MINISTÉRIO DA SAÚDE FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
CENTRO DE PESQUISAS AGGEU MAGALHÃES CPqAM/FIOCRUZ
PROJETO:
População de ectoparasitos em animais domésticos e sua relação com a epidemiologia das leishmanioses no estado de Pernambuco.
COORDENADORA: Milena de Paiva Cavalcanti, MV, MSc, PhD.
APOIO FINANCEIRO: FACEPE APQ-0135-4.06/10 INÍCIO DO PROJETO: Setembro de 2010
Recife, 2012
SUMÁRIO
Resumo 03
1. Introdução / Justificativa 04
2. Objetivos e metas 08
2.1 Objetivo Geral 08
2.2 Objetivos Específicos 08
2.3 Metas 08
3. Pergunta condutora 09
4. Material e métodos 09
4.1 Área de estudo 09
4.2 Amostragem e aspectos éticos 09
4.3 Coleta de material 09
4.4 Processamento das amostras 09
4.5 Sequenciamento 10
4.6 Análise dos resultados 10
5. Contribuição científica e impacto do projeto 11
6. Parcerias e comprometimento das Instituições inclusas no projeto 11
7. Equipe 12
8. Justificativa da necessidade da Bolsa de Cooperação Técnica (BCT) da FACEPE 12 9. Duração do projeto / Plano de trabalho (Cronograma de atividades) 14 10. Viabilidade do projeto (Infra-estrutura, apoio técnico e orçamento) 14
11. Referências bibliográficas 15
Apêndices 21
Parecer CEUA 24
Resumo: A principal forma de transmissão da leishmaniose visceral (LV) e da leishmaniose tegumentar americana (LTA), em seus ciclos naturais, é a vetorial. No Novo Mundo, os insetos vetores são dípteros, fêmeas, do gênero Lutzomyia. No entanto, frente a algumas evidências científicas já comprovadas, alguns autores acreditam que, na ausência destes vetores, existe a possibilidade de outros ectoparasitos do cão serem possíveis transmissores da LV. Em relação à LTA, as pesquisas ainda estão insipientes. Mediante a importância destas enfermidades no âmbito da saúde pública, das evidências epidemiológicas e experimentais da participação de outros ectoparasitos em sua cadeia de transmissão e o complexo ciclo que envolve um conjunto de interações entre protozoários, seus hospedeiros reservatórios e vetores, os quais podem variar de região para região, este projeto tem como objetivo verificar o envolvimento dos animais domésticos e seus ectoparasitos na epidemiologia das leishmanioses no Estado de Pernambuco. Os resultados obtidos em dois anos (2010-2012) demonstram que nas localidades trabalhadas (Zona Rural de Igarassu, Região Metropolitana do Recife e Passira, Agreste Setentrional do Estado), L.
infantum e L. braziliensis circulam nas diferentes espécies analisadas (cães, gatos e ectoparasitos), com diferentes cargas parasitárias, enfatizando o surgimento de novos paradigmas na epidemiologia das leishmanioses, reforçando a necessidade de estudos para o direcionamento das medidas de controle e prevenção de surtos. Dentre as atividades inerentes ao cronograma de trabalho, para a análise molecular por meio de PCR em tempo real e quantificação da carga parasitária de Leishmania Viannia braziliensis foi desenvolvido e validado um novo sistema diagnóstico; durante o desenvolvimento deste novo sistema verificou-se, em teste de especificidade, o deslocamento da curva de melting de acordo com a espécie parasitária analisada (cepas de referência) desta forma, torna-se extremamente interessante a re-análise das amostras para avaliação da tecnologia de PCR em tempo real na caracterização de Leishmania spp. e possível identificação de outras espécies responsáveis pela LTA no estado de Pernambuco, as quais podem estar relacionadas a dificuldades de controle e tratamento.
Palavras-chave: leishmanioses, epidemiologia, PCR em tempo real.
1. Introdução / Justificativa
As leishmanioses são complexos de doenças parasitárias de caráter zoonótico e constituem um grupo de enfermidades causadas por diferentes espécies de protozoários tripanosomatideos, com distribuição cosmopolita, estando ausente unicamente na Antártida (GALLEGO, 2004).
A transmissão da leishmaniose visceral (LV) e da leishmaniose tegumentar americana (LTA), em seus ciclos naturais, ocorre por meio de vetor, no Novo Mundo, dípteros fêmeas do gênero Lutzomyia. Estes insetos, ao se alimentarem do sangue de um hospedeiro infectado têm seu trato digestivo colonizado por formas promastigotas, podendo ser eliminadas durante o repasto sanguíneo. Uma vez em seu novo hospedeiro, essas formas promastigotas são fagocitadas por macrófagos no interior dos quais, se diferenciam em amastigotas, e se multiplicam reiniciando o ciclo (KILLICK-KENDRICK, 1990;
MARZOCHI, 1992; ASHFORD, 1996). No mundo, existem cerca de 350 espécies de Lutzomyia catalogadas, distribuídas desde o sul do Canadá até o norte da Argentina, destas, pelo menos 200, ocorrem na bacia amazônica (REBÊLO et al., 1999; GIL et al., 2003).
Além da forma primária de transmissão (vetorial), a LV também pode ocorrer por meio de transfusão sanguínea, agulha contaminada entre usuários de drogas, transplante de órgãos, infecções laboratoriais (GUERIN et al., 2002), por contato direto (LAINSON;
BRAY, 1964; NUWAYRI-SALTI; KHANSA, 1985) e sexual (SYMMERS, 1960;
CATONE et al., 2003). Já a LTA, conforme literatura, até o momento é transmitida, apenas, por meio da picada de insetos infectados, não havendo outra forma de transmissão (BRASIL, 2007).
A LV é causada pela Leishmania donovani na Índia (DAVIDSON, 1999), Leishmania infantum no Mediterrâneo (SOLANO-GALLEGO et al., 2001) e Leishmania chagasi na América Latina (TAFURI et al., 2001); porém, com base em estudos dos perfis isoenzimáticos, a L. chagasi tem sido considerada sinonímia de L. infantum (MAURÍCIO et al., 2000). No Brasil, o principal vetor é Lutzomyia longipalpis, flebotomíneo conhecido popularmente como mosquito palha, tatuquiras, birigui, entre outros (BRASIL, 2006).
Em relação à LTA, a Leishmania (Viannia) braziliensis é a espécie mais prevalente em seres humanos, encontrada em todas as zonas endêmicas do país, transmitida
por diferentes espécies de flebotomíneos tais como, Lutzomyia whitmani, Lu. intermédia, Lu. wellcomei, entre outras (LACERDA, 1994). Conforme o mesmo autor, L. (V.) guyanensis, espécie que ocorre na margem do Rio Amazonas, é transmitida principalmente por Lu. umbratilis, Lu. anduzei e Lu. whitmani. L. (V.) naiffi e L. (V.) shawi, ocorrem nos estados do Pará e Amazonas, sendo os principais vetores Lu. squamiventris, Lu. paraensis, Lu. ayrozai e Lu. whitmani, respectivamente (SHAW; LAINSON, 1975; SHAW, 1999).
Ainda na região da Amazônia, L. (V.) lainsoni e L. (L.) amazonensis são transmitidas, respectivamente, por Lu. ubiquitalis e Lu. flaviscutellata (SHAW; LAINSON, 1975;
SHAW, 1999).
Em relação aos reservatórios, L. infantum já foi relatada no cão (Canis familiaris), gato (Felis catus), canídeos silvestres (Cerdocyon thous, Lycalopex vetulus), marsupiais (Didelphis marsupialis, D. albiventris) e roedores (Proechymis oris) (SHERLOCK et al., 1984; SHERLOCK, 1996; SANTA ROSA; OLIVEIRA, 1997; DANTAS-TORRES;
BRANDÃO-FILHO, 2006). Semelhantemente, L. braziliensis, L. amazonensis e L.
guyanensis, foram descritas em animais silvestres (Bolomys lasiurus), sinantrópicos (Rattus rattus) e domésticos (canídeos, felídeos e eqüídeos) (BRASIL, 2007).
No entanto, em relação à LV o cão doméstico (Canis familiaris) é considerado o reservatório de maior importância epidemiológica (SANTA ROSA; OLIVEIRA, 1997;
FEITOSA et al., 2000; FRANÇA-SILVA et al., 2003), uma vez que, os casos humanos, normalmente, são precedidos por casos caninos, além de os cães apresentarem um intenso parasitismo cutâneo, albergando uma maior quantidade de parasitos na pele, favorecendo a infecção dos vetores (SANTA ROSA; OLIVEIRA, 1997; ALMEIDA et al., 2005). A proximidade do cão com os humanos tem sido referenciada como um importante fator de risco para LV (DESJEUX, 2001). No Nordeste brasileiro, o aumento da incidência da LV possivelmente associa-se à presença de cães infectados no interior ou peridomicílio (CUNHA et al., 1995; DESJEUX, 2001).
As leishmanioses podem manifestar-se clinicamente de várias formas dependendo da espécie parasitária envolvida e da resposta imune do hospedeiro (SACKS; KAMHAWI, 2001). A LV apresenta manifestações clínicas que variam de formas assintomáticas até o quadro clássico da infecção com febre, anemia, hepatoesplenomegalia, manifestações
hemorrágicas e perda de peso (MIRANDA, 2008). A LTA acomete as estruturas da pele e cartilagens da nasofaringe, de forma localizada ou difusa (BRASIL, 2007).
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), as leishmanioses constituem- se em um sério problema de saúde pública tanto no velho como no novo mundo, estando dentre as seis mais importantes doenças infecciosas, devido ao seu alto coeficiente de detecção, capacidade de produzir deformidades físicas e, em relação à LV, o potencial de ser fatal, (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2006).
A LV ocorre em 65 países, distribuídos em cinco continentes, sendo a África o mais afetado. São esperados 500.000 novos casos e mais de 50.000 mortes anuais. A maioria (≥90%) dos casos é registrada em áreas pobres rurais e suburbanas de seis países:
Bangladesh, Índia, Nepal, Sudão, Etiópia e Brasil (ORGANIZAÇÃO PANAMERICANA DE SAÚDE, 1997; DESJEUX, 2004; CHAPPUIS et al., 2007). A LTA ocorre em 88 países distribuídos em quatro continentes (Américas, Europa, África e Ásia), sendo estes, aproximadamente, 72 países em desenvolvimento (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2006).
O Brasil é o principal responsável pelos casos notificados das leishmanioses na América Latina (BRASIL, 2004), quase sempre esses registros estão relacionados com mudanças ambientais como, por exemplo, a utilização de terras florestais para desenvolvimento e exploração de novos recursos naturais e agricultura; tais mudanças modificam a epidemiologia das leishmanioses, ocasionando novas áreas endêmicas (DORVAL et al., 2006), o que segundo Monteiro et al. (2005), vem acelerando cada vez mais o processo de urbanização das doenças.
Casos autóctones de LV são notificados em, pelo menos, 19 estados da Federação, distribuídos em quatro, das cinco regiões, permanecendo indene apenas a Sul (QUEIROZ;
ALVES; CORREIA, 2004; BRASIL, 2006). A maior incidência encontra-se na região Nordeste (70% do total de casos), onde a doença constitui-se em importante problema de saúde pública, cuja letalidade pode alcançar 10% quando não se institui o tratamento adequado (ALEXANDRINO, 2001; GONTIJO; MELO, 2004; BRASIL, 2006).
A LTA apresenta ampla distribuição, com casos autóctones em todos os estados do Brasil (DORVAL et al., 2006). Em Pernambuco, segundo estudos realizados por
Brandão-Filho et al. (1999), incide em todas as regiões, com predominância (mais de 60%
dos casos notificados) na região correspondente à Zona da Mata Atlântica, sendo quase totalmente na forma cutânea localizada.
A LV é uma doença endêmica em Pernambuco (DANTAS-TORRES, 2006, 2008), sendo diagnosticada, em cães e humanos, em regiões indenes para o principal inseto vetor, Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae), tais como, Recife (DANTAS- TORRES, 2006) e São Vicente Férrer (CARVALHO et al., 2007), sugerindo que outras espécies de Lutzomyia, como Lutzomyia migonei podem estar envolvidas na transmissão de L. infantum nesses municípios (DANTAS-TORRES, 2008).
Frente a algumas evidências científicas já comprovadas, alguns autores acreditam que, na ausência, dos insetos vetores incriminados de transmissores das leishmanioses, existe a possibilidade de outros ectoparasitos do cão como Rhipicephalus sanguineus, Ctenocephalides canis e Ctenocephalides felis, serem possíveis transmissores da LV (COUTINHO et al., 2005; SILVA et al., 2007).
Nos últimos anos, tem crescido o interesse científico sobre a possível competência vetorial do Rh. sanguineus (Acari: Ixodidae), o qual já foi encontrado naturalmente infectado, sendo capaz de transmitir, em condições experimentais, os parasitos a roedores, abrindo novas perspectivas na epidemiologia da LV zoonótica (COUTINHO et al., 2005).
No Brasil, há relatos do encontro de exemplares de Rh. sanguineus infectados por formas semelhantes à promastigotas de L. infantum (SHERLOCK, 1964; SILVA et al., 2007).
A hipótese sobre a participação do carrapato Rh. sanguineus na transmissão de L.
infantum entre cães não é recente (BLANC; CAMINOPETROS, 1930; MACHATTIE;
CHADWICK, 1930; GIRAUD; RANQUE; CABASSU, 1954; SHERLOCK, 1964;
MCKENZIE, 1984). No início da década de 1930, na França, demonstrou-se a susceptibilidade do Rh. sanguineus à infecção por L. infantum e a capacidade desse carrapato transmitir mecanicamente o protozoário para roedores (BLANC;
CAMINOPETROS, 1930).
As evidências disponíveis sugerem que Rh. sanguineus pode estar envolvido na epidemiologia das leishmanioses. A real importância dessa possível forma secundária de transmissão é desconhecida, não se sabe se Rh. sanguineus é capaz de transmitir
leishmanioses durante o repasto sanguíneo. Considerando que formas semelhantes à promastigotas de L. infantum têm sido encontradas nesse carrapato, a possibilidade de transmissão biológica não pode ser totalmente descartada (DANTAS-TORRES, 2009).
Atualmente, no âmbito Nacional, as leishmanioses encontram-se como doenças endêmicas, negligenciadas, com surtos epidêmicos sendo relados em diversas cidades, tais como, Teresina e Fortaleza. O programa de controle instituído no país, baseado na identificação e tratamento dos casos, combate ao vetor e eutanásia do reservatório canino (BRASIL, 2004), não tem sido suficiente para controlar o avanço das enfermidades (DANTAS-TORRES; BRANDÃO-FILHO, 2006).
Frente a estas evidências epidemiológicas e experimentais, o ciclo de transmissão das leishmanias é bastante complexo e envolve um conjunto de interações entre o protozoário, seus hospedeiros reservatórios e vetores, que podem variar de região para região (KILLICK-KENDRICK, 1990; ASHFORD, 1996; DANTAS-TORRES;
BRANDÃO-FILHO, 2006), sendo necessários estudos, para um melhor entendimento da epidemiologia destas enfermidades.
2. Objetivos e metas 2.1 Geral:
Verificar o envolvimento dos animais domésticos e ectoparasitos na epidemiologia das leishmanioses no Estado de Pernambuco.
2.2 Específicos:
Efetuar levantamento da fauna de ectoparasitos em animais domésticos nas áreas trabalhadas;
Detectar DNA de L. infantum e L. braziliensis em animais domésticos e seus ectoparasitos;
Relacionar carga parasitária entre animais e ectoparasitos por meio de PCR em tempo real.
2.3 Metas
Verificar o envolvimento de reservatórios domésticos e seus ectoparasitos na epidemiologia das leishmanioses no Estado de Pernambuco.
3. Pergunta condutora
Qual o envolvimento dos animais domésticos e seus ectoparasitos na epidemiologia das leishmanioses no Estado de Pernambuco?
4. Material e métodos 4.1 Área do estudo
Por demanda espontânea das Prefeituras, serão inclusos no estudo municípios de todo o Estado de Pernambuco que solicitem apoio e orientações ao Serviço Regional de Referência em Leishmanioses da FIOCRUZ-PE.
4.2 Amostragem e aspectos éticos
A amostragem será de conveniência. Serão inclusos no estudo animais em que os proprietários concordarem em participar da pesquisa. Os proprietários assinarão um termo de consentimento livre e esclarecido (Apêndice A) e responderão a um questionário para identificação dos animais (Apêndice B). Este projeto foi submetido e aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA), da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) sob o registro P-50/10.5-Licença LW-1/11.
4.3 Coleta de material (sangue e ectoparasitos)
O trabalho de coleta de material para os exames laboratoriais em cães e gatos será feito casa a casa, com visita aos domicílios de cada área previamente definida, de acordo com a demanda dos municípios. Os cães e gatos serão devidamente contidos, com focinheiras adequadas ao porte e, quando necessário, serão submetidos à sedação química por meio de acepromazina 1% na dosagem de 0,58 a 2,25mg/kg de peso corpóreo, ou seja, 1 a 4 gotas por kg de peso corporal e, acompanhados por médico veterinário durante todo o procedimento.
Os animais serão submetidos à avaliação física constando de inspeção da pele e fâneros, sendo efetuada a coleta dos ectoparasitos, os quais serão acondicionados em frascos contendo álcool a 70%, individualizados por animal.
Serão colhidos, de cada animal, 2 - 5 mL de sangue da veia cefálica, o qual será estocado a -80°C para posterior extração de DNA.
4.4 Processamento das amostras (sangue e ectoparasitos)
A análise molecular das amostras de sangue e ectoparasitos será realizada no Laboratório de Imunoparasitologia do Departamento de Imunologia e no Núcleo de Plataformas Tecnológicas do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (CPqAM) - FIOCRUZ/PE, bem como a identificação dos ectoparasitos, a qual seguirá as chaves taxonômicas tradicionais (WERNECK, 1936; ARAGÃO; FONSECA, 1961; LINARDI;
GUIMARÃES, 2000).
A extração de DNA dos ectoparasitos e amostras de sangue será realizada utilizando-se os kits Illustra tissue & cells genomicprep mini spin Kit e Illustra blood genomicprep mini spin Kit (GE Healthcare, New York, USA), respectivamente, seguindo as instruções do fabricante. Após a extração, as amostras de DNA serão testadas pela PCR convencional de acordo com Brujin; Barker (1992) e Paiva-cavalcanti et al. (2009), utilizadas no Serviço de Referência em Leishmanioses da FIOCRUZ/PE. As amostras positivas serão quantificadas por meio de PCR em tempo real.
4.5 Sequenciamento
Produtos da PCR convencional serão purificados utilizando Illustra GFX PCR de DNA e Gel Kit de Purificação Band (GE Healthcare, EUA), seguindo as instruções do fabricante e, em seguida, sequenciados usando BioDye Terminator Cycle Sequencing Kit (versão 3.1) (Applied Biosystems) em sequenciador automático (ABI Analyzer 3100 Genetic). As seqüências obtidas serão submetidas a National Center for Biotechnology Information (NCBI), efetuando BLAST para verificação de homologia.
4.6 Análise dos resultados
A análise, interpretação e registro dos resultados dos testes moleculares em amostras serão efetuados por meio de eletroforese em gel de agarose 1,5%, corado com brometo de etídio (10 mg/ml), usando marcador de peso molecular (100 bp DNA ladder - GibcoBRL-Life Technologies, MD, USA). Para a PCR em tempo real, será utilizado o software ABI PRISM 7500 SDS (versão 1.4).
Para análise dos dados serão obtidas distribuições absolutas e percentuais para a frequência da infecção por Leishmania spp. nos animais e ectoparasitos. O teste Qui-
quadrado de Pearson ou Exato de Fisher (quando as condições para utilização do teste Qui- quadrado não foram verificadas) será utilizado para avaliar a associação entre a presença de animais e ectoparasitos infectados.
O nível de significância utilizado na decisão dos testes estatísticos será de 5,0%.
Os dados serão digitados na planilha Excel e o “software” estatístico utilizado para a obtenção dos cálculos será o SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) em versão para microcomputador.
5. Contribuição científica e impacto do projeto
Conhecer as espécies de ectoparasitos e animais domésticos que, possivelmente, relacionam-se com a epidemiologia das leishmanioses Estado de Pernambuco; promover conhecimento para o controle estratégico das leishmanioses por município trabalhado;
fornecer subsídios para estudos direcionados à comprovação de novos vetores e reservatórios domésticos para as leishmanioses no estado de Pernambuco.
6. Parcerias e comprometimento das Instituições inclusas no projeto
Até o momento, este projeto faz parte de uma parceria entre CPqAM/FIOCRUZ- PE e prefeituras dos municípios de Igarassu e Passira porém, existem demandas de outras localidades, as quais estão em análise pela equipe do Serviço de Referência em Leishmanioses do CPqAM/FIOCRUZ-PE.
As prefeituras participantes demonstram interesse em expandir o projeto para todas as localidades, uma vez que, casos de leishmanioses estão sendo registrados em outras áreas dos municípios. Em um futuro próximo, o conhecimento sobre a participação ou não de um novo vetor e/ou reservatório no ciclo biológico de Leishmania spp., em conjunto com avaliação da situação epidemiológica local, irão contribuir para o direcionamento das medidas de controle e prevenção de surtos; consequentemente, redução dos déficits gerados com pacientes em tratamento, fornecendo uma melhoria na qualidade de vida da população afetada pela enfermidade. Tais metas fazem parte da política da FIOCRUZ, em contribuir para a melhoria da qualidade de vida da população e promoção da saúde.
Os resultados obtidos irão contribuir para a ampliação teórica e prática, das atividades do Serviço de Referência Regional em Leishmanioses do CPqAM/FIOCRUZ, o qual é responsável pelo fornecimento do diagnóstico de complexidade, identificação de novos vetores e reservatórios, além de capacitação de recursos humanos.
7. Equipe
Nome/Formação/Cargo Responsabilidade Instituição
Milena de Paiva-Cavalcanti/Médica Veterinária/Tecnologista
Coordenadora/Orientadora dos estudantes
CPqAM/FIOCRUZ
Sinval Pinto Brandão-
Filho/Farmacêutico/Pesquisador
Colaborador / Consultor CPqAM/FIOCRUZ Maria Edileuza Felinto de
Brito/Bióloga/Pesquisadora
Colaboradora CPqAM/FIOCRUZ
Filipe Dantas-Torres/ Médico Veterinário/Pesquisador Visitante
Identificação dos ectoparasitos
CPqAM/FIOCRUZ Rayana Carla Silva de Morais* / Estudante de
Graduação em Ciências Biológicas UFRPE
Coleta e Análises Bolsista BCT-0268-
5.05/11 FACEPE-
FIOCRUZ
* A ser contemplada com a Bolsa solicitada no presente Edital (FACEPE 12/2012)
8. Justificativa da continuidade da Bolsa de Cooperação Técnica (BCT) da FACEPE Este estudo contempla uma parceria entre o CPqAM/FIOCRUZ/PE e Prefeituras dos municípios de Igarassu e Passira. Cada município fornecerá o apoio logístico durante as coletas, incluindo local para estadia da equipe de campo e agentes de Saúde para o contato com a comunidade, além de implementação das medidas de controle e prevenção resultantes deste projeto.
O CPqAM fornecerá apoio técnico para a realização das coletas, diagnóstico molecular em animais e ectoparasitos, busca de possíveis casos de LV e LTA, além da contribuição científica para determinação de medidas de controle. Para execução de tais medidas, faz-se necessário a aquisição de técnico qualificado para os procedimentos acima mencionados uma vez que, a equipe de pesquisa em leishmanioses do CPqAM/FIOCRUZ/PE apresenta uma deficiência em recursos humanos aptos a exercer atividades inerentes à Medicina Veterinária e Biologia.
Durante o desenvolvimento deste estudo foram encaminhados relatórios técnicos às prefeituras com as análises moleculares e posicionamento do Serviço de Referência em Leishmanioses frente aos resultados, com orientações de medidas de prevenção e controle de acordo com as particularidades encontradas para cada localidade; prestando um serviço de Saúde Pública e fornecendo melhorias na qualidade de vida da população. Sob o ponto de vista científico, os resultados foram apresentados em Reunião Científica Nacional e aceitos para publicação em Congresso Internacional, além da submissão de artigo, conforme item 5 do relatório Técnico.
Em conjunto com o projeto “Desenvolvimento de ferramentas moleculares com aplicação do gene G3PD de mamíferos como controle de qualidade amostral para o diagnóstico das leishmanioses” aprovado para financiamento pelo PAPES VI- FIOCRUZ/2011, foi desenvolvido e validado um novo sistema diagnóstico para a análise molecular por meio de PCR em tempo real e quantificação da carga parasitária de Leishmania Viannia braziliensis; durante o desenvolvimento deste novo sistema verificou- se, em teste de especificidade, o deslocamento da curva de melting de acordo com a espécie parasitária analisada (cepas de referência) desta forma, torna-se extremamente interessante a re-análise das amostras para avaliação da tecnologia de PCR em tempo real na caracterização de Leishmania spp. e possível identificação de outras espécies responsáveis pela LTA no estado de Pernambuco, as quais podem estar relacionadas a dificuldades de controle e tratamento.
Diante do exposto, para o aprofundamento das análises de PCR em tempo real para os casos de LTA e possibilidade de ampliação do projeto para outros municípios do Estado de Pernambuco, esta proposta de estudo (projeto de pesquisa) solicita ao Edital FACEPE 12/2012 “Apoio a projetos de pesquisa do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães - CpqAM” Convênio FIOCRUZ, a continuidade da Bolsa do Cooperação Técnica (BCT) - 8 iniciada em 01/08/2011 (BCT-0268-5.05/11 APQ-0135-4.06/10), a ser utilizada conforme plano de trabalho abaixo (item 9.1) e duração de 24 meses.
9. Duração do projeto / Plano de trabalho (Cronograma de atividades)
Estima-se que as etapas para re-análise das amostras e a possível caracterização de Leishmania spp. por meio da análise da curva de melting (PCR em tempo real) e demais etapas experimentais tenham duração total de 24 meses.
9.1 Plano de trabalho (Cronograma de atividades)
2012 2013 2014
Atividades
Out-Dez Jan-Jul Ago-Dez Jan-Jul Ago-Out Coleta de material (sangue)*
Extração de DNA
PCR convencional para LTA Sequenciamento dos produtos Análise das sequências - BLAST Aquisição de novas cepas de referência PCR em tempo real para LTA
Análise dos resultados
Apresentação em evento científico Elaboração do artigo
* de acordo com demanda das Prefeituras.
10. Viabilidade do projeto (Infra-estrutura, apoio técnico e orçamento)
O CPqAM/FIOCRUZ dispõe dos recursos físicos e apoio financeiro necessários (aprovação pelo PAPES VI-FIOCRUZ, R$: 15 000,00/ano durante dois anos) à execução dos ensaios propostos na metodologia. As prefeituras envolvidas no projeto se comprometem em executar o apoio logístico necessário bem como, ceder os agentes de saúde para visitação casa-casa. A equipe envolvida contempla a experiência requerida para execução das etapas do projeto.
10.1 Orçamento
* Solicitada ao presente Edital (FACEPE 12/2012)
** Parte dos recursos já adquiridos com verba do Tesouro Nacional durante o andamento do projeto.
11. Referências bibliográficas
ALEXANDRINO, A. C. Diagnóstico e controle da leishmaniose visceral: considerações sobre Pernambuco. 2001. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal de Pernambuco, Recife. 2001.
ALMEIDA, M.A.O, et al. Clinical and serological aspects of visceral leishmaniasis in Northeast brasilian dogs naturally infected with Leishmania chagasi. Veterinary Parasitology, Amsterdam, v.127, p.227-232, 2005.
ARAGÃO, H. B.; FONSECA, F. Notas de Ixodologia. VIII. Lista e chave para os representantes da fauna ixodológica brasileira. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v. 59, n. 2, p.115-129, jul. 1961.
Material / Passagens Quantidade Valor unitário R$
Valor total R$
SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) 06 (10x200 reações)
1 000,00 6 000,00 MicroAmp Optical tube without cap 0.2 ml 2000 tubes 641,00 641,00
MicroAmp Optical 8 - cap strip 2 400 tampas 261,00 261,00
Brometo de Etídeo 02 (10 ml) 180,00 360,00
TAE 50X – 1000 ml 03 304,92 914,76
100 pb DNA Ladder 02 666,00 1 332,00
Blue/Orange 6X 03 62,00 186,00
Agarose 250g 02 1 075,00 2 150,00
Conj. p/ purif. DNA Illustra Blood Genomic Prep Mini (250 r)
04 (1000 r) 1 505,00 6 020,00 Conj. p/ purif. DNA Illustra Tissue and cells Genomic
Prep Mini Spin (250 r)
08 (2000 r) 1 759,00 14 072,00
Tubo tipo eppendorf 1,5ml pct com 1000 03 (1000) 24,50 73,50
Tubo tipo eppendorf 0,5ml pct com 1000 03 (1000) 34,60 103,80
Ponteiras azuis (200 – 1000) pct com 1000 03 (1000) 29,88 89,64
Ponteiras amarelas (0-200) pct com 1000 03 (1000) 28,85 86,55
Primers 6 120,00 720,00
Conjunto de pipetas 02 1 500,00 3 000,00
Microcomputador 01 2 499,00 2 499,00
Passagens e diárias 4 000,00 4 000
Bolsa FACEPE BCT-8/24 meses* 01 1 100,00/mês 26 400,00
VALOR TOTAL:
66 509,25**
ASHFORD, R. W. Leishmaniasis reservoirs and their significance in control. Clinics in Dermatology, Philadelphia, v. 14, n. 5, p. 523-532, Sept./Oct. 1996.
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APÊNDICE A
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARESCIDO
Projeto: População de ectoparasitos em animais domésticos e sua relação com a epidemiologia das leishmanioses no Estado de Pernambuco.
Eu, _______________________________________, RG ______________________, proprietário do animal __________________________, espécie _______________________
residente à rua/Av. ___________________________________________________________, bairro______________________, cidade/estado ________________, CEP:_______________
aceito participar desse estudo, cujo objetivo é desenvolver um método de diagnóstico para as leishmanioses.
Fui informado que meu animal será submetido à coleta de ectoparasitos (pulgas e carrapatos) e de sangue para os testes de diagnóstico da leishmaniose visceral / leishmaniose tegumentar americana no estudo acima referido, sem que haja nenhum dano à saúde do mesmo. A coleta de sangue será realizada com uso de agulha e seringa e, o animal poderá sentir um desconforto no momento em que a agulha for introduzida na pele, sendo retirado de 3 a 5 mL de sangue, o equivalente a duas ou três colheres de sopa; este processo também poderá causar uma mancha roxa no local que, desaparecerá com o tempo de, aproximadamente, sete dias.
Durante a assinatura deste termo fui informado que os materiais coletados serão incorporados ao Laboratório de Imunoparasitologia do Departamento de Imunologia do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/FIOCRUZ, podendo ser utilizados em pesquisas posteriores; e que tenho plena liberdade de recusar ou retirar o consentimento sem sofrer nenhum tipo de penalização ou pressão por tal. Estou ciente que não haverá incentivo financeiro para participação nesta pesquisa, que este documento é emitido em duas vias, uma ficará comigo e outra com a equipe de pesquisa, tenho garantida de que não haverá divulgação de minha identidade ou de meu animal nos produtos gerados por este projeto.
Contatos: Drª. Milena de Paiva Cavalcanti, CPqAM/FIOCRUZ – Tel. (81) 2101-2679
________________________ ___________________________
Sujeito da pesquisa Coordenador do projeto
Recife, ____/____/____
APÊNDICE B
FICHA DE CADASTRO
Projeto: População de ectoparasitos em animais domésticos e sua relação com a epidemiologia das leishmanioses no Estado de Pernambuco.
Responsável: Drª. Milena de Paiva Cavalcanti 1 – IDENTIFICAÇÃO
NOME DO ANIMAL: ______________________________________ Nº _____________________
IDADE:___________ SEXO: M F ESPÉCIE: ___________________ RAÇA: _______________
PROPRIETÁRIO: __________________________________________________________________
ENDEREÇO: ______________________________________________________________________
FONE:
2 - AVALIAÇÃO DO ANIMAL:
2.1 Estado Nutricional:
Ótimo Regular
Bom Péssimo
2.2 Localização e características das lesões:
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
2.3 Sintomas:
Alopecia Onicogrifose Inapetência
Conjuntivite Perda de Peso Distensão abdominal
Linfadenopatia Coriza Paralisia dos membros posteriores
3 - COLHEITA DO MATERIAL:
Sangue Punção medular
Raspado da lesão cutânea Raspado de pele íntegra
4 - OUTRAS INFORMAÇÕES IMPORTANTES
________________________________________________________________________________________
5 - DADOS SOBRE O VETOR:
• HÁ PRESENÇA DE MOSQUITOS? Sim ( ) Não ( )
• CASO HAJA, QUAL A FREQUÊNCIA? Alta ( ) Moderada ( ) Baixa ( )
• PERÍODO DE MAIOR QUEIXA: Manhã ( ) Tarde ( ) Noite ( )
• VEGETAÇÃO NAS IMEDIAÇÕES: Primária ( ) Secundária ( )
6 - SOBRE O CONHECIMENTO DO PROPRIETÁRIO ACERCA DA LVC / LTA SIM NÃO
Já ouviu falar sobre?
Tem conhecimento sobre a gravidade?
7 - RESULTADO DOS EXAMES:
PARASITOLÓGICO SOROLÓGICO PCR
