HELIANA KARENINA BARONI SILVEIRA RELATÓRIO DE ESTÁGIO SUPERVISIONADO EM BANCO DE SANGUE VETERINÁRIO DE PEQUENOS ANIMAIS

HELIANA KARENINA BARONI SILVEIRA

RELATÓRIO DE ESTÁGIO SUPERVISIONADO EM BANCO DE SANGUE VETERINÁRIO DE PEQUENOS ANIMAIS

CURITIBA 2011

HELIANA KARENINA BARONI SILVEIRA

RELATÓRIO DE ESTÁGIO SUPERVISIONADO EM BANCO DE SANGUE VETERINÁRIO DE PEQUENOS ANIMAIS

Trabalho apresentado para conclusão do Curso de Medicina Veterinária da Universidade Federal do Paraná.

Supervisora: Prof. Dra. Rosangela Locatelli Dittrich

Orientadora: Prof. Dra. Denise Tabacchi Fantoni

CURITIBA 2011

Dedico este trabalho aos meus pais, pelo incentivo, força e carinho

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, Joana Maria Baroni Silveira e Helio Miguel Silveira, que sempre acreditaram em mim, me apoiando, dando suporte e amor.

Aos meus irmãos Helio (Inho) e Marcia, às minhas primas, aos meus avós (que não estão mais aqui) e outros familiares que sempre torceram por mim. Um agradecimento especial ao meu tio João Marcos Baroni, um exemplo de amor e dedicação à profissão.

Aos amigos, que me ajudaram a passar por esta etapa, pela companhia, pelas risadas, pelas (várias) horas de estudo compartilhadas e pela ajuda em tantos outros momentos. Especialmente: Alessandra, Bruna, Dani, Esther, Juliana, Kamila, Luciane, Luísa, Martha, Natália, Raquel, Suelen, Talita, Vanessa e Verena.

Aos professores, que fizeram parte deste caminho contribuindo para minha formação pessoal e profissional.

Agradeço à Profª. Dra. Denise Tabacchi Fantoni, pela oportunidade de estágio, à Dra. Simone Gonçalves (Hemovet), à Luciana Kinoshita pela ajuda e disponibilidade, à doutoranda Ludmila Rodrigues Moroz e às mestrandas Lilian Tatibana e Karin D. Botteon, por tudo o que me ensinaram durante o meu estágio.

E finalmente, aos animais, grande motivo da escolha da minha profissão.

Muito Obrigada!

iv SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS...v

LISTA DE GRÁFICOS E TABELAS...vi

LISTA DE ABREVEATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS...vii

RESUMO...viii 1. RELATÓRIO DE ESTÁGIO 1.1. Introdução...9 1.2. Objetivos...9 1.3. Descrição do estágio 1.3.1. Estrutura e equipamentos...10 1.3.2. Atividades desenvolvidas...11 1.3.2.1. Coletas...12 1.3.2.2. Processamento...16 1.3.2.3. Exames...21 1.3.2.4. Controle de qualidade...22 1.3.2.5. Acompanhamento de transfusões...23

1.3.2.6. Utilização dos hemocomponentes...24

1.3.2.7. Projetos de pesquisa...26

1.4. Discussão...26

1.5. Considerações finais...27

2. Avaliação de TTPA, TP, proteínas totais, fibrinogênio e albumina em plasma fresco congelado canino de acordo com diferentes períodos de estocagem...28

3. REFERÊNCIAS ADICIONAIS...39

4. ANEXOS 4.1. Ficha de acompanhamento de transfusões sanguíneas...40

v LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Doação de sangue de cão...12

Figura 2- Gato doador de sangue...13

Figura 3- Coleta de sangue em cão...15

Figura 4- Homogeneizador automático...15

Figura 5- Bolsas de sangue total em centrífuga para separação em hemocomponentes...17

Figura 6- Selador para separação de bolsas satélites...17

Figura 7- Bolsa de concentrado de hemácias...18

Figura 8- Bolsas de concentrado de plaquetas no agitador de plaquetas...19

Figura 9- Extrator de plasma...19

Figura 10- Plasma antes do congelamento...20

Figura 11- Preparação de crioprecipitado...20

Figura 12- Hemácias em teste de reação cruzada maior negativo em microscopia óptica...22

vi LISTA DE GRÁFICOS E TABELAS

Gráfico 1- Proporção dos hemocomponentes utilizados no período de estágio...25

Gráfico 2- Proporção de transfusões realizadas em cães e gatos...25

Tabela 1- Proporção de atividades (em horas) realizadas durante o estágio na USP (ago a set /2011)...11

Tabela 2- Parâmetros avaliados durante a transfusão...23

Tabela 3- Afecções dos animais avaliados durante a transfusão...24

Tabela 4- Total de hemocomponentes utilizados...25

Tabela 5- Avaliação de tempo de tromboplastina parcial ativada em bolsas de plasma fresco congelado...31

Tabela 6- Avaliação de tempo de protrombina em bolsas de plasma fresco congelado...32

Tabela 7- Avaliação de proteína total em bolsas de plasma fresco congelado...33

Tabela 8- Avaliação de fibrinogênio em bolsas de plasma fresco congelado...34

vii

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

ALT- alanina aminotransferase CH- concentrado de hemácias CP- concentrado de plaquetas

CPDA-1- citrato fosfato dextrose adenina DP- desvio padrão

F.A.- fosfatase alcalina

FMVZ- Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia HOVET- hospital veterinário

IRC- insuficiência renal crônica mov/min- movimentos por minuto mg- miligramas

ml- mililitros

PFC- plasma fresco congelado PT- proteína total

RPM- rotações por minuto ST- sangue total

TP- tempo de protrombina

TTPA- tempo de tromboplastina parcial ativada USP- Universidade de São Paulo

viii RESUMO

O estágio supervisionado ocorreu no Banco de Sangue Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, em São Paulo- SP. O período foi de 01 de Agosto a 30 de Setembro de 2011, totalizando 352 horas. Os objetivos do estágio foram o acompanhamento das atividades de coleta de sangue dos animais doadores, processamento de hemocomponentes, parte laboratorial do processo e acompanhamento de transfusão sanguínea de cães. Foram realizados dois projetos de pesquisa intitulados: “Reações transfusionais na rotina de um hospital veterinário” e “Avaliação de TTPA, TP, proteínas totais, fibrinogênio e albumina em plasma fresco congelado canino de acordo com diferentes períodos de estocagem” exposto na segunda parte deste trabalho.

1. RELATÓRIO DE ESTÁGIO

1.1 Introdução

O estágio curricular supervisionado foi realizado no Laboratório de Hematologia e Banco de Sangue do Departamento de Cirurgia (VCI) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (FMVZ/USP). Ocorreu no período de 01 de Agosto a 30 de Setembro de 2011, totalizando 352 horas. Foi realizado sob a orientação da Profª Dra. Denise Tabacchi Fantoni. O local escolhido para o estágio foi a FMVZ-USP pelo grande prestígio da instituição em âmbito nacional. Além de ser referência no país, a USP possui um dos poucos bancos de sangue veterinário do Brasil. Possui uma rotina de coletas, processamento de exames e separação de hemocomponentes que mantém o banco de sangue ativo e disponível para o uso no próprio hospital da Universidade.

O estágio neste local foi muito proveitoso para aprendizado na área de hemoterapia em pequenos animais e aprimoramento na área de patologia clínica animal.

1.2 Objetivos

1.2.1 Objetivo geral do estágio

Desenvolver conhecimento e prática na área de banco de sangue veterinário e medicina transfusional em pequenos animais.

1.2.2 Objetivos específicos do estágio

Acompanhar as etapas da cadeia produtiva de um banco de sangue, como coletas de sangue em bolsas, processamento, armazenamento, aplicações de hemocomponentes e acompanhamento de transfusões sanguíneas em cães e gatos.

O estágio envolveu as seguintes atividades: - coleta de sangue;

- realização de exames (hemograma, bioquímicos, sorológicos -snap 4Dx- e teste de reação cruzada); - acompanhamento de transfusões; - discussão de casos. 1.3 Descrição do estágio

A FMVZ-USP, localizada à Av. Prof. Dr. Orlando Marques de Paiva, 87 em São Paulo-SP foi inaugurada em 1981 e possui um Hospital Veterinário que realiza atendimento clínico e cirúrgico de pequenos e grandes animais. O banco de sangue desta instituição faz parte do Departamento de Cirurgia de Pequenos Animais (VCI), e é integrado ao serviço de anestesia veterinária. Atende exclusivamente à demanda interna do hospital universitário, não sendo realizada venda de hemocomponentes para outras clínicas e hospitais. A rotina do banco de sangue é mantida, principalmente por pós-graduandos, sendo uma doutoranda e duas mestrandas, além de estagiários e alunos de iniciação científica.

Durante o período do estágio, foi possível acompanhar a rotina do local, participando de coletas de sangue de animais, processamento das bolsas de sangue de cão, realização de exames bioquímicos e hemogramas dos animais doadores, realização de testes sorológicos para Dirofilaria, Ehrlichia, Anaplasma e Borrelia (com Snap 4dx para cães), triagem de possíveis doadores (exames físicos e laboratoriais), tipagem sanguínea de gatos, realização de teste de compatibilidade (reação cruzada) e acompanhamento de transfusões em cães.

1.3.1 Estrutura e equipamentos

O laboratório de hematologia e banco de sangue possui uma sala própria, contendo todos os equipamentos necessários para o processamento de hemocomponentes e seu armazenamento. Também possui aparelhos e materiais para realização de exames bioquímicos e hemogramas.

Possui um microscópio óptico (Nikon Eclipse E200), contador de células diferencial (Evlab), um equipamento de hemograma composto por centrífuga (QBC VetCentrifugue- Idexx) e pelo leitor (QBC VetAutoreader), microcentrífuga (Evlab), centrífuga (TDL80-2B–Centerbio), um equipamento para exames bioquímicos (Reflotron Plus- Roche), uma centrífuga para bolsas de sangue (RC-3B Refrigerated Centrifugue - Sorvall Instruments), uma geladeira 4°C (Metalfrio), freezer (-20°C) ,

coagulômetro (Coagutimer III- Inlab), agitador de plaquetas (PlaquetaMix- Fresenius HemoCare), extrator de plasma (Fanem), balança de precisão (Marte), selador (TermoClamp- Fresenius HemoCare), computador e impressora.

Neste laboratório as bolsas são processadas e armazenadas, e os exames são realizados (exceto sorologia para leishmaniose que é feita no Centro de Controle de Zoonoses de São Paulo). Além destes equipamentos, existe o material para coleta de sangue, que é levado a campo, como o homogeneizador de bolsa (HemoMix LT- Fresenius Hemocare).

1.3.2 Atividades desenvolvidas

Durante o estágio, foram desenvolvidas todas as atividades que envolvem a obtenção dos hemocomponentes, tais como: participação e realização de coletas, processamento de hemocomponentes, realização dos hemogramas, exames bioquímicos e testes sorológicos, realização de prova de compatibilidade (reação cruzada), tipagem sanguínea de gatos, acompanhamento da transfusão sanguínea, realização de projeto de pesquisa (Avaliação de TTPA, TP, proteínas totais, fibrinogênio e albumina em plasma fresco congelado de cães de acordo com diferentes períodos de estocagem).

Tabela 1- Proporção de atividades (em horas) realizadas durante o estágio na USP (ago a set /2011)

Atividades Desenvolvidas Proporção de horas

aproximadas Realização de projeto de pesquisa

Realização de exames

Acompanhamento de coletas Acompanhamento de transfusões Processamento de hemocomponentes Discussão de casos

Acompanhamento de visitas de triagem

25% 20% 19% 15% 10% 7% 4%

1.3.2.1 Coletas

As coletas são realizadas geralmente a campo, com transporte oficial em carro da FMVZ-USP, em canis ou gatis que foram pré-selecionados através de triagem, onde são realizados hemograma, exame bioquímico, testes sorológicos dos possíveis doadores (cães são testados para Leishmaniose, Erliquiose, Doença de Lyme e Anaplasmose e gatos para FIV, FeLV e Micoplasmose). Caso os animais estejam saudáveis e apresentem características específicas para doação (peso, idade e comportamento) se tornam doadores regulares.

A cada nova coleta, que é feita no mínimo a cada três meses, são realizados novos testes sorológicos, hemogramas e exames bioquímicos dos doadores.

Animais doadores

O cão doador de sangue (Fig. 1) deve ter entre 2 e 8 anos de idade, estar clinicamente saudável, pesar mais de 27kg e ter temperamento dócil e de fácil manejo, evitando necessidade de sedação. Nenhum cão foi sedado para o procedimento durante o período de estágio.

Figura 1- Doação de sangue de cão. O animal permanece sobre a mesa sob contenção física, o sangue flui por gravidade para a bolsa que se encontra próxima ao chão. A coleta é feita por punção da Veia Jugular.

O gato (Fig. 2), da mesma forma que o cão, deve estar clinicamente saudável, negativo para as doenças pesquisadas. Deve ter mais de 2 anos de idade e pesar

mais de 4 kg. Em gatos, devido à maior dificuldade de contenção, utiliza-se Butorfanol (0,1 mg/kg) para auxiliar o manejo. Os gatos recebem soro fisiológico durante a coleta para evitar efeitos adversos à coleta, devido ao volume retirado, como formação de trombos e choque hipovolêmico.

Figura 2- Gato doador de sangue. O animal recebe Butorfanol 15 minutos antes da coleta, facilitando a contenção. O sangue flui por gravidade, por auxílio de seringa ou por utilização de câmara de vácuo. A coleta é feita por punção da Veia Jugular.

Durante o estágio foram realizadas coletas em 6 canis, sendo 1 de Pastor Branco (número de bolsas), 1 de Bernese, 1 de Braco Alemão, 1 de Rottweiler, 1 de Boxer e 1 de raças diversas. Além dos cães de canil, foram feitas coletas em um sítio, sendo cães de diversos proprietários e de diferentes raças, 2 coletas internas, em que o proprietário levou seu animal ao banco de sangue para doação, sendo 1 Pitbull e 1 Setter Irlandês. Em cada coleta de cão realizada a campo, foram coletadas no mínimo 3 bolsas e no máximo 9 bolsas. Em gatos foram realizadas 3 coletas, sendo uma em um gatil da raça Maine Coon, 2 coletas internas em gato SRD.

No total, foram 12 coletas, sendo 9 de cães e 3 de gatos. Na coleta externa de felino, não foi possível coletar adequadamente, pois o animal estava excitado, comprometendo a coleta e a qualidade da bolsa, portanto a bolsa foi descartada.

Volume coleta

O volume coletado irá depender do tamanho do animal, sendo considerados 11 ml/kg para cães e gatos. O valor mínimo para cão é de 300 ml de sangue total, pois com um volume menor que este a proporção de CPDA-1 (anticoagulante utilizado) fica acima do adequado, podendo causar intoxicação no animal transfundido, uma vez que este anticoagulante seqüestra cálcio, podendo levar a uma hipocalcemia no receptor.

Em gatos a bolsa é preparada de forma estéril com auxílio de um conector, e a quantidade de anticoagulante dentro da bolsa é calculado individualmente para o volume que o animal está apto a doar.

Técnicas de coleta

Tanto em cães, quanto em gatos, a coleta foi feita a partir de punção jugular, precedida por anti-sepsia com clorexidine. A tricotomia é indicada, porém como grande parte dos doadores é de animais de exposição, a pelagem é mantida, e a anti-sepsia é feita com mais cuidado, não havendo problemas com contaminação. O sangue flui diretamente para a bolsa, que é ligada com a agulha de punção, não havendo contato do sangue com o ar. O fluxo de sangue deve ser constantemente avaliado e a bolsa deve ficar em movimento para homogeneização do sangue com o anticoagulante (movimento manual ou em homogeneizador automático -Fig.4-).

O sangue flui por gravidade, portanto o animal permanece sobre a mesa de atendimento e a bolsa fica próxima ao chão (Fig. 3). Outra técnica para coleta de sangue de gatos é posicionar a bolsa dentro de uma câmara a vácuo, fazendo com que a coleta seja mais rápida. Também foi realizada coleta por seringa, em que a seringa é conectada à bolsa e ao escalpe em sistema fechado, permitindo a transferência do sangue para a bolsa sem contato com o ar. A coleta por seringa convencional, seguida de transferência para a bolsa, não é utilizada no banco de sangue, devido ao fato de não poder armazenar a bolsa, já que há contato do sangue com o ambiente, portanto o risco de contaminação é alto e por ter disponível equipamentos e aparelhos que permitem uma coleta mais eficiente e fácil, com menos contaminação.

Os 35 cães coletados durante o estágio foram pela técnica da gravidade e nenhum animal foi sedado. Das 3 coletas de gatos observadas, 1 foi por gravidade, 1 por vácuo e 1 por seringa (técnica asséptica). Todos os animais sofreram sedação

e somente a coleta com o uso do vácuo não foi bem sucedida por agitação excessiva do animal. Outros gatos foram selecionados para doação, porém devido a comportamento ou dificuldade de punção, não doaram sangue.

Figura 3- Coleta de sangue em cão.

Figura 4- Homogeneizador automático para bolsas de concentrado de hemácias.

Bolsas de sangue

Para cães, são utilizadas bolsas de sangue de uso humano, que contém anticoagulante (CPDA-1). Deve-se coletar no mínimo 300 ml de sangue total para não haver alta concentração do anticoagulante, com risco de intoxicação no animal receptor. As bolsas utilizadas são quádruplas, sendo possível dividir o volume total coletado em mais de uma bolsa, que poderão ser usadas em animais que

necessitem um volume de sangue pequeno. Para gatos, são utilizadas bolsas pediátricas onde o anticoagulante é transferido de forma estéril de uma bolsa tradicional para a pediátrica em quantidade previamente calculada de acordo com o peso do doador e o volume que ele poderá doar.

1.3.2.2 PROCESSAMENTO

Armazenamento das bolsas pós-coleta

Imediatamente após a coleta as bolsas contendo sangue total são armazenadas em uma caixa térmica. Não devem permanecer à luz nem serem resfriadas. Ao serem processados, cada hemocomponente tem um armazenamento específico. O concentrado de hemácias e o sangue total em geladeira até 4°C, o concentrado de plaquetas em temperatura ambiente (20 a 25°C) e constante movimento, o plasma fresco congelado, o plasma congelado, crioprecipitado e crioplasma pobre são armazenados em temperatura de – 22°C.

Separação de hemocomponentes

As bolsas são processadas no mesmo dia da coleta no próprio banco de sangue. Somente as bolsas de cães são divididas em hemocomponentes, em gatos ainda é usado sangue total, porém há previsão de iniciar o processamento destas bolsas em breve.

o CONCENTRADO DE HEMÁCIAS (CH)

Para a obtenção deste hemocomponente é realizada uma centrifugação das bolsas a 2500rpm por 7 minutos (Fig. 5). As hemácias irão se depositar ao fundo da bolsa e o plasma permanecer como sobrenadante. A bolsa é retirada da centrífuga e colocada no extrator de plasma, onde por meio de uma leve compressão, o plasma é deslocado para uma bolsa satélite. As bolsas de plasma e de hemácias são separadas com auxílio de um selador (Fig. 6). Na bolsa de concentrado de hemácias deve permanecer aproximadamente 5cm do plasma, para o metabolismo das células. Para determinar o volume da bolsa, primeiramente deve-se tarar a balança com uma bolsa vazia, e então pesar a bolsa de concentrado de hemácias. Esse peso dado em gramas é convertido a mililitros dividindo o valor por 1,08 (densidade do concentrado de hemácias). O hematócrito da bolsa de CH é feito e então ela

pode ser acondicionada no refrigerador a 4°C. O hematócrito padrão destas bolsas é de 70%. O prazo de validade é de 21 dias, porém em coletas em que houve necessidade de mais de uma punção, a validade é de somente 5 dias, devido à possibilidade de contaminação. Durante o estágio foram processados 23 CH (Fig. 7), sendo que apenas o concentrado de hemácias de um animal foi descartado por volume insuficiente.

Figura 5- Bolsas de sangue total em centrífuga para separação em hemocomponentes.

Figura 7- Bolsa de concentrado de hemácias.

o CONCENTRADO DE PLAQUETAS (CP)

Para produzir concentrado de plaquetas é utilizado o plasma que foi previamente separado das hemácias. Este plasma deve ser avaliado quanto a sua coloração e aspecto. É importante saber detalhes sobre a coleta de sangue dos animais, pois o plasma de animais que ficaram muito agitados ou nos quais foram feitas duas punções venosas não será utilizado para produção de concentrado de plaquetas, uma vez que a ocorreu ativação das plaquetas. O plasma possível de se utilizar as plaquetas é classificado quanto à observação de turbilhonamento, de 1 a 5, sendo 5 ótimo. Para classificar o plasma, a bolsa deve ser colocada contra a luz, agitar o plasma com os dedos e observar a formação de uma “nuvem”, que são as plaquetas.

O plasma é centrifugado a 3500 rpm por 15 minutos e separado por gravidade, com auxilio de uma balança, até que o concentrado de plaquetas pese entre 60 e 80 mg. O CP permanece em temperatura ambiente e em constante movimentação (Fig. 8), tendo um prazo de 5 dias, pois a temperatura pode favorecer o crescimento bacteriano. Essas bolsas devem ser avaliadas diariamente, quanto ao turbilhonamento e turbidez. Uma bolsa não pode, nos 5 dias, cair 2 pontos da sua classificação inicial, e nem apresentar turbidez. Se isso for observado, a bolsa é descartada.

Durante o estágio foram processadas 8 bolsas de CP.

Figura 8- Bolsas de concentrado de plaquetas no agitador de plaquetas.

o PLASMA FRESCO CONGELADO (PFC) E PLASMA CONGELADO

O plasma é adquirido na separação do concentrado de hemácias (Fig. 9), e para ser congelado deve aguardar meia hora após a centrifugação (Fig. 10). Antes de ser congelada, a bolsa é pesada em balança, determina-se o volume, dividindo o seu peso por 1,03 (densidade do plasma). A principal diferença entre o plasma fresco congelado e o plasma congelado é o tempo entre a coleta e o congelamento. Se esse período for de até 4 horas, é considerado plasma fresco congelado, caso contrário, é considerado plasma fresco. A diferença entre as propriedades destes hemocomponentes é realizada pela presença de todos os fatores de coagulação, inclusive os lábeis, como o V e VIII no PFC, que também é rico em proteínas plasmáticas.

Durante o estágio foram processadas 15 bolsas de PFC.

Figura 10- Plasma antes do congelamento.

o CRIOPRECIPITADO E CRIOPLASMA POBRE

O crioprecipitado é obtido a partir do plasma fresco congelado. As bolsas de PFC que estavam a -20°C devem ser descongeladas a 4ºC, processo que demora de 4 a 6 horas. Após o descongelamento, as bolsas são centrifugadas a uma temperatura de 0°C por 15 minutos e é extraído aproximadamente 90% do sobrenadante (Fig. 11).

O crioprecipitado é rico em fibrinogênio, fator VIII, fator XIII. Foram preparadas 4 bolsas de crioprecipitado no período do estágio.

O crioplasma pobre é o produto separado do crioprecipitado. No banco de sangue o crioplasma pobre é descartado, pois ele pode ser substituído pelo plasma fresco congelado, estocado em grande quantidade. Foram produzidas 4 bolsas de crioprecipitado.

o SANGUE TOTAL

No banco de sangue, somente sangue de felinos não é separado em hemocomponentes, sendo então utilizado o sangue total. Há projetos para em breve iniciar o processamento de sangue de gatos. Foram somente 2 bolsas de sangue total (felino).

1.3.2.3 EXAMES

São realizados hemogramas de todos os cães doadores e de outros cães do proprietário, como forma de recompensa, e de cães triados para serem futuros doadores.

O hemograma é feito no equipamento QBC VetAutoreader (IDEXX) que fornece automaticamente hematócrito, número de leucócitos, número de plaquetas e hemoglobina.

A realização de contagem diferencial e avaliação morfológica são feitas na extensão sanguínea corada com panótico rápido e em microscópio óptico. Foram realizados 65 hemogramas.

Os exames bioquímicos são realizados no equipamento Reflotron Plus (Roche), determinando creatinina, ALT e FA de animais que apresentaram alguma alteração no exame físico ou anamnese. Foram realizados 15 exames bioquímicos no total.

Os testes imunológicos, para Borreliose, Anaplasmose, Erliquiose e Dirofilariose eram feitos através do Snap4Dx (Idexx) em 100% dos doadores e em cães não doadores da propriedade que já apresentaram alguma destas afecções. Houve 2 resultados positivos, em cães não doadores. Os testes para Leishmaniose eram realizados em laboratório externo, e não houve nenhum resultado positivo.

O teste de reação cruzada maior é realizado com o objetivo de detectar possíveis anticorpos no plasma do receptor, contra algum componente das hemácias do doador. Foram feitos 3 testes, pois normalmente é realizado no laboratório de análises clínicas do próprio hospital. No teste maior, utiliza-se soro do animal receptor e hemácias do doador. O soro é dividido em 3 tubos, em volume de 50 µL. As hemácias são lavadas em solução fisiológica por 3 vezes. As hemácias são suspendidas no soro em cada tubo, em volume de 50 µL. Os tubos são homogeneizados e acondicionados cada um a temperatura diferente (4ºC,

temperatura ambiente e 37ºC) por 30 minutos. Os tubos são homogeneizados e observa-se se houve aglutinação macroscópica. A avaliação microscópica é feita em microscópio óptico em aumento de 20x ou 40x (Fig. 12). Para não haver resultado falso positivo, já que aglutinação pode ser confundida com roulleaux eritrocitário, é adicionada 1 gota de solução fisiológica na lâmina. O teste menor é executado da mesma maneira que o teste maior, porém com hemácias do receptor e plasma do doador.

Figura 12- Hemácias em teste de reação cruzada maior negativo em microscopia óptica.

1.3.2.4 CONTROLE DE QUALIDADE

Para garantir a maior segurança possível no uso dos hemocomponentes produzidos no laboratório, são realizadas algumas ações que testam a qualidade das bolsas produzidas.

Para testar a inocuidade de bolsas de CH, que contém substrato com grande possibilidade de contaminação, bolsas que passaram do prazo de validade e não foram usadas são enviadas ao laboratório de microbiologia, para realização de cultura. Nenhuma das 8 bolsas enviadas apresentou crescimento bacteriano.

Para CP, como já citado anteriormente, as bolsas são avaliadas diariamente, durante os 5 dias que estão viáveis, sendo qualquer alteração considerada negativa, indicativo de contaminação e portanto não são mais utilizadas.

Para PFC não são realizados muitos testes de qualidade, portanto foi desenvolvido um projeto de avaliação de parâmetros de coagulação e quantidade de proteínas nessas bolsas, considerando o tempo de armazenamento da bolsa e buscando possíveis alterações do tempo na qualidade e viabilidade da bolsa.

1.3.2.5 ACOMPANHAMENTO DE TRANSFUSÕES

As bolsas de sangue são utilizadas somente no Hovet-FMVZ/USP, pela clínica e cirurgia. É importante acompanhar as transfusões pelo risco de reação, mesmo com o teste de reação cruzada não acusando incompatibilidade.

Existe um protocolo de acompanhamento de transfusões onde o animal é avaliado antes da transfusão, após o início da transfusão (primeiros 15 e 30 minutos) e a cada meia hora até o final da transfusão (Anexo 1).

Os parâmetros avaliados são: coloração de mucosas, frequência cardíaca, frequência respiratória, temperatura e comportamento.

Foram acompanhados 10 cães em transfusão de concentrado de hemácias. As médias dos parâmetros até 150 minutos de transfusão estão relacionadas na Tabela 2.

Tabela 2- Parâmetros avaliados durante a transfusão. Freqüência cardíaca (bpm) Frequência respiratória (mov/min) Temperatura (°C) Inicial Final 122 104 31 27 37,5 37,7

Dos 11 cães avaliados, todos estavam com as mucosas pálidas e somente um não apresentou as mucosas róseas ao final da transfusão.

Tabela 3- Afecções dos animais avaliados durante a transfusão. Afecções Nº de animais Insuficiência renal crônica (IRC) 03 Úlcera gástrica (medicamentosa) 02 Pancreatite 02 Indefinidos 02 Retenção placenta/anemia hemolítica 01 Aplasia medular 01

Dos cães avaliados durante a transfusão, nenhum teve reação transfusional aguda.

Em um animal houve reação transfusional tardia (hemólise 24 horas depois, seguida de óbito, não sendo confirmada se a transfusão foi determinante para o óbito).

Durante o estágio não foram acompanhadas as transfusões que ocorreram em dias de coleta, em horário em que estavam sendo feitos os hemogramas, em projetos e em cirurgia.

1.3.2.6 UTILIZAÇÃO DE HEMOCOMPONENTES

O hemocomponente a ser utilizado é escolha do clínico responsável pelo caso. A transfusão sanguínea não é realizada para tratamento de afecções, mas sim para dar mais tempo para que o tratamento específico tenha efeito.

No total utilizado pelo hospital no período de estágio, o concentrado de hemácias foi o mais usado, sendo o concentrado de plaquetas o de menor uso.

Tabela 4- Total de hemocomponentes utilizados.

Hemocomponente Número de bolsas Concentrado de Hemácias 21

Plasma Fresco Congelado 12 Sangue Total 03 Concentrado de Plaquetas 02 TOTAL 38

Gráfico 1- Proporção dos hemocomponentes utilizados no período de estágio.

As transfusões foram mais frequentes em cães, sendo somente 3 gatos transfundidos com sangue total. Isso ocorre pela dificuldade de obtenção de bolsas de sangue de gatos, e alta demanda, fazendo com que as bolsas não permaneçam em estoque. Outra situação que ocorre é a coleta de sangue de um doador trazido pelo proprietário do animal debilitado, portanto o sangue já é utilizado imediatamente após a coleta em um gato pré-determinado.

Gráfico 2- Proporção de transfusões realizadas em cães e gatos.

55,26 31,57 7,89 5,26

Hemocomponentes (%)

Transfusões (%)

A causa mais frequente para a transfusão sanguínea foi IRC ou anemia hemolítica, sendo utilizado o CH em cães com hematócrito menor de 15%. O CP foi utilizado em hemorragias intensas e persistentes. O PFC teve maior uso em cães com desidratação.

1.3.2.7 PROJETOS

Participação no projeto Avaliação de TTPA, TP, proteínas totais, fibrinogênio e albumina em plasma fresco congelado de cães de acordo com diferentes períodos de estocagem, apresentado na segunda parte deste trabalho. Participação no projeto de levantamento de reações transfusionais ocorridas no Hospital Veterinário da USP entre os anos de 2007 e 2010. Este projeto visou avaliar todos os casos de reações adversas relatadas durante as transfusões de sangue realizadas neste período. Os casos em que houve relato de reação adversa foram avaliados de acordo com dados contidos nas fichas dos animais, para determinar se o episódio se tratava de reação transfusional ou não. As reações transfusionais descritas foram classificadas de acordo com sua origem, características e sua provável relação com a transfusão. A classificação é entre reações imunológicas ou não-imunológicas, e como agudas e tardias. O trabalho ainda está em andamento, portanto os dados não podem ser divulgados.

1.4 DISCUSSÃO

As atividades desenvolvidas na FMVZ-USP envolveram todas as áreas necessárias para o funcionamento de um banco de sangue, desde a coleta até a utilização dos hemocomponentes e seu controle de qualidade.

A rotina deste laboratório é menor que de um banco de sangue particular, uma vez que o objetivo não é a venda dos hemocomponentes para clínicas e hospitais externos, mas para suprir a demanda interna da instituição e realização de pesquisas na área de medicina transfusional.

A demanda maior para cães foi de concentrado de hemácias, seguido de plasma fresco congelado. A procura por bolsas de sangue total para felinos é consideravelmente menor, uma vez que a utilização deste recurso ainda não é tão frequente (Griot-Wenk e Giger, 1995). Além disso, a sua utilização é restrita, visto que a disponibilidade das bolsas não é frequente, a coleta é dificultosa e as

restrições por peso mínimo, comportamento adequado e aceitação do proprietário a oferecer o seu animal para um programa de doação limitam o número de doadores.

A seleção dos animais doadores é essencial para que a transfusão seja segura e eficiente (Green, 2002; Hohenhaus, 2004), portanto a existência de um canil ou gatil com doadores frequentes é de extrema importância para o funcionamento de um banco de sangue, já que tais estabelecimentos já possuem um controle sanitário de doenças infecto-contagiosas, registro e histórico dos animais doadores e animais acostumados com o procedimento da doação. Foi observado que animais que estão doando sangue pela primeira vez geralmente ficam mais agitados, porém a partir da segunda doação se mostram mais tranqüilos, tornando a coleta mais fácil e o produto com maior qualidade. A fidelização do proprietário do canil com o banco de sangue também se mostra muito vantajosa, pois em situações de emergência pode-se recorrer a tais canis ou gatis.

O estágio em um banco de sangue foi extremamente proveitoso, atingindo todas as expectativas e por possibilitar a obtenção de novos conhecimentos na área de hemoterapia veterinária.

1.5 CONSIDERAÇÕES FINAIS

O estágio no banco de sangue da FMVZ-USP cumpriu com os objetivos gerais e específicos propostos, tanto no aprendizado de uma área na qual eu não tinha experiência prática, quanto no aprimoramento de técnicas laboratoriais.

Durante o período de estágio pude perceber o quanto é importante para um grande hospital manter um banco de sangue, com doadores cadastrados. Também foi observado que a rotina para manter um banco de sangue em funcionamento envolve mais etapas que somente coleta, processamento e encaminhamento do produto, mas principalmente garantir produtos com qualidade e segurança, que irão cumprir seu objetivo na clínica.

2. Avaliação de TTPA, TP, proteínas totais, fibrinogênio e albumina em plasma fresco congelado canino de acordo com diferentes períodos de estocagem

(Evaluation of APTT, TP, total proteins, fibrinogen and albumin in canine fresh frozen plasma on different storage times)

Resumo

A utilização do plasma fresco congelado na clínica de cães é de grande valor no tratamento de coagulopatias e deficiência protéica. Para avaliação da qualidade de bolsas de plasma fresco congelado foram determinados TTPA (tempo de tromboplastina parcial ativada), TP (tempo de protrombina), proteínas totais, fibrinogênio e albumina em bolsas estocadas por diferentes períodos: até três meses, 3-6 meses, 6-9 meses, 9-12 meses e mais de 12 meses. Não houve diferença nos parâmetros de acordo com o tempo de armazenamento, sugerindo que o prazo de validade determinado para seu estoque está de acordo com a manutenção de sua viabilidade, podendo ser utilizada com segurança.

Palavras-chave: armazenamento; plasma congelado; qualidade; validade

ABSTRACT

The use of the fresh frozen plasma in small animal practice is of great value in the treatment of coagulopatias and protein deficiency. For evaluation of the quality of fresh frozen plasma in stock, APTT (activated partial thromboplastin time), TP (prothrombin time), total proteins, fibrinogen and albumin were determined. The time of stock was: up to 3 months, 3-6 months, 6-9 months, 9-12 months and more than 12 months. The results had shown that there is no difference in these parameters with the storage time, suggesting that the period of validity determined for its supply is in accordance with the maintenance of its viability, thus being able to be used with security.

Key words: expiration date; frozen plasma; quality; storage;

Introdução

O plasma fresco congelado (PFC) é comumente utilizado na clínica de cães para tratar coagulopatias (Logan, 2001), como a deficiência de fator Von Willebrand, hemofilia A (deficiência de fator VIII), intoxicação por raticidas e para reposição de albumina (Stokol e Parry, 1998; Chiaramonte, 2004; Rozanski, 2004).

O controle de qualidade do PFC, segundo a RDC 153 (2004) deve avaliar parâmetros como TTPA (tempo de tromboplastina parcial ativada) e fator VIII, sendo considerado adequado TTPA até 20% acima do valor de pool e o fator VIII com no mínimo 0,7UI/mL, não existindo um valor determinado para a concentração de albumina e fibrinogênio para este hemocomponente.

Em bancos de sangue, o PFC pode ficar armazenado por um ano, desde que mantido abaixo de -20°C (Feldman e Sink, 2007), entretanto, como seu uso é menor quando comparado ao de concentrado de hemácias, existe excedente na produção. Isso permite que sejam realizadas pesquisas sem prejuízo do estoque. Sabe-se, também, que o armazenamento do PFC por um período longo pode reduzir as concentrações de fatores de coagulação e prejudicar parâmetros de coagulação (Wardrop e Brooks, 2001). Portanto, a avaliação deste hemocomponente estocado por diferentes períodos de tempo é necessária para avaliar o controle de qualidade interno, podendo, inclusive, redefinir períodos de estocagem.

Este projeto visa avaliar a qualidade do PFC canino de acordo com faixa de tempo de estocagem. Através destas análises será possível avaliar se o tempo de estocagem interfere com a qualidade deste hemocomponente, reavaliando sua validade. Foram realizadas mensurações de Tempo de protrombina (TP); Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa); Proteínas totais (PT); Fibrinogênio e Albumina.

Material e métodos

Foram determinados parâmetros bioquímicos e de coagulação em 22 bolsas de PFC de cães estocadas entre -22°C e -30°C, em diferentes períodos de armazenamento.

As amostras foram avaliadas em duplicata, sendo divididas em 5 grupos:  até 3 meses da coleta;

 3 a 6 meses;  6 a 9 meses;  9 a 12 meses;

As bolsas contendo PFC foram selecionadas aleatoriamente, descongeladas em temperatura ambiente, abertas, separadas em alíquotas e descartadas.

A determinação de proteína total, fibrinogênio e albumina foram feitas por uma mesma pessoa, sem conhecimento do grupo ao qual a amostra pertence.

Para determinação do fibrinogênio foi utilizada técnica de precipitação, em que o plasma é aquecido a 57°C por 3 minutos em banho-maria, centrifugado por 5 minutos e a leitura é feita através de um refratômetro (Kaneko e Smith, 1967).

A determinação de TTPA foi feita em aparelho automático (Coagutimer III- Inlab), onde 50µL de plasma citratado são adicionados a 50µL de reagente de cefalina, contendo fosfolipídeos provenientes de extrato de cérebro de coelho, que atuam como substituto plaquetário. São adicionados 50µL de cloreto de cálcio, promovendo uma recalcificação do plasma e o tempo de coagulação cronometrado, avaliando a via intrínseca da coagulação (Pacific Hemostasis).

Para determinação de TP foi utilizado aparelho automático (Coagutimer III- Inlab), onde adicionam-se 50µL de plasma citratado a 100µL de tromboplastina (extrato tecidual), e o tempo de formação de coágulo cronometrado, avaliando assim a via extrínseca da coagulação (Pacific Hemostasis). Tanto a determinação de TTPA quanto de TP foram realizadas a temperatura de 37ºC.

Para a determinação de albumina foi utilizada técnica colorimétrica (Verde de Bromocresol) em espectrofotômetro semi-automático (BIOPLUS 200) (Doumas,1971). A proteína total foi determinada por refratometria (refratômetro manual).

Os dados foram analisados estatisticamente através de testes de Tukey.

Resultados

Os resultados dos testes de TTPA estão apresentados na Tabela 5, de TP na Tabela 6, de proteína total na Tabela 7, de fibrinogênio na Tabela 8 e de albumina na Tabela 9.

Tabela 5- Avaliação de tempo de tromboplastina parcial ativada em segundos em bolsas de plasma fresco congelado.

TTPA (segundos) Até 3 m 3-6 m 6-9 m 9-12 m mais de 12 meses 1 20,45 11,55 21,5 17,3 22,15 2 22,3 15,2 16,15 15,65 15,35 3 29,3 19,9 12,8 18,15 18,3 4 17,05 17,6 17,05 15,2 28,9 5 18,85 14,25 17,6 14,45 18,1 6 17,8 17,9 17,35 20,3 16,45 7 17,15 13,8 15,25 15,95 15,7 8 15,55 14,4 15,5 19,85 16,7 9 14,8 17,25 18,65 19,3 10 14,95 16,2 15,2 11 14,55 14,25 12 16,75 14,7 13 15,7 15,95 14 13,65 15,2 15 18,15 19,9 16 17,25 21,8 17 17,35 18 22,9 19 19,2 20 17,6 21 18,65 22 15,25 Média 17,96364 15,76111 16,86563 17,10625 18,615 DP 3,466616 2,582002 2,531516 2,171313 4,193715536 m = meses

Tabela 6- Avaliação de tempo de protrombina em segundos em bolsas de plasma fresco congelado.

Bolsas Até 3 m 3-6 m 6-9 m 9-12 m mais de 12 meses 1 15,45 12,15 13,8 14,5 17,45 2 15,2 13 10,25 13,8 11,3 3 27,15 18,5 8,25 9 7,9 4 12,35 9,3 11,05 8,5 18,4 5 15,65 8 13,8 11,05 14,5 6 19,6 7,6 9,35 8,35 14,1 7 12,2 8,05 9 12,65 9,05 8 10,5 9,1 8,35 11,1 9 12,25 9,9 12,35 9,65 10 10,3 10,9 9,3 11 10 7,45 12 12,3 8,9 13 10,55 9,85 14 9,2 9,4 15 11,95 11,7 16 11 12,4 17 10,25 18 10,75 19 8,95 20 9,15 21 16 22 9,6 Média 12,74318 10,62222 10,425 11,12143 12,275 DP 4,224681 3,486771 1,956868 2,581482 3,654392334 m = meses

Tabela 7- Avaliação de proteína total em bolsas de plasma fresco congelado. Bolsas Até 3 m 3-6 m 6-9 m 9-12 m mais de

12 meses 1 4,8 6,8 - - 3,4 2 5 5,4 5,6 5,4 5,4 3 5,2 - 5,9 8 5,8 4 6,6 5,5 5,6 6,8 3 5 6 6 6,2 5,9 5 6 6,2 5,8 5,9 6,6 6 7 7 5,8 6 6 6 8 6,4 5,8 6,1 6,2 5,2 9 6,6 5,9 6,2 5,6 10 7,8 5,8 6,2 11 8 5,8 12 5,5 5,6 13 5,8 5,7 14 5,8 6,3 15 5,9 5,7 16 5,6 6,1 17 5,4 18 6 19 6 20 6,2 21 6,1 22 6 Média 6,086364 5,875 5,9 6,414286 5,16 DP 0,786369 0,423421 0,239046 0,837513 1,1027239 m= meses

Tabela 8- Avaliação de fibrinogênio (g/dL) em bolsas de plasma fresco congelado. Bolsas Até 3 m 3-6 m 6-9 m 9-12 m mais de 12

meses 1 1 2 - - 2 1 1 2 2 2 3 1 - 1 0 4 4 1 1 0 4 1 5 1 1 8 4 1 6 1 3 3 7 0 7 2 4 4 4 3 8 1 0 3 2 1 9 2 1 1 2 10 2 0 4 11 4 0 12 1 0 13 0 2 14 3 1 15 3 3 16 1 1 17 0 18 2 19 2 20 0 21 0 22 2 Média 1,409091 1,625 1,933333 3,285714 2 DP 1,05375 1,30247 2,120198 2,21467 1,414213562 m= meses

Tabela 9- Avaliação de albumina em bolsas de plasma fresco congelado. Bolsas Até 3 m 3-6 m 6-9 m 9-12 m mais de 12

meses 1 1,95 2,1 2,6 2,5 1,55 2 1,9 2,3 2,85 2,6 1,9 3 2,1 2,7 2,7 3,3 2,5 4 2,5 2,45 2,6 1,6 5 2,5 2,55 2,7 2,6 2,4 6 2,6 2,8 2,1 1,9 2,7 7 2,65 2,8 2,9 2,4 2,3 8 2,6 2,7 2,6 2,6 2,5 9 2,15 2,6 2,7 2,4 10 2,6 2,9 3,1 11 1,7 2,7 12 2,8 2,8 13 2,7 2,5 14 2,6 3 15 2,8 2,3 16 2,5 2,7 17 2,7 18 2,6 19 2,2 20 2,6 21 2,4 22 3 Média 2,461364 2,555556 2,665625 2,557143 2,295 DP 0,326938 0,236438 0,227097 0,411733 0,484452727 m= meses

Os resultados de TTPA, TP, fibrinogênio e albumina não tiveram diferença estatística (teste de Tukey). Resultados que estavam muito fora do padrão do grupo foram excluídos para novos testes, não havendo diferença dos resultados anteriores.

A proteína total (PT) apresentou diferença estatística, porém sem significado, uma vez que tal resultado indicaria um aumento da proteína total após um ano, o que não ocorre.

Discussão

Em estudo realizado por Rizzo et al. (2008), foram avaliado TP e TTPA em plasma canino congelado a -20°C por um período entre 4 e 7 meses. O TTPa teve alteração significativa, aumentando em média de 13,2 segundos para 15 segundos. O TP, com o mesmo tempo de armazenamento, não teve alteração significativa.

Fibrinogênio, TP e TTPA em plasma humano congelado a -20°C e -70°C foram mensurados por Alesci et al. (2009). Este estudo mostrou que o TTPA em plasma congelado a -20°C sofre alteração significativa, sendo que quando congelado a -70°C as alterações são sutis. O TP também teve alterações no congelamento a -20°C. O fibrinogênio não se alterou com o congelamento.

Fibrinogênio, TP e TTPA também foram mensurados por Iazbik et al. (2001) em plasma fresco congelado canino armazenado por até 30 dias a 2ºC e a -30ºC. Nenhum dos parâmetros se alterou nos períodos avaliados, demonstrando que o período de validade determinado está de acordo com a manutenção da qualidade da bolsa, para os parâmetros avaliados.

Um teste importante que não foi realizado é a mensuração do fator VIII, anteriormente comprovado que há diminuição de concentração com o tempo, assim como o fator de von Willebrand (Wardrop K. J. e Brooks M. B., 2001).

Deve-se considerar que os grupos não estão uniformes por diferença na quantidade de bolsas estocadas com diferentes datas de armazenamento, uma vez que quando são utilizadas, são escolhidas aleatoriamente ou em razão de seu volume.

Alguns valores que estão fora do padrão do grupo podem ser atribuídos às particularidades do animal doador. Valores muito abaixo do esperado também podem ser causados por uma coleta de sangue traumática, causando uma ativação da coagulação, e assim ocorrendo consumo desses fatores.

Conclusão

A determinação da viabilidade de uma bolsa de plasma fresco congelado é importante porque a sua utilização ocorre especialmente em emergências, portanto

a sua qualidade deve ser sempre avaliada. Para os parâmetros avaliados, não existe diferença na qualidade da bolsa de PFC com até 15 meses de armazenamento a temperatura mínima de -18ºC. Com isso define-se que até este período a utilização de PFC é viável e de qualidade. A partir destes resultados também se determina que o período de validade utilizado para este material é correto e não causa prejuízo ao produto. Sugere-se que a mensuração do fator VIII seja feita com PFC com o mesmo tempo de estocagem para comparar os resultados.

Referências

ALESCI, S.; BORGGREFE, M.; DEMPFLE, C. E. Effect of freezing method and storage as -20°C and -70°C on prothrombine time, aPTT and plasma fibrinogen levels. Thrombosis Research, 124, p.121-126, 2009.

CHIARAMONTE, D. Blood-Component Therapy: Selection, Administration and Monitoring. Clinical Techniques in Small Animal Practice, v.19, n.2, p.63-67, 2004.

DOUMAS, B.T., BIGGS, H.G., WATSON, W. Albumin standards and the measurement of serum albumin with bromocresol green. Clinica Chimica Acta, v. 31, p. 87-96, 1971

FELDMAN, B. F.; SINK, C. A. Hemoterapia para o Clínico de Pequenos Animais. São Paulo: Editora Roca, 2007. 104 p.

IAZBIK, C.; COUTO, G.; GRAY, T. L. et al. Effect of storage conditions on hemostatic parameters of canine plasma obtained for transfusion. American Journal of Veterinary Research, v. 62, n.5, p.734-735, 2001.

KANEKO, J.J.; SMITH, R. The estimation of plasma fibrinogen and its clinical significance in the dog. The California Veterinarian, Sacramento, CA, v.21, n.8, p.21-24, 1967.

LOGAN, J. C.; CALLAN, M. B.; DREW, K. et al. Clinical indications for use of fresh frozen plasma in dogs: 74 dogs (October through December 1999). Journal of the American Veterinary Medical Association, v.218, n.9, p.1449-1455, 2001.

RESOLUÇÃO-RDC Nº 153, DE 14 DE JUNHO DE 2004. Disponível em < http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/resolucao_153_2004.pdf> Acesso em: 15/11/2011.

RIZZO, F.; PAPASOULIOTIS, K.; CRAWFORD, E. et al. Measurement of prothrombine time (PT) and activated partial thromboplastin time (APTT) on canine citrated plasma samples following different storage conditions. Research in Veterinary Science, 85, p.166-170, 2008.

ROZANSKI, E.; LAFORCADE, A. M. Transfusion Medicine in Veterinary Emergency and Critical Care Medicine. Clinical Techniques in Small Animal Practice, v. 19, n. 2, p.83-87, 2004.

STOKOL, T.; PARRY, B. W. Efficacy of Fresh-Frozen Plasma and Cryoprecipitate in Dogs with von Willebrand’s Disease or Hemophilia A. Journal of Veterinary Internal Medicine, v.12, p.84-92, 1998.

WARDROP, K. J.; BROOKS, M. B. Stability of Hemostatic Proteins in Canine Fresh Frozen Plasma Units. Veterinary Clinical Pathology, v.30, n.2, p.91-95, 2001.

3. Referências adicionais

FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO. Disponível em: <http://www.fmvz.usp.br> Acesso em 27 de out. de 2011.

GRIOT-WENK, M. E.; GIGER, U. Feline transfusion medicine. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice, v.25, n.6, p.1305-1322, 1995

HOHENHAUS, A. E. Banco de sangue e clínica de transfusão. In: ETTINGER, S. e FELDMAN, E. C. Tratado de Medicina Interna Veterinária. 5.ed. Guanabara-Koogan, 2004, Cap.79, p.367-375.

4. Anexos Anexo 1:

Ficha de acompanhamento de transfusões sanguíneas:

FICHA DE ACOMPANHAMENTO DE TRANSFUSÃO

Nome do animal: Raça: Prontuário: Data: Idade: Peso: MV responsável: Setor de encaminhamento: Hemocomponente: Doador:

Hematócrito pré-transfusional: Volume infundido: Hematócrito pós-transfusional:

Afecção:

Hora Mucosas FC FR Atitude Temp. (°C) PA Hct (%)/ Plasma (cor) Obs 0 x 15 30 60 x 90 120 x 150 180 x 210 240 x 24 horas x 72 horas x 7 dias x 14 dias x 21 dias x 28 dias x Fonte: FMVZ-USP

Anexo 2

INSTRUÇÃO AOS AUTORES

O periódico ARCHIVES OF VETERINARY SCIENCE (AVS) é publicado

trimestralmente, sob orientação do seu Corpo Editorial, com a finalidade de divulgar artigos completos e de revisão relacionados à ciência animal sobre os temas: clínica, cirurgia e patologia veterinária; sanidade animal e medicina veterinária preventiva; nutrição e alimentação animal; sistemas de produção animal e meio ambiente; reprodução e melhoramento genético animal; tecnologia de alimentos; economia e sociologia rural e métodos de investigação científica. A publicação dos artigos científicos dependerá da observância das normas editoriais e dos pareceres dos consultores “ad hoc”. Todos os pareceres têm caráter sigiloso e imparcial, e os conceitos e/ou patentes emitidos nos artigos, são de inteira responsabilidade dos autores, eximindo-se o periódico de quaisquer danos autorais. A submissão de artigos deve ser feita diretamente na página da revista (www.ser.ufpr.br/veterinary.). Mais informações são fornecidas na seção “Informações sobre a revista”.

APRESENTAÇÃO DOS ARTIGOS

1. Digitação: O artigo com no máximo vinte e cinco páginas deverá ser digitado em folha com tamanho A4 210 x 297 mm, com margens laterais direita, esquerda, superior e inferior de 2,5 cm. As páginas deverão ser numeradas de forma

progressiva no canto superior direito. Deverá ser utilizado fonte arial 12 em espaço duplo; em uma coluna. Tabelas e Figuras com legendas serão inseridas diretamente no texto e não em folhas separadas.

2. Identificação dos autores e instituições (máximo 6 autores por artigo):Todos os dados referentes a autores devem ser inseridos exclusivamente nos metadados no momento da submissão online. Não deve haver nenhuma identificação dos autores no corpo do artigo enviado para a revista. Os autores devem inclusive remover a identificação de autoria do arquivo e da opção Propriedades no Word, garantindo desta forma o critério de sigilo da revista.

3. Tabelas: Devem ser numeradas em algarismo arábico seguido de hífen. O título será inserido na parte superior da tabela em caixa baixa (espaço simples) com ponto final. O recuo da segunda linha deverá ocorrer sob a primeira letra do título. (Ex.: Tabela 1 – Título.). As abreviações devem ser descritas em notas no rodapé da tabela. Estas serão referenciadas por números sobrescritos (1,2,3). Quando couber, os cabeçalhos das colunas deverão possuir as unidades de medida. Tanto o título quanto as notas de rodapé devem fazer parte da tabela, inseridos em "linhas de tabela".

4. Figuras: Devem ser numeradas em algarismo arábico seguido de hífen. O título será inserido na parte inferior da figura em caixa baixa (espaço simples) com ponto final. O recuo da segunda linha deverá ocorrer sob a primeira letra do título (Ex.: Figura 1 – Título). As designações das variáveis X e Y devem ter iniciais maiúsculas e unidades entre parênteses. São admitidas apenas figuras em preto-e-branco.

Figuras coloridas terão as despesas de clicheria e impressão a cores pagas pelo autor. Nesse caso deverá ser solicitada ao Editor (via ofício) a impressão a cores.

NORMAS EDITORIAIS

Artigo completo - Deverá ser inédito, escrito em idioma português (nomenclatura oficial) ou em inglês. O artigo científico deverá conter os seguintes tópicos: Título (Português e Inglês); Resumo; Palavras-chave; Abstract; Key words; Introdução; Material e Métodos; Resultados; Discussão; Conclusão; Agradecimento(s) (quando houver); Nota informando aprovação por Comitê de Ética (quando houver);

Referências.

Artigo de Revisão - Os artigos de revisão deverão ser digitados seguindo a mesma norma do artigo científico e conter os seguintes tópicos: Título (Português e Inglês); Resumo; Palavras-chave; Abstract; Key words; Introdução; Desenvolvimento; Conclusão; Agradecimento(s) (quando houver); Referencias. A publicação de

artigos de revisão fica condicionada à relevância do tema, mérito científico dos autores e disponibilidade da Revista para publicação de artigos de Revisão.

ESTRUTURA DO ARTIGO

TÍTULO - em português, centralizado na página, e com letras maiúsculas. Logo abaixo, título em inglês, entre parêntesis e centralizado na página, com letras minúsculas e itálicas. Não deve ser precedido do termo título.

RESUMO - no máximo 1800 caracteres incluindo os espaços, em língua portuguesa. As informações devem ser precisas e sumarizar objetivos, material e métodos, resultados e conclusões. O texto deve ser justificado e digitado em parágrafo único e espaço duplo. Deve ser precedido do termo “Resumo” em caixa alta e negrito. PALAVRAS-CHAVE – inseridas abaixo do resumo. Máximo de cinco palavras em letras minúsculas, separadas por ponto-e-vírgula, em ordem alfabética, retiradas exclusivamente do artigo, não devem fazer parte do título, e alinhado a esquerda. Não deve conter ponto final. Deve ser precedido do termo “Palavras-chave” em caixa baixa e negrito.

ABSTRACT - deve ser redigido em inglês, refletindo fielmente o resumo e com no máximo 1800 caracteres. O texto deve ser justificado e digitado em espaço duplo, em parágrafo único. Deve ser precedido do termo “Abstract” em caixa alta e negrito. KEY WORDS - inseridas abaixo do abstract. Máximo de cinco palavras em letras minúsculas, separadas por ponto-e-vírgula, em ordem alfabética, retiradas

exclusivamente do artigo, não devem fazer parte do título em inglês, e alinhado a esquerda. Não precisam ser traduções exatas das palavras-chave e não deve conter ponto final. Deve ser precedido do termo “Key words” em caixa baixa e negrito.

INTRODUÇÃO – abrange também uma breve revisão de literatura e, ao final, os objetivos. O texto deverá iniciar sob a primeira letra da palavra “Introdução” (escrita em caixa alta e negrito), com recuo da primeira linha do parágrafo a 1,0 cm da margem esquerda.

MATERIAL E MÉTODOS - o autor deverá ser preciso na descrição de novas metodologias e adaptações realizadas nas metodologias já consagradas na experimentação animal. Fornecer referência específica original para todos os procedimentos utilizados. Não usar nomes comerciais de produtos. O texto deverá iniciar sob a primeira letra do termo “Material e Métodos” (escrito em caixa alta e negrito), com recuo da primeira linha do parágrafo a 1,0 cm da margem esquerda. RESULTADOS (O item Resultados e o item Discussão podem ser apresentados juntos, na forma RESULTADOS e DISCUSSÃO, ou em itens separados)

o texto deverá iniciar sob a primeira letra da palavra “Resultados” (escrita em caixa alta e negrito), com recuo da primeira linha do parágrafo a 1,0 cm da margem esquerda. Símbolos e unidades devem ser listados conforme os exemplos: Usar 36%, e não 36 % (não usar espaço entre o no e %); Usar 88 kg, e não 88Kg (com espaço entre o no e kg, que deve vir em minúsculo); Usar 42 mL, e não 42 ml (litro deve vir em L maiúsculo, conforme padronização internacional); Usar 25oC, e não 25 oC (sem espaço entre o no e oC ); Usar (P<0,05) e não (p < 0,05); Usar r2 = 0,89 e não r2=0,89; Nas tabelas inserir o valor da probabilidade como “valor de P”; Nas tabelas e texto utilizar média ± desvio padrão (15,0 ± 0,5). Devem ser evitadas abreviações não-consagradas, como por exemplo: “o T3 foi maior que o T4, que não diferiu do T5 e do T6”. Este tipo de redação é muito cômodo para o autor, mas é de difícil compreensão para o leitor. Escreva os resultados e apresente suporte com dados. Não seja redundante incluindo os mesmos dados ou resultados em tabelas ou figuras.

DISCUSSÃO - o texto deverá iniciar sob a primeira letra da palavra “Discussão” (escrita em caixa alta e negrito), com recuo da primeira linha do parágrafo a 1,0 cm da margem esquerda. Apresente a sua interpretação dos seus dados. Mostre a relação entre fatos ou generalizações reveladas pelos seus resultados. Aponte exceções ou aspectos ainda não resolvidos. Mostre como os seus resultados ou interpretações concordam com trabalhos previamente publicados ou discordam deles, mas apresente apenas trabalhos originais, evitando citações de terceiros. Discuta os aspectos teóricos e/ou práticos do seu trabalho. Pequenas especulações podem ser interessantes, porém devem manter relação factual com os seus

resultados. Afirmações tais como: "Atualmente nós estamos tentando resolver este problema..." não são aceitas. Referências a "dados não publicados" não são aceitas. Conclua sua discussão com uma curta afirmação sobre a significância dos seus resultados.

CONCLUSÕES - preferencialmente redigir a conclusão em parágrafo único,

baseada nos objetivos. Devem se apresentar de forma clara e sem abreviações. O texto deverá iniciar sob a primeira letra da palavra “Conclusão” (escrita em caixa alta e negrito), com recuo da primeira linha do parágrafo a 1,0 cm da margem

AGRADECIMENTOS - os agradecimentos pelo apoio à pesquisa serão incluídos nesta seção. Seja breve nos seus agradecimentos. Não deve haver agradecimento a autores do trabalho. O texto deverá iniciar sob a primeira letra da palavra

“Agradecimento” (escrita em caixa baixa).

NOTAS INFORMATIVAS - quando for o caso, antes das referências, deverá ser incluído parágrafo com informações e número de protocolo de aprovação da

pesquisa pela Comissão de Ética e ou Biossegurança. (quando a Comissão de Ética pertencer à própria instituição onde a pesquisa foi realizada, deverá constar apenas o número do protocolo).

REFERÊNCIAS - o texto deverá iniciar sob a primeira letra da palavra “Referências” (escrita em caixa alta e negrito). Omitir a palavra bibliográficas. Alinhada somente à esquerda. Usar como base as normas da Associação Brasileira de Normas Técnicas – ABNT (NBR 10520 (NB 896) - 08/2002). Devem ser redigidas em página separada e ordenadas alfabeticamente pelo(s) sobrenome(s) do(s) autor(es). Os destaques deverão ser em NEGRITO e os nomes científicos, em ITÁLICO. NÃO ABREVIAR O TÍTULO DOS PERIÓDICOS. Indica-se o(s) autor(es) com entrada pelo último sobrenome seguido do(s) prenome(s) abreviado (s), exceto para nomes de origem espanhola, em que entram os dois últimos sobrenomes. Mencionam-se os autores separados por ponto e vírgula. Digitá-las em espaço simples e formatá-las segundo as seguintes instruções: no menu FORMATAR, escolha a opção PARÁGRAFO... ESPAÇAMENTO...ANTES...6 pts.Exemplo de como referenciar:

ARTIGOS DE PERIÓDICOS:

(citar os 3 primeiros autores seguido de "et al.")

JOCHLE, W.; LAMOND, D.R.; ANDERSEN, A.C. et al. Mestranol as an abortifacient in the bitch. Theriogenology, v.4, n.1, p.1-9, 1975.

Livros e capítulos de livro. Os elementos essenciais são: autor(es), título e subtítulo (se houver), seguidos da expressão "In:", e da referência completa como um todo. No final da referência, deve-se informar a paginação. Quando a editora não é identificada, deve-se indicar a expressão sine nomine, abreviada, entre colchetes [s.n.]. Quando o editor e local não puderem ser indicados na publicação, utilizam-se ambas as expressões, abreviadas, e entre colchetes [S.I.: s.n.].

REFERÊNCIA DE LIVROS (in totum):

BICHARD, S.J.; SHERDING, R.G. Small animal practice. Philadelphia : W.B. Saunders, 1997. 1467 p.

REFERÊNCIA DE PARTES DE LIVROS: (Capítulo com autoria)

SMITH, M. Anestrus, pseudopregnancy and cystic follicles. In: MORROW, D.A. Current Therapy in Theriogenology. 2.ed. Philadelphia : W.B. Saunders, 1986, Cap.x, p.585-586.

COCHRAN, W.C. The estimation of sample size. In____. Sampling techniques. 3.ed. New York : John Willey, 1977. Cap.4., p.72-90.

OBRAS DE RESPONSABILIDADE DE UMA ENTIDADE COLETIVA: A entidade é tida como autora e deve ser escrita por extenso, acompanhada por sua respectiva abreviatura. No texto, é citada somente a abreviatura correspondente. Quando a editora é a mesma instituição responsável pela autoria e já tiver sido mencionada, não é indicada.

ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTRY - AOAC. Official methods of analysis. 16.ed. Arlington: AOAC International, 1995. 1025p.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA - UFV. Sistema de análises estatísticas e genéticas - SAEG. Versão 8.0. Viçosa, MG, 2000. 142p.

REFERÊNCIA DE TESE/DISSERTAÇÃO/MONOGRAFIA:

BACILA, M. Contribuição ao estudo do metabolismo glicídico em eritrócitos de animais domésticos. 1989. Curitiba, 77f. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) - Curso de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Federal do Paraná.

REFERÊNCIA DE PUBLICAÇÕES EM CONGRESSOS:

KOZICKI, L.E.; SHIBATA, F.K. Perfil de progesterona em vacas leiteiras no período do puerpério, determinado pelo radioimunoensaio (RIA). In: CONGRESSO

BRASILEIRO DE MEDICINA VETERINÁRIA, XXIV., 1996, Goiânia. Anais... Goiânia: Sociedade Goiana de Veterinária, 1996, p. 106-107.

RESTLE, J.; SOUZA, E.V.T.; NUCCI, E.P.D. et al. Performance of cattle and buffalo fed with different sources of roughage. In: WORLD BUFFALO CONGRESS, 4., 1994, São Paulo. Proceedings... São Paulo: Associação Brasileira dos Criadores de

Búfalos, 1994. p.301-303.

REFERÊNCIA DE ARTIGOS DE PERIÓDICOS ELETRÔNICOS:Quando se tratar de obras consultadas on-line, são essenciais as informações sobre o endereço eletrônico, apresentado entre os sinais < >, precedido da expressão “Disponível em: xx/xx/xxxx”e a data de acesso do documento, precedida da expressão “Acesso em: xx/xx/xxxx.”

PRADA, F.; MENDONÇA Jr., C. X.; CARCIOFI, A. C. [1998]. Concentração de cobre e molibdênio em algumas plantas forrageiras do Estado do Mato Grosso do Sul. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v.35, n.6, 1998. Disponível em: http://www.scielo.br/ Acesso em: 05/09/2000.

MÜELLER, Suzana Pinheiro Machado. A comunicação científica e o movimento de acesso livre ao conhecimento. Ciência da Informação, Brasília, v. 35, n. 2, 2006. Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-19652006000200004&lng=pt&nrm=iso>. Acesso em: 13/05/2007.

REBOLLAR, P.G.; BLAS, C. [2002]. Digestión de la soja integral em ruminantes. Disponível em: http://www.ussoymeal.org/ruminant_s.pdf. Acesso em: 12/10/2002. SILVA, R.N.; OLIVEIRA, R. [1996]. Os limites pedagógicos do paradigma da qualidade total na educação. In: CONGRESSO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA DA URPe, 4., 1996, Recife. Anais eletrônico...Recife: Universidade Federal do Pernambuco, 1996. Disponível em: http://www.propesq.ufpe.br/anais/anais.htm> Acesso em: 21/01/1997.

CITAÇÃO DE TRABALHOS PUBLICADOS EM CD ROM:Na citação de material bibliográfico publicado em CD ROM, o autor deve proceder como o exemplo abaixo:

EUCLIDES, V.P.B.; MACEDO, M.C.M.; OLIVEIRA, M.P. Avaliação de cultivares de Panicum maximum em pastejo. In: REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE ZOOTECNIA, 36., 1999, Porto Alegre. Anais... São Paulo: Gmosis, 1999, 17par. CD-ROM. Forragicultura. Avaliação com animais. FOR-020.

INSTITUTO BRASILEIRO DE INFORMAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA. Bases de dados em Ciência e Tecnologia. Brasília, n. 1, 1996. CD-ROM.

E.mail Autor, < e-mail do autor. “Assunto”, Data de postagem, e-mail pessoal, (data da leitura)

Web Site Autor [se conhecido], “Título”(título principal, se aplicável), última data da revisão [se conhecida], < URL (data que foi acessado)

FTPAutor [se conhecido] “Título do documento”(Data da publicação) [se disponível], Endereço FTP (data que foi acessado)

CITAÇÕES NO TEXTO: As citações no texto deverão ser feitas em caixa baixa. Quando se tratar de dois autores, ambos devem ser citados, seguido apenas do ano da publicação; três ou mais autores, citar o sobrenome do primeiro autor seguido de et al. obedecendo aos exemplos abaixo:

Silva e Oliveira (1999) Schmidt et al. (1999) (Silva et al., 2000)

Archives of Veterinary Science Setor de Ciências Agrárias

Curso de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias

(Disponível em <http://ojs.c3sl.ufpr.br/ojs2/index.php/veterinary/about/submissions> Acesso em: 01/11/2011)