FÁBIO LEANDRO SANTOS FENNER
PERFIL DA PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO (
·NO) PELO CEREBELO NA PROGRESSÃO DO ESTADO
CAQUÉTICO INDUZIDO POR TUMOR DE WALKER -256
LONDRINA 2009
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FABIO LEANDRO SANTOS FENNER
PERFIL DA PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO (
·NO) PELO CEREBELO NA PROGRESSÃO DO ESTADO
CAQUÉTICO INDUZIDO POR TUMOR DE WALKER -256
Dissertação apresentada no Curso de Pós- Graduação Stricto Sensu em Patologia Experimental, Departamento de Ciências Patológicas da Universidade Estadual de Londrina, como requisito final à obtenção do título de Mestre.
Orientadora: Profa. Dra. Alessandra Lourenço Cecchini Armani
LONDRINA 2009
Catalogação na publicação elaborada pela Divisão de Processos Técnicos da Biblioteca Central da Universidade Estadual de Londrina.
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
F336p Fenner, Fábio Leandro Santos.
Perfil da produção de óxido nítrico (NO) pelo cerebelo na progressão do estado caquético induzido por tumor de Walker-256 / Fábio Leandro Santos Fenner. – Londrina, 2009.
57 f. : il.
Orientador: Alessandra Lourenço Cecchini Armani.
Dissertação (Mestrado em Patologia Experimental) − Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Patologia Experimental, 2009.
Inclui bibliografia.
1. Óxido nítrico – Teses. 2. Caquexia – Teses. 3. Câncer – Patologia experi- mental – Teses. 4. Cerebelo – Teses. I. Armani, Alessandra Lourenço Cecchini.
II. Universidade Estadual de Londrina. Centro de Ciências Biológicas. Pro- grama de Pós-Graduação em Patologia Experimental. III. Título.
CDU 616-092
PERFIL DA PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO (
·NO) PELO CEREBELO NA PROGRESSÃO DO ESTADO
CAQUÉTICO INDUZIDO POR TUMOR DE WALKER -256
Dissertação apresentada ao Curso de Pós- Graduação Stricto Sensu em Patologia Experimental, Departamento de Ciências Patológicas da Universidade Estadual de Londrina, como requisito final à obtenção do título de Mestre.
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Marli Cardoso Martins Pinge Universidade Estadual de Londrina
Prof. Dr. Isaias Dichi Universidade Estadual de Londrina
Profa. Dra. Alessandra Lourenço Cecchini Armani Universidade Estadual de Londrina
Londrina, 10 de julho de 2009
Porém, eu, Senhor, esperei em Vós, por causa da Vossa Lei, e porque em Vós tudo é clemência.
Esperou a minha alma no Senhor, susteve-se a minha alma na Sua palavra. Amém
AGRADECIMENTOS
A Profa. Dra. Alessandra Lourenço Cecchini Armani pela sua imprescindível orientação, instrução e encorajamento durante todas as etapas deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Rubens Cecchini pelo valioso suporte durante a realização deste trabalho.
A Profa. Flávia Alessandra Guarnier pela disponibilidade e contribuição essencial na realização deste trabalho e na minha formação científica.
A minha família que sempre me apoiou e colaborou em todas as horas e com todas as suas forças para meu êxito. Este trabalho não seria realizado se não fosse vocês.
Aos estimados amigos Vera Lúcia Hideo Tatakihara, Roberto Iemitsu Tatakihara, Marcelo Abbá Macioszek pela amizade sincera e confortante nas horas mais difíceis.
A Profa. Alissana Ester Iakmiu Camargo pelas instruções fundamentais no início da pesquisa.
Ao Prof. Alexandre Yukio Saito pela sua colaboração em informática.
Aos amigos e técnicos Jesus Antonio Vargas e Pedro Sebastião Raimundo Dionízio Filho pela disponibilidade e ajuda nos experimentos e na manutenção dos animais. Deus abençoe vocês sempre!
Aos amigos da pós-graduação: Andrea Cristina Koishi, Carolina Panis, Gabriela Gonçalves de Oliveira, Jacqueline Bueno Ferreira, Jair Tonon, Juliana Laino do Val Carneiro, Juliana Torres Tomazi Fritzen, Karen Brajão de Oliveira, Luiz Antonio Custódio, Maria Claudia N Dutra de Menezes, Sandra Regina Lepri, Sergio Marques Borghi, Tatiane Ferreira Petroni, Thiago Yuiti Castilho Massuda.
A Profa. Dra. Marli Cardoso Martins Pinge e Profa. Dra. Helenir Medri de Souza pelas orientações indispensáveis no momento de escrever a dissertação.
Ao corpo docente do Mestrado em Patologia Experimental: Profa. Dra. Eiko Nakagawa Itano,
Prof. Dr. Emerson José Venancio, Profa. Dra. Halha Saridakis, Profa. Dra. Ionice Felipe, Prof.
Dr. Leonardo Sturion, Profa. Dra. Maria Angelica Ehara Watanabe, Prof. Dr. Mario Augusto Ono, Prof. Dr. Phileno Pinge Filho, Prof. Dr. Rubens Cecchini, Profa. Dra. Tânia Longo Mazzuco.
Aos amigos do laboratório: Cláudia Roberta Brunnquell, Daniel Kogashi, Franciele Caroline Rodrigues, Lucas Freitas de Freitas, Márcio Tomáz de Aquino, Pâmela Micheletti, Patricia da Silva Peres, Rafaela C. Cayus, Renato Cardoso, Sara Bernardes, Tatiane De Rossi, Vânia Aparecida Terra Malachias, Vitor Basso Schul.
A todos os amigos do Laboratório de Microbiologia do Hospital Universitário que me apoiaram e permitiram fazer esta pós-graduação.
Aos amigos do Biotério do Hospital Universitário, Donizete Rodrigues Belitardo e Izaltino Farias que sempre demonstraram disposição e eficiência.
As secretárias Ana Maria Rodrigues e Vânia Darc de Castro pela disponibilidade e simpatia.
FENNER, Fábio Leandro Santos. Perfil da produção de Óxido Nítrico (xNO) pelo cerebelo na progressão do estado caquético induzido por Tumor de Walker-256. 2009, 56f., Dissertação (Mestrado em Patologia Experimental) – Universidade Estadual de Londrina, Londrina.
RESUMO
A síndrome caquexia-anorexia é um estado metabólico complexo caracterizado por perda de músculos, tecido adiposo e anorexia. A perda de peso corporal pode ser causada por uma adaptação metabólica do indivíduo em prol do crescimento do tumor. A caquexia faz parte da progressão de diversas doenças, dentre elas, o câncer. Estudos anteriores em nosso laboratório demonstraram a associação entre caquexia e produção de xNO no músculo esquelético e no córtex cerebral de ratos. O xNO é um radical livre gasoso e hidrofóbico e sua baixa reatividade permite difundir-se por longas distâncias, intra e intercelularmente, de modo semelhante ao oxigênio molecular (O2) e ao dióxido de carbono (CO2). Ele pode atuar nas células do sistema nervoso central de forma fisiológica ou estimulando a produção de espécies reativas do oxigênio (EROs) e nitrogênio (ERNs) no organismo. Um exemplo é o peroxinitrito (ONOO-) que pode provocar lipoperoxidação e lesar células do SNC levando a doenças neurodegenerativas. Este estudo tem como objetivo traçar o perfil da produção de xNO pelo cerebelo durante a evolução da caquexia induzida pelo tumor de Walker-256 e relacionar a produção do xNO com a lipoperoxidação tecidual. A caquexia foi induzida através da inoculação subcutânea (sc) de 8x107 células tumorais na porção lateral da pata posterior direita de ratos Wistar machos. Estes animais foram divididos em três grupos de acordo com o tempo de implante das células tumorais: 5 (T5), 10 (T10) ou 14 dias (T14). Os grupos controle, inoculado com PBS ao invés de células do tumor (controle PBS), e grupo pair-fed também foram utilizados. O grupo experimental T5 foi tratado com LNAME (20 mg/Kg) ou AG (50 mg/Kg) diariamente até o 5º dia após o implante das células tumorais e foram denominados T5-LN e T5-AG, respectivamente. O cerebelo de todos os animais foram removidos e homogeneizados na concentração de 100 mg/mL com o tampão específico para cada ensaio realizado. A produção de xNO foi diretamente detectada no homogenato de cerebelo dos animais controle e experimentais pela técnica de quimiluminescência com H2O2- luminol. Também, a técnica de quimiluminescência induzida por t-butil hidroperóxido foi realizada para a detecção da lipoperoxidação nos mesmos grupos. A capacidade antioxidante do cerebelo foi investigada através da medida da Capacidade Antioxidante Total (TRAP). Os níveis de ·NO dos animais T5 (p<0,0001) foram significativamente aumentados em relação ao grupo controle PBS. Nos animais T10 e T14 não houve alteração significativa nos níveis de
·NO. Os níveis de ·NO de animais T5-LN e T5-AG apresentaram diminuição significativa em relação ao grupo T5 (p<0,0001). O grupo pair-fed não apresentou aumento significativo nos níveis de ·NO em relação ao controle PBS. Em relação a lipoperoxidação do tecido, os animais T5, T10 e T14 apresentaram níveis de lipoperoxidação significativamente maiores (p<0,0001) em relação ao grupo controle PBS. Os níveis de lipoperoxidação dos animais T5- LN e T5-AG apresentaram diminuição significativa em relação ao grupo T5 (p<0,0001). Os níveis de TRAP apresentam-se significativamente diminuídos em relação ao grupo controle PBS no T10 (p<0,01) e no T14 (p<0,05). Estes resultados revelam a participação do ·NO na lesão peroxidativa observada no cerebelo durante a progressão da caquexia induzida por tumor de Walker-256. De maneira particular, o cerebelo está vulnerável à lesão através deste mecanismo. A inibição da produção de ·NO neste tecido pode diminuir os níveis de lesões lipoperoxidativas.
Palavras chave: Caquexia, Óxido Nítrico, Cerebelo, Radicais Livres, Câncer.
FENNER, Fábio Leandro Santos. Profile of the nitric oxide (xNO) production on the cerebellum in the progression of the cachexia induced by Walker-256 tumor. 2009, 56f., Dissertação (Mestrado em Patologia Experimental) – Universidade Estadual de Londrina, Londrina.
ABSTRACT
The cachexia-anorexia sindrome is a complex metabolic state, characterized by muscle and fat tissue loss. In cancer subjects, body weight loss could be caused by the presence of a growing tumor that causes metabolic adaptation of the subject in favour of its growth. Cachexia is part of many illness, amongst that, cancer. Prior studies in our lab have shown an association between the development of cachexia and the production of nitric oxide (·NO) by skeletal muscle and brain cortex. ·NO is a free radical with low reactivity, and its hidrofobic nature allows it to travel far distances inside and outside the cells, likewise O2 and CO2. ·NO can also act as a physiological or pathological device in the central nervous system (CNS), by producing reactive oxigen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS). One of the
·NO products is peroxinitrite (ONOO-) that can cause lipid peroxidation of cell membranes of the CNS leading to neurodegenerative diseases. This study aim to draw a profile of ·NO production by the cerebellum of rats, during the development of cachexia induced by Walker- 256 tumor and relate this production to cerebellum lipidperoxidation. To induce cachexia, 8 x 107 walker-256 tumor cells were injected on the hing muscle leg of Wistar male rats. The experiment was divided into three groups - 5 (T5), 10 (T10) and 14 days (T14) after the tumor implant, folowed by its controls, pair-fed and sham. The experimental group (T5) was also treated with LNAME (20 mg/Kg) or AG (50 mg/Kg) daily up to the 5th day of tumor cell implant, and those were designated T5-LN and T5-AG.The cerebellum was used for the ·NO quantification by the H2O2-luminol and lipidperoxidation induced by tert-butyl hidroperoxide chemiluminescence tequinic. The total antioxidant capacity (TRAP) was also measured. T5 cerebellum showed a significant increase (p<0,0001) of xNO when compared to sham control.
When treated with LNAME and AG, ·NO T5-LN (p<0,0001) and T5-AG (p<0,0001) decreased significantly when compared to T5. The pair-fed control group did not have any change on the ·NO parameters when compared to ad libitum control group, suggesting that the decrease of food intake does not have a significant impact on the ·NO production by the cerebellum. Lipidperoxidation was significantly higher (p<0,0001) than control group for all the experimental groups (T5, T10 and T14), but with ·NO inhibitors treatment, T5-LN e T5- AG, it showed a significant (p<0,0001) decrease of lipidperoxidation when compared to experimental group T5. TRAP levels showed a significant decrease on the T10 (p<0,01) and T14 (p<0,05) when compared to the sham control. These data suggest that ·NO is produced on the 5th day of tumor implant and in that occasion it could be related to the lipidperoxidation observed in the same cachexia developing time. The inhibition of ·NO production could diminish the lipidperoxidative lesions observed on the 5th day, and it could be an insight for future follow-up treatments for cancer patients that develop cachexia.
Palavras chave: Cachexia, Nitric Oxide, Cerebellum, Free Radical, Cancer.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Alterações promovidas pelo tumor e hospedeiro atuam em diversos locais no organismo e levam a caquexia... 17 Figura 2 - Química Biológica do ·NO... 20 Figura 3 - Formação de radical lipídico, radical Alquil-peroxi, propagação da
cadeia de Peroxidação lipídica dependente de O2, reação de radical alquil-peroxi com ·NO... 24 Figura 4 - A química dos efeitos indiretos do ·NO... 26 Figura 5 - Cadeia de propagação de peroxidação lipídica... 29 Figura 6 - Gráfico modelo mostrando a emissão de fótons na TRAP pelo tempo de
reação... 35 Figura 7 - Quimiluminescência emitida por diferentes concentrações de
homogenato de cerebelo de ratos... 38 Figura 8 - Diminuição da emissão entre as análises de uma mesma amostra
provavelmente relacionada ao tempo de exposição da amostra ao O2 e luz... 38 Figura 9 - Reprodutibilidade entre as análises em quadruplicata de um mesmo
animal. Ensaio de Determinação dos níveis de ·NO por Quimiluminescência induzida por H2O2-luminol... 39 Figura 10 - Efeito da progressão da caquexia na concentração de ·NO no cerebelo
determinada através de quimiluminescência induzida por H2O2-luminol em cerebelo de ratos com tumor de Walker-256... 39 Figura 11 - Determinação dos níveis de ·NO em animais pair-fed T5, T10, T14 e
Controle PBS... 40 Figura 12 - Efeito dos inibidores de NOS sobre o nível de ·NO determinado através
de quimiluminescência iniciada por H2O2-luminol em cerebelo de ratos inoculados com tumor Walker-256 por 5 dias (T5)... 40 Figura 13 - Quimiluminescência emitida por diferentes concentrações de
homogenato de cerebelo de ratos Wistar... 41 Figura 14 - Correlação entre os parâmetros concentração do homogenato de cerebelo
e altura ou área da emissão da quimiluminescencia induzida por t-butil ... 42 Figura 15 - Quimiluminescência emitida por cerebelos oxidados com ABAP por 30,
60 e 90 minutos... 42 Figura 16 - Efeito da caquexia nos níveis de hidroperóxidos lipídicos determinados
por quimiluminescência induzida por t-butil em cerebelos de ratos inoculados com tumor de Walker-256 após 5, 10 e 14 dias... 43
Figura 17 - Efeito dos inibidores de NOS sobre os níveis de lipoperóxidos determinados através de quimiluminescência iniciada por t-butil em cerebelo de ratos inoculados com celular de tumor de Walker-256 após 5 dias (T5)... 43 Figura 18 - TRAP dos homogenatos de cerebelo de ratos inoculados com tumor de
Walker-256 após 5, 10 e 14 dias... 44
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Parâmetros de perda de massa corpórea em ratos Wistar inoculados com célula de tumor de Walker-256 após 5, 10 e 14 dias e tratados com aminoguanidina e LNAME até o 5º dia da inoculação do tumor de Walker-256... 37
LISTA DE SIGLAS
·NO: óxido nítrico
ABAP/AZOBIS: 2,2-azo-bis 2-amidinopropano diidroclorido AG: aminoguanidina
AIDS: síndrome de imunodeficiência adquirida ATP: adenosina trifosfato
Ca+2: íon cálcio
cGMP: guanosina monofosfato cíclico
cNOS: enzimas óxido nítrico sintase constitutivas CO2: dióxido de carbono
DFX: mesilato de desferrioxamina DNA: ácido desoxirribonucléico e-: elétron
eNOS: enzima óxido nítrico sintase endotelial ERNs: espécies reativas do nitrogênio
ERON: espécies reativas do óxido nítrico EROs: espécies reativas do oxigênio FAD: flavina adenina dinuclotídeo Fe2+: ferro
FMN: flavina adenina mononucleotídeo GSH: glutationa reduzida
GSNO: S-nitrosoglutationa GSSG: glutationa oxidada H·: ânion hidrogênio
H2O2: peróxido de hidrogênio H2SO4: ácido sulfúrico
HNO: ácido nítrico HNO2: ácido nitroso
HOONO: ácido peroxinitroso IFN-γ: interferon gama IL-1: interleucina 1 IL-10: interleucina 10 IL-13: interleucina 13 IL-2: interleucina 2 IL-4: interleucina 4 IL-6: interleucina 6
iNOS: enzima óxido nítrico sintase indutível ip: intraperitoneal / intraperitonealmente KCl: cloreto de potássio
KH2PO4: Fosfato monopotássico LMF: fator mobilizador de lipídio LN: LNAME
LNAME: NG-nitro-L-arginina-metil éster LTD: long-term depression
LTP: long-term potentiation
MCP-1: proteína quimioatraente de macrófagos-1 Mn-SOD: manganês-superóxido dismutase mtNOS: enzima óxido nítrico sintase mitocondrial
N2: nitrogênio molecular N2O3:trióxido de dinitrogênio Na2CO3: Carbonato de sódio
Na2HPO4: Fosfato de sódio dibásico NaCl: cloreto de sódio
NADPH: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato NaH2PO4: Fosfato de sódio monobásico
NMDA: receptores N-metil-D-aspartato nNOS: enzima óxido nítrico sintase neuronal NO+: íon nitrosonium
NO2: dióxido de nitrogênio NO2-: nitrito
NO3-: nitrato
NOS I: enzima óxido nítrico sintase I NOS II: enzima óxido nítrico sintase II NOS III: enzima óxido nítrico sintase III NOS: enzima óxido nítrico sintase O2x-: ânion superóxido
O2: oxigênio molecular OH·: radical hidroxil ONOO-: peroxinitrito
PARS: enzima poli(ADP-ribose) sintetase
PDZ: Domínio da nNOS – PSD95, discs-large e zona occludens-1 pH: potencial hidrogeniônico
PIF: fator indutor de proteólise PSD-95: proteína pós-sináptica RO·2: radical peroxil
RR’NH: aminas RSH: grupamento tiol
sc: subcutânea / subcutaneamente sGC: guanilato-ciclase solúvel
SNAP: S-nitroso-N-acetilpenicilamina SNC: sistema nervoso central
SNP: sistema nervoso periférico
TBARs: substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico T-butil: t-butil hidroperóxido
TGF-β: fator de crescimento e transformação beta TLRs: teceptores Toll
TNF-α: fator de necrose tumoral alfa
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO... 16
1.1 Caquexia: aspectos gerais... 16
1.2 Bioquímica do ·NO... 17
1.3 Cerebelo e ·NO... 22
1.4 ·NO como Neuroprotetor... 24
1.5 Estresse oxidativo e nitrosativo... 25
2 OBJETIVOS... 30
2.1 Gerais... 30
2.2 Específicos... 30
3 MATERIAIS E MÉTODOS... 30
3.1 Animais... 30
3.2 Reagentes... 30
3.3 Manutenção das células de Tumor de Walker-256... 31
3.4 Modelo experimental de caquexia... 31
3.5 Obtenção e preparo dos cerebelos... 32
3.6 Quantificação de ·NO... 33
3.7 Avaliação de lipoperoxidação... 33
3.8 Determinação da capacidade antioxidante total do cerebelo... 34
3.9 Análise estatística... 35
4 RESULTADOS... 37
4.1. Caracterização da caquexia... 37
4.2. Quimiluminescência induzida por H2O2-Luminol para quantificação de ·NO nos cerebelos... 37
4.3. Quimiluminescência induzida por tert-butil para determinação dos níveis de hidroperóxidos lipídicos nos cerebelos... 41
4.4. Medida da capacidade antioxidante total (TRAP)... 44
5 DISCUSSÃO... 45
6 CONCLUSÃO... 50
7 REFERÊNCIAS... 51
16
1 INTRODUÇÃO
1.1 CAQUEXIA: ASPECTOS GERAIS
A síndrome caquexia-anorexia representa um estado metabólico complexo caracterizado por progressiva perda e atrofia muscular e anemia secundária. Pode ser decorrente de câncer, falência cardíaca congestiva, doença pulmonar obstrutiva crônica, AIDS, diabetes, entre outras doenças (DELANO; MOLDAWER, 2006). Conforme MacDonald et al. (2003, p.143) a caquexia pode ser definida como a “síndrome que envolve perda de músculos e gorduras diretamente causada por fatores tumorais, ou indiretamente causada por uma resposta alterada do hospedeiro à presença do tumor”. Seus critérios para o diagnóstico clínico variam, entretanto, caracteriza-se em pacientes com câncer como uma perda de peso involuntária de mais de 5% do peso corporal (antes do aparecimento da doença) dentro de 6 meses (INUI, 2002). Ocorre em mais de 80% dos pacientes com câncer em estágios avançados e é responsável pela morte em mais de 20% desses casos. Mais precisamente, a caquexia está relacionada a determinados tipos de câncer, particularmente os do trato gastrointestinal e pulmão e, segundo Slaviero et al. (2003), a morte pode ocorrer quando há uma perda de 30% do peso pré-doença.
Podem ser identificadas três fases da caquexia: caquexia leve, moderada e grave. A caquexia grave é facilmente diagnosticada em pacientes com perda de peso irreversível, perda muscular, anorexia, saciedade precoce, funções físicas reduzidas, fadiga, anemia e edema. Apesar da inespecificidade dos sintomas nos primeiros estágios da caquexia, ela deve ser diferenciada da perda de peso que ocorre devido a pouca ingestão calórica. Assim, a perda de peso serve como marcador do processo caquético, entretanto, a verificação de anormalidades na perda de energia em repouso, que constitui uma parte específica da demanda energética do organismo, tem sido sugerida como possível marcador precoce, uma vez que inicia antes da perda de peso. Desta forma, faz-se necessário o aprimoramento e uso de marcadores precoces desta síndrome para que a intervenção terapêutica seja iniciada antes da detecção da perda de peso (SKIPWORTH et al., 2006).
Segundo Argilés e colaboradores (2005) a competição por nutrientes entre o tumor e o paciente leva ao progressivo estado de debilidade física e promove distúrbios metabólicos severos, como o hipercatabolismo, com déficit energético. Esse processo é regido por uma série de mediadores, entre os quais, as citocinas são relatadas como os principais fatores
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humorais envolvidos na promoção e desenvolvimento da caquexia (BARACOS, 2006).
Ainda, o tumor gera fatores que tem efeitos catabólicos, como o Fator Indutor de Proteólise (PIF) e Fator Mobilizador de Lipídeos (LMF) (HIRAI et al., 1998; TISDALE, 2003). A ação desses mediadores leva a alterações no metabolismo de carboidratos lipídeos e proteínas (figura 1) e aumento da taxa metabólica basal (TISDALE, 2009).
Figura 1: Alterações promovidas pelo tumor e hospedeiro atuam em diversos locais no organismo e levam à caquexia. Fonte: Gonçalves et al., 2006.
Segundo Baracos (2006), as citocinas podem atuar diretamente no catabolismo protéico, por isso, há uma concomitância entre inflamação e perda muscular. Os tumores contêm células inflamatórias e produz diversas citocinas. Durante o câncer, as citocinas pró- inflamatórias estão associadas à fadiga, depressão e prejuízo da capacidade cognitiva (SERUGA et al., 2008).
A associação entre câncer e neurodegeneração é conhecida há muito tempo (NORRIS, 1972). Geralmente, os pacientes com câncer em estado adiantado apresentam delírio (LAGMAN et al., 2005). Segundo Michalak et al. (2006), durante o processo de caquexia em ratos ocorre degeneração cerebelar através de um mecanismo que envolve TNF- α e proteína quimioatraente de macrófagos-1 (MCP-1). Os animais caquéticos apresentaram atrofia no cerebelo, com perdas e alterações nas células de Purkinje e diminuição da densidade celular da camada granulosa do cerebelo. Estes animais caquéticos ainda apresentaram diminuição da atividade locomotora e distúrbios do equilíbrio.
1.2 BIOQUÍMICA DO ·NO
Conforme Pacher et al. (2007) o óxido nítrico (·NO) é um radical livre gasoso com
Fatores Tumorais
(PIF, LMFs) Fatores do Hospedeiro (citocinas, hormônios) Órgãos alvo
(fígado, cérebro, outros)
Má-nutrição Caquexia Anormalidades
Metabólicas Anorexia
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solubilidade moderada na água e presente em todos os vertebrados. Concentra-se em ambientes lipofílicos, como membranas e domínios hidrofóbicos de proteínas.
Particularmente, o ·NO tem somente um elétron desemparelhado o que permite a sua ligação ao ferro nos grupos heme e, assim, ativar a guanilato-ciclase solúvel (sGC) ou diminuir a respiração mitocondrial por se ligar a citocromo-c oxidase. O ·NO pode percorrer distâncias surpreendentes a partir da célula que o produz, antes de ser inativado e difundir-se de maneira ampla intra e intercelularmente sem a necessidade de canais ou receptores. Sua constante de difusão em água encontra-se entre 2-4 x 10-14 cm2/s e em condições fisiológicas é de 3,3 10-5 cm2/s (WOOD; GARTHWAITE, 1994). A velocidade molecular média estimada de uma molécula com a massa do ·NO na temperatura ambiente é de, aproximadamente, 400 m/s. Em solução, sua trajetória é repetidamente alterada por cerca de 10 bilhões de colisões por segundo. Assim, esta molécula pode atravessar várias vezes a membrana de uma ou de várias células durante a sua meia-vida de, aproximadamente, um segundo (PACHER et al., 2007).
Segundo seu comportamento e características químicas, o ·NO é um intermediário entre o oxigênio molecular (O2) e o nitrogênio molecular (N2), e esta condição explica a sua baixa reatividade comparada aos outros radicais livres como o ânion superóxido (O2x-).
Contudo, ·NO também pode reagir com radicais livres ou como terminador da cadeia de reação da lipoperoxidação. Além disso, este radical pode converter radicais tiol em nitroso- tiol e formar produtos intermediários que podem ser reparados por antioxidantes e regenerar o composto original. Esta característica é a principal responsável pelas propriedades antioxidantes atribuídas ao ·NO (PACHER et al., 2007).
Segundo Ignarro (2000, p.13), a inativação deste radical depende apenas da sua reatividade não enzimática com outras moléculas. Ele pode reagir com oxi-hemoglobina ou oxi-mioglobina para gerar nitrato (NO3-) além de hemoproteínas oxidadas, como meta- hemoglobina ou meta-mioglobina.
Apesar de seu histórico como gás tóxico e poluente ambiental, este gás pode ser produzido durante 80 anos pelos neurônios sem apresentar atividade tóxica, pois, por si só ele não é um agente citotóxico importante. Ele é pouco reativo comparado com os outros radicais livres e reage lentamente com a maioria das moléculas biológicas. Por outro lado, ele reage rapidamente com radicais superóxido (O2x-), peroxil (RO·2), tirosil, triptofanil, hidroxietil, hidroxil (OH·), elétrons (e-) e anion hidrogênio (H·) (HALLIWELL;
GUTTERIDGE, 2007).
Segundo Wink e Mitchell (1998), o ·NO pode atuar no organismo de maneira
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protetora, regulatória ou deletéria conforme as suas reações químicas subseqüentes em condições biológicas particulares. Assim, os seus efeitos biológicos são classificados em duas categorias principais: os efeitos diretos e os indiretos Os efeitos diretos ocorrem através de reações rápidas o suficiente para acontecer entre o ·NO e moléculas biológicas específicas.
Já, os efeitos indiretos são mediados por espécies reativas do óxido nítrico (ERON).
Geralmente, os efeitos diretos acontecem em concentrações baixas, menores que 1 µM, e medeiam funções fisiológicas, enquanto os efeitos indiretos são significativos em concentrações locais maiores que 1 µM, sendo incluídos na química da nitrosação, oxidação e nitração além de estarem mais envolvidos em processos deletérios (Figura 2).
Segundo Liaudet et al., (2000), os seus efeitos biológicos diretos podem resultar de interações com metais de transição. A reação deste radical com complexos metálicos tem grande importância biológica, acontece de maneira muito rápida e em baixas concentrações do radical livre (WINK; MITCHELL, 1998).
Segundo Espey et al. (2002), ambos os efeitos, diretos e indiretos participam do metabolismo basal, contudo, os efeitos indiretos podem resultar em estresse oxidativo ou nitrosativo, especialmente em condições de elevado influxo de ·NO. Conforme Wink e Mitchell (1998), os efeitos indiretos são mediados por reações entre xNO/O2 ou xNO/O2x-. Suas propriedades citotóxicas podem estar na origem de diversas doenças neurodegenerativas onde o fator determinante dos efeitos lesivos deste radical será as reações químicas nas quais participa.
A síntese fisiológica do xNO é realizada principalmente pela enzima óxido nítrico sintase (NOS), uma enzima especializada que cataliza a oxidação dependente de O2 do nitrogênio guanidino de L-arginina com a produção de xNO e citrulina (KNOWLES et al., 1989; McCall et al., 1989). Três isoformas de NOS tem sido caracterizadas. Elas são denominadas NOS I (foi primeiramente caracterizada e isolada a partir de cerebelo de ratos e suínos também denominada nNOS ou NOS neuronal (BREDT; SNYDER, 1989)), NOS II (primeiro detectada em macrófagos e também denominada iNOS ou NOS indutível), e NOS III (primeiro detectada no endotélio e também denominada eNOS ou NOS endotelial). Elas pertencem à superfamília das monooxigenases, assim, são homodimeros e tem homologia com citocromo P-450 redutase na porção C-terminal, região denominada “domínio redutase”.
A porção N-terminal da enzima denominada “domínio oxigenase ou heme” contém o local de ligação para o grupo heme ou substrato de L-arginina. Elas também são produtos de diferentes genes e podem apresentar localização, regulação e sensibilidade a inibidores diferentes, além de propriedades catalíticas características (MONCADA et al., 1991).
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Figura 2: A química biológica do xNO. Fonte: Wink e Mitchell, 1998.
Alem de oxigênio, L-arginina e de grupo prostético heme, a catálise do xNO requer a forma reduzida de nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH), flavina adenina dinuclotídeo (FAD) e flavina adenina mononucleotídeo (FMN) bem como tetraidrobiopterina. Todos estes elementos são ligados à enzima. Da mesma forma, o fluxo de elétrons a partir do domínio redutase para o domínio oxigenase é essencial para a catálise do
xNO e é objeto de uma regulação da ação da enzima in vivo (MARTIN et al., 2006).
Todas as isoformas desta enzima contêm uma seqüência semelhante entre o domínio redutase e o domínio oxigenase capaz de se ligar a calmodulina que regula a transferência de elétrons entre estes domínios. As enzimas nNOS e eNOS (são também denominadas NOS constitutivas (cNOS) por estarem continuamente presentes na célula) ligam-se à calmodulina somente após o aumento do Ca+2 intracelular (>500 nm). Em condições normais, a interação com maioria a dos receptores agonistas resulta em influxo de Ca+2 ou liberação de Ca+2 a partir dos estoques intracelulares com ativação de cNOS. Assim, a natureza transitória destes fluxos determina a produção de xNO pelas cNOS e é importante para a sinalização fisiológica através da via xNO/cGMP. De outra forma, a NOS indutível recebe este nome porque a
xNO
Hemoglobina / Mioglobina Guanilato ciclase Citocromo P450
Proteínas ligadoras de resposta ao ferro
Radicais centrais de carbono Radicais lipídicos
Dióxido de Nitrogênio
EFEITOS INDIRETOS EFEITOS DIRETOS
RNOS
COMPLEXOS METÁLICOS
RADICAIS DE ALTA ENERGIA
Produtos:
Nitrosamina S-nitrosotiol
Produtos:
Nitrotirosina NITROSAÇÃO
Produtos:
Quebra de fita de DNA Peroxidação lipídica
Hidroxilação
OXIDAÇÃO NITRAÇÃO
O2 ou O2 x -
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produção desta isoforma de NOS pode ser induzida pelas citocinas durante processos inflamatórios. A interação da calmodulina e iNOS pode ocorrer mesmo se a concentração de Ca+2 estiver < 100 nm, o que faz com que esta isoforma não dependa das alterações no Ca+2 intracelular. Desta forma, a iNOS é completamente ativa e capaz de gerar grande quantidade de xNO no momento em que é sintetizada. De fato, a grande concentração de xNO gerado pela iNOS em condições inflamatórias constitui a base do estresse nitrosativo deletério (MARTIN et al., 2006).
Além das isoformas já citadas, em 1997 foi descrita a existência de uma NOS mitocondrial constitutiva que afeta profundamente o funcionamento desta organela celular.
Esta enzima foi denominada NOS mitocondrial (mtNOS) (GHAFOURIFAR; RICHTER, 1997). A mtNOS está ativa continuamente e localizada na membrana mitocondrial interna, ainda, é modulada pelo cálcio e regula a respiração mitocondrial, o potencial eletroquímico transmembrana, o gradiente de pH transmembrana, a homeostase do cálcio e a síntese de ATP. (GHAFOURIFAR; SAAVEDRA-MOLINA, 2006).
Por outro lado, o xNO também pode ser gerado de maneira independente de NOS.
Desta forma, xNO e outros óxidos de nitrogênio podem ser gerados a partir de nitrito (NO2-) em ambientes ácidos e redutores, como o estômago (LUNDBERG et al., 1994). No pH baixo, o NO2- é convertido em ácido nitroso e, subseqüentemente, em óxidos de nitrogênio, inclusive xNO. Esta via de produção de xNO tem sido demonstrada na superfície da pele, onde as glândulas sudoríparas reduzem nitrato (NO3-)a NO2- e o ambiente ácido converte o NO2- a
xNO (WEITZBERG; LUNDENBERG, 1998). Também há relatos sobre a possibilidade de geração de xNO in vitro a partir de D- ou L-arginina na ausência de NOS, desde que na presença de H2O2 (NAGASE et al., 1997).
Este radical livre pode interagir com diversos alvos intercelulares e desencadear um conjunto de sinais estimulatórios ou inibitórios no organismo. Conforme Calabrese et al.
(2007), no SNC o xNO pode atuar como neuromodulador, neuroprotetor e neurotóxico além de estar associado à função cognitiva, indução e manutenção da plasticidade sináptica, controle do sono, apetite, temperatura corporal, neurosecreção entre outros. Neste mesmo local, ele deve atuar como uma molécula sinalizadora que modula o metabolismo da glicose em astrócitos e neurônios e estas vias metabólicas mediadas por ele podem determinar a sobrevivência ou morte celular (BOLAÑOS; ALMEIDA, 2006).
Por outro lado, peroxinitrito (ONOO-) tem sido associado com apoptose em vários tipos celulares como neurônios dopaminérgicos (SHACKA et al., 2006), neurônios primários (BONFOCO et al., 1995), astrócitos (ZHU et al., 2006) e oligodendrócitos (ZHANG et al.,
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2006). Quando formado em excesso, o ONOO- causa dano ao DNA e desencadeia a ativação do sistema reparador poli(ADP-ribose) sintetase (PARS), seguido de depleção dos estoques de ATP. Ainda, ONOO- inibe a aconitase e interfere com a cadeia respiratória mitocondrial (BOLAÑOS; ALMEIDA, 2006).
A atividade neuroprotetora deste gás é essencial para a viabilidade das células em condições patológicas. O papel neuroprotetor do xNO neste processo pode ocorrer através da estimulação de expressão e da atividade da Mn-SOD mitocondrial, uma enzima scavenger para radical superóxido (O2x-) gerado pela cadeia transportadora de elétrons mitocondrial (SCORZIELLO et al., 2007).
Por outro lado, no SNC o xNO também está, fatalmente, envolvido nos diversos processos neurodegenerativos como Doença de Alzheimer, Mal de Parkinson, Doença de Huntington, Esclerose múltipla e processos isquêmicos (GUIX et al., 2005).
1.3 CEREBELO E ·NO
Segundo Gammie et al. (2000), ·NO pode atuar como neurotransmissor e neuromodulador no SNC e Sistema nervoso periférico (SNP). Por atuar nas funções neuroendócrinas dos eixos hipotálamo-pituitária-adrenal ele também influencia o aprendizado e memória.
De fato, o xNO foi caracterizado primeiro no SNC como um mensageiro intercelular que aumenta os níveis de cGMP seguido de ativação dos receptores de glutamato (GARHWAITE; CHESS-WILLIAMS, 1988). Por sua vez, o aumento dos níveis de cGMP pode modular um grande número de ações do xNO nos tecidos neuronais (GARTHWAITE, 1991). A iNOS pode ser induzida em células gliais em um mecanismo inespecífico associado a resposta imune e condições patológicas (MURPHY, 2000). A função da eNOS no SNC está envolvida principalmente na regulação da função vascular, apesar de ser encontrada em alguns neurônios (DINERMAN et al., 1994) e células da glia (WIENCKEN;
CASAGRANDE, 1999). Apesar de as três isoformas de NOS serem encontradas no cérebro, acredita-se que a nNOS é a principal responsável pela sinalização neuronal, plasticidade sináptica, neurotoxicidade , aprendizado e dor (MARTIN et al., 2006).
O cerebelo é essencial na coordenação, adaptação e aprendizado motor. Certamente, esta região do SNC é responsável pelo aprendizado e execução das habilidades motoras especializadas, além de regular o tônus postural e equilíbrio. Da mesma forma, o cerebelo modula os movimentos dos músculos responsáveis pela fala e movimentos oculares e está
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envolvido no aprendizado e memória (THACH, 1998; KAWATO, 1999). Lesões ou anormalidades no cerebelo podem ser associadas a autismo e déficit cognitivo (GLICKSTEIN, 2006).
A plasticidade sináptica está envolvida em grande parte das funções executadas pelo cerebelo (ITO, 2001). Conforme Citri e Malenka (2008), a plasticidade sináptica consiste em modificações na eficácia ou força da transmissão sináptica de sinapses pré-existentes. Assim, o xNO está envolvido no mecanismo de Potenciação de longa duração (long-term potentiation - LTP) e na Depressão de longa duração (long-term depression - LTD), este último inibe as conexões sinápticas associadas a erros nos movimentos e preserva outras conexões associadas a execução correta destes movimentos (ITO, 2001).
O principal mecanismo de geração de xNO neste tecido é aquele associado a nNOS. A síntese de xNO no sistema nervoso é predominantemente regulada pelo influxo de Ca+2 através de canais dependentes de receptores. Ou seja, na maioria das vezes, a biossíntese de xNO no cerebelo é preferencialmente ativada pelo influxo de cálcio através de canais iônicos associados ao receptor glutamatérgico N-metil-D-aspartato (NMDA) (CHRISTOPHERSON et al., 1999). Esta é uma das três classes de receptores cerebrais que podem ser estimulados por aminoácidos excitatórios como o glutamato (BECKMAN, 1991). A nNOS não é estimulada de maneira eficiente através da ativação de outros receptores que geram influxo de cálcio que não sejam receptores NMDA. Diante disso, é sugerida a existência de uma ligação específica entre este receptor e a isoforma desta enzima (CHRISTOPHERSON et al., 1999).
Contudo, o xNO livre pode desempenhar dois papeis radicalmente diferentes no sistema nervoso central. Primeiro, ele pode atuar como uma molécula citotóxica na medida em que causa estresse oxidativo e nitrosativo (BROWN; BAL-PRICE, 2003). A morte de células ou o colapso dos gradientes iônicos durante a depleção energética pode causar a liberação maciça de glutamato pelos neurônios, causando um aumento prolongado do Ca2+
intracelular e superprodução de NO através de nNOS (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007).
Segundo Bonfoco et al., (1995), a neurotoxicidade através da ativação dos receptores NMDA constitui uma via de lesão comum a diversas desordens neurológicas agudas ou crônicas, como isquemia, trauma, epilepsia, Doença de Huntington, Doença de Alzheimer, AIDS, demência, que estão associadas com grande produção de NO por células da glia, fagócitos ou células endoteliais (PACHER et al., 2007).
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1.4 ·NO COMO NEUROPROTETOR
A localização e a concentração de xNO produzido podem determinar se o seu efeito será benéfico ou deletério (ESPEY et al., 2002). Apesar de ser radical livre, xNO tem habilidade de atuar como antioxidante e prevenir o estresse oxidativo promovido por EROs e agentes oxidantes derivados dele mesmo, como NO2 ou o próprio ONOO-. Conforme Espey et al. (2002), xNO pode atuar como scavenger de EROs formando moléculas menos reativas ou mesmo inócuas. Os mecanismos antioxidantes deste gás envolvem a sua ligação a metais de transição, a radicais livres ou a ERON.
A habilidade deste radical livre em reagir rapidamente através de uma combinação simples entre dois radicais livres permite que ele atue como terminador da cadeia de reação da peroxidação lipídica. De fato, ·NO pode atuar como terminador da reação de lipoperoxidação dependente de O2. (Figura 3). Esta reação inicia com a retirada de um átomo de hidrogênio alílico de um ácido graxo poli-insaturado por uma espécie iniciadora (·X) formando um radical lipídio (Lipídio·). Então, este Lipídio· reage com O2 para gerar radical alquil-peroxi (Lipídio-OO·) que pode reagir com outro lipídio e propagar a reação. Esta reação pode modificar ou destruir muitos lipídios e prejudicar a integridade das membranas (FUKUTO et al., 2000).
Figura 3: Formação de radical lipídio (A), radical alquil-peroxi (B), propagação da cadeia de peroxidação lipídica dependente de O2(C), reação de radical alquil-peroxi com ·NO (D). Fonte: Fukuto, et al., 2000.
Segundo Contestabile e Ciani (2004), no sistema nervoso o xNO constitui um mensageiro essencial para a sobrevivência de linhagens de células neuronais e neurônios primários em condições neuropatológicas. Uma quantidade fisiológica de xNO é necessária para manter os neurônios vivos e saudáveis.
Segundo Chiueh (1999), xNO pode suprimir o estresse oxidativo no cérebro por diversas vias. Por exemplo, ele pode diminuir a geração de ·OH induzida pelo ferro através da reação de Fenton.
A) Lipídio-H + ·X → Lipídio· + X-H B) Lipídio· + O2 → Lipídio-OO·
C) Lipídio-OO· + Lipídio-H → Lipídio-OH + Lipídio· ... etc ...
D) Lipídio-OO· + ·NO → Lipídio-OO-NO (cadeia terminada)
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Glutationa reduzida (GSH) é o principal antioxidante tiol das células de mamíferos.
No cérebro esta molécula protege contra o estresse oxidativo através de reações não enzimáticas com O2·-, ·OH, ·NO, ONOO- ou H2O2 (AOYAMA et al., 2008). Contudo, a interação entre xNO e GSH pode gerar um antioxidante mais potente, S-nitrosoglutationa (GSNO). GSNO tem sido identificada em células e tecidos que contém NOS e alta concentração de GSH e deve servir como um reservatório intracelular de ·NO no tecido cerebral. Por sua vez, esta molécula é 100 vezes mais potente do que GSH na supressão da geração de ·OH e da peroxidação lipídica (CHIUEH, 1999). De fato, esta molécula é um bom doador de ·NO in vitro e in vivo (IGNARRO, 2000, p.14).
Segundo Ciani et al. (2002) a inibição prolongada da produção de ·NO induz apoptose neurônios cerebelares e este fenômeno pode ser revertido através de compostos que liberam lentamente o ·NO. De fato, a inibição da produção de ·NO por L-NAME em culturas de células granulares cerebelares por 3-4 dias resulta em progressiva morte apoptótica das células diferenciadas. Estas células podem ser recuperadas pela adição ao meio de cultura de doadores de ·NO ou análogos do cGMP. A inibição de guanilato ciclase através de um inibidor específico reproduz o efeito pro-apoptótico da inibição da nNOS, demonstrando o papel essencial do cGMP neste mecanismo.
O receptor NMDA também pode ser modulado através da S-nitrosilação de uma cisteína (Cys 399) na subunidade NR2A. Desta maneira o ·NO diminui a freqüência de abertura do canal iônico associado ao receptor e impede a sua ativação excessiva e a exacerbação de desordens neurodegenerativas (CHOI, 2000).
1.5 ESTRESSE OXIDATIVO E NITROSATIVO
Os efeitos indiretos do xNO podem resultar em estresse oxidativo ou nitrosativo especialmente em condições de produção alta e sustentada. Este estresse oxidativo consiste no envolvimento de grande número de moléculas importantes, como lipídeos, proteínas ou DNA, em reações de oxidação ou nitrosação devido ao comprometimento dos mecanismos antioxidantes de defesa celular. As reações entre xNO/O2, xNO/O2x- ou HNO/O2 podem gerar oxidantes (aceptores de elétrons) fortes ou moderados como o NO2, um agente oxidante forte que está envolvido na peroxidação lipídica, um dos principais sinais do estresse oxidativo neste local (ESPEY et al., 2002). Particularmente, este radical pode levar a reações de oxidação, nitração ou nitrosação conforme os níveis de substrato e de xNO (ESPEY et al., 2001).
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O produto imediato da reação entre O2x- e xNO, o ONOO-, é estável em pH alcalino, no pH fisiológico encontra-se mais na forma de ácido peroxinitroso (HOONO). O HOONO tem potencial para desencadear diversas oxidações, pois é um agente muito mais oxidante do que xNO ou mesmo O2x-. Por outro lado, ONOO- pode ser detoxificado através da reação com o dióxido de carbono (CO2), uma das mais rápidas reações deste radical devido às características da reação e altas concentrações de CO2 no ambiente celular (FUKUTO et al., 2000).
Segundo Espey et al. (2000), seus efeitos indiretos ocorrem principalmente em células ou tecidos capazes de gerar altos níveis de xNO catalisado pela iNOS e durante processos patológicos e toxicológicos. Nestas condições, ele pode desencadear o estresse nitrosativo ou oxidativo através de reações com O2x- ou O2 para formar espécies reativas do óxido nítrico (ERONs) e reações de nitrosação ou oxidação. Desta maneira, o estresse nitrosativo acontecerá através de reações mediadas pelo trióxido de dinitrogênio (N2O3), enquanto o estresse oxidativo é mediado por superóxidos e peróxidos, como o ONOO- (figura 4).
Figura 4: A química dos efeitos indiretos do ·NO. Fonte: Wink e Mitchell, 1998.
Da mesma maneira, conforme Wink e Mitchell (1998), para compreender o mecanismo da condição patológica não basta saber se este radical inibe uma função celular particular, mas, é necessário entender se isto ocorre por causa de xNO ou de ERONs, ou seja, compreender a química de xNO naquela concentração e ambiente celular particulares.
Primeiramente, xNO deve ser oxidado para gerar radicais que servem de fonte de íon nitrosonium (NO+) que é extremamente reativo em um sistema biológico. O estresse nitrosativo pode ocorrer através da nitrosação de grupos tiol, álcool ou amina pelo NO+. Um dos mais importantes doadores de NO+ no sistema biológico é, justamente, N2O3.
ESTRESSE NITROSATIVO
ESTRESSE OXIDATIVO O2
xNO
NO2 N2O3
MetHb + NO3-
HbO2
Scavengers GSH Ácido ascórbico
S-nitrosotiol
Nitrosaminas Nitrito
RSH RR’NH +NO
O2-
OONO- HOONO
GSSG H+ GSH
Nitrato
Oxidação da Ribose Ribose
Nitrotirosina Tirosina
Metioninil sufóxido Metionina
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Predominantemente, N2O3 é gerado através da reação de oxidação aeróbica de xNO (xNO/O2), uma reação dependente de altas concentrações do gás no meio. Contudo, este mediador também pode ser gerado a partir de HNO2 ou pela reação entre xNO/O2- (ESPEY et al., 2000).
Em síntese, algumas reações de xNO in vivo já estão bem caracterizadas. Assim, a detoxificação deste radical ocorre principalmente através da reação com oxihemoglobina com formação de metahemoglobina e nitrato. Nas condições de acumulo de xNO, este radical pode reagir com O2 para formar N2O3. Fisiologicamente, a geração de 10µM/min de NO in vivo gera uma concentração constante de 2µM, considerando sua meia-vida de um segundo e a detoxificação pela oxihemoglobina (GONZALEZ-ZULUETA et al., 2000, p.697).
De fato, no inicio do um insulto a grande produção de EROs supera os mecanismos normais de defesa antioxidante do tecido, assim, ocorre estresse oxidativo. Com o aumento dos níveis de xNO também aumentam as reações de oxidação e nitração com formação de ONOO-. Neste momento, o xNO também pode converter o ONOO- através da nitrosação. Na seqüência, com o aumento contínuo de xNO em relação a EROs e ERON, o estresse nitrosativo começa a prevalecer através da via da auto-oxidação do xNO.
Conforme Halliwell e Gutteridge (2007, p.576), alguns mecanismos químicos que acontecem no sistema nervoso tornam este tecido propenso ao estresse oxidativo. Entre eles, a excitotoxicidade do glutamato pode se tornar um ciclo vicioso onde haverá mais liberação de glutamato e geração concomitante de O2x- e xNO.
Conforme Gonzalez-Zulueta et al. (2000, p.695), a geração excessiva de xNO pode mediar a lesão neuronal em muitos distúrbios do sistema nervoso. A compreensão das vias através das quais ele causa a morte neuronal é essencial para o desenvolvimento de terapias mais efetivas. O reconhecimento da hipótese de que lesões excitotóxicas são a principal causa de morte neuronal no SNC durante desordens neurológicas constitui um dos maiores avanços na neurologia (MELDRUM; GARTHWAITE, 1990). Segundo Bonfoco et al., (1995), no sistema nervoso, nNOS está estreitamente associada aos receptores NMDA através dos domínios PDZ das duas proteínas e a neurotoxicidade através da ativação deste receptores constitui uma via de lesão comum a diversas desordens neurológicas agudas ou crônicas, como isquemia, trauma, epilepsia, Doença de Huntington, Doença de Alzheimer, AIDS, demência, entre outras. O desacoplamento da interação entre nNOS e PSD-95 provoca atenuação da toxicidade por esta via e prejudica a sinalização excitotóxica pelo Ca+2 (SATTLER et al., 1999).
Conforme Halliwell e Gutteridge (2007), as desordens neurodegenerativas podem apresentar diferentes sintomas e afetar partes diferentes do SNC, contudo, elas têm algumas
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características comuns como: função mitocondrial prejudicada, aumento no dano oxidativo, defeitos no sistema ubiquitina-proteassoma, presença de agregados anormais de proteína, alterações no metabolismo do ferro e envolvimento do mecanismo de excitotoxicidade. A lesão oxidativa pode ser observada através do aumento da peroxidação lipídica e seus produtos finais.
Os resíduos de aminoácidos podem interagir com este radical livre através de reações de nitrosação, para formação de nitrosaminas, grupamentos nitrosotiol e desaminação ou oxidação pelo ONOO-. Nas condições dos seus efeitos diretos e indiretos, ·NO pode modificar muitos tipos de proteínas, como é exemplo a reação com a enzima guanilato- ciclase. As reações de S-nitrosilação de proteínas para formar grupos S-nitrosotiois pode constituir um mecanismo geral de controle da função protéica. Desta maneira, algumas destas reações participam nos mecanismos de ação fisiológicos deste gás. Entretanto, a modificação de proteínas pode produzir danos no DNA, mitocôndrias e mesmo gerar mais radicais livres (GONZALEZ-ZULUETA et al., 2000).
Conforme Brown (1999), além da excitotoxidade, a alta sensibilidade de neurônios ao xNO é parcialmente devido à inibição da respiração mitocondrial por este radical, um fator importante envolvido em muitos processos neurodegenerativos.
Segundo Pacher et al. (2007), quando o nível de lesão celular induzida pelo ONOO- supera a possibilidade de reparo o destino desta célula será a morte por necrose ou apoptose.
Em diversas condições patológicas cerebrais pode ocorrer a geração simultânea de xNO e O2x- neste tecido. Nestes casos, o xNO pode ser gerado pelas NOS enquanto o O2x- pode surgir a partir da perda de elétrons da mitocôndria, NADPH oxidase, xantina oxidase e sintases desacopladoras. Em quantidades baixas ou moderadas, o ONOO- pode causar citotoxicidade através da peroxidação lipídica, nitração e oxidação protéica, lesão oxidativa do DNA, ativação de metaloproteinases da matriz e inativação de diversas enzimas celulares.
Segundo Rameau et al. (2003), a ativação dos receptores NMDA promove a ativação da nNOS e, conseqüentemente, acumulação de nitrotirosina e aumento da morte de neurônios. Os níveis de nitrotirosina nas células refletem os níveis de produção de xNO.
Também foi constatado neste trabalho um aumento na morte celular nos neurônios com níveis maiores de nitrotirosina.
Segundo Merrill e Van der Veen (2000, p.470), no cérebro encontra-se grande quantidade de ferro divalente livre, enzimas geradoras de EROs e ERNs, fosfolipídios contendo ácidos graxos com muitas ligações além de muito O2 para manutenção da atividade elétrica. Por outro lado, há níveis diminuídos de glutationa reduzida (GSH). Diante disso,
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este tecido constitui um alvo importante para o estresse oxidativo e formação de lipoperóxidos. Diversas ERONs, como xNO2 e ONOO-, podem iniciar a lipoperoxidação neste tecido. Geralmente, o processo de lipoperoxidação depende da decomposição mediada por metal de um lipoperóxido pré-existente. Porém, de maneira particular, ONOO- pode atacar os lipídios em um micro-ambiente onde as moléculas metálicas estão cataliticamente inativas ou ausentes.
O radical peroxil (LOO·) é o elemento central na cadeia da peroxidação lipídica.
Este radical pode retirar um hidrogênio de um acido graxo adjacente para formar um hidroperóxido lipídico e um segundo radical lipídico (figura 5). Este segundo radical pode reagir com O2 e formar, novamente, LOO·. Desta maneira a cadeia de reação se propaga (HOGG; KALYANARAMAN, 1999).
LOO· + LH → LOOH + L·
L· + O2 → LOO·
Figura 5: cadeia de propagação da peroxidação lipídica. Fonte: Hogg e Kalyanaraman, 1999.
Segundo Keynes et al. (2005), a concentração de xNO no homogenato de células do cerebelo depende da sua taxa de geração e degradação. O consumo deste radical nestas células diminui cerca de 50% com o uso de inibidores da peroxidação lipídica. Ou seja, a peroxidação lipídica neste sistema funciona como um mecanismo que contribui para o consumo de xNO. A peroxidação lipídica é iniciada por uma espécie reativa como ·OH. Este radical pode retirar um átomo de hidrogênio de um lipídio insaturado e produzir um radical lipídio (L·). Este L· pode reagir com O2 para formar LOO· e prosseguir a cadeia de reação conformo descrito acima. Contudo, durante os processos inflamatórios além de mediar modificações oxidativas nos lipídios, o ONOO- pode originar produtos nitrogenados através da nitração. Estes lipídios nitrogenados originam novos sinalizadores para enzimas metabolizadoras de lipídios (RUBBO et al., 2009).
Certamente, no cerebelo, o xNO pode desempenhar papeis totalmente diferentes como protetor ou neurodegenerativo. Considerando a escassez de trabalhos que associem a produção de xNO no cerebelo e a lesão lipoperoxidativa neste tecido durante a progressão da caquexia induzida pelo tumor de Walker-256 torna-se justificável a realização deste trabalho.
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2 OBJETIVOS
2.1 GERAL
• Traçar um perfil de produção de ·NO no cerebelo durante a progressão da caquexia induzida por tumor de Walker-256 e relacionar esta produção com a lipoperoxidação;
2.2 ESPECÍFICO
• Quantificar o ·NO no cerebelo de ratos portadores de caquexia induzida por tumor de Walker-256 em diferentes tempos de desenvolvimento da caquexia;
• Avaliar a lipoperoxidação no cerebelo de ratos portadores de caquexia induzida por tumor de Walker-256;
• Relacionar a produção de ·NO e a lesão por lipoperoxidação no cerebelo de ratos com caquexia induzida por tumor de Walker-256;
• Avaliar a capacidade antioxidante (TRAP) no cerebelo de ratos portadores de caquexia induzida por tumor de Walker-256;
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 ANIMAIS
Foram utilizados ratos Wistar machos (250 a 350g) fornecidos pelo biotério do Hospital Universitário de Londrina. Os animais foram mantidos em gaiolas de polipropileno com dimensões de 16x34x40 cm sob o ciclo de claro/escuro de 12 horas. Foram alimentados ad libitum com água e alimento completo para ratos (Nutrivital Nutrientes, Curitiba-PR, Brasil) até o início da experimentação. Este projeto encontra-se registrado sob o número 04153, processo de número 28371/2004 na Universidade Estadual de Londrina.
3.2 REAGENTES
Foram utilizados os seguintes reagentes com as respectivas procedências:
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Aminoguanidina (Sigma); Azul de Tripan (Vetec Quimica Final); Desferal® (mesilato de desferrioxamina, Ciba); Éter etílico (Nuclear); KCl (Reagen Quimibrás); Heparin® (heparina sódica 5000 UI, Cristália); H2O2 (Synth); LNAME (NG-nitro-L-arginina-metil éster / Fluka);
Luminol (5-Amino-2-3-diidro-1,4-ftalazinadiona, Sigma); N2 (Air Liquide Brasil LTDA);
NaCl (Reagen Quimibrás); Na2CO3 (Merk); Na2HPO4 (Merk); NaH2PO4 (Merk); terc-butil hidroperóxido (Sigma).
3.3 MANUTENÇÃO DAS CÉLULAS DO TUMOR DE WALKER-256
As células do tumor de Walker-256 foram mantidas em laboratório através de passagens semanais de 2x106 células viáveis para a cavidade abdominal de ratos Wistar adultos machos. Aproximadamente, 6 mL de PBS heparinizado foram inoculados ip para a remoção do líquido ascítico. Após centrifugação 300xg durante 10 min a 4°C, a fração composta por células tumorais foi removida e adicionada a igual volume de PBS. A viabilidade celular foi determinada em câmara de Neubauer através do método de exclusão pelo azul de Tripan.
3.4 MODELO EXPERIMENTAL DE CAQUEXIA
Foi adotado um modelo experimental de caquexia induzida por câncer que utiliza o tumor de Walker-256, um carcinossarcoma mamário de ocorrência espontânea em ratas Wistar. Este modelo foi realizado conforme descrito por Pereira et al. (2004) com poucas modificações.
A caquexia foi induzida em ratos através da inoculação de 0,5 mL de suspensão de células tumorais (8x107 células viáveis) subcutaneamente (sc) na porção lateral da pata posterior direita de ratos Wistar machos. Estes animais foram divididos em 3 grupos experimentais conforme o tempo decorrido após o implante do tumor: 5 dias (T5), 10 dias (T10) e 14 dias (T14). Ainda foram estudados 2 grupos T5 tratados diariamente ip com Aminoguanidina - AG (50 mg/kg) ou LNAME (20 mg/kg). A ingestão alimentar destes animais foi acompanhada diariamente.
Também foram realizados grupos controle PBS e pair-fed. Ao invés de células de tumor de Walker-256, os animais do grupo controle PBS foram inoculados com 0,5 mL de PBS na porção lateral da pata posterior direita. A ingestão alimentar e peso corporal deste grupo foram registrados diariamente até o 14º dia, quando foram sacrificados e seu cerebelo
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retirado para os ensaios. Os grupos de animais pair-fed foram inoculados com 0,5 mL de PBS na porção lateral da pata posterior direita e alimentados com a mesma quantidade de ração ingerida pelos grupos experimentais com tumor 5 dias (pair-fed T5), 10 dias (pair-fed T10) e 14 dias (pair-fed T14). A ingestão alimentar e peso corporal deste grupo foram registrados diariamente até o dia do sacrifício de cada grupo. Após a decapitação dos animais também foi feita a dissecção cuidadosa e pesagem do tumor nos grupos de animais experimentais T5, T10, T14, T5-AG e T5-LN.
As perdas de massa corpórea (pmc) foram utilizadas como parâmetro para a avaliação do desenvolvimento de caquexia durante os tempos estabelecidos para crescimento tumoral. As pmc foram calculadas através da seguinte equação:
PMC (%) = 100 x [MCi – MCf + MT + GMC]
[MCi + GMC]
Onde:
GMC: média do ganho de massa do grupo controle nos dias 5, 10 ou 14 após a inoculação de PBS;
MCf: massa corpórea final do grupo tumor;
MCi: massa corpórea inicial do grupo tumor;
MT: massa tumoral;
3.5 OBTENÇÃO E PREPARO DOS CEREBELOS
Os cerebelos foram obtidos cirurgicamente após a decapitação destes animais ao fim do tempo previsto para cada grupo de animal. Estes cerebelos foram lavados com solução de KCl 1,15% e estocados em nitrogênio líquido até o momento da análise. Antes de cada ensaio, os cerebelos foram homogeneizados manualmente em um tubo potter com auxilio de um pistilo com solução tampão específica de cada análise em volume suficiente para preparar um homogenato na concentração de 100 mg de cerebelo / mL de solução tampão. Durante os ensaios, estes homogenatos foram diluídos novamente com solução tampão específica de cada análise até a concentração de homogenato previamente padronizada para cada ensaio.
Para a técnica de quantificação de ·NO no cerebelo foi preparado um homogenato na concentração de 1,25 mg/mL. Para a determinação de lipoperoxidação foi preparado um homogenato de 15 mg/ml de cerebelo. Na determinação da capacidade antioxidante do cerebelo foi utilizado homogenato na concentração de 100 mg/mL.
