POTENCIAL EFEITO TIPO ANTIMANÍACO DA QUERCETINA EM UM MODELO ANIMAL DE MANIA INDUZIDO POR OUABAÍNA
VIVIAN CRISTHIANE MONTEIRO PEREIRA
CURITIBA 2020
VIVIAN CRISTHIANE MONTEIRO PEREIRA
POTENCIAL EFEITO TIPO ANTIMANÍACO DA QUERCETINA EM UM MODELO ANIMAL DE MANIA INDUZIDO POR OUABAÍNA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Área de Concentração em Neurociências, Setor de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Paraná, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Roberto Andreatini
CURITIBA 2020
Pereira, Vivian Cristhiane Monteiro.
Potencial efeito tipo antimaníaco da quercetina em um modelo animal de mania induzido por ouabaína. / Vivian Cristhiane Monteiro Pereira. – Curitiba, 2020.
56 f. : il.
Orientador: Roberto Andreatini.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia.
1. Transtorno bipolar. 2.Quercetina. 3.Flavonoides. 4. Camundongo. 5. Estresse oxidativo. I. Título. II. Andreatini, Roberto. III. Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia.
CDD (20. ed.) 616.895
Universidade Federal do Paraná. Sistema de Bibliotecas. Biblioteca de Ciências Biológicas.
DEDICATÓRIA
A mim. Ao meu sucesso. À minha superação.
Ao meu pai, Dirceu (in memoriam). À minha mãe, Esther.
Ao meu irmão, Victor Hugo e ao meu sobrinho, Pedro Henrique.
Aos meus avós maternos, José e Laide. Ao Daniel, meu companheiro de vida.
Aos familiares que apoiaram, incentivaram e torceram. Aos amigos que foram fiéis em todo o tempo.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela vida, força, oportunidade de viver e proteção em todo o tempo. Ao professor Dr. Roberto Andreatini, por mais uma vez confiar e acreditar em mim, sempre oferecendo orientação, apoio, incentivo, motivação e inspiração. Se chego até aqui com a saúde mental íntegra é por conta da ajuda e da compreensão dele. Sempre digo que se tivesse 10 vidas como pesquisadora, nas 10 eu o escolheria como orientador. São 6 anos ao lado de um gigante e será uma honra estar por mais 4 durante o doutorado.
Á doutoranda Priscila Samaha Gonçalves, por toda a amizade, parceria, amparo, apoio, auxílio e carinho. Este trabalho só foi possível pela ajuda, companheirismo, paciência, dedicação e conhecimento dela. Que nossos feitos científicos ganhem o mundo!
Aos colegas do Laboratório de Fisiologia e Farmacologia do Sistema Nervoso Central, Luiz Kae Sales, Bruno Pesquero, Isadora Pozzeti Siba e Leticia Trein, que me auxiliaram quando precisei e deram todo o apoio necessário para que meu trabalho fosse concluído.
Á profª Dra. Maria Fernanda Torres, por toda a motivação, parceria e amizade e acima de tudo por despertar em mim ainda mais a paixão pela pesquisa e pela docência, permitindo que eu a auxiliasse em sala de aula e em ideias que futuramente serão nossos maiores orgulhos.
Ao farmacêutico do Laboratório Central, Fernando Zonzini, por toda a orientação e ensinamento que me deu durante toda a minha pesquisa. Agradeço imensamente a ajuda e o apoio durante a execução deste trabalho.
À doutoranda Maria Carolina Stipp, pela colaboração extremamente importante neste trabalho. Não tenho palavras para agradecer a imensa ajuda! Obrigada, profª Dra. Alexandra Acco, por proporcionar essa parceria tão importante.
Á todos os professores do departamento de Farmacologia da UFPR, pelo conhecimento passado e pela participação ativa da minha formação como Mestra em Farmacologia e por me despertarem dia após dia a paixão pela Farmacologia, onde pretendo atuar e me aperfeiçoar pelos próximos anos da vida.
Ao professor Herbert Trebien e à Profª Maria Vital, por aceitarem o convite para participar da minha banca de qualificação e pelas contribuições importantes em meu trabalho final.
Às professoras Dra. Maria Fernanda de Paula Werner e Dra. Mara Cordeiro, por terem aceitado meu convite para compor minha banca de defesa e avaliar meu trabalho e, acima de tudo, pela honra em tê-las em minha história acadêmica.
Á UFPR, à PRPPG e à CAPES, esta que me proporcionou a concessão de bolsa de estudos, por me proporcionarem todas as oportunidades e condições para que eu me mantivesse na instituição durante os últimos 2 anos.
À minha mãe, Esther Henrique Monteiro, por ser a melhor mãe do mundo e a pessoa mais guerreira e forte que eu conheço. Por todo o apoio em todos os sentidos, pelo incentivo, pelo orgulho demonstrado e por ter permitido que eu chegasse até aqui. Te amo, mãe!
Ao meu irmão Victor Hugo Monteiro Pereira, por ser o maior e melhor parceiro de vida e ter me dado um presente incrível, que é o meu sobrinho Pedro Henrique, nos trazendo alegria e equilíbrio na vida.
Ao meu psiquiatra, João Guilherme Borgio, por ajudar a manter minha saúde mental minimamente saudável e permitir que eu ainda esteja aqui. Foram mais 2 anos em que eu precisei de amparo emocional e ele cumpriu fielmente com a sua missão.
Aos meus amigos, Aline Pereira, Larissa Guimarães, Fernanda Vergara, Jordana Lima, Guilherme Augusto, Tiago Reis, Bruna Luiza de Almeida, Tássila Zerbini, Andressa Isaias, Vivien Christina Segadilha e Lilian Vanzo por terem aguentado tantas barras e tantas dificuldades comigo, mas também por terem participado de tantas alegrias e tantas comemorações pelas pequenas e grandes conquistas. Gratidão e amor eterno por vocês!
Ao meu namorado Daniel Pires, por todo o amor, companheirismo, parceria, lealdade e cumplicidade. A caminhada seria bem mais longa, difícil, pesada e cansativa sem você. Obrigada por me amparar, me acolher e me motivar todos os dias. Te amo.
“A pesquisa básica é como atirar uma flecha para o ar e,
onde ela cair, pintar um alvo”. (Homer Adkins Burton)
RESUMO
O transtorno bipolar (TB) é uma doença crônica caracterizada por episódios recorrentes de depressão e mania, ocasionando um grande prejuízo funcional e social ao paciente, além de elevada taxa de mortalidade e morbidade. Aliado à psicoterapia, os principais tratamentos farmacológicos disponíveis atualmente para o TB incluem os estabilizadores de humor, como o lítio e o ácido valpróico e antipsicóticos de segunda geração, como a quetiapina, a risperidona e a olanzapina. Entretanto, o tratamento atual para o transtorno bipolar envolve a ocorrência de diversos efeitos colaterais importantes, o que causa uma grande ocorrência de abandono do tratamento por parte dos pacientes. Estudos recentes indicam que a fisiopatologia do transtorno bipolar está associada ao estresse oxidativo, principalmente nas áreas cerebrais responsáveis pelo controle do humor. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial efeito tipo antimaníaco da quercetina, um flavonóide antioxidante, em um modelo animal de mania induzido por ouabaína. Para isto, foram utilizados camundongos da linhagem Swiss, submetidos a cirurgia estereotáxica para a implantação de uma cânula-guia, a fim de produzir um modelo de hiperlocomoção induzido pela injeção icv de ouabaína, um inibidor específico da bomba Na+/K+-ATPase, modelo este já consagrado e padronizado em ratos. A risperidona (1 mg/kg, IP), um antipsicótico antagonista do receptor D2 e o ácido valpróico (200 mg/kg, IP), estabilizador do humor amplamente utilizado na clínica, foram utilizados como controle positivo no tratamento agudo e repetido (respectivamente). A quercetina foi administrada nas doses de 10 e 40 kg/mg (i.p.), doses estas que já demonstraram efeitos positivos em outros experimentos realizados em nosso laboratório, confirmando seu efeito antioxidante (in vitro e in
vivo), além do seu potencial efeito tipo antimaníaco em outros modelos animais. Os
animais foram submetidos ao Teste da Caixa de Locomoção, ao Teste de Campo Aberto e ao Teste de Monitoramento Comportamental (BPM), a fim de avaliar o efeito de hiperlocomoção provocado pela injeção de ouabaína e os efeitos dos demais fármacos testados, além da possibilidade de padronização deste modelo em camundongos. Adicionalmente foram avaliados os níveis de glutationa reduzida (GSH) e peroxidação lipídica (LPO) no estriado, cortéx pré-frontal e hipocampo. A quercetina preveniu a hiperlocomoção induzida por ouabaína em camundongos nas doses utilizadas, sem comprometer a atividade locomotora, sugerindo um efeito do tipo antimaníaco. A risperidona e o ácido valpróico, utilizados como controle positivo, bloquearam a hiperlocomoção induzida por ouabaína, corroborando os resultados obtidos com a quercetina e validando a versão do modelo para camundongos..Os marcadores de estresse oxidativo (GSH e LPO) não apresentaram padrão consistente com os resultados comportamerntais, sugerindo que, neste modelo, o efeito tipo antimaníaco da quercetina não estaria relacionado ao efeito antioxidante da quercetina.
Palavras-chave: Transtorno bipolar. Quercetina. Ouabaína. Modelo Animal. Camundongos. Estresse Oxidativo.
ABSTRACT
Bipolar disorder (BD) is a chronic disease characterized by recurrent episodes of depression and mania, causing great functional and social damage to the patient, in addition to a high rate of mortality and morbidity. In addition to psychotherapy, the main pharmacological treatments currently available for BD include mood stabilizers, such as lithium and valproic acid, and second-generation antipsychotics, such as quetiapine, risperidone, and olanzapine. However, current treatment for bipolar disorder involves the occurrence of several important side effects, which causes a high incidence of patients abandoning treatment. Recent studies indicate that the pathophysiology of bipolar disorder is associated with oxidative stress, especially in the brain areas responsible for controlling mood. The objective of this work was to evaluate the potential anti-manic effect of quercetin, an antioxidant flavonoid, in an animal model of mania induced by ouabain. For this purpose, Swiss mice were used, submitted to stereotactic surgery for the implantation of a guide cannula, to produce a hyperlocomotion model induced by the ICV injection of ouabain, a specific inhibitor of the Na+/K+-ATPase pump, model this already established and standardized in rats.
Risperidone (1 mg/kg, IP), an antipsychotic D2 receptor antagonist and valproic acid (200 mg/kg, IP), a mood stabilizer widely used in the clinic, were used as a positive control in acute and repeated treatment (respectively). Quercetin was administered in doses of 10 and 40 kg/mg (IP), doses that have already demonstrated positive effects in other experiments carried out in our laboratory, confirming its antioxidant effect (in vitro and in vivo), in addition to its potential type effect. antimanic in other animal models. The animals were submitted to the Locomotion Box Test, the Open Field Test and the Behavioral Pattern Monitor (BPM), to evaluate the hyperlocomotion effect caused by the ouabain injection and the effects of the other tested drugs, in addition to the possibility of standardizing this model in mice. Additionally, the levels of reduced glutathione (GSH) and lipid peroxidation (LPO) in the striatum, prefrontal cortex and hippocampus were evaluated. Quercetin prevented ouabain-induced hyperlocomotion in mice at the doses used, without compromising locomotor activity, suggesting an antimanic-type effect. Risperidone and valproic acid, used as a positive control, blocked ouabain-induced hyperlocomotion, corroborating the results obtained with quercetin and validating the model version for mice. The oxidative stress markers (GSH and LPO) did not show a consistent pattern with the behavioral results, suggesting that, in this model, the anti-manic effect of quercetin would not be related to the antioxidant effect of quercetin.
Key words: Bipolar Disorder. Quercetin. Ouabain. Animal Model. Mouses. Oxidative Stress.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AMPH - Anfetamina
ANOVA - Análise de Variância
ATP - Adenosina Trifosfato
BCL2 - gene BCL2
BDNF - Fator neurotrófico derivado do cérebro
BHE - Barreira hematoencefálica
BPM - Monitor de Padrão Comportamental
CAT - Catalase
CEUA - Comitê de Ética no Uso de Animais
CMC - Carboximetilcelulose
CPF - Córtex Pré-frontal
D2 - Receptor de dopamina tipo 2
DTNB - ácido 5,5'-ditiobis- (ácido 2-nitrobenzóico)
ECs - Esteróides cardíacos
ERK - Quinase regulada por sinal extracelular
EROs - Espécies reativas de oxigênio
EST - Estriado GPx - Glutationa peroxidase GR - Glutationa redutase GSH - Glutationa reduzida GSSG - Glutationa Oxidada HIP - Hipocampo ICV - Intracerebroventricular IP - Intraperitoneal LPO - Lipoperoxidação
MAPK - Proteína quinase ativada por mitógenos
Na+/K+- ATPase - Bomba de sódio e potássio dependente de ATP
NADH - Nicotinamida adenina dinucleotídeo
OUA - Ouabaína
p53 - Gene supressor de tumor
PKC - Proteína quinase C
SNC - Sistema Nervoso Central
SOD - Superóxido dismutase
Src - Tirosina quinase
TB - Transtorno Bipolar
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 14
2.1 Transtorno Bipolar ... 15
2.2 Fisiopatologia do transtorno bipolar... 15
2.3 Tratamento medicamentoso ... 17
2.4 Estresse oxidativo e transtorno bipolar ... 18
3 OUABAÍNA ... 20
3.1 Modelo animal de mania induzido por ouabaína ... 22
4 QUERCETINA ... 23 5 OBJETIVOS... 26 5.1 Objetivos específicos ... 26 6 MATERIAIS E MÉTODOS ... 27 6.1 Animais: ... 27 6.2 Drogas e tratamentos: ... 27 6.3 Cirurgia Estereotáxica ... 28
6.4 Administração da Ouabaína e Veículo ... 29
6.5 Testes Comportamentais ... 29
6.5.1 Monitor de Padrão Comportamental (BPM): ... 29
6.5.2 Teste do Campo Aberto ... 30
6.5.3 Teste da Caixa de Movimentação Automatizada... 31
6.6 DESENHOS EXPERIMENTAIS ... 32
6.7 Determinação da localização da cânula-guia ... 33
6.8 Avaliação dos parâmetros de estresse oxidativo ... 34
6.8.1 Obtenção e preservação das amostras de tecido cerebral ... 34
6.8.2 Avaliação dos níveis de glutationa reduzida ... 34
6.8.3 Avaliação da peroxidação lipídica ... 35
6.9 Análise Estatística ... 35
7 RESULTADOS ... 36
7.1 Efeitos da administração aguda de quercetina no teste da caixa de locomoção automatizada e no teste do campo aberto após administração ICV de ouabaína .... 36
7.2 Efeitos da administração repetida de quercetina no BPM após administração ICV de ouabaína ... 37
7.3 Efeitos da administração repetida de quercetina nos níveis de glutationa após administração ICV de ouabaína ... 38
7.4 Efeitos da administração repetida de quercetina na peroxidação lipídica após
administração ICV de ouabaína ... 39
8 DISCUSSÃO ... 41
9 CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 44
REFERÊNCIAS ... 45
ANEXO 1 – Dados estatísticos da ANOVA de 2 vias ... 56
1 INTRODUÇÃO
O Transtorno Bipolar (TB) é um transtorno neuropsiquiátrico crônico do humor e caracteriza-se como um grupo de alterações afetivas, incluindo depressão, mania ou hipomania. Atualmente estão classificados em: transtorno bipolar tipo I (episódios depressivos e maníacos, sendo diagnosticado com base em um episódio maníaco); Transtorno bipolar tipo II (episódios depressivos e hipomaníacos); Transtorno ciclotímico (sintomas hipomaníacos e depressivos que não satisfazem os critérios para episódios exclusivamente depressivos); e transtorno bipolar não especificado (sintomas depressivos e hipomania, que não cumprem o critério diagnóstico das demais desordens acima mencionadas)(APA, 2013).
O transtorno bipolar tipo II é especialmente dificultoso para diagnosticar com precisão, devido à dificuldade na diferenciação entre esse transtorno e a depressão unipolar recorrente (episódios depressivos recorrentes) em pacientes deprimidos. Apesar de novas descobertas e avanços no estudo das bases neurobiológicas e abordagens terapêuticas no transtorno bipolar, elevadas taxas de recorrência, sintomas persistentes e refratariedade terapêutica são aspectos clínicos desafiadores (MACHADO-VIEIRA et al., 2007). Sendo assim, a busca por substâncias capazes de induzirem uma rápida e sustentável melhora do quadro clínico destes transtornos e que apresentem poucos efeitos colaterais se faz necessária. Um dos objetivos deste trabalho é verificar os efeitos de um flavonóide já consagrado na literatura por seu efeito neuroprotetor, a quercetina, em um modelo animal de mania induzido por ouabaína em camundongos, um modelo já consagrado em ratos e pouco usado em camundongos (KURAUCHI et al., 2019; LOPACHEV et al., 2019).
15
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Transtorno Bipolar
O transtorno bipolar (TB) é uma transtorno psiquiátrico crônico, prevalente na população mundial de 1% a 5%, sendo o tipo 1 mais prevalente nos pacientes (CLEMENTE et al., 2015; MERIKANGAS et al., 2011). Está entre as principais causas de incapacidade devido a seus efeitos comportamentais e sociais acentuados, além das comorbidades (ANDERSON et al., 2012; ANGST et al., 2000). Os sintomas da mania incluem humor elevado, hiperatividade, pensamentos acelerados, redução da necessidade de sono, sentimentos de grandiosidade e, em alguns casos, sintomas psicóticos. A fase depressiva está associada a sintomas como humor deprimido, baixa autoestima, insônia ou hipersonia, letargia e anedonia (GOODWIN et al., 2008). Nos últimos anos, diversas pesquisas apontaram que o transtorno bipolar está associado à mortalidade prematura (ROSHANAEI-MOGHADDAM et al., 2009), incluindo um risco quase duas vezes maior de mortalidade por doenças cardiovasculares (WEINER et al., 2011) e 15 vezes mais por suicídio em comparação com a população em geral (LATALOVA et al., 2014).
2.2 Fisiopatologia do transtorno bipolar
A natureza progressiva do TB foi descrita pela primeira vez em 1921 (ZIVANOVIC et al., 2012), onde foi introduzido o termo "loucura maníaco-depressiva". Apenas em 1992 fundamentou-se as características da compreensão atual da natureza progressiva da fisiopatologia do transtorno (POST, 1992). Uma alteração lenta da atividade neuronal subjazia as mudanças progressivas observadas em estudos de neuroimagem e as mudanças progressivas na gravidade dos sintomas. Em um estudo posterior, Post sugeriu que alguns dos desfechos negativos do TB podem ser devidos a uma falha de mecanismos compensatórios endógenos que normalmente minimizariam o impacto de injúrias de caráter endógeno, como a redução da liberação de fatores neurotróficos e neuroprotetores como o BDNF, e o aumento de fatores de morte celular, como a proteína p53 e a BCL2 pró-apoptótica (POST, 2007).
Posteriormente incorporou-se a hipótese da “carga alostática”, onde os efeitos combinados de fatores genéticos, estressores do cotidiano e fatores agravantes, como o uso de drogas, culminam em um processo cumulativo de "desgaste" (KAPCZINSKI et al., 2008). Essas características combinadas contribuiriam para lesionar ainda mais os circuitos funcionais do cérebro responsáveis pela modulação e manutenção do humor. Com as mudanças estruturais e o declínio cognitivo associado observado, os circuitos que seriam mais interrompidos resultariam na diminuição da capacidade de resposta à terapia que ocorre com a cronicidade. A progressão também está diretamente ligada ao aumento da vulnerabilidade a futuros episódios de crises, principalmente maníacas, e do surgimento de comorbidades. Desta forma, podemos perceber que os fundamentos bioquímicos do TB são multifatoriais e interativos, advindos da sensibilização ao estresse do meio ambiente e fatores intrínsecos aos pacientes.
As mitocôndrias desempenham um papel crucial na produção de adenosina trifosfato (ATP), sendo a maior fonte de geração de energia das células e também servem como reservas de cálcio e reguladores da apoptose (FATTAL et al., 2007; STUCHEBRUKHOV et al., 2009). Durante o transporte de elétrons ao longo da cadeia transportadora, os elétrons podem se perder e reduzir elétrons do oxigênio molecular, formando um ânion superóxido O2-, especialmente no complexo I (NADH:
ubiquinona óxido redutase) (GREEN et al., 2004). Estudos mais focados no metabolismo mitocondrial mostraram uma redução na atividade do complexo I da cadeia transportadora de elétrons mitocondrial no córtex pré-frontal pós-mortem em pacientes com TB, mas não na esquizofrenia ou depressão maior (TANG et al., 2014), além de evidências de expressão alterada das subunidades deste complexo (SUN et al., 2006). Dada a hipótese mitocondrial envolvida no TB, é de grande interesse que o lítio aumente a atividade dos complexos mitocondriais I/II e II/III no tecido cerebral de humanos (MAURER et al., 2009).
Alguns estudos mostram o envolvimento de Na+K+-ATPase e cardiotônicos
endógenos, como a OUA, no TB e em outros transtornos do humor, como associação genética entre o TB e polimorfismos de nucleotídeo único no gene da subunidade α3(KIRSHENBAUM et al., 2011). Mutações nesta isoforma promovem
uma série de alterações neurológicas, incluindo comportamento tipo maníaco em camundongos (HOLM et al., 2016; LOONEY; EL-MALLAKH, 1997). Anormalidades
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na atividade Na+/K+-ATPase e alterações nos níveis endógenos de ECs foram
relatados em indivíduos bipolares (EL-MALLAKH et al., 2010; HODES et al., 2016). Houve, também, a constatação de que a redução nos ECs no cérebro de ratos promoveu proteção contra uma resposta comportamental do tipo maníaca (aumento da atividade locomotora) em um modelo de mania induzido por anfetamina (AMPH) (VALVASSORI et al., 2019). Estudos do genoma mostraram que os genes envolvidos na regulação de íons fornecem uma maior contribuição para o diagnóstico bipolar (CIPRIANI et al., 2016; ROBY et al., 2017). A desregulação de íons pode estar ligada a uma anormalidade primária da bomba de sódio ou, possivelmente, secundária à regulação anormal do fluxo de sódio, desencadeando anormalidades na função eletrofisiológica neuronal e nos sistemas de segundo mensageiro (EL-MALLAKH et al., 2016).
2.3 Tratamento medicamentoso
O tratamento do TB progrediu significativamente nas últimas décadas devido aos avanços tanto na pesquisa pré-clínica quanto na clínica. Grande parte deste progresso está centrado no desenvolvimento de uma nova geração de estabilizadores de humor-anticonvulsivantes (LI et al., 2002). O tratamento farmacológico do TB inclui o tratamento de estados agudos e o tratamento de manutenção, a fim de impedir novos episódios. Estabilizadores do humor, como o lítio e valproato, são drogas de primeira linha indicadas para a mania e manutenção posterior do tratamento agudo (JORNADA et al., 2011). O ácido valpróico e a carbamazepina têm propriedades estabilizadoras de humor bem definidas, enquanto a lamotrigina, o topiramato e a gabapentina são utilizadas para outras variações do transtorno (LI et al., 2002). Os antipsicóticos também são usados em monoterapia ou em combinação com estabilizadores do humor, como a olanzapina e a risperidona, principalmente em pacientes que apresentam características mistas (CHAKRABARTY et al., 2020).
Alguns estudos sugerem que os efeitos neuroprotetores do lítio e do valproato podem ser responsáveis pelos seus efeitos terapêuticos (CHENGAPPA; GOODWIN, 2005; (CHUANG et al., 2002) e um dos mecanismos que implica neste efeito é a indução do fator neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF)/via de
sinalização TrkB (HASHIMOTO et al., 2002; MANJI et al., 2002). O uso de antidepressivos para tratar a depressão bipolar é controversa e a base de evidências é inconclusiva (PACCHIAROTTI et al., 2013; KARANTI et al., 2016).
Sabe-se que os estabilizadores de humor utilizados atualmente afetam os mecanismos associados à neuroprogressão do TB. A lamotrigina, o lítio e o ácido valpróico reduzem o estresse oxidativo (CUI et al., 2007; EREN et al., 2007; KIM et al., 2007)e os antipsicóticos atípicos também demonstraram efeito sobre o estresse oxidativo, não só através do antagonismo da dopamina, mas também através de efeitos diretos sobre as defesas oxidativas (BERK et al., 2007). Outro alvo proposto para a ação do lítio e do ácido valpróico é a proteína quinase C (PKC), pois estes fármacos reduzem a atividade da PKC, que estaria aumentada no episódio maníaco (ARMANI et al., 2014).
Mesmo com o uso adequado dos atuais fármacos indicados para o tratamento de TB, a maioria dos pacientes continua a ter recorrentes episódios de flutuações de humor, sintomas residuais, comprometimento funcional, deficiência psicossocial e comorbidades psiquiátricas. Os recentes avanços na genética, neurobiologia e nas metodologias farmacológicas têm ajudado no desenvolvimento de modelos animais, os quais são importantes ferramentas para investigar novos sistemas intracelulares que podem estar envolvidos na fisiopatologia específica de desordens psiquiátricas (VALVASSORI et al., 2013).
2.4 Estresse oxidativo e transtorno bipolar
As espécies reativas de oxigênio (EROs) no cérebro dos mamíferos possuem como principal fonte as mitocôndrias durante o transporte de elétrons na cadeia de fosforilação oxidativa. Os tecidos cerebrais são mais suscetíveis às EROs porque metabolizam 20% do oxigênio total que o organismo recebe e possui uma quantidade limitada de proteção antioxidante (FLOYD, 1999). Estudos apontaram diversas evidências de que o estresse oxidativo pode estar relacionado à fisiopatologia do TB (OZCAN et al., 2004; FREY et al., 2007; GERGERLIOGLU et al., 2007). Estudos pré-clínicos mostraram que estabilizadores de humor, como lítio e valproato, auxiliam no aumento dos níveis de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e promovem a proteção de estruturas cerebrais contra danos
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oxidativos causados pelas EROs (JORNADA et al., 2011; JORNADA et al., 2010), os quais aparentemente estão envolvidos na morte celular e em outros danos teciduais (ALLEN et al., 2000). Tais danos resultam no aumento da geração de EROs, de um sistema antioxidante ineficaz ou de ambos (CALABRESE et al., 2003; HALLIWELL et al., 2001).
As principais enzimas antioxidantes presentes no organismo de mamíferos são a superóxido dismutase (SOD), que converte o O2- intracelular em peróxido de
hidrôgênio H2O2, a catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GPx), ambas com a
função de metabolizar o H2O2 (CALABRESE et al., 2003) (figura 1). A glutationa
reduzida (GSH) possui grande importância como antioxidante neuronal. Trata-se de um tripipeptídeo composto de glutamato, cisteína e glicina, que é usado como doador de elétrons para a ação da GPx, levando à produção de glutationa oxidada (GSSG). Outra enzima importante desse sistema é a glutationa redutase (GR) necessária para catalisar a redução de GSSG em GSH e reiniciar o processo (DRINGEN et al., 2003).
FIGURA 1: ORIGEM DOS RADICAIS LIVRES E O FUNCIONAMENTO DO SISTEMA ANTIOXIDANTE ENZIMÁTICO.
FONTE: o autor (2020)
LEGENDA: SOD – superóxido dismutase. H2O2 – Peróxido de Hidrogênio. CAT – Catalase. GPx- glutationa peroxidase. GSH – glutationa reduzida. GSSG – glutationa oxidada. GR – glutationa redutase. 3 OUABAÍNA
A ouabaína, também conhecida como estrofantina g (figura 2) é um composto do grupo dos digitálicos ou glicosídeos cardíacos, substâncias derivadas de plantas da família da dedaleira (Digitalis sp.). Pertencem à família de esteróides utilizados na clínica denominados esteróides cardíacos (ECs) (WASSERSTROM et al., 2005). Em doses utilizadas na clínica, esses compostos aumentam a força de contração do músculo cardíaco e são utilizados no tratamento de insuficiência cardíaca congestiva e arritmias atriais (HAMLYN et al., 1991). Compostos semelhantes ou idênticos aos esteróides cardíacos foram identificados em tecidos de mamíferos, inclusive no sistema nervoso central (SNC) (BENARROCH et al., 2011; HODES et al., 2014; LOPACHEV et al., 2018).
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FIGURA 2: ESTRUTURA QUÍMICA DA OUABAÍNA.
FONTE: Domínio Público - Wikimedia Commons (2019)
A bomba de sódio e potássio – Na+K+-ATPase (figura 3), alvo da ação dos
ECs, é composta por uma subunidade α catalítica que possui três isoformas: a α1
está presente em todas as células do organismo dos mamíferos, α2 é expressa
apenas em células gliais e miócitos e α3 está presente apenas em neurônios de
mamíferos adultos (MADAN et al., 2017). A subunidade α3 pode atuar como um
receptor de esteróides cardíacos endógenos no SNC (HODES et al., 2014; LOPACHEV et al., 2018; MADAN et al., 2017).
FIGURA 3: ESQUEMA DO FUNCIONAMENTO DA BOMBA DE SÓDIO-POTÁSSIO (NA+/K+-ATPASE).
FONTE: Domínio Público - Wikimedia Commons (2019) LEGENDA: Na+: Sódio
K+: Potássio
ATP: adenosina trifosfato ADP: adenosina bifosfato Pi: íon fosfato
A OUA se liga à subunidade α3 da Na+K+-ATPase, promovendo a redução da
função de transporte de íons e a ativação de várias cascatas de transdução de sinal, incluindo a proteína quinase ativada por mitogênio (MAPK), quinase regulada por sinal extracelular (ERK), proto-oncogene tirosina-proteína quinase (Src), via PI3K/Akt, sinalização de Ca2+ e vias de geração de EROs (CUI; XIE, 2017;
(GOLDSTEIN et al., 2009; EL-MALLAKH; BARRETT; WYATT, 1993).
3.1 Modelo animal de mania induzido por ouabaína
O modelo de mania induzido pela OUA tem como base a “hipótese Na+/K+
-ATPase”, proposto por El-Mallakh et al. (1995) a qual indica que uma redução da atividade deste transportador seja um fator desencadeante para os episódios de humor maníaco e depressivo no TB (EL-MALLAKH, 1983; EL-MALLAKH; BARRETT; WYATT, 1993; LOONEY & EL-MALLAKH, 1997). Diversos trabalhos na literatura mostraram que a atividade Na+/K+- ATPase é reduzida em pacientes com TB
Constatou-23
se, também, que a administração via intracerebroventricular (ICV) de OUA em ratos induz alterações moleculares semelhantes às detectadas em pacientes com TB, como alterações nos fatores neurotróficos (RIEGEL et al., 2009), disfunção mitocondrial (RIEGEL et al., 2010) e estresse oxidativo (LOPES-BORGES et al., 2015; EL-MALLAKH et al., 2003).
Vale ressaltar que os modelos animais de transtornos psiquiátricos devem atender a três requisitos básicos para sua validação: Validade de face, onde o modelo animal deve reproduzir os sinais de um transtorno ou doença específicos; Validade do construto, demonstrando a capacidade do modelo em simular aspectos fisiopatológicos da doença; Validade de predição, onde verifica-se se os medicamentos utilizados na clínica para a condição humana são capazes de reverter os sintomas induzidos no modelo (VALVASSORI et al., 2019). O modelo animal de mania induzido pela ouabaína (OUA) administrada via ICV em ratos parece atender aos requisitos básicos, tornando-o adequado para investigar determinados aspectos comportamentais e neuroquímicos do TB (EL-MALLAKH et al., 2003; JORNADA et al, 2011; HERMAN et al., 2007). Por outro lado, poucos estudos utilizaram com sucesso a versão para camundongos (KURAUCHI et al., 2019 (a); KURAUCHI et al., 2019 (b);
PEREIRA, 2017).
4 QUERCETINA
A quercetina (3,3',4',5,7-penta-hidroxiflavona) é um flavonóide (fig. 4) encontrado em frutas e vegetais, como a maçã, frutas cítricas, cenoura, uvas, grãos de cereais e chás (AMÁLIA et al., 2007; HARWOOD et al., 2007).
FIGURA 4: ESTRUTURA MOLECULAR DA QUERCETINA.
FONTE: Domínio Público - Wikimedia Commons (2019)
A quercetina possui diversas propriedades farmacológicas, incluindo efeitos antioxidantes (CHOI et al., 2003; PATIR et al., 2012), anti-inflamatórios (HUANG et al., 2012; LIU et al., 2012; KIM et al., 2012) e hepatoprotetores (AMALIA et al., 2007). Ela possui a capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica (BHE) e estima-se que a proporção de sua passagem é em torno de 65% (REN et al., 2010). Seus metabólitos aparentam possuir menor capacidade neuroprotetora e atravessam a BHE com menos eficiência (OSSOLA et al., 2009). Há diversos registros na literatura versando acerca do papel inibitório da quercetina na peroxidação lipídica em estudos comportamentais (LIU et al., 2006; SUN et al., 2007; HALEAGRAHARA et al., 2009; TOTA et al., 2010).
Diversos estudos mostraram um aumento consistente de peroxidação lipídica e alterações em enzimas antioxidantes em pacientes com TB, reforçando a hipótese de que o estresse oxidativo está envolvido na fisiopatologia do TB (OZCAN et al., 2004; FREY et al., 2013), assim como o papel proposto para a PKC no transtorno bipolar. A quercetina apresenta ações nessas duas possíveis vias e em nosso grupo de pesquisa já foi observado um efeito tipo antimaníaco nas doses de 10 mg/kg e 40 mg/kg nos modelos animais de privação de sono paradoxal (KANAZAWA et al., 2016) e de hiperlocomoção induzida por metilfenidato (KANAZAWA et al., 2017). Portanto, o estudo dos possíveis efeitos neuroprotetores nas vias de defesa antioxidante promovidos pela quercetina deve ser avaliado, considerando a
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possibilidade de sua utilização em conjunto no tratamento de pacientes não-responsivos ou pouco não-responsivos aos tratamentos convencionais.
5 OBJETIVOS
Considerando as evidências apresentadas, a injeção de OUA via ICV em camundongos aparenta ser um bom modelo experimental para o estudo do TB, considerando a reprodução de mecanismos comportamentais e fisiopatológicos ligados ao transtorno. Portanto, o presente estudo foi desenvolvido a fim de avaliar se o modelo de hiperlocomoção induzido por ouabaína é reproduzível em camundongos, ou se trata de um modelo com efeito espécie-específico. Avaliamos também as alterações comportamentais e as possíveis alterações no sistema de defesa antioxidante de tecidos cerebrais após a injeção de OUA via ICV e os efeitos da quercetina administrada de forma aguda e repetidaem camundongos. Os efeitos da risperidona e do ácido valpróico, usados como controle positivo, também foram avaliados.
5.1 Objetivos específicos
Verificar se o modelo animal de mania por hiperlocomoção induzida por ouabaína é reproduzível em camundongos;
Verificar se a Risperidona e o Ácido Valpróico, utilizados como controle positivo, exercem efeito sobre o comportamento de hiperlocomoção e exploração (específica e espacial), a fim de validar o possível modelo animal e também confirmar o possível efeito antimaníaco da quercetina;
Verificar se a quercetina exerce efeito tipo antimaníaco quando administrada de forma aguda e repetida, antes da indução da hiperlocomoção pela ouabaína (pré-tratamento).
Verificar se a quercetina promove proteção contra o estresse oxidativo ocasionado pela injeção ICV de ouabaína através de análises de dosagem de GSH e da medida de peroxidação lipídica em áreas cerebrais específicas (córtex pré-frontal, hipocampo e estriado).
27
6 MATERIAIS E MÉTODOS
6.1 Animais:
Camundongos Swiss (Mus musculus), com 45 dias de idade, foram fornecidos pelo Biotério Central da Universidade Federal do Paraná (UFPR). Os animais foram alojados 8 por gaiola em uma sala com condições controladas (temperatura: 22 ± 1 °C), em ciclo claro/escuro de 12/12h (luzes ligadas às 07:00 horas). Os animais foram mantidos em gaiolas de polipropileno (41 cm × 34 cm × 16 cm) com comida e água disponíveis ad libitum. Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Experimentação Animal da Universidade Federal do Paraná (CEUA / BIO-UFPR, protocolo nº 1284).
6.2 Drogas e tratamentos:
Os camundongos foram tratados com solução salina (NaCl a 0,9%) 10 ml/kg, via intraperitoneal (IP); Risperidon (Risperidona 1 mg/kg - Cristália, Brasil), via IP, empregado como controle positivo e diluído em solução salina; Valpakine (Valproato de Sódio, Sanofi-Aventis, Brasil - 200 mg/kg), via IP, também empregado como controle positivo e dissolvidos em solução salina; carboximetilcelusose 0,3% (CMC), veículo utilizado para a quercetina, via IP; Quercetina (Sigma, EUA), dissolvida em CMC 0,3% e administrada nas doses de 10 mg/kg e 40 mg/kg via IP; Ouabaína (Sigma, EUA), administrada via ICV em volume constante de 2,5 µl na concentração de 10-4 mM e dissolvida em solução de 1% de Tween 80; Tween 80, veículo, em
solução de 1%, administrada em volume constante de 2,5 µl. Todos os medicamentos foram administrados em um volume de 10 ml/kg de peso corporal, exceto a ouabaína. As doses foram baseadas em dados da literatura (BHUTADA et al., 2010) e em trabalhos anteriores do nosso grupo de pesquisa (KANAZAWA et al., 2016; KANAZAWA et al., 2017; PEREIRA, 2017).
6.3 Cirurgia Estereotáxica
Os animais foram anestesiados via IP com cetamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Em um aparelho estereotáxico, a pele do crânio do camundongo foi aberta e uma cânula guia de 10 mm de calibre 30 foi colocada 1,0 mm posterior ao bregma, 0,34 mm à esquerda da linha média e 2,2 mm acima do ventrículo lateral do cérebro, de acordo com Paxinos e Franklin (2019) (figura 5).
FIGURA 5: COORDENADAS ESTEREOTÁXICAS UTILIZADAS PARA IMPLANTAÇÃO DA CÂNULA-GUIA E SUA POSIÇÃO DE IMPLANTAÇÃO.
FONTE: Paxinos e Watson, 2019 (adaptado).
A cânula foi fixada com cimento acrílico odontológico, que também foi utilizado para cobrir a pequena superfície do crânio que foi exposta pela remoção da pele. Após a cirurgia, os animais foram mantidos em gaiolas individuais e tratados com Cetoprofeno (1 mg/kg) uma vez ao dia, via IP, por 3 dias, até a total recuperação da cirurgia.
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6.4 Administração da Ouabaína e Veículo
As injeções via ICV foram realizadas inserindo as cânulas de injeção nas cânulas-guia com 1,1 mm de profundidade após um período de recuperação de 3 dias após a cirurgia. As cânulas de injeção foram conectadas a uma seringa Hamilton por um tubo de polietileno (0,10 mm). 0,25 μl de Tween 80 em solução de 1% ou 10-4 M de ouabaína (Sigma, EUA) em Tween 80 a 1% foram injetados no
ventrículo lateral direito por 2 minutos a uma velocidade de 1,25 µl/min com o uso de uma bomba de infusão. Após as injeções, os camundongos foram testados imediatamente na Caixa de Movimentação, no Campo Aberto ou no BPM. Nos grupos de animais tratados com risperidona e quercetina, a administração única (aguda) ocorreu 20 minutos antes das injeções via ICV. Para o grupo tratado de forma repetida, as administrações ocorreram uma vez ao dia, no período da tarde, durante 14 dias, sendo a última administração 30 minutos antes da injeção de ouabaína no dia do primeiro teste comportamental.
6.5 Testes Comportamentais
6.5.1 Monitor de Padrão Comportamental (BPM):
A atividade locomotora e o comportamento exploratório foram avaliados no
Behavioural Pattern Monitor (BPM), que consiste de uma câmara de acrílico envolta
por uma caixa de madeira preta de 30,5 × 61,0 × 28,0 cm, equipada com sete furos nas paredes laterais (três em cada parede maior e um em cada parede menor) e três furos no piso, cada um com 1,25 cm de diâmetro (GEYER et al., 1986; HALBERSTADT et al., 2016) (figura 6).
FIGURA 6: MONITOR DE PADRÃO COMPORTAMENTAL (BEHAVIOUR PATTERN MONITOR -BPM)
FONTE: o autor (2020).
As fotocélulas em cada orifício detectam a exploração dos animais quando estes inserem o focinho no orifício. O chão é dividido em 9 quadrantes, onde em cada divisão há feixes de raios infravermelhos, usados para detectar a posição do animal nas coordenadas X-Y. A cada 17 ms, um sistema de microprocessador registra o status de todos os feixes e armazena essas informações para posterior análise off-line. Cada animal foi submetido ao teste por 30 minutos.
6.5.2 Teste do Campo Aberto
O equipamento consiste de uma arena circular bem iluminada (iluminação da sala = 110 lux) com aproximadamente 40 cm de diâmetro, circundada por uma parede circular de 28 cm de altura, com fundo branco e área de piso dividida por linhas na cor preta, dividida em 25 espaços dispostos em 3 círculos concêntricos. A quantidade de quadrantes a partir do círculo interno é de 1, 8 e 16, respectivamente, com iluminação de 110 lux no piso (figura 7).
31 FIGURA 7: ARENA DO TESTE DE CAMPO ABERTO (OPEN FIELD TEST).
FONTE: o autor (2020)
O procedimento de avaliação consiste em confrontar o animal com a novidade do ambiente e observar comportamentos de locomoção (número de linhas cruzadas no chão da arena pelo animal). Os roedores parecem preferir a periferia ao centro do aparelho, normalmente circulando em contato com as paredes (tigmotaxia) (RAMOS et al., 1997; PRUT et al., 2003). Em nosso experimento, avaliamos apenas a hiperlocomoção e a quantidade de cruzamentos nas demarcações da arena durante 5 minutos a fim de verificar variações na locomoção espontânea dos camundongos.
6.5.3 Teste da Caixa de Movimentação Automatizada
Os animais foram submetidos à caixa de locomoção, composta por paredes de madeira medindo 40x14x20 cm, a qual possui uma grade no chão e é equipada com 3 fotocélulas posicionadas a 2 cm da grade, espaçadas ao longo do eixo longitudinal e fechada na parte superior por uma tampa escura (figura 8). A atividade locomotora na caixa foi registrada durante 5 minutos por um contador digital acoplado às fotocélulas.
FIGURA 8: CAIXA DE MOVIMENTAÇÃO AUTOMATIZADA.
FONTE: o autor (2020).
6.6 DESENHOS EXPERIMENTAIS
As figuras 9 e 10 mostram a linha do tempo indicando as etapas dos experimentos realizados.
FIGURA 9: LINHA DO TEMPO REFERENTE AO PROTOCOLO DE TRATAMENTO AGUDO COM QUERCETINA.
FONTE: o autor (2020).
FIGURA 10: LINHA DO TEMPO REFERENTE AO PROTOCOLO DE TRATAMENTO REPETIDO COM QUERCETINA.
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A organização dos grupos controle e tratados foram distribuídos conforme as tabelas 1 e 2:
TABELA 1 - DISTRIBUIÇÃO DOS GRUPOS EXPERIMENTAIS CONFORME ASSOCIAÇÃO DE FÁRMACOS NO TRATAMENTO AGUDO.
TRATAMENTO AGUDO
GRUPO VEÍCULO (TWEEN 80) GRUPO OUABAÍNA
TWEEN 80 + CMC 3% (veículo) OUABAÍNA + CMC 3% (veículo) TWEEN 80 + QUERCETINA 10 mg/kg OUABAÍNA + QUERCETINA 10 mg/kg TWEEN 80 + QUERCETINA 40 mg/kg OUABAÍNA + QUERCETINA 40 mg/kg TWEEN 80 + RISPERIDONA 1 mg/kg OUABAÍNA + RISPERIDONA 1 mg/kg
TABELA 2 - DISTRIBUIÇÃO DOS GRUPOS EXPERIMENTAIS CONFORME ASSOCIAÇÃO DE FÁRMACOS NO TRATAMENTO REPETIDO.
TRATAMENTO REPETIDO
GRUPO VEÍCULO (TWEEN 80) GRUPO OUABAÍNA
TWEEN 80 + CMC 3% (veículo) OUABAÍNA + CMC 3% (veículo) TWEEN 80 + QUERCETINA 10 mg/kg OUABAÍNA + QUERCETINA 10 mg/kg TWEEN 80 + QUERCETINA 40 mg/kg OUABAÍNA + QUERCETINA 40 mg/kg TWEEN 80 + ÁCIDO VALPRÓICO 200 mg/kg OUABAÍNA + ÁCIDO VALPRÓICO 200 mg/kg
6.7 Determinação da localização da cânula-guia
Após a realização dos experimentos e antes da eutanásia, foi administrado via ICV através da cânula-guia uma solução de azul de metileno, a fim de determinar se a cânula estava realmente implantada no ventrículo. Todos os animais apresentaram a marcação ventricular, sendo validados para compor os dados experimentais.
6.8 Avaliação dos parâmetros de estresse oxidativo
6.8.1 Obtenção e preservação das amostras de tecido cerebral
Os camundongos foram eutanasiados por deslocamento cervical imediatamente após serem expostos à caixa de atividade automatizada, ao campo aberto e ao BPM. O córtex pré-frontal (CPF), o hipocampo (HIP) e o estriado (EST) foram dissecados, congelados e armazenados a -80ºC até análise posterior. As amostras cerebrais foram, então, homogeneizadas em tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 6,5) em uma diluição 1:10. Uma parte do homogenato foi utilizada para determinar os níveis de GSH e a outra foi centrifugada a 6000 rotações por minuto (rpm) em uma microcentrífuga refrigerada de alta velocidade (VS-15000 CFNII, Vision Scientific, Daejeon, Coréia do Sul) durante 20 minutos. O sobrenadante foi utilizado para avaliar a LPO.
6.8.2 Avaliação dos níveis de glutationa reduzida
Para avaliar os níveis de GSH, 100 μl do homogeneizado foram misturados com 80 μl de ácido tricloroacético 12,5% e centrifugados a 6000 rotações por minuto (rpm) durante 15 min a 4ºC. Em seguida, foram acrescentados 20 μl do sobrenadante com 280 μl de tampão Tris (0,4 M, pH 8,9) e 5 μl de DTNB (ácido 5,5'-ditiobis-[2-nitrobenzóico] ou reagente de Ellman; 0,01 M), de acordo com o protocolo originalmente descrito por Sedlak e Lindsay (1968), com pequenas modificações. A absorbância foi medida usando um leitor de microplacas multi-modo (BioTek Synergy HT, BioTek Instruments, Winooski, VT, EUA). Os valores individuais foram interpolados em uma curva padrão de GSH (0.375-3 μg) para verificar a linearidade da reação (r2 deve ser > 0,99) e os valores foram divididos por um fator de correção. Os resultados estão expressos em μg/g de tecido, representando a quantidade de GSH (μg) no tecido (g).
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6.8.3 Avaliação da peroxidação lipídica
A peroxidação lipídica foi medida de acordo com o método descrito por Jiang et al. (1992), com algumas modificações. Inicialmente, 100 μl do sobrenadante foram suspensos em 100 μl de metanol, vortexados e centrifugados a 5000 rpm durante 5 minutos a 4ºC. Posteriormente, foram adicionados 100 μl do sobrenadante a 900 μl de reagente FOX2 (reagente de Wolff, BHT 4 mM, FeSO4 250 μM, H2SO4 250 mM e laranja de xilenol 100 mM). As amostras foram, então, submetidas a vortex e incubadas durante 30 min a temperatura ambiente no escuro. A absorbância foi obtida por um leitor de microplacas multi-modo (BioTek Synergy HT, BioTek Instruments, Winooski, VT, EUA). Os resultados estão descritos como mmol de hidroperóxidos/mg de tecido.
6.9 Análise Estatística
Para todos os experimentos, os dados foram analisados por ANOVA de duas vias, tendo como fatores ouabaína (ouabaína ou veículo) e tratamento 1 (veículo, quercetina ou risperidona/ ácido valpróico), seguido do teste de Newman-Keuls, exceto no experimento para comparação de camundongos operados e não operados, em que foi empregado o teste t de Student. Os dados estão expressos como média ± SEM. Os valores de p <0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
7 RESULTADOS
7.1 Efeitos da administração aguda de quercetina no teste da caixa de
locomoção automatizada e no teste do campo aberto após administração ICV de ouabaína
O tratamento com quercetina nas duas doses utilizadas foi capaz de bloquear o efeito hiperlocomotor da ouabaína, em doses que não alteram a locomoção per se, demonstrando seu efeito tipo antimaníaco quando administrada antes da injeção ICV de ouabaína (figura 11). Importante ressaltar que este padrão comportamental foi também exibido pela risperidona, utilizada como controle positivo. Os dados da ANOVA podem ser observados no ANEXO I.
FIGURA 11: Efeito da administração aguda de quercetina (10 e 40 mg/kg, IP) e da risperidona (1 mg/kg, IP) na atividade locomotora em camundongos submetidos à injeção i.c.v. de ouabaína (10-4 M)
no Caixa de Locomoção Automatizada. Os valores estão expressos como média + E.P.M. (n = 6). *P< 0,05 quando comparados com o grupo veículo+CMC.
No teste do campo aberto, a ouabaína induziu aumento da atividade locomotora e a quercetina 10 mg/kg bloqueou a hiperlocomoção induzida pela ouabaína não alterando a locomoção espontânea (figura 12). A quercetina 40 mg/kg apresentou apenas uma tendência em bloquear o efeito da ouabaína. A risperidona bloqueou a hiperlocomoção induzida por ouabaína, mas reduziu a locomoção espontânea.
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FIGURA 12: Efeito da administração aguda de quercetina (10 e 40 mg/kg, IP) e da risperidona (1 mg/kg, IP) na atividade locomotora em camundongos submetidos à injeção i.c.v. de ouabaína (10-4 M)
no Campo Aberto. Os valores estão expressos como média + E.P.M. (n = 6). + p<0,05 e (+) .10>p>0,05 em relação à ouabaína+ CMC; *p<0,05 e ***p<0,001 em relação ao grupo veículo+CMC.
7.2 Efeitos da administração repetida de quercetina no BPM após administração ICV de ouabaína
O tratamento com quercetina nas duas doses utilizadas foi capaz de bloquear o efeito hiperlocomotor da ouabaína (Figura 13A). Este padrão comportamental também foi exibido pelo ácido valpróico, utilizada como controle positivo neste experimento. Com relação ao comportamento exploratório, caracterizado pelo número de visitas aos orifícios do equipamento, não houve efeito significativo no fator tratamento e na interação, mas ocorreu diferença no fator ouabaína. Camundongos tratados com ouabaína apresentaram redução no número de visitas aos orifícios (Figura 13B) independente do tratamento com quercetina ou ácido valpróico. Referente ao comportamento de rearing, não houve efeito da ouabaína ou dos tratamentos. (Figura 13C).
FIGURA 13: Efeito da administração repetida (14 dias) de quercetina (10 e 40 mg/kg, IP) e do Ácido Valpróico (200 mg/kg, IP) em camundongos submetidos à injeção ICV de ouabaína (10-4 M)
testados no Monitor de Padrão Comportamental (BPM). (A) atividade locomotora; (B) visitas nos orifícios; (C) rearings. CMC: carboximetilcelulose. Os valores estão expressos como média + E.P.M. (n = 6); *** p<0,001 em relação ao grupo veículo CMC + veículo; +++ P< 0,001 em relação ao grupo CMC + ouabaína; # P<0,05 em relação ao fator veículo.
7.3 Efeitos da administração repetida de quercetina nos níveis de glutationa após administração ICV de ouabaína
A administração de ouabaína ICV, independente do tratamento com quercetina 10 ou 40 mg/kg, aumentou os níveis de GSH no CPF dos animais (fig. 14A). No hipocampo, todos os grupos exibiram um aumento nos níveis de GSH (Fig. 14B) em comparação com o grupo CMC. Já no estriado, camundongos submetidos à injeção ICV de OUA exibiram um aumento nos níveis de GSH. A quercetina 10 mg/kg acarretou um aumento dos níveis de GSH tanto em camundongos que
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receberam veículo ou OUA ICV. Já os tratados com quercetina 40 mg/kg mais ouabaína não diferiram dos grupos tratados com veículo.
G S H C P F 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 v e íc u lo o u a b a ín a C M C Q u e r c e tin a 1 0 Q u e r c e tin a 4 0 µ g G S H /g d e t e c id o # # A G S H H IP O 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 v e íc u lo o u a b a ín a µ g G S H /g d e t e c id o * * * * * * * * * * B G S H E S T 0 5 0 1 0 0 1 5 0 µ g G S H /g d e t e c id o o u a b a ín a v e íc u lo * * * * ( *) * * C
FIGURA 14: Efeito da administração repetida de quercetina (Q; 10 e 40 mg/kg, IP) na GSH no córtex pré-frontal (A), hipocampo (B) e estriado (C) em camundongos que foram ou não submetidos á injeção ICV de OUA. Os dados são expressos como média ± SEM. n = 6 camundongos / grupo. **p <0,05, comparado com camundongos tratados com T80 e CMC; ##p <0,05, comparado com camundongos submetidos à injeção ICV de OUA e tratados com CMC.
7.4 Efeitos da administração repetida de quercetina na peroxidação lipídica após administração ICV de ouabaína
No CPF, os animais tratados com quercetina nas doses de 10 e 40 mg/kg, independente da administração ICV de ouabaína ou veículo, apresentaram um aumento nos níveis de LPO quando comparado ao grupo CMC (Fig. 15A). Já no hipocampo (Fig. 15B) e no estriado (Fig. 15C), é possível observar uma tendência de diminuição dos níveis de LPO em animais tratados com quercetina 10 mg/kg e veículo, quando comparados ao grupo CMC em animais que receberam veículo.
L P O C P F 0 5 0 1 0 0 1 5 0 C M C Q u e r c e tin a 1 0 Q u e r c e tin a 4 0 [h id r o p e r ó x id o s ] (n m o l. m in -1 .g t e c id o -1 ) v e íc u lo o u a b a ín a x x A L P O H IP 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 v e íc u lo o u a b a ín a [h id r o p e r ó x id o s ] (n m o l. m in -1 .g t e c id o -1 ) ( *) B L P O E S T 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 v e íc u lo o u a b a ín a [h id r o p e r ó x id o s ] (n m o l. m in -1 .g t e c id o -1 ) ( *) C
FIGURA 15: Efeito da administração repetida de quercetina (Q; 10 e 40 mg/kg, IP) na LPO no córtex pré-frontal (A), hipocampo (B) e estriado (C) em camundongos que foram ou não submetidos á injeção ICV de OUA. Os dados são expressos como média ± SEM. n = 6 camundongos/grupo. *p <0,05, comparado com camundongos tratados com T80 e CMC; #p <0,05, comparado com camundongos submetidos à injeção ICV de OUA e tratados com CMC.
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8. DISCUSSÃO
Os resultados do presente estudo indicam que a administração de quercetina produz um efeito tipo antimaníaco em um modelo animal de mania induzido pela injeção ICV de ouabaína em camundongos, pois foi capaz de prevenir a hiperlocomoção induzida nos camundongos, sem interferir na locomoção espontânea. Além deste potencial efeito tipo antimaníaco da quercetina, pudemos também confirmar que o modelo de hiperlocomoção induzida por ouabaína pode ser reproduzível em camundongos. Até recentemente, este modelo, desenvolvido originalmente em ratos, era considerado irreprodutível em camundongos (HODES et al., 2016). Interessante notar que efeito de hiperlocomoção não parece ser provocado pelo procedimento cirúrgico, nem pela ação do veículo utilizado na dissolução da ouabaína. A reversão da hiperlocomoção pela administração aguda de risperidona e repetida de ácido valpróico indica a sensibilidade do modelo às drogas antimaníacas. Entretanto, a risperidona também induziu efeito depressor geral, como observado anteriormente com o haloperidol em ratos (EL-MALLAKH et al., 2006). Além disso, a risperidona também apresenta efeitos antipsicóticos enquanto o ácido valpróico efeitos anticonvulsivantes, havendo, portanto, a necessidade de complementação da validação farmacológica com outras drogas antimaníacas mais seletivas para a mania, como o lítio. O valor preditivo negativo também deve ser avaliado, ou seja, drogas que não possuem efeito antimaníaco na clínica (p.ex. topiramato) não devem ser efetivas no modelo.
A hiperlocomoção induzida pela OUA tem sido associada a uma desregulação no sistema antioxidante, levando ao aumento da peroxidação lipídica e alterações em enzimas antioxidantes no córtex pré-frontal e no hipocampo de ratos Wistar (DAL-PONT et al., 2019). Um aumento da peroxidação lipídica no córtex pré-frontal e no hipocampo de ratos pode ser observada em 7, 9 e 14 dias após uma única administração de OUA. No presente estudo observou-se que a ouabaína acarretou um aumento da GSH no córtex pré-frontal, que pode ser interpretado como um mecanismo de defesa contra o aumento do estresse oxidativo. Nesta linha, a ausência de aumento da peroxidação lipídica pela ouabaína indicaria a efetividade deste mecanismo. Portanto, estes dados iniciais indicariam algumas diferenças no estresse oxidativo do modelo de mania pela ouabaína em ratos e camundongos. A
quercetina aumentou os níveis de GSH no hipocampo e apresentou uma tendência de redução da peroxidação lipídica no hipocampo e estriado mesmo sem a administração de ouabaína (Fig. 14B, Fig. 15 B e C). Estes dados podem corroborar o efeito antioxidante da quercetina no SNC; entretanto, a quercetina aumentou a peroxidação lipídica no córtex pré-frontal independentemente da administração de ouabaína (Fig. 15A). De qualquer modo, os dados sugerem que, pelo menos no modelo da ouabaína, o efeito tipo-antimaníaco da quercetina não seria mediado por um efeito antioxidante. Interessante notar que a quercetina também apresenta efeito inibidor da proteína quinase C (PKC) (GAMET-PAYRASTRE et al., 1999), efeito também apresentado pelo lítio, ácido valpróico e tamoxifeno, drogas com ação antimaníaca (SAXENA et al., 2017). Nesta linha, existe a proposta de que a PKC tenha papel relevante na fisiopatologia do episódio maníaco e que esta mediação envolveria o sistema dopaminérgico. Nos estudos recentes de adaptação do modelo da ouabaína para camundongos, observou-se uma possível mediação dopaminérgica (KURAUCHI et al., 2019; LOPACHEV et al., 2019). A identificação de biomarcadores específicos, que representam processos fisiopatológicos que diferem o transtorno bipolar da depressão unipolar podem auxiliar na definição do diagnóstico de transtorno bipolar e fornecer alvos biológicos para o desenvolvimento de tratamentos novos e personalizados(PHILLIPS et al., 2013).
Em termos de translação destes resultados para a clínica, é interessante notar que a quercetina é um flavonóide amplamente estudado na clínica, apresentando efeitos anti-hipertensivos (MARUNAKA et al., 2017), propriedades antinflamatórias, antioxidantes e antidiabéticas (OBOH; ADEMOSUN; OGUNSUYI, 2016), além de auxiliar no tratamento da obesidade e diabetes (PORTILLO et al., 2011) e na recuperação de dano muscular induzido por exercício excêntrico (BAZZUCCHI et al., 2019). Estudos de fase II comprovaram a eficácia da quercetina combinada com outros tratamentos no tratamento de rinite alérgica em crianças (MARSEGLIA et al., 2019) e potencial redução de células carcinogênicas do intestino (CHALET et al., 2018), efeitos que parecem estar ligados a seus potenciais antinflamatórios e antioxidantes. Considerando esses estudos clínicos, que pressupõem estudos de farmacocinética e toxicidade no ser humano, a quercetina apresentaria um caminho mais curto para implementação de estudos clínicos com pacientes maníacos, inicialmente em conjunto com medicamentos já utilizados na
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clínica, com a possibilidade de auxiliar em tratamentos disponíveis atualmente. Outro aspecto interessante da quercetina é que estudos pré-clínicos indicam um potencial efeito tipo-antidepressivo (BHUTADA et al., 2010), o que abriria a possibilidade da quercetina ser um estabilizador no humor no transtorno bipolar.
9 CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS
A quercetina produziu efeito tipo antimaníaco específico em um modelo animal de mania induzido por ouabaína em camundongos, tanto de forma aguda quanto da forma repetida, indicando ausência de tolerância ao efeito tipo antimaníaco com a administração repetida. A reversão da hiperlocomoção induzida por ouabaína pela quercetina foi observada em diferentes ambientes experimentais (caixa de locomoção, campo aberto e BPM), indicando que este efeito não é restrito a uma configuração experimental específica. Além disso, seu efeito no modelo de mania empregado neste estudo é qualitativamente comparável ao apresentado pelo ácido valpróico e pela risperidona, fármacos clinicamente eficazes no tratamento do transtorno bipolar. Finalmente, os resultados indicam a validade da versão de camundongos do modelo de mania induzido pela ouabaína.
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