UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS
HERMANN FERREIRA COSTA
INVESTIGAÇÃO DO EFEITO ANTI-INFLAMATÓRIO DOS ALCALOIDES WARIFTEINA E METIL-WARIFTEINA DE Cissampelos sympodialis EICHL. (Menispermaceae) EM MODELOS DE INFLAMAÇÃO
AGUDA E CRÔNICA.
HERMANN FERREIRA COSTA
INVESTIGAÇÃO DO EFEITO ANTI-INFLAMATÓRIO DOS ALCALOIDES WARIFTEINA E METIL-WARIFTEINA DE Cissampelos sympodialis EICHL. (Menispermaceae) EM MODELOS DE INFLAMAÇÃO
AGUDA E CRÔNICA.
Teses apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos do Centro de Ciências da Saúde, da Universidade Federal da Paraíba, como parte dos requisitos para obtenção do título de DOUTOR EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS, área de concentração - Farmacologia.
Orientadora: Profa. Dra. Marcia Regina Piuvezam
HERMANN FERREIRA COSTA
INVESTIGAÇÃO DO EFEITO ANTI-INFLAMATÓRIO DOS ALCALOIDES WARIFTEINA E METIL-WARIFTEINA DE Cissampelos sympodialis EICHL. (Menispermaceae) EM MODELOS DE INFLAMAÇÃO AGUDA E
CRÔNICA.
Aprovado em _______________
BANCA EXAMINADORA:
________________________________________ Profa. Dra. MARCIA REGINA PIUVEZAM Departamento de Fisiologia e Patologia-UFPB
(Orientadora)
________________________________________ Prof. Dr. FREDERICO BARBOSA DE SOUSA
Departamento de Morfologia-UFPB (Membro Titular Externo ao PgPNSB/UFPB)
________________________________________ Prof. Dra JANEUSA TRINDADE SOUTO Departamento de Microbiologia e Parasitologia-UFRN
(Membro Titular Externo ao PgPNSB/UFPB)
________________________________________ Prof. Dra LIANA CLÉBIA DE MORAIS PORDEUS Departamento de Fisiologia e Patologia-UFPB
(Membro Titular Externo ao PgPNSB/UFPB)
________________________________________ Prof. Dra SANDRA RODRIGUES MASCARENHAS
Aos meus pais Edilza e Antonio,
exemplo e contraexemplo, que
AGRADECIMENTOS
-A benevolência de Deus que me permite a caminhada.
-Aos meus irmãos Helane Ferreira Costa e Hearle Ferreira Costa (in
memorian) estejam onde estiverem sempre apoiaram a continuação do
trabalho.
-Aos meus pais Maria Edilza Ferreira Costa e Antonio Costa da Mota.
-Aos meus familiares que sempre direta e indiretamente me auxiliaram e,
com isso, foi possível chegar até aqui.
-A prof
aMárcia Regina Piuvezam, pela orientação, paciência e paciência,
compreensão, exemplo de dedicação e ética.
-Ao profº Dr. Cláudio Roberto Bezerra dos Santos pelo tempo e auxílio
intelectual na exportação desses resultados.
-Aos companheiros do laboratório de imunologia, que criam um ambiente
descontraído-tenso onde é possível o crescimento técnico e intelectual.
Destacar um ou outro seria imprudente e, em verdade, excludente.
-As todos os laboratórios vizinhos, sem ser excludente, todos mesmo, que
nunca me fecharam a porta e pelo contrário sempre deixaram que eu
percorresse onde a educação do “com licença” permitisse, inclusive os da
química.
-Aos professores da pós-graduação, aos novos e antigos. Aprendi a dizer
que só posso enxergar mais longe por estar sobre os ombros de gigantes
-Aos funcionários do C. Biotec nas pessoas de José Crispin Duarte e
Mônica Rodrigues da Silva não só pelo braço forte, mas também pela mão
amiga nos momentos necessários.
-Aos colegas da turma da pós-graduação pela ajuda durante as disciplinas e
pelo apoio com reforço positivo diariamente.
-A Glageane da Silva Souza, companheira de todas as horas, por me
suportar mesmo quando nem eu suporto mais.
-Ao Dante, meu filho, pela compreensão abusada, pelo encorajamento a
minha evolução e treino da minha atenção periférica.
"Abre a mente ao que eu te revelo
e retém bem o que eu te digo, pois não é ciência
ouvir sem reter o que se escuta."
RESUMO
Infusões das raízes da planta Cissampelos sympodialis Eichl (Menispermaceae)
são utilizadas, pela medicina popular, no Nordeste Brasileiro, para o tratamento de doenças do trato respiratório e digestório. Estudos prévios demonstram que o extrato hidroalcoólico das folhas (AFL) da planta e a warifteina (W), alcaloide bisbenzilisoquinolínico, apresentam efeitos anti-inflamatórios e antialérgicos. Esse estudo avaliou, portanto, o efeito do tratamento oral de camundongos com W e a metil-warifteina (MW) na formação do edema de pata induzido por agentes flogísticos, no extravasamento vascular e na migração celular em modelos de inflamação aguda e o efeito do tratamento oral com a AFL e seus alcaloides (W e MW) na inflamação crônica representada pelo modelo experimental de alergia alimentar (camundongos BALB/c sensibilizados com ovalbumina - OVA). O tratamento com a W reduziu o edema de pata induzido por carragenina, por histamina ou prostaglandina E2, efeito esse não observado com o tratamento com MW. A warifteina e a metil-warifteina também reduziram o extravasamento vascular, contudo sem inibir a migração celular associada à inflamação. No modelo experimental de alergia alimentar o tratamento com W induziu ganho de peso dos animais com diminuição da diarreia. A metilação da warifteina, embora não tenha induzido o ganho de peso diminuiu a diarreia durante os desafios com o alérgeno. Todavia o tratamento com AFL não induziu o ganho de peso e nem inibiu a diarreia alérgica. Diferentemente, os tratamentos com o AFL e com os alcaloides reduziram os títulos de IgE específica para ovalbumina (OVA), aumentaram a proporção de linfócitos T CD4+ e CD8+ no linfonodo mesentérico. A proporção de linfócitos T reguladores foi aumentada no linfonodo mesentérico pelos tratamentos em estudo. Os experimentos in vitro, com células do linfonodo
mesentérico de animais sensibilizados, demonstraram que W e MW inibiram a secreção de interleucina (IL-)12 e IL-10, sem alteração nos níveis de interferon- (IFN- ) e IL-13. Esses resultados demonstraram que o tratamento oral com warifteina apresentou atividade anti-inflamatória por inibir a ação de mediadores da inflamação e que a metilação da molécula não potencializou seu efeito. Também, os tratamentos com AFL, W e MW apresentaram efeitos imunomoduladores na alergia alimentar com aumento de células Treg e com diminuição de citocinas oriundas de células do mecanismo imune inato independente das do mecanismo imune adaptativo.
Palavras-chave: Cissampelos sympodialis Eichl (Menispermaceae), warifteina,
ABSTRACT
Root bark infusions of the plant Cissampelos sympodialis Eichl (Menispermaceae) are
used in folk medicine, in Northeast Brazil, for the treatment of diseases of the respiratory and digestive tracts. Previous studies showed that the hydroalcoholic extract of the leaves (AFL) of the plant and warifteine (W), alkaloid bisbenzylisoquinolinic, presented anti-inflammatory and anti-allergic effects. This study evaluated the effect of the oral treatment of mice with W and methyl warifteine (MW) in the paw edema formation induced by phlogistic agents, vascular leakage and cell migration in acute inflammatory models and the effect of oral treatment with AFL and its alkaloids (W and MW) in chronic inflammation represented by the experimental model of food allergy (BALB / c mice sensitized with ovalbumin - OVA). Oral treatment with W reduced the paw edema induced by carrageenan, histamine and prostaglandin E2, an effect not presented in MW treatment. The warifteine and methyl-warifteine also reduced the vascular leakage, however without inhibiting cell migration associated with inflammation. In the experimental model of food allergy the treatment with W induced weight gain in animals with decreased of diarrhea. Methylation of warifteine did not induce weight gain nor inhibited allergic diarrhea during the allergen challenge. However treatment with AFL did not induce weight gain nor inhibited allergic diarrhea. In contrast, treatment with the AFL or its alkaloids reduced the IgE specific for ovalbumin (OVA) titer, increased the proportion of CD4 + or CD8+ T lymphocytes in mesenteric lymph nodes. The proportion of regulatory T lymphocytes in the mesenteric lymph nodes was also increased by the treatments. In vitro experiments, with cells from
mesenteric lymph nodes of sensitized animals, demonstrated that W and MW inhibited the secretion of interleukin (IL-) 12 and IL-10 with no change in the interferon-
(IFN-) and IL- 13 levels. These results demonstrated that the oral treatment with warifteine presented anti-inflammatory activity by inhibiting the action of mediators of inflammation and the methylation of the molecule did not improve this effect. Also, the treatment with AFL, W and MW showed immunomodulatory effects in food allergy with increased of Treg cells and decreased of cytokines derived from cells of the innate immune mechanism independent of that of the adaptive immune mechanism.
Key words: Cissampelos sympodialis Eichl (Menispermaceae), warifteine,
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS AA ácido araquidônico.
AFL extrato hidroalcoólico das folhas “alcoholic fraction from leaves”
AFR extrato hidroalcoólico de raízes “alcoholic fraction from roots”
AMPc monofosfato cíclico de adenosina BAL lavado bronco-alveolar
BK Bradicinina COXs Ciclooxigenases cPGES PGES citosólica CTR- Controle negativo CTR+ Controle positivo DEXA Dexametasona DL50 dose letal para 50%
FcεRI, receptor de alta afinidade para IgE
FAE follicles-associated epithelium
GM-CSF fator estimulante de colônias de granulócitos-monócitos i.p. via intraperitoneal
IC50 Concentração inibitória 50% IFN Interferon
Ig Imunoglobulina IL Interleucina
ICAM-1 Molécula 1 de adesão intercelular “intercelular adhesion molecule-1”
kg, Kilograma
LPS Lipopolisacarídeo
MAPK tirosinacinase ativada por mitógeno
mg Miligrama
min Minuto
mL Mililitro
mM milimolar
mPGES-1 PGE sintase-1 microssomal MW metil-warifteina
NFκB fator nuclear κB
OVA Ovalbumina
PBS solução de tampão fosfato PGES PGE2 sintase
PGs Prostaglandinas
ROS reativos intermediários do oxigênio rpm Rotação por minutos
SBF Soro Bovino Fetal
TNF‐α Fator de Necrose Tumoral
TLRs Receptors semelhantes ao toll “toll like receptors”
Treg Linfócitos T regulatórios ATP trifosfato de adenosina v.o. por via oral
VCAM-1 Molécula 1 de adesão ao endotélio vascular
“Vascular adhesion molecule-1”
W Warifteina
μg Micrograma
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Folhas da planta Cissampelos sympodialis EICHL (Menispermaceae)... 36
Figura 2 Estrutura química da warifteina e da metil-warifteina... 38 Figura 3 Desenho esquemático do protocolo experimental para a indução de alergia
alimentar experimental e tratamentos... 49 Figura 4
Figura 5
Figura 6
Microfotografias dos jejunos, corado com Azul de toluidina, dos animais avaliados no modelo de alergia alimentar... Microfotografias dos jejunos, corados com Hematoxilina&Eosina., dos animais avaliados no modelo de alergia alimentar... ... Microfotografias dos jejunos, corados com ácido periódico de Shiff, dos animais avaliados no modelo de alergia alimentar... ..
69
70
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Efeito da warifteina e metil-warifteina na formação do edema de pata em camundongos Swiss desafiados com carragenina ou lipopolissacarideo (LPS)... 56
Gráfico 2. Efeito da warifteina e da metil-warifteina na formação do edema de pata de camundongos Swiss desafiados com histamina, prostaglandina E2 e bradicinina... 59
Gráfico 3. Efeito da warifteina e metil-warifteina no extravasamento de líquido para o peritônio de camundongos Swiss desafiados com ácido acético... 61
Gráfico 4. Efeito da warifteina e metil-warifteina na migração de células da inflamação para o peritônio de camundongos Swiss desafiados com zimosan... 63
Gráfico 5. Efeito do AFL e dos alcaloides warifteina e metil-warifteina no peso corporal durante os desafios com o alérgeno e no ganho de peso corporal em modelo experimental alergia alimentar... 65
Gráfico 6
Gráfico 7
Efeito do AFL e dos alcaloides warifteina e metil-warifteina na diarreia provocada pelos desafios com o alérgeno em modelo experimental alergia alimentar... ...
Efeito do AFL e dos alcaloides warifteina e metil-warifteina na presença de células inflamatórias em modelo experimental alergia alimentar...
66
69
Gráfico 8 Efeito do AFL ou alcaloides warifteina e metil-warifteina na produção de IgE-OVA específica no modelo experimental de alergia alimentar... 73
Gráfico 10 Efeito do AFL e dos alcaloides warifteina e metil-warifteina na proporção de células T CD25 e FoxP3 no linfonodo mesentérico (MLN)... 76
Gráfico 11
Gráfico 12
Efeito do alcaloide warifteina na produção de citocinas em células de linfonodo mesentérico de camundongos BALB/c sensibilizados e desafiados com ovalbumina... ...
Efeito do alcaloide metil-warifteina na produção de citocinas em células de linfonodo mesentérico de camundongos BALB/c sensibilizados e desafiados com ovalbumina... .
78
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO... ... 17 1.1 Inflamação... ... 1.2 Inflamação aguda... ... 1.3 Inflamação crônica... ...
17 20 22 1.4 Mediadores da inflamação... 1.5 Alergias... ... 1.6 Alergia Alimentar... 1.7 Plantas, compostos e inflamações... ... 1.8. A planta Cissampelos sympodialis e seus alcaloides...
24 30 31 34 36
2. OBJETIVOS... ... 41 2.1 Geral... ... 2.2 Específicos... ...
41 41
3. MATERIAL E METODOS... ... 42 3.1 Lista de reagente químicos e biológicos... 3.2 Lista de material plástico e equipamentos... ... 3.3 Local de pequisa... 3.4 Animais experimentais... 3.5 Preparação do extrato e das soluções dos alcaloides... .. 3.6 Edema de pata induzido por agentes flogísticos e mediadores da inflamação... 3.7 Avaliação da permeabilidade vascular... ...
42 43 44 44 44 45 46 3.8 Avaliação da migração de células da inflamação induzida por zimosan... 47 3.9 Indução de alergia alimentar experimental... 3.10 Avaliação do peso corporal... ...
47 49 3.11 Coleta de sangue para retirada de soro... ... 49 3.12 Titulação de IgE-OVA-específica por de Anafilaxia Cutânea Passiva... 3.13 Coleta de tecido e morfometria... 3.14 Citometria de fluxo para análise do fenótipo dos linfócitos T... ... 3.15 Cultura celular e coleta de sobrenadante... ... 3.16 Dosagens de citocinas... ...
3.17 Análises estatísticas... ... 53
4. RESULTADOS... ... 55 4.1 Efeito da warifteina e metil-warifteina no edema de pata induzido por carragenina ou lipopolissacarídeo... 55 4.2 Efeito da warifteina e da metil-warifteina no edema de pata induzido por mediadores da inflamação, histamina, prostaglandina E2 (PGE2) ou bradicinina... .. 58 4.3 Efeito da warifteina e metil-warifteina na permeabilidade vascular induzida por ácido acético... 61 4.4 Efeito da warifteina e metil-warifteina na migração de células inflamatórias induzida por zimosan... 63 4.5 Efeito do extrato de Cissampelos sympodilais (AFL) e dos alcaloides warifteina
e metil-warifteina no peso corporal em modelo experimental de alergia alimentar.... . 64 4.6 Efeito dos tratamentos com AFL ou com os alcaloides warifteina e metil -warifteina na diarreia alérgica... 4.7 Efeito do tratamento com AFL ou com os alcaloides warifteina e metil -warifteina na produção de muco e infiltrado de eosinófilos e mastócitos... ..
66
68 4.8 Efeitos dos tratamentos com AFL e os alcaloides warifteina e metil -warifteina na produção de IgE... ... 73 4.9 Efeito do tratamento com AFL ou com os alcaloides warifteina e metil-warifteina na proporção de células T... ... 74 4.10 Efeitos dos alcaloides warifteina e metil-warifteina na produção de citocinas... ... 77
5. DISCUSSÃO... ... 80 6. CONCLUSÕES...
7. REFERENCIAS...
1. INTRODUÇÃO
1.1. INFLAMAÇÃO
A inflamação é uma resposta fisiológica em reação a um corpo estranho ou lesão tecidual e é dividida em padrões agudos e crônicos. A inflamação é considerada aguda por possuir duração relativamente curta e ser auto limitada podendo durar minutos, horas ou alguns dias, e é caracterizada por vasodilatação, exsudação de líquido plasmático rico em proteínas e migração de células para o local da lesão (SHERWOOD e TOLIVER-KINSKY, 2004). A inflamação é considerada crônica por apresentar maior tempo de duração e estar histologicamente associada à presença de linfócitos e de macrófagos, proliferação de vasos sanguíneos, fibrose e necrose tecidual (FUJIWARA e KOBAYASHI 2005).
A inflamação aguda tem um papel fisiológico importante na defesa do hospedeiro e reparação dos tecidos, contudo se esse processo é exacerbado pode levar à lesão tecidual excessiva podendo evoluir para um processo crônico. A inflamação crônica, resultado do estímulo inflamatório do modo contínuo, apresenta consequências mais graves como o câncer, o diabetes, as doenças cardiovasculares, pulmonares e neurológicas. Para evitar a progressão da inflamação para o processo crônico é necessário limitá-lo desde a fase aguda com a redução do infiltrado celular e de liberação e ação de seus produtos potencialmente tóxicos (BALKWILL e COUSSENS, 2004; AGGARWAL et al., 2006).
Uma grande variedade de eventos, incluindo danos mecânicos, infecções, queimaduras por substâncias químicas ou radiação e injúria tecidual podem induzir a inflamação aguda (SCHMID-SCHONBEIN, 2006). O processo inflamatório agudo é iniciado a partir da ativação de células dos tecidos (células endoteliais e dendríticas, macrófagos e mastócitos) e de células migratórias (neutrófilos, monócitos, eosinófilos e linfócitos) que realizam papéis essenciais na inflamação desde os mecanismos de proteção até as ações de lesão tecidual (SIMON e GREEN, 2005; SCHMID-SCHONBEIN, 2006).
trifosfato de adenosina, essas substâncias são denominadas de padrões moleculares associados ao dano (DAMPs) cuja ação resulta em aumento da inflamação. Outro grupo de substâncias de origem normalmente infecciosa são os padrões moleculares associados a patógeno nos quais incluem-se o
lipopolissacarídeo (LPS) bacteriano, peptídeos formilados (fMLP) e -glicanas
(TANG et al., 2012).
Em reposta a essas substâncias são liberados mediadores que favorecem a inflamação dentre eles o Fator de Necrose Tumoral (TNF‐α), Interleucina-1 (IL‐
1 ), prostaglandinas (PGs), cininas (SALLUSTO et al., 1995; SCHNURR et al.,
2000) e outras citocinas, tais como IL-6 e IL-12 liberadas dos macrófagos tissulares (CAMPOREALE e POLI, 2012).
Os mediadores liberados na inflamação atuam localmente e/ou sistematicamente colaborando para o aparecimento dos sinais cardinais característicos desse processo, ou seja, dor, calor, rubor e tumor, acompanhados ou não da perda de função do tecido ou órgão afetado (ROCHA e SILVA, 1994).
É possível determinar e confirmar o mecanismo de ação de substâncias anti-inflamatórias já utilizadas na clínica e também descobrir novas substâncias a partir de modelos experimentais que mimetizam os sinais da inflamação pela administração de compostos com ação pro - inflamatória denominados agentes flogísticos (VASCONCELOS et al., 2012).
Dentre os modelos experimentais empregados há os que utilizam substâncias de origem natural como a carragenina, composto derivado de algas vermelhas (Chondrus crispus), amplamente usado para melhorar a textura e a
solubilidade de produtos alimentícios como as fórmulas infantis. Entretanto essa substância tem sido utilizada na indução de inflamação em modelos animais para testar a efetividade de anti-inflamatórios (MURAI et al., 2003).
A carragenina é molecularmente semelhante aos glicosaminoglicanos sulfatados da matriz extracelular sendo capaz de ligar ao receptor semelhante ao Toll-4 (TLR- Toll like receptors) (BHATTACHARYYA et al., 2008). Após a
consequência da presença de células migratórias como neutrófilos e macrófagos (MURAI et al., 2003; KHAN et al.,2013)
O zimonsan representa outra substância bastante empregada na pesquisa inicial de novas drogas com potencial anti-inflamatório e no estudo dos mecanismos fisiológicos da inflamação (CHOI et al., 2011; HUNG et al., 2011). O zimosan é um polissacarídeo rico em glicose, extraído da parede celular d e fungos Saccharomyces cerevisiae, capaz de se ligar a receptores TLR-2 e
Dectin-1 na membrana de fagócitos induzindo a ativação dessas células (IKEDA et al., 2008). Após a administração de zimosan é possível mensurar diversos eventos inflamatórios como o edema, secreção das citocinas tais como TNF‐α e
IL‐1 e migração celular (GIL et al., β010), a fagocitose também pode ser
avaliada usando o zimosan como marcador (BANG et al., 2012)
A administração de lipopolissacarídeo (LPS) bacteriano é rotineiramente empregada em modelos experimentais para estudo de substâncias anti -inflamatórias (FU et al., 2012). O LPS possui o mecanismo de ação bem determinado sendo dependente da ligação ao TLR-4 que ativa os mediadores intracelulares como o MyD88 resultando na secreção de TNF-α e IL-1 que
podem agir de modo local induzindo edema e migração celular ou de modo sistêmico induzindo aumento de temperatura corporal (SIMON et al., 2010)
Os modos de ação mais específicos para a indução dos eventos inflamatórios como edema e dor, podem ser encontrados em modelos que utilizam diretamente os mediadores encontrados na inflamação dentre eles histamina, PGE2 e bradicinina (CHAVES et al., 2013; TRIVELLATOGRASSI et al., 2013), definindo dessa forma contra qual substância inflamatória a droga testada está agindo, seja inibindo sua liberação/secreção, ligação ao receptor ou aos mediadores intracelulares responsáveis pelos efeitos finais.
como os Interferons (IFN) ou interleucina (IL)-17 (GHAEMI-OSKOUIE e SHI, 2011).
Outros modelos de inflamação crônica podem ser observados pelo uso de uma substancia antigênica associado a um adjuvante. O adjuvante induz a inflamação aguda (HORNUNG, 2008) e a presença contínua do antígeno resulta em inflamação crônica no sítio anatômico onde o mesmo persiste. Um exemplo de inflamação crônica pode ser observado nos modelos de hipersensibilidades como a asma alérgica à ovalbumina (OVA) (FUCHS e BRAUN, 2008), no qual a OVA, após sensibilização, induz lesão aos pulmões se administrada por instilação nasal ou aerossol (LLOYD et al., 2001), ou no modelo de alergia alimentar no qual ocorre dano ao trato gastrointestinal caso o antígeno seja administrado por via oral (BRANDT et al. 2003).
Na inflamação crônica associada a hipersensibilidade tipo I a lesão tecidual é sustentada pela presença dos mastócitos, eosinófilos e os linfócitos T secretores de IL-4 e IL-5 (VIEIRA, R. P. et al., 2007; FUCHS e BRAUN, 2008). Essas células ativadas liberam seus produtos de desgranulação (proteases e agentes quimiotáticos entre outros) que são responsáveis pela destruição tecidual e perda de função (DAS et al., 2006, DAHLIN et al., 2011)
1.2. INFLAMAÇÃO AGUDA
O conjunto de células que migram para o sítio inflamatório durante o processo inicial da inflamação é constituído principalmente de neutrófilos e de monócitos/macrófagos (CHOI et al., 2009; INGERSOLL et al., 2011)
Os neutrófilos constituem cerca de 50-70 % dos leucócitos no sangue periférico e circulam por cerca de 10 horas e depois morrem. Eles patrulham os vasos sanguíneos e, na presença dos sinais inflamatórios, deixam de circular e migram para os tecidos inflamados sendo as primeiras células a extravasarem para os sítios inflamatórios (CHOI et al., 2009).
(ROS), proteases e citocinas IL-1 e TNF-α (SAVILL et al., 1989; SOUSA et al., 2010).
A migração e acúmulo contínuo de neutrófilos nos tecidos é uma característica de condições inflamatórias agudas e crônicas, tais como glomerulonefrite, doença inflamatória intestinal, vasculite autoimune, dermatite e artrite reumatoide (WEISSMANN e KORCHAK 1984; KASAMA et al., 2005; RANDIS et al., 2008; LARSEN et al., 2009). Portanto, a inibição da migração e redução do número de neutrófilos no sítio inflamatório representa um benefício no controle das doenças relacionadas (NATHAN 2006; MCDONALD et al., 2010).
Os monócitos por sua vez se apresentam em menor proporção correspondendo de 5 a 10 % dos leucócitos periféricos circulantes. Estas células se desenvolvem na medula óssea, circulam no sangue periférico e migram para o tecido inflamado mediante a presença de estímulos tais como a quimiocina proteína-1 quimiotática do monócito (MCP-1/CCL2) (VAN FURTH 1985; CHOI et al., 2009).
Os monócitos se diferenciam em macrófagos ou células dendríticas, por isso, estas células são comumente denominadas derivadas de monócitos (KUMAR e JACK, 2006; GEISSMANN et al., 2010). A diferenciação dos monócitos em macrófagos é influenciada por eventos de adesão durante o extravasamento e por mediadores presentes no local inflamado (WANG et al., 2001; SUDHAKARAN et al., 2007).
Em comparação com a cinética de aparecimento dos neutrófilos, no sítio inflamatório, os macrófagos têm um início mais lento durante os estágios iniciais da inflamação (DALE et al., 2008). Os macrófagos já residentes nos tecidos fazem parte da rede do estroma em associação com o endotélio. Eles são rapidamente ativados em caso de lesão tecidual ou na presença de micro -organismos e fornecem sinais para ativação endotelial com aumento da expressão de moléculas de adesão como as selectinas e ligantes de integina (VCAM e ICAM) que possibilitam a migração celular (MEDZHITOV 2008; MORI et al., 2011).
na iniciação, manutenção e resolução do processo inflamatório como a fagocitose de restos celulares e proteicos somados a secreção de citocinas como o TGF-que estimula a proliferação de fibroblastos (WILLOUGHBY et al., 2000; FUJIWARA e KOBAYASHI, 2005).
Os sinais de ativação para estas células incluem citocinas tais como
TNF-α, Interferon (IFN)- , IL-12, fator estimulante de colônias de
granulócitos-monócitos (GM-CSF), componentes bacterianos (LPS) assim como proteínas da matriz extracelular (FUJIWARA e KOBAYASHI, 2005).
Após a estimulação, os macrófagos produzem e liberam várias citocinas
(IL-1 , TNF-α e IL-6) e quimiocinas (CXCL1, CXCL8, CCL2 e CCL5),
desempenhando um papel fundamental na iniciação da inflamação (FEGHALI e WRIGHT, 1997; CASTELLHEIM et al., 2009; MEDZHITOV, 2008).
Devido à produção de uma grande variedade de mediadores e de participarem de processos homeostáticos de limpeza tecidual e secreção de fatores de crescimento, os macrófagos podem apresentar sinais prejudiciais ao organismo no desenvolvimento do processo inflamatório. Desta forma intervenções terapêuticas que agem direta ou indiretamente nessas células e em seus produtos podem abrir novos caminhos para o controle de doenças inflamatórias (RODERO e KHOSROTEHRANI, 2010).
A inflamação, portanto, protege uma região definida do tecido infectado ou danificado para inibir a progressão da lesão isolando a área e evitando a disseminação do agente infectante ou de produtos celulares tóxicos aos tecidos e, uma vez a inflamação sendo resolvida, a função tecidual é restaurada ao normal. Contudo os mecanismos da inflamação aguda são responsáveis pelo início da resposta imune adaptativa e caso o agente infeccioso ou os produtos celulares continuem presentes desenvolver-se-á uma inflamação crônica (MONTELEONE, PALLONE e MONTELEONE, 2011).
1.3. INFLAMAÇÃO CRÔNICA
A manutenção das doenças inflamatórias crônicas é dependente das respostas imunes adaptativas e mais especificamente de linfócitos T CD4+ (Linfócitos T helper (Th)).
A resposta imune celular é dependente de linfócitos Th1, que receberam essa numeração por ser a primeira resposta imune estudada. A IL-12 proveniente de macrófagos, de células dendríticas, é a principal citocina responsável pela sua
indução e o IFN como a principal citocina responsável por sua ação (NEURATH
et a., β00β). O IFN ativa macrófagos e linfócitos T CD8+ a produzirem enzimas
associadas à destruição de micro-organismos e de células infectadas respectivamente, entretanto mesmo na ausência de infecção essas células podem encontrar-se ativadas resultando em lesão tecidual (RINCÓN e FLAVEL, 1997).
A artrite reumatoide é um exemplo de doença sistêmica que é caracterizada pela inflamação crônica das articulações com graus variáveis de erosão óssea e cartilaginosa assim como com hiperplasia do tecido sinovial, cuja patofisiologia é classicamente associada às células Th1 tanto em humanos quanto em modelos experimentais (SAKKAS et al., 1998; HOLLÓ et al., 2000). Na contra mão da resposta Th1 associada à artrite, por exemplo, há a resposta Th2, induzida por IL-4 proveniente de mastócitos e/ou basófilos ou de células dendríticas (MIN, BROWN e LEGROS, 2012), que é caracterizada pela secreção aumentada de IL-4, IL-5 e IL-13. A IL-4 possui funções inibitórias ou de controle da secreção de IFN- , ou seja, da resposta Th1 e consequentemente da
artrite reumatoide e outras doenças associadas ao perfil Th1 de citocinas (JOOSTEN et al., 1999).
A inibição ou controle da resposta Th1, associada a inflamação crônica, pela resposta Th2 também pode ser observada na doença inflamatória intestinal na forma de doença de Crohn (THOMAS e BAUMGART, 2011). O equilíbrio entre o IFN- e IL-4 controla a inflamação intestinal crônica e as vias moleculares são dependentes da inibição dos fatores de transcrição T -bet e STAT-4, responsáveis pela indução/manutenção da resposta Th1, pelos fatores de transcrição GATA-3 e STAT-6, associados à resposta Th2 (KWEON et al., 2000; NEURATH et al., 2002; USUI et al., 2003).
por infiltrado de eosinófilos, mastócitos, linfócitos T e B presentes no sítio anatômico afetado pela alergia como nos pulmões no caso da asma, vias respiratórias superiores como a rinite alérgica ou no trato intestinal observado na alergia alimentar (BARRETT e AUSTEN, 2009; SINAND E TOGIAS, 2011; SMIT et al., 2011).
As doenças inflamatórias crônicas ricas em neutrófilos e monócitos, classicamente associadas a resposta Th1 como a artrite ou a doença de Crohn citadas, tem ganhado um novo enfoque com a descoberta da subpopulação de células denominadas de Th17 cuja principal citocina é a IL-17. Os estímulos caracterizados que polarizam para Th17 é a presença constante das citocinas IL1, IL6 associadas a citocina regulatória Fator de crescimento e transformação -(TGF- ) que aumentam a expressão do fator de transcrição ROR t induzindo a
resposta Th17 (ANNUNZIATO et al., 2008).
A IL-17 é responsável pelo estímulo contínuo à ativação e migração de neutrófilos para o sítio inflamatório (ROUSSEL et al., 2010). Associados inicialmente a inflamação aguda, os neutrófilos passam a ser ativos produzindo agressão tecidual crônica exigindo o controle na sua produção para a reversão de doenças associadas (BELGI e FRIEDMANN, 2002).
1.4. MEDIADORES DA INFLAMAÇÃO
Uma variedade de mediadores da inflamação de diferentes fontes como leucócitos, plaquetas e endotélio, liberados a partir do metabolismo do ácido araquidônico como PGs e leucotrienos (LTs), são reconhecidos por exercerem papéis importantes no processo inflamatório. Os mediadores podem ser considerados de ação rápida como as aminas vasoativas (histamina e serotonina) e as cininas ou de ação prolongada, como as citocinas (ALLER et al., 2006; GONZALEZ-REY et al., 2007).
As aminas vasoativas são substâncias hidrossolúveis que contêm grupamentos amino em sua estrutura, como a histamina e serotonina, que agem sobre os vasos sanguíneos para alterar a sua permeabilidade ou para causar vasodilatação (SHEPRO e DUNHAM, 1986; BRAND et al., 2002).
(JONES e KEARNS, 2011). Os efeitos da histamina são mediados por receptores do tipo H1, H2, H3 e H4 que são acoplados à proteína G. Os receptores H1 e H2 são responsáveis pela maioria das ações inflamatórias induzidas pela histamina (JONES e KEARNS, 2011).
O aumento da permeabilidade vascular leva ao angioedema e urticária que são os sintomas clínicos mais comuns na anafilaxia (hipersensibilidade tipo I ou imediata) sendo visto em 88 % dos casos de reações anafiláticas (OGAWA e GRANT, 2007).
A histamina é liberada dos mastócitos por exocitose durante as reações inflamatórias ou alérgicas, a exemplo quando o antígeno interage com moléculas de Imunoglobulina (Ig) do isotipo E (IgE) fixadas as células; ou ainda, por meio de outros estímulos, como substância P e citocinas (SHERWOOD e TOLIVER-KINSKY, 2004; JONES e KEARNS, 2011).
Os efeitos dos mediadores hidrossolúveis liberados durante a inflamação somam-se aos das substâncias lipossolúveis denominadas prostanóides provenientes do metabolismo do ácido araquidônico (AA), tais como PGD2, PGE2, PGF2, PGI2, prostaciclinas e tromboxanos que apresentam suas biossínteses significantemente aumentadas nos tecidos inflamados (NARUMIYA, 2009).
A PGE2 e PGI2 são os principais prostanóides com ação pró-inflamatória (SMYTH et al., 2009). A PGE2 é dotada de potente atividade vasodilatadora, sendo umas das substâncias responsáveis pela vasodilatação e pelo eritema presentes na inflamação aguda (SMYTH et al., 2009). É formada a partir do AA por ação das COXs que catalisam a síntese de PGH2, para posteriormente ser transformada em PGE2 pela ação da PGE2 sintase (PGES) (SAMUELSSON et al., 2007). Existem pelo menos três isoformas de PGES humanas clonadas e caracterizadas, como duas PGES associadas à membrana, chamada PGE sintase-1 microssomal (mPGES-1, mPGES-2), e uma PGES citosólica (cPGES) (KAWABATA, 2011).
As evidências associam prostanóides, como a PGE2, e a via da COX-2 na inflamação como observado na expressão de ambos em muitos tecidos inflamados dentre eles a articulação de pacientes com artrite reumatoide (CROFFORD et al., 1994), bem como em vários modelos experimentais de inflamação (VANE et al., 1994; ANDERSON et al., 1996). A injeção de PGE2 diretamente no tecido reproduz os sinais clássicos da inflamação (WILLIAMS e HIGGS, 1988).
Há estudos que sugerem que a PGE2 atua sinergicamente com outros mediadores, como a histamina e a bradicinina, especialmente na dor e no edema associados aos processos inflamatórios (ANDERSON et al., 1996; LAVICH et al., 2003). O bloqueio da ação de PGE2 pela inibição de sua síntese ou pela administração de anticorpos seletivos são capazes de inibir a inflamação, a hiperalgesia e a produção da IL-6 na inflamação induzida pela carragenina (PORTANOVA et al., 1996) .
Por outro lado, diferente das aminas vasoativas e das PGs as cininas são moléculas maiores constituídas de polipeptídios que também apresentam tempo de ação imediato. As cininas são IFN-formados no plasma e em tecidos periféricos em resposta a ativação de enzimas denominadas calicreínas, atuando em substratos denominados de cininogênios. As cininas atuam em diferentes mecanismos fisiológicos, incluindo o controle da pressão arterial, da contração ou do relaxamento de músculo liso, da permeabilidade vascular e da transmissão da dor (BHOOLA et al., 1992; FERREIRA et al., 2002).
Em mamíferos foram identificadas três cininas importantes: bradicinina (BK), Lys-bradicinina e des-Arg9-bradicinina (MARCEAU e REGOLI, 2004). Os efeitos da BK (nonapeptídeo) no processo inflamatório dependem da sua interação com os subtipos de receptores B1 e/ou B2 (MARCEAU e REGOLI, 2004). Os receptores B1 são escassamente expressos em tecidos saudáveis, mas sua expressão pode ser aumentada pela injúria e infecção. (EHRENFELD et al., 2006)
A administração de LPS ou citocinas como TNF-α e IL-1 podem induzir
constitutivamente e distribuídos em diversos tecidos (MARCEAU e REGOLI, 2004).
Estudos têm demonstrado que o receptor B2 participa na indução dos sinais da inflamação aguda, incluindo aumento de permeabilidade vascular, de vasoconstrição, da migração celular e da dor por meio da ativação de fibras sensoriais (MCLEAN et al., 2000, SHAW e HARPER, 2011), ao passo que, o receptor B1 participa da fase crônica da resposta inflamatória (CALIXTO et al., 2001; NODA et al., 2003).
As PGs, aminas vasoativas e cininas são moléculas cujos mecanismos de ação são dependentes de receptores acoplando a proteína G (GPCR). Por outro lado, as citocinas utilizam os receptores do tipo tirosina cinase, e estão envolvidos no processo inflamatório cuja atividade deve ser regulada para a inibição eficiente da inflamação (VAN HAUWERMEIREN et al., 2011; DINARELLO et al., 2012).
As citocinas produzidas durante o processo inflamatório dependem da natureza do agente causador. Assim, a presença de patógenos bacterianos ou das substâncias carragenina, zimosan ou Concanavalina-A são detectados por receptores celulares do sistema imunológico inato, como os TLRs, que são expressos em macrófagos residentes e induzem a produção de citocinas inflamatórias (por exemplo, TNF-α, IL-1, IL-6) e quimiocinas (por exemplo, CCL2, CXCL1 e CXCL8) (TOGBE et al., 2006; MEDZHITOV 2008).
O TNF-α é produzido principalmente por fagócitos mononucleares, mas
pode ser produzido por outras células inflamatórias (neutrófilos, linfócitos, células NK, e mastócitos) ou não inflamatórias (células endoteliais). Estímulos indutores de TNF-α são transmitidos intracelularmente por meio dos membros da família das MAPKs, NF-kB e p38 que elevam a síntese de citocinas como o próprio TNF-α e a IL-6 (EL ALWANI et al., 2006; VANDEN et al., 2000).
O TNF-α exerce potente efeito inflamatório pela capacidade de induzir a expressão das moléculas de adesão endotelial ICAM-1 (intercelular adhesion molecule-1) e VCAM-1(vascular adhesion molecule-1) (ZHANG et al., 2002;
permeabilidade vascular, tendo essas ações associadas a liberação do NF-kB no citosol ao estimular a degradação da subunidade inibitória IkB.
O mediador intracelular NF-kB regula a síntese de muitas proteínas que funcionam em vias inflamatórias incluindo o próprio TNF-α, a IL-1 , o IFN- e
as COXs (EL ALWANI et al., 2006; SUN, 2011; ZHENG et al., 2011).
Assim como o TNF-α, a IL-1 é um potente mediador da inflamação e da febre (DINARELLO, et al., 2012). Os quatro membros da família da IL-1 (IL-1α,
IL-1 , IL-1Ra e IL-18) são produzidos de forma diferente ao TNF-α, contudo são
encontrados em inúmeros cenários inflamatórios (DINARELLO et al., 2012; EL ALWANI et al., 2006). Seus efeitos fisiológicos são essencialmente idênticos aos do TNF-α, entretanto, a IL-1 não induz, por si só, lesão tecidual ou morte
apoptótica, embora possa intensificar os efeitos lesivos do TNF-α (DINARELLO,
et al., 2012; SHERWOOD e TOLIVER-KINSKY, 2004; EL ALWANI et al., 2006).
A secreção das citocinas TNF-α e IL-1 , mesmo que transitória, é suficiente para induzir a síntese e liberação de uma cascata de citocinas pró -inflamatórias secundárias, incluindo IL-6, CXCL8, IL-12, IL-18, GM-CSF e CCL3/4 (FEGHALI e WRIGHT, 1997; WITKAMP e MONSHOUWER, 2000; HE et al., 2007).
Em associação a IL-1 e ao TNF-α liberados pelos macrófagos, células
endoteliais e fibroblastos secretam IL-6, que exibe ações inflamatórias como o principal sinal para a resposta de fase aguda hepática e como fator de crescimento para linfócitos B (SHERWOOD e TOLIVER-KINSKY, 2004; EL ALWANI et al., 2006). Contudo, enquanto o TNF-α e a IL-1 induzem a
produção de IL-6, esta última inibe a síntese dos primeiros, resultando em uma forma de resolução da inflamação induzida pelas próprias citocinas pró-inflamatórias (DI SANTO et al.,1997).
A IL-6 somada a presença do Fator de Crescimento e Transformação (TGF- ), citocina anti-inflamatória que é liberada durante a resolução da inflamação, estimula a diferenciação e ativação de linfócitos T a liberar IL-17 (McGEACHY et al., 2007) citocina que está associada a processos inflamatórios crônicos (TOUSSIROT, 2012).
associado à adjuvante, como os sais de alumínio, induz a fagocitose e posterior liberação dos mediadores inflamatórios tais como IL-1 e TNF-α (HORNUNG et al., 2008) seguido do desenvolvimento de resposta imune dependente de linfócitos T (GHIMIRE et al., 2011; MORI et al., 2012).
Kubo e col. (2004) demonstraram, em modelo experimental, que a PGE2 e análogos químicos são capazes de direcionar a resposta imune para o tipo Th2 (T helper-2) e inibir a liberação de IL-12p70 por macrófagos, portanto a redução na
liberação ou ação de mediadores da inflamação aguda pode resultar em inibição no desenvolvimento do processo alérgico, configurando um possível modo de ação pelo qual uma substância pode apresentar atividade antialérgica.
Contudo foi demonstrado que anti-inflamatórios não esteroidais clássicos como o diclofenaco e o ácido acetilsalicílico, cujos mecanismos de ação são o bloqueio estérico das enzimas COX e a inibição da liberação de PGE2, podem exacerbar as reações alérgicas, a exemplo, da desencadeada pelo trigo (HARADA et al., 2001; SHIRAI et al., 2003). O diclofenaco foi capaz de aumentar a resposta alérgica em modelo de alergia alimentar a amendoim (BOL-SCHOENMAKERS et al., 2010) sendo os anti-inflamatórios não esteroidais considerados fatores de risco nas reações alérgicas (CARDONA et al., 2012)
Substâncias anti-inflamatórias com propriedades antialérgicas devem apresentar outros mecanismos de ação além do bloqueio da síntese de PGs tornando-as hábeis em inibir a inflamação aguda e o processo alérgico crônico. Como exemplos desta classe de substâncias há o honokiol (análogo do neurotransmissor GABA) apresentando efeito anti-inflamatório e antialérgico por inibir a liberação de citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-6 e estimular a liberação de citocinas anti-inflamatórias e antialérgicas tais como IL-10 e TGF-(MUNROE et al., 2010),
A substância AQX-1125, ligante da fosfatase1 de inositol (SHIP-1), inibiu a inflamação e a alergia em modelos de lesão pulmonar aguda induzida por LPS e alergia pulmonar induzida por ovalbumina (OVA) (STENTON et al., 2012), cujo mecanismo de ação é dependente da ligação ao SHIP-1. Outra substância que apresenta esse efeito benéfico duplo é a IMD-0354, inibidor da cinase beta do IB (SUGITA et al., 2008).
denominado brazilina (LEE et al., 2012) com ações dependentes da inibição de secreção de citocinas IL-4 e TNF-α, representando uma categoria de fármacos
com efeito mais amplo e com mecanismo determinado contra doenças cuja fisiopatologia é fundamentalmente imunológica a exemplo das alergias.
1.5. ALERGIAS
As doenças alérgicas são de interesse em saúde pública devido ao número de indivíduos que apresentam afecções relacionadas. Dentre as doenças alérgicas há a dermatite atópica, alergia alimentar, rinite, asma alérgica e o choque anafilático que são classificadas como reações de hipersensibilidade do tipo I –
imediato, cuja fisiopatologia são semelhantes diferindo no sítio anatômico onde se manifestam. (SICHERER e LEUNG, 2012).
O mecanismo imunológico responsável pelo início das reações alérgicas em humanos e camundongos, na maioria das vezes, depende da produção de IgE que ativam células efetoras como mastócitos, basófilos, eosinófilos e macrófagos. Essas células, que são amplamente distribuídas nos tecidos, quando ativadas são responsáveis pela liberação de mediadores da resposta inflamatória, tais como PGE2, histamina e serotonina, contribuindo assim para exacerbação e manutenção do processo alérgico (FINKELMANN et al., 2005; SICHERER e LEUNG, 2012).
Segundo Punphrey (2004) a reação alérgica do tipo imediato ou anafilático ocorre dentro de alguns minutos e persiste por até cerca de 6 h após a exposição ao alérgeno. Essa reação pode ser desencadeada por picadas de insetos, pelo contato com moléculas estranhas ao organismo como os medicamentos e aquelas presentes na poeira e pela ingestão de alimentos (PEDEN 2005; SICHERER e LEUNG, 2006).
asmáticos e no trato gastrointestinal de quem apresenta alergia alimentar (FORBES et al., 2008).
1.6. ALERGIA ALIMENTAR
O trato gastrointestinal (TGI) é uma região no qual se destacam duas funções essenciais ao organismo: a absorção de nutrientes e a defesa do hospedeiro. A sua grande superfície de absorção e o fino epitélio que o compreende, exercem um papel facilitador na defesa do hospedeiro uma vez que, parte deste mecanismo, se deve a íntima associação entre células epiteliais vizinhas (MACDONALD e MONTELEONE, 2005; YU, 2012).
A barreira celular primária do TGI e os processos de digestão previnem o contato dos antígenos com o sistema imune (PERRIER e CORTHÉSY, 2010). O lúmen intestinal mantém um largo contato com antígenos provenientes da dieta. Em particular o íleo e o cólon compartimentalizam muitos antígenos da complexa microflora comensal existente nessa área, esses micro-organismos possuem funções relevantes para o sistema imune (PERRIER e CORTHÉSY, 2010).
A barreira epitelial não previne completamente a entrada de antígenos luminais para o tecido (HUSBY et al., 1985). Alguns antígenos podem cruzar a superfície epitelial por meio do rompimento das finas conexões que unem o epitélio associado aos folículos – FAE (follicles-associatedepithelium), que são
estruturas acomodadas no tecido linfóide organizado nas paredes do intestino (O'BOYLE et al, 1998). Um tipo especial de célula presente no FAE é a célula M, que funciona como célula transportadora de antígeno do lúmen para o folículo (CORR, GAHAN e HILL, 2008).
As células dendríticas localizadas na mucosa intestinal, cuja função essencial é a de apresentação antigênica, emitem prolongamentos por entre as células do epitélio intestinal favorecendo o reconhecimento de partículas estranhas (RESCIGNO et al, 2001).
gastrointestinais e as inflamações idiopáticas têm aumentado dramaticamente, e as causas desses eventos ainda não estão claramente determinadas (BIRD 2008).
Os estudos epidemiológicos da alergia alimentar são limitados, mas tem sido observada uma prevalência dessa afecção aos antígenos derivados do amendoim, ovo e leite, principalmente em crianças de países ocidentais ( LACK 2008). Estudos de prevalência desta patologia, utilizando como parâmetros os testes dérmicos, demonstraram 3,5 a 10% de desencadeamento de alergia a qualquer tipo de alimento (ZUIDMEER et al., 2008; SANTOS e LACK, 2012)
Mudanças na dieta podem ser responsáveis pelo desenvolvimento de alergia, como a deficiência de ácidos graxos poli-insaturados do tipo ômega 3 que favorece o desenvolvimento da resposta tipo Th2 (KULL et al., 2006). Da mesma forma, o aumento de ácidos graxos poli-insaturados do tipo ômega 6 podem favorecer a formação de PGE2 e inibir a resposta Th1 resultando em prevalência da resposta imune do tipo Th2 (LACK, 2008)
A resposta imune aos antígenos alimentares proteicos resulta da interação entre alimentos, células efetoras e seus mediadores. A maioria das reações agudas aos alimentos é devido a interação entre antígenos alimentares, IgE -alérgeno-específica e o receptor de alta afinidade (FcεRI) expressos em mastócitos (GOULD e SUTTON, 2008). A interação do antígeno com o mastócito sensibilizado estimula uma série de eventos que resulta na liberação de mediadores tais como serotonina, histamina e fator de agregação plaquetária (BRANDT et al. 2003).
A manifestação da alergia alimentar ocorre imediatamente após a ingestão do alérgeno levando aos sintomas clínicos incluindo náusea, vômitos e diarreia (LEHRER et al., 2002).
O evento celular inicial que induz as manifestações alérgicas a alimentos está diretamente relacionado a mediadores tais como histamina, bradicinina e PGE liberados de mastócitos no intestino (HOLGATE, 2000; BRANDT et al., 2003). Portanto moléculas que inibam a produção ou o efeito destes mediadores provavelmente minimizarão os sintomas como diarreias observadas nas hipersensibilidades do trato digestório.
alergia alimentar, estimulando a migração dessas células para o intestino (FORBES et al., 2008)
No intestino delgado são encontradas também estruturas linfóides denominadas placas de Peyer em forma de agregados de tecidos linfóides (NEUTRA et al., 2001). Os linfonodos mesentéricos e as placas de Peyer, presentes no TGI, possuem uma função inibitória no desenvolvimento da diarreia alérgica, possivelmente por serem o local de acomodação das células T regulatórias (Treg) CD4+ CD25+ foxp3+ produtoras de IL-10 (TAKAYAMA et al., 2007).
Outra forma de minimizar o desenvolvimento de alergia alimentar é induzir os mecanismos de tolerância ao alérgeno, isto é, o reconhecimento deste produto, até então estranho ao sistema imunológico, como inócuo (STROBEL e FERGUSON, 1986).
A tolerância que se desenvolve no trato digestório e pode se tornar sistêmica dando ao TGI a função de indutora de tolerância a antígenos estranhos, essa tolerância é chamada de tolerância periférica para diferenciar da tolerância central realizada pelos órgãos linfoides primários tais como timo e medula óssea (MATHIS e BENOIST, 2010).
A falha no desenvolvimento ou na manutenção da tolerância tem como consequência, no trato digestivo, a presença de doenças como alergia alimentar e doença inflamatória intestinal (RACHID e UMETSU, 2012; BERGSTROM et al., 2012). Essa falha pode acontecer devido a presença do antígeno associado a substâncias inflamatórias como PAMPs ligantes de TLR-7 como o RNA, ou ligantes de TLR-9 como o DNA (SHLOMCHIK, 2009).
A falha na tolerância imunológica pode ser resultando de uma apresentação antigênica eficiente com moléculas estimulatórias e citocinas aos linfócitos T CD4+ específicos que se tornam responsivos a presença deste antígeno. Contudo ocorre em paralelo o desenvolvimento de linfócitos T CD4+ específicos inibidores da ativação imune frente ao antígeno, esta célula com função inibidora é denominado de Treg cujos mecanismos de ação a torna o principal tipo de célula responsável pela tolerância periférica (RACHID e UMETSU, 2012).
mesmo tempo em que permitem a avaliação de terapias que auxiliem no combate aos sintomas alérgicos, como a imunoterapia oral e a descoberta de substâncias terapêuticas contra alergias (BERIN e MAYER, 2009; SICHERER e SAMPSON, 2009).
1.7. PLANTAS, COMPOSTOS E INFLAMAÇÕES
A necessidade de intervenções terapêuticas que possam trazer benefício ao paciente com inflamação, independente da origem, tornam os estudos em modelos experimentais de inflamação relevantes permitindo a avaliação dos efeitos de diferentes substâncias nos mais variados parâmetros presentes nesta afecção (SICHERER e SAMPSON, 2009).
As plantas e seus produtos são amplamente estudados em modelos de inflamação aguda e crônica objetivando a descoberta de novas formas de tratamento com ações terapêuticas e alvos farmacológicos diversificados (LOURENÇO, FERREIRA e BRANCO, 2012). Os produtos de origem natural podem ser o ponto de partida para a descoberta de novas estruturas químicas com ação terapêutica ou para o inicio de síntese de novas substâncias (LOURENÇO, FERREIRA e BRANCO, 2012).
Uma classe química de origem natural com representantes anti-inflamatórios são os alcaloides. O cetorolaco, o etodolaco e a indometacina são anti-inflamatórios, produtos de síntese, que apresentam estrutura química de alcaloide pirrolizínico, pirano e indólico respectivamente (British national formulary, 2005).
Dentre os medicamentos, atualmente usados na clínica, que apresentam origem em produtos naturais, há o ácido salicílico que foi originalmente isolado das cascas do salgueiro (Salix alba) que após reação de síntese deu origem ao
ácido acetilsalicílico, um dos fármacos mais utilizados como anti-inflamatório na clínica médica (VANE e BOTTING, 1998)
Plantas da família Menispermaceae como a Tinospora smilacina e a Cissampelos parreira tiveram seus extratos testados e demonstraram efeitos em
modelos inflamatórios de edema de pata e artrite respectivamente (LI, R. W. et al., 2004; AMRESH et al., 2007). O extrato de Stephania tetrandra
bisbenzilisoquinilínico, demonstram efeitos anti-inflamatórios pela redução de citocina IL-8 e IL-6 (KANG et al., 1996; WU e NG, 2007)
Em modelo de inflamação crônica como na alergia alimentar alguns trabalhos vem demonstrando o potencial das plantas como, por exemplo, o Kakkonto, uma formulação produzida a partir da mistura de sete plantas medicinais, que reduziu a diarreia alérgica, os neutrófilos e mastócitos no intestino assim como as citocinas IL-4, IL-10 e IFN- sem modificar os níveis de
IgE séricos em modelo de alergia alimentar (YAMAMOTO et al., 2008).
Huang, Liu e Jan (2010) demonstraram que a diosgenina, saponina derivada da planta Dioscorea opposita, aumentou o número de células FoxP3+ e
IL-10+ no tecido duodenal entretanto sem diminuir a diarreia alérgica induzida por OVA em modelo murino.
Outro trabalho, em modelo de alergia alimentar, mostra que o tratamento com polifenóis extraídos de maçã reduziu os níveis de IgE séricos elevando a proporção de células CD8+ sem avaliar a presença de diarreia alérgica ou alterações no peso induzida pelos desafios com o antígeno OVA (AKIYAMA et al., 2005).
Em adição o uso de extrato de raízes Panax ginseng em modelo de alergia
alimentar a OVA não alterou a diarreia ou os níveis de IgE, entretanto aumentou a proporção de células CD8+ no intestino e os experimentos in vitro
demonstraram aumento nos níveis de IFN- e IL-12 estimulados com Con-A (SUMIYOSHI et al., 2010).
A redução na diarreia induzida por alimento em animais hipersensíveis pode ser observada com o pré-tratamento (antes das sensibilizações e desafios) com os extratos de Actinidia arguta (KIM et al., 2009)e de Nigella sativa
(DUNCKER et al., 2012). O extrato de Actinidia arguta reduziu os níveis de IgE,
efeito este não observado pela administração de Nigella sativa.
A formulação produzida a partir de plantas medicinais denominada de FAHF-2 (Food Allergy Herbal Formula-2) apresentou resultados satisfatórios na
alergia alimentar envolvendo os mecanismos como redução de IgE, inibição da desgranulação de mastócitos, aumento de células Treg e CD8+ com secreção de
INF- , incluindo a inibição o choque anafilático. Esses efeitos foram
efeitos no trato gastrointestinal em modelo de OVA (SRIVASTAVA et al., 2009; 2012).
Com base nos escassos trabalhos realizados em modelos experimentais de alergia e seu tratamento com plantas ou compostos derivados de plantas é possível portanto destacar dois pontos importantes: 1) a dificuldade de atenuar os diversos parâmetros mensurados durante a alergia alimentar, e 2) não há padronização completa das metodologias que possam determinar todo potencial antialérgico em modelos de alergias experimentais.
Os extratos das plantas e formulações derivadas de plantas acima citadas já são utilizadas como antialérgicas pela população e representaram estímulo primordial à pesquisa para o tratamento de alergia alimentar.
1.8. A PLANTA Cissampelos sympodialis E SEUS ALCALOIDES. A planta Cissampelos sympodialis Eichl. (Menispermaceae) (Figura 1) é
endêmica no nordeste brasileiro (BARBOSA-FILHO, AGRA e THOMAS, 1997) apresentando os nomes populares de milona, abútua ou orelha de onça. As suas raízes são utilizadas, em forma de maceração, pela medicina popular para o tratamento de diarreias, doenças do trato geniturinário e doenças do trato respiratório tais como: asma, influenza e bronquite (CORRÊA, 1984).
Fonte: Arquivo particular dos autores.
Ensaios farmacológicos demonstraram que o extrato hidroalcoólico das raízes de Cissampelos sympodialis (AFR- alcoholic fraction from roots)
apresentou ação espasmolítica na musculatura lisa de traqueia de cobaias sensibilizados com OVA (THOMAS et al., 1995). Contudo para a produção do AFR se faz necessária a destruição da planta o que limita os estudos e a possível produção de um medicamento fitoterápico. A alternativa para transpor tal barreira foi realizar os estudos com o extrato hidroalcoólico de suas folhas (AFL-
alcoholic fraction from leaves), os quais demonstraram apresentar atividade
espasmolítica na musculatura lisa de traqueia de cobaias semelhante a do AFR (THOMAS et al., 1997a)
Posteriormente foi demonstrado que o AFL inibiu a resposta proliferativa de células esplênicas de camundongos BALB/c (PIUVEZAM et al., 1999; ALEXANDRE-MOREIRA et al., 2003a), a proliferação de linfócito B e a produção de IgM, quando as células foram estimuladas com LPS bacteriano ou com Ig-anti-IgM (ALEXANDRE-MOREIRA et al., 2003b), demonstrando que o extrato das folhas da planta interfere na atividade imunológica e que tem potencial contra doenças relacionadas, estimulando a continuidade da pesquisa.
A atividade anti-inflamatória do AFL foi inicialmente demonstrada utilizando o método clássico de edema de orelha induzido por mediadores farmacológicos tais com capsaicina ou acetato de tetradecanoilforbol (BATISTA-LIMA et al., 2001).
Bezerra-Santos e colaboradores (2004) demonstraram que AFL quando administrado por via oral (v.o.) inibiu a produção de imunoglobulina E (IgE OVA-específica) em modelo experimental de asma, possivelmente por um mecanismo que envolveu a produção de IFN- e da citocina reguladora IL-10, ambas produzidas por linfócitos T (PIUVEZAM et al., 1999). O AFL também inibiu o recrutamento de leucócitos inflamatórios para o lavado bronco alveolar e tecido pulmonar induzido por antígenos (ovalbumina ou extrato de ácaro Blomia tropicalis) e o remodelamento pulmonar associado à inflamação crônica
(SANTOS et al., 2006; CERQUEIRA-LIMA et al., 2010; BEZERRA-SANTOS et al., 2012).
associadas ao remodelamento tecidual pulmonar presente na inflamação crônica induzida por alérgeno.
Em paralelo aos estudos na área de imunofarmacologia foram realizados estudos fitoquímicos que resultaram no isolamento, identificação e caracterização dos compostos dos extratos de Cissampelos sympodialis. Dentre eles estão os
alcaloides bisbenzilisoquinolínicos - warifteina e metil-warifteina (Figuras 2A e 2B respectivamente), o alcaloide morfinânico - milonina e o alcaloide aporfínico- laurifolina (BARBOSA-FILHO, AGRA e THOMAS, 1997). O alcaloide roraimina, do tipo bisbenzilisoquinolínico, foi isolado posteriormente (DE LIRA et al., 2002) demonstrando que a maior parte de metabólitos secundários presentes nos extratos de C. sympodialis são representados por alcaloides.
(A) (B)
Fonte: BARBOSA-FILHO et al., 2012.
A warifteina (W) é um alcaloide do tipo bisbenzilisoquinolínico com peso molecular igual a 592 u, possuindo em sua molécula uma ponte metilênica, que é uma característica pouco comum às substâncias desta classe (BARBOSA-FILHO, AGRA e THOMAS, 1997). A warifteina foi o alcaloide isolado e encontrado em maior proporção nos extratos hidroalcoólicos das raízes e das folhas da planta
Cissampelos sympodialis (BARBOSA-FILHO, AGRA e THOMAS, 1997;
MARINHO et al., 2012) o que vem justificar a sua escolha como um marcador químico, pré-requisito para a produção de um fitoterápico a partir de um extrato padronizado (MARINHO, 2012; RESOLUÇÃO-RDC Nº- 48, DE 14 DE MARÇO DE 2004).
A warifteina demonstrou ter ampla atividade farmacológica, dentre elas: bloqueadora neuromuscular (GORINSKY et al. 1972); relaxante de músculos lisos de íleos de cobaias (CÔRTES et al.,1995) e ação espasmolítica em músculo liso de aorta de coelho por modificação do metabolismo do cálcio (Ca++) (FREITAS et al., 1996). A warifteina também foi capaz de aumentar os níveis de monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) em cultura de músculo liso de cobaia
pela inibição da atividade enzimática da fosfodiesterase IV e V (THOMAS et al., 1997b).
Ensaios de toxicidade aguda da warifteina em camundongos demonstraram que a dose letal para 50% (DL50) dos animais é de 511 mg/kg, por via intraperitoneal (i.p.). Entretanto, por via oral (v.o.), doses até 1000 mg/kg não induziram mortalidade nos animais durante o tempo de avaliação (CÔRTES, 1992). As avaliações de citotoxicidade de warifteina em culturas de hepatócitos e fibroblastos mostraram que a concentração inibitória de 50% das células (CI50)
varia de 10 a γ5 μM de acordo com a metodologia empregada (MELO et al.
2003).
Estudos em modelo de alergia experimental demonstraram que o tratamento com warifteina (v.o.) reduziu a eosinofilia provocada pelo antígeno na pleura e no lavado bronco-alveolar (BAL) de animais sensibilizados com OVA, assim como reduziu os níveis pleurais de cistenil-leucotrienos e a inflamação alérgica pulmonar (BEZERRA-SANTOS et al., 2006).
Em estudo posterior, foi observado que o tratamento com warifteina, inibiu o desenvolvimento da hiperalgesia induzida por IgE, na presença de antígeno ou por mediadores fisiológicos, inibiu a produção de IgE total e de IgE antígeno-específica e ainda reduziu a formação de edema de pata pelo mecanismo dependente da produção de IgE, assim como inibiu a desgranulação de mastócitos e a proliferação de esplenócitos in vitro (COSTA et al., 2008). No entanto, a
warifteina induziu a produção de óxido nítrico (NO) de macrófagos peritoneais (COSTA et al., 2008) demonstrando estimular um perfil de resposta imunológica inibitória ao desenvolvimento da resposta imune alérgica.
A warifteina exibiu similaridades aos efeitos demonstrados com o AFL, Rocha e colaboradores (2010) demonstram que a warifteina age diretamente na função dos linfócitos B inibindo a proliferação e secreção de Ig, modificando o padrão de fosforilação de tirosina cinase ativada por mitógeno ERK e os níveis
intranucleares de NFκB. Associado à inibição da atividade dos sinalizadores
intracelulares, a warifteina promove o aumento de AMPc em linfócitos B e em homogenato de musculo liso.
nos extratos limitou as pesquisas anteriores. Em adição a metil-warifteina reduziu o número de linfócitos T no BAL sugerindo que a planta com seus compostos estejam regulando esta população de células (VIEIRA et al. 2012).
De acordo com o exposto acima em que o extrato das folhas da planta C. sympodialis tem apresentado efeitos anti-inflamatório e antialérgico em modelos
clássicos de inflamação (BATISTA-LIMA et al. 2001) e de alergia pulmonar (BEZERRA-SANTOS et al. 2006, 2012) e ainda os relatos de que macerados de partes da planta são utilizados na medicina popular para o tratamento de inflamações e diarreias, o objetivo deste estudo foi estudar o efeito anti -inflamatório de Cissampelos sympodialis e de warifteina em modelos de
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Estudar o potencial anti-inflamatório da warifteina (W) e metil-warifteina (MW) em modelos de inflamação aguda e o potencial antialérgico do extrato das folhas de C. sympodialis (AFL), W e MW em modelo experimental de alergia
alimentar. 2.2 Específicos
-Avaliar o efeito do tratamento oral com a W ou MW no desenvolvimento dos edemas de pata induzidos por carragenina, lipopolissacarídeo (LPS), histamina, prostaglandina E2 (PGE2) e bradicinina;
-Determinar o efeito do tratamento oral com os alcaloides na permeabilidade vascular e migração celular para a cavidade peritoneal de camundongos desafiados com ácido acético ou zimosan respectivamente;
- Em modelo experimental de alergia alimentar avaliar o efeito do tratamento oral com o AFL, W ou MW no desenvolvimento da diarreia alimentar e do peso de animais sensibilizados e desafiados com ovalbumina;
-Determinar, no tecido do intestino delgado, o número de células tais como mastócitos e eosinófilos e quantificar o muco nos animais sensibilizados e desafiados com ovalbumina e tratados com AFL, W ou MW;
-Quantificar a concentração de IgE-ovalbumina específica nos soros dos animais sensibilizados e desafiados com ovalbumina e tratados com AFL, W ou MW;
-Determinar o percentual das subpopulações de linfócitos T CD4/CD8 E Treg em linfonodos mesentéricos de animais sensibilizados e desafiados com ovalbumina;
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 LISTA DE REAGENTES QUÍMICOS E BIOLÓGICOS
Acetato de Dexametasona (HENRIFARMA)
Ácido acético (VETEC)
Ácido clorídrico (VETEC)
Azul de Evans (VETEC)
Azul de Tripan (Sigma-Aldrich)
Bradicinina (Sigma-Aldrich)
Carragenina (Sigma-Aldrich)
Cetamina (König)
Clorofórmio (VETEC)
Composto 48/80 (Sigma-Aldrich)
Concanavalina A (Sigma-Aldrich)
Etanol (QEEL)
Hepes (Sigma-Aldrich)
Hidróxido de amônio (Merck)
Hidróxido de sódio (Sigma-Aldrich)
Histamina (Sigma-Aldrich)
IgG anti-CD25 conjugada com APC (eBIOSCIENCE)
IgG anti-CD4 de camundongo conjugado com FITC (eBIOSCIENCE)
IgG anti-CD4 de camundongo conjugado com PE (eBIOSCIENCE)
IgG anti-CD8 conjugados com FITC (eBIOSCIENCE)
IgG anti-foxp3 conjugada com PE (eBIOSCIENCE)
Indometacina (ASPEN Port Elisabeth ltd)
Kit de ELISA para a detecção das Citocinas IL-12, IL-10, IL-13 e IFN-
(eBIOSCIENCE)
L-glutamina (Sigma-Aldrich)
Lps de Escherichia coli sorotipo O111:B4 (Sigma-Aldrich)
Ovalbumina (Sigma-Aldrich)
Penicilina G (Sigma-Aldrich)
