preparado com 40 mL de água destilada e 50 mg de mangiferina; o controle 2-CI com 20 mL de água destilada, 20 mL de leite e 50 mg de mangiferina; o controle 3-CI com 40 mL de leite e 50 mg de mangiferina; o controle 4-CI com 40 mL de água e uma medida de iogurte (~3 g); a amostra 1-AI com 40 mL de água destilada, 50 mg de mangiferina e uma medida de iogurte; a amostra 2-AI com 20 mL de água destilada, 20 mL de leite, 50 mg de mangiferina e 1 medida de iogurte; a amostra 3-AI com 40 mL de leite, 50 mg de mangiferina e uma medida de iogurte.
As amostras e os controles foram colocados em estufa a 45 ºC por 15 minutos antes de se adicionar o iogurte. Em seguida, foram colocados sob ausência de luz em repouso em estufa por 6 horas a 45 ºC. Após esse tempo, os tubos foram retirados e congelados para cessar a reação. Logo após, os tubos foram centrifugados e 1 mL de cada sobrenadante foi retirado e colocado em um tubo Eppendorf onde foi centrifugado novamente. O sobrenadante dessa última centrifugação foi retirado e um volume de 10 µ L foi injetado em HPLC-DAD pelo método MANG2 e analisado em comprimentos de onda de 258, 278 e 340 nm.
25 Tabela 2. Modo de preparo dos controles e das amostras para os ensaios de biotransformação de mangiferina com iogurte.
Água destilada Leite DMSO Iogurte Mangiferina
Controle 1-CI 40 mL - - - 50 mg
Controle 2-CI 20 mL 20 mL - - 50 mg
Controle 3-CI - 40 mL - - 50 mg
Controle 4-CI 40 mL - - ~3 g -
Controle 5-CI 40 mL - 1 mL - 50 mg
Amostra 1-AI 40 mL - - ~3 g 50 mg
Amostra 2-AI 20 mL 20 mL - ~3 g 50 mg
Amostra 3-AI - 40 mL - ~3 g 50 mg
Amostra 4-AI 40 mL - 1 mL ~3 g 50 mg
Amostra 5-AI 40 mL - 1 mL ~6 g 50 mg
Amostra 6-AI 40 mL - 1 mL ~15 g 50 mg
4.3.2 Reação da mangiferina com rúmen de vaca
Foram preparadas 4 amostras para a reação da mangiferina com rúmen de vaca e um controle. O controle 1-CR foi preparado utilizando 10 mL de uma solução 1 mg/mL de mangiferina dissolvida em DMSO com 30 mL de água destilada. Para as amostras 1-AR, 2-1-AR, 3-AR e 4-AR foram acrescentados 1, 2, 5 e 10 mL, respectivamente, de rúmen de vaca. O esquema de preparo do controle e das amostras pode ser visto na Tabela 3.
Tabela 3. Modo de preparo do controle e das amostras para os ensaios de biotransformação de mangiferina com rúmen de vaca.
Água destilada Rúmen Mangiferina (1 mg/mL)
Controle 1-CR 30 mL - 10 mL
Amostra 1-AR 30 mL 1 ml 10 mL
Amostra 2-AR 30 mL 2 mL 10 mL
26 O procedimento seguinte foi o mesmo realizado nas reações com iogurte e o fluxograma 2 ilustra este procedimento.
Fluxograma 2. Procedimento para realização dos testes de biotransformação com iogurte e rúmen de vaca.
4.4 Estudo químico de diferentes partes de Maclura tinctoria e raiz de Mangifera indica
4.4.1 Preparação dos extratos
Foram obtidos os extratos hexânicos e metanólicos da casca do caule, caule, folhas e galhos jovens de Maclura tinctoria e da raiz de Mangifera indica através de sistema Soxhlet (BARRETO et al., 2008). Foram realizadas três extrações de 100 mL de solvente para 10 g de material seco. Os extratos obtidos foram concentrados em evaporador rotativo e armazenados a uma temperatura de 3 ºC. Foi realizada uma análise qualitativa da seiva dissolvendo-a em metanol de grau HPLC e injetando um volume de 10 µ L em HPLC-DAD. O fluxograma 3 ilustra este procedimento.
1-CI 2-CI 3-CI 4-CI 5-CI 1-AI 2-AI 3-AI 4-AI 5-AI 6-AI 1-CR 1-AR 2-AR 3-AR
ESTUFA
4 ºC por 7 hµL
27 Fluxograma 3. Procedimento de obtenção dos extratos à quente de Maclura tinctoria e
Mangifera indica.
Maclura tinctoria
Casca do
Caule Caule Folhas Galhos Raiz
Extração
hexânica Torta
Extração
hexânica Torta
Extração
hexânica Torta
Extração
hexânica Torta
Extração
hexânica Torta
Extração metanólica Extração metanólica Extração metanólica Extração metanólica Extração metanólica
EHCCMT EHCMT EHFMT EHGMT EHRMT
EMCCMT EMCMT EMFMT EMGMT EMRMT
Mangifera
indica Raíz
Extração hexânica
EHRMI
28 Outras extrações, desta vez a frio, foram feitas com 328 g de caule da Maclura tinctoria com hexano (1x500mL) e etanol (3x500mL). Para cada extração deixou-se o solvente em contato com o material seco por uma semana. Foram o extrato hexânico do caule da Maclura tinctoria (EHCMT) e o extrato etanólico do caule da Maclura tinctoria (EECMT). Após a obtenção dos extratos, os mesmos foram concentrados em evaporador rotativo e armazenados a uma temperatura de 3 ºC, como mostrado no fluxograma 4.
Fluxograma 4. Procedimento para obtenção dos extratos a frio de Maclura tinctoria.
4.4.2 Análise dos constituintes das partes de Maclura tinctoria e Mangifera indica em HPLC-DAD
Os extratos, depois de secos, foram dissolvidos em metanol de grau HPLC a uma concentração de 10 mg/mL. As amostras foram colocadas em vial e um volume de 10 µ L foi injetado no HPLC-DAD e analisados em comprimentos de onda de 258, 278 e 340 nm.
4.5 Curva analítica e quantificação do noratiriol
Para a quantificação do noratiriol foi construída uma curva analitica com um padrão adquirido do German Cancer Research Center na Alemanha. Foram usadas soluções com o padrão de noratiriol nas concentrações de 0.0025, 0.005, 0.0125, 0.025, 0.0375 e 0.05 mg/mL. Cada solução preparada teve um volume de 10 µL injetado em HPLC-DAD pelo método MANG2 e os dados obtidos no cromatograma foram introduzidos em no software Microcal Origin 6.0 para a obtenção do gráfico que relaciona a área do pico da substância com a concentração da solução correspondente a cada comprimento de onda utilizado na análise. Com o extrato metanólico do caule da Maclura
Maclura
tinctoria Caule
Extração hexânica
EHCMT-2
Torta Extração
29 tinctoria (EMCMT) injetado em HPLC a uma concentração de 10 mg/mL e o extrato metanólico da raiz da Mangifera indica (EMRMI) injetado em HPLC a uma concentração de 10 mg/mL, foram feitas as quantificações de noratiriol de acordo com a curva analítica construída.
4.6 Fracionamento cromatográfico de EECMT e isolamento do noratiriol
4.6.1 Métodos cromatográficos
O fracionamento dos extratos foi realizado em cromatografia de adsorção em coluna gravitacional e a vácuo com tamanhos e diâmetros compatíveis com a quantidade de amostra. Foi utilizada sílica 60 (63-200 µm) da marca VETEC como fase estacionária do processo cromatográfico.
4.6.2 Fracionamento cromatográfico de EECMT
Uma porção do extrato EECMT (26,1434 g) foi adsorvido em 26 g de sílica e acondicionado em 50 g de sílica em um sistema de filtração a vácuo. Os solventes utilizados para a eluição foram hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol, rendendo 4 frações mostradas na Tabela 4
Tabela 4. Rendimentos do fracionamento de EECMT.
Solvente Fração Massa (g) Rendimento (%)
Hexano EECMT-H 0,0058 0,02
Diclorometano EECMT-D 0,0912 0,3
Acetato de etila EECMT-A 15,2914 58,5
Metanol EECMT-M 7,1412 27,3
30
4.6.3 Fracionamento cromatográfico de EECMT-A
Uma porção de 15,2914 g do extrato EECMT-A obtido foi adsorvido em 15 g de sílica e em seguida foi acondicionado em 150 g de sílica em uma coluna de vidro. Os eluentes utilizados no fracionamento foram hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol com algumas combinações entre si foram feitas para se obter uma melhor separação. As 9 frações obtidas são mostradas na Tabela 5.
Tabela 5. Frações e rendimentos do fracionamento de EECMT-A.
Solvente Fração Frações reunidas Massa (g)
Hexano/AcOEt (15%) 01 – 200 EECMT-AHA (304 – 438) 1,3127 Hexano/AcOEt (20%) 201 – 218
Hexano/AcOEt (25%) 219 – 236 Hexano/AcOEt (30%) 237 – 272 Hexano/AcOEt (35%) 273 – 447 Hexano/AcOEt (40%) 448 – 489 Hexano/AcOEt (45%) 490 - 535
4.6.4 Isolamento do noratiriol
31 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Ensaios de biotransformação de mangiferina com iogurte e rúmen de vaca
A biotransformação da mangiferina em noratiriol pode ser feita através da microflora intestinal de humanos saudáveis (DE SOUZA et al., 2012) e, também, de porcos (BOCK et al., 2008, BOCK & TERNES, 2010). Porém, devido à falta de um ambiente adequado para manipulação de substratos que possam ser patogênicos, procurou-se realizar alguns métodos que pudessem ser trabalhados em segurança. Os experimentos foram realizados com iogurte natural comercial e rúmen de vaca. Verificou-se no iogurte natural e no rúmen de vaca Verificou-se as bactérias ali contidas poderiam realizar a conversão de mangiferina em noratiriol.
32 Figura 8. Cromatogramas dos controles e amostras dos ensaios de biotransformação realizados com mangiferina e iogurte pelo método MANG2 em 258 nm. CI: 40 mL de água e 50 mg de mangiferina, 1-AI: 40 mL de água, 50 mg de mangiferina e uma medida de iogurte.
Um outro experimento foi realizado ainda com iogurte porém, sem leite e dissolvendo-se a mangiferina em DMSO, já que ela não se dissolveu bem em água. O leite foi retirado para deixar a reação com menos interferência e a quantidade de iogurte utilizada foi aumentada gradualmente. O método de comparação foi o mesmo e pôde-se observar que os cromatogramas das reações não apresentaram mudanças significativas ou aparecimento de outro pico quando comparados com o controle (Figura 9). Para o resultado positivo esperava-se que ocorresse o aparecimento do pico de noratiriol nos cromatogramas das misturas reacionais.
1-CI
33 Figura 9. Cromatogramas do controle e amostras dos ensaios de biotransformação realizados com mangiferina dissolvida em DMSO, sem leite e com aumento da quantidade de iogurte pelo método MANG2 em 258 nm. 5-CI: 40 mL de água, 50 mg de mangiferina e 1 mL de DMSO, 4-AI: 40 mL de água, 50 mg de mangiferina, 1 mL de DMSO e uma medida de iogurte (~3 g) , 5-AI: 40 mL de água, 50 mg de mangiferina, 1 mL de DMSO e duas medidas de iogurte, 6-AI: 40 mL de água, 50 mg de mangiferina, 1 mL de DMSO e 5 medidas de iogurte.
Comparando-se o cromatograma do controle com os das amostras, pode-se perceber que não houve alteração no perfil dos cromatogramas das amostras em relação ao controle. Mesmo aumentando-se a quantidade de iogurte utilizada e removendo interferências da mistura reacional, não foi possível obter o produto de biotransformação da mangiferina da forma esperada nas condições estabelecidas.
5-CI
4-AI
5-AI
34 Buscando novos meios de encontrar um microrganismo que faça a biotransformação da mangiferina em noratiriol, foi utilizado o rúmen de vaca em diferentes quantidades para esses ensaios. Os cromatogramas podem ser vistos na Figura 10.
Figura 10. Cromatogramas do controle e das amostras dos ensaios de biotransformação da mangiferina com rúmen de vaca pelo método MANG2 em 258 nm. 1-CR: 30 mL de água e 10 mL de mangiferina 1 mg/mL, 1-AR: 30 mL de água, 10 mL de mangiferina 1 mg/mL e 1 mL de rúmen, 2-AR: 30 mL de água, 10 mL de mangiferina 1 mg/mL e 2 mL de rúmen, 3-AR: 30 mL de água, 10 mL de mangiferina 1 mg/mL e 5 mL de rúmen.
Como pode ser observado, não houve o aparecimento de um outro pico nos cromatogramas mesmo com a dissolução da mangiferina em DMSO, indicando que não ocorreu a biotransformação da mangiferina da forma esperada com o rúmen de vaca.
1-CR
1-AR
2-AR
35 5.2 Análise dos extratos metanólicos a quente de Maclura tinctoria e Mangifera indica
Os extratos hexânicos e metanólicos das extrações a quente de Maclura tinctoria e Mangifera indica depois de secos foram pesados. As massas dos extratos e os rendimentos podem ser consultados na Tabela 6. Os extratos e a análise qualitativa da seiva dissolvida em metanol foram injetados em HPLC numa concentração de 10 mg/mL dissolvidos em metanol de grau HPLC utilizando coluna de fase reversa. De todos os extratos analisados o noratiriol foi identificado apenas no caule da Maclura (Figura 11) e na raiz da Mangifera (Figura 12), sendo nesta última identificado pela primeira vez na espécie. A Figura 13 mostra o cromatograma de um padrão de noratiriol a 258 nm pelo método MANG2 e a Figura 14 em anexo mostra o padrão de noratiriol a 258 nm pelo método REAC para fins de comparação.
Tabela 6. Rendimentos dos extratos a quente de Maclura tinctoria e Mangifera indica.
Material:
Maclura tinctoria Massa inicial (g) Extrato (g)
Massa do
extrato (g) Rendimento (%)
Casca do caule 10,0055 Hexânico 0,3591 3,58
Metanólico 1,1872 11,86
Caule 10,0001 Hexânico 0,0310 0,31
Metanólico 2,4687 24,68
Folha 9,2547 Hexânico 0,3791 4,09
Metanólico 0,7684 8,30
Galho 10,0000 Hexânico 0,1040 1,04
Metanólico 0,5626 5,62
Material:
Mangifera indica Massa inicial (g) Extrato (g)
Massa do
extrato (g) Rendimento (%)
Raiz 10,0024 Hexânico 0,0193 0,19
Metanólico 0,7258 7,25
Figura 11. Extrato metanólico do caule da Maclura tinctoria pelo método MANG2 em 258 nm. I: noratiriol.
36 Figura 12. Cromatograma do extrato metanólico da raiz da Mangifera indica pelo método MANG2 em 258 nm. I: noratiriol.
Figura 13. Padrão de noratiriol pelo método MANG2 em 258 nm.
Figura 14. Padrão de noratiriol no pelo método REAC em 258 nm. I: noratiriol
Em parceria com o German Cancer Research Center, várias outras substâncias puderam ser identificadas através de padrões de HPLC-MS no extrato metanólico da raiz da Mangifera. As substâncias identificadas foram: ácido gálico, ácido gálico glicosilado, ácido 3,4-dihidroxibenzóico, metil galato, iriflofenona-3-C-β-glicosídeo, iriflofenona-3-C-(2-O-p-hidroxibenzoil)-β-D-glicosídeo, iriflofenona-3-C-(2-O-galoil)-β-D-glicosídeo, mangiferina, isomangiferina, 6-O-(p-hidroxibenzoil)mangiferina, metil mangiferina, naningeria, maclurina 3-C-(2-O-galoil)-β-D-glicosídeo e taxifolina. A Figura 15,
37 apresenta a estrutura de cada um desses compostos bem como o pico de massa principal obtido por HPLC-MS.
Figura 15 Compostos identificados no extrato metanólico da raiz da Mangifera indica. (1) ácido gálico, (2) ácido gálico glicosilado, (3) ácido 3,4-dihidroxibenzóico, (4) metil galato, (5) iriflofenona-3-C-β -glicosídeo, (6) iriflofenona-3-C-(2-O-p-hidroxibenzoil)-β-D-glicosídeo, (7) iriflofenona-3-C-(2-O-galoil)-β-D-glicosídeo, (8) mangiferina, (9) isomangiferina, (10) 6-O-(p-hidroxibenzoil)mangiferina, (11) metil mangiferina, (12) naningeria, (13) maclurina 3-C-(2-O-galoil)-β-D-glicosídeo, (14) taxifolina e (15) noratiriol.
1 (M=170)
2 (M=332)
3 (M=154)
4 (M=184)
5 (M=408) 6 (M=560)
7 (M=528)
8 (M=422)
9 (M=422)
10 (M=542)
38
5.2.1 Quantificação do noratiriol nos extratos a quente do caule de Maclura tinctoria e na raiz de Mangifera indica
A quantidade de noratiriol presente nas referidas partes pôde ser calculada utilizando a curva analítica construída em HPLC utilizando-se o método MANG2. Desta curva, obteve-se 3 equações, uma para cada comprimento de onda, que relacionam a concentração (X) com a área do pico (Y). Para o comprimento de onda de 258 nm utilizou-se a equação (1), para o comprimento de onda de 278 nm utilizou-se a equação (2) e para o comprimento de onda de 340 nm utilizou-se a equação (3).
Y = 38352 . X (1)
Y = 10290 . X (2)
Y = 9745 . X (3)
12 (M=272)
13 (M=576)
14 (M=304)
39 A área do pico I (noratiriol) no extrato metanólico do caule da Maclura corresponde a 24771,7 mAU.s num comprimento de onda de 258 nm. Aplicando este valor de área na equação (1) obtém-se o valor da concentração de noratiriol que é de 0,64 mg/mL. Em 10 mg de extrato há uma massa de 0,64 mg de noratiriol, fazendo-se a proporção para todo o extrato (2,4687g) tem-se 0,158 g de noratiriol no extrato e, consequentemente, em todo o material inicial (10,0001 g). A área do pico I do extrato metanólico da raiz da Mangifera corresponde a 188 mAU.s num comprimento de onda de 258 nm. Aplicando este valor de área na equação (1) obtém-se um valor de concentração de noratiriol de 0,0049 mg/mL. Em 10 mg de extrato há uma massa de 0,0049 mg de noratiriol, fazendo-se uma proporção para todo o extrato (0,7258 g) tem-se 3,5 x 10-4 g de noratiriol e, consequentemente, em todo o material inicial (10,0024 g). Os rendimentos podem ser consultados na Tabela 7.
Tabela 7. Rendimento do noratiriol no caule da Maclura tinctoria e raiz da Mangifera indica.
Material:
Maclura tinctoria Massa inicial (g)
Massa de
noratiriol (g) Rendimento (g/Kg) Rendimento (%)
Caule 10,0001 0,158 15,8 1,58
Material:
Mangifera indica Massa inicial (g)
Massa de
noratiriol (g) Rendimento (g/Kg) Rendimento (%)
Raiz 10,0024 3,5 x 10-4 0,035 0,0035
5.3 Isolamento e quantificação do noratiriol a partir do extrato EECMT
40 I
Depois de seca, um sólido fino marrom se formou rendendo uma massa de 1,3127 g. Este sólido foi dissolvido em metanol de grau HPLC e 10 µL dessa solução foram injetados em HPLC pelo método REAC para uma análise qualitativa. O cromatograma mostrou vários picos dentre eles o noratiriol, estando este bem separado dos demais. Iniciou-se então o processo de isolamento do noratiriol. Uma solução de 50 mg/mL teve um volume de 2 µL injetados em HPLC agora em uma coluna preparativa utilizando o método REAC2 para se ter uma ideia do perfil do cromatograma e saber em que tempo poderia ser feita a coleta (Figura 16). Percebeu-se que utilizando a acetonitrila no lugar de metanol pôde-se obter um melhor resultado na separação dos picos Com base no cromatograma realizado em 258 nm, iniciou-se a coleta aos ~9,5 min e encerrou-se aos ~10,1 min. A coleta começou a ser realizada injetando-se 50 µL dessa mesma solução. Este processo foi realizado 15 vezes e, em seguida, a amostra obtida foi secada a temperatura ambiente gerando um sólido fino e amarelo claro que rendeu 13,6 mg. Este sólido foi dissolvido novamente em metanol de grau HPLC e analisado em HPLC com coluna analítica pelo método MANG2 com uma coinjeção do padrão de noratiriol utilizando acetonitrila no lugar de metanol para diminuir o tempo de retenção. O cromatograma mostrou apenas um pico (Figura 17) o qual foi confirmado ser o noratiriol por comparação de padrão em HPLC.
41 Figura 17. Cromatograma da coleta do pico de noratiriol da fração EECMT-AHA no método MANG2 em 258 nm usando acetonitrila no lugar de metanol.
O rendimento de noratiriol pode ser consultado na Tabela 8. Como foram injetados 50 µ L por 15 vezes, a massa de 13,6 mg de noratiriol corresponde a 750 µ L (15 x 50 µL) portanto, em 1 mL que continha 50 mg da fração EECMT-AHA tem-se 18,1 mg e, proporcionalmente, 475 mg de noratiriol em toda a fração. Logo, esses 475 mg estão contidos em 26,1434 g do extrato EECMT, fazendo-se a proporção, tem-se 901 mg de noratiriol em todo o extrato. Este extrato foi obtido de 328 g do caule de Maclura tinctoria, portanto em 1 kg de caule, pode ser obtida uma massa de 2,7469 g de noratiriol.
Tabela 8: Rendimento de noratiriol na extração a frio do caule de Maclura tinctoria.
Material:
Maclura tinctoria
Massa inicial (g)
Massa de noratiriol (g)
Rendimento (g/Kg)
Rendimento (%)
Caule 328 0,901 2,7469 0,27
42 6. CONCLUSÕES
As tentativas de se conseguir noratiriol a partir de biotrasnformação utilizando iogurte natural comercial e rúmen de vaca mostraram resultados negativos na obtenção do produto esperado e nas condições estabelecidas.
Pôde-se identificar o noratiriol no caule da Maclura tinctoria e na raiz de Mangifera indica, sendo nesta última, identificado pela primeira vez na espécie.
A quantificação de noratiriol mostrou um maior rendimento na extração a quente, sendo esta cerca de 6 vezes maior que a extração a frio.
Com auxílio de HPLC em coluna preparativa, conseguiu-se isolar o noratiriol do caule de Maclura tinctoria.
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