RENATA LOPES ARAUJO
AVALIAÇÃO DO USO DE L-TIROXINA
PARA O CONTROLE DO SOBREPESO
DURANTE A RESTRIÇÃO ALIMENTAR EM
RATOS
TESE SUBMETIDA AO INSTITUTO DE BIOFÍSICA CARLOS CHAGAS FILHO DA UNIVERSIDADE FERDERAL DO RIO DE JANEIRO PARA OBTENÇÃO
DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (FISIOLOGIA)
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
Universidade Federal do Rio de Janeiro
2005
Livros Grátis
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Este trabalho foi realizado no Laboratório de Fisiologia Endócrina do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro sob a orientação da professora Denise Pires de Carvalho, com apoio financeiro concedido pela Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX-MCT).
FICHA CATALOGRÁFICA
Araujo, Renata Lopes
Avaliação do uso de L-tiroxina para o controle do sobrepeso durante a restrição alimentar em ratos.
Rio de Janeiro, UFRJ, 2005.
xi: 65
Orientadora: Denise Pires de Carvalho
Tese de Mestrado para obtenção do Grau de Mestre em Ciências Biológicas (Fisiologia)
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho 1- Restrição alimentar
2- Hormônios tireoideanos 3- Leptina
Dedico este trabalho aos grandes
contribuidores da minha história de
vida: “Serjão e Silvinha” (meus pais).
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Denise Pires de Carvalho, que procurou despertar meus “poderes interiores”, não entregando de maneira fácil, as respostas que procurava. Soube me estimular com sua maravilhosa capacidade de ensinar. Obrigada pelas palavras sábias e amigas.
À professora Doris Rosenthal, por ser o maior exemplo de amor e dedicação à ciência, inspirando-me a prosseguir na vida científica.
Às professoras Tânia Ortiga e Vânia Costa, que me apresentaram à fisiologia endócrina durante a graduação e me estimularam a entrar no laboratório.
À professora Tamar Frankenfeld, que me incentivou a lecionar presenteando-me com suas turmas de graduação.
À professora Patrícia Rocco, que colaborou com esta tese, revisando-a com muita competência.
Às amigas Natália Lourival e Raquel Campos, que se empenharam com muita competência para a concretização deste trabalho.
Às grandes companheiras de trabalho Michelle Marassi e Renata Grozovsky, que me ajudaram demais na fase final. Foram muitas “madrugadas” de radioimunoensaios, desiodases e extrações de RNA.
Aos demais amigos de laboratório que de maneira individual contribuíram para a realização deste estudo: Alba Cenélia, Andrea Freitas, Camilla Brito, Débora Galvão, Elaine Cristina, Flávia Nóbrega, Glória Ginabreda, Lívia de Lima, Luciene Cardoso, Márcia Figueiredo, Nathércia
Percegoni, Rodrigo Fortunato, Sabrina Coelho, Thiago Pantaleão, Valmara Pereira.
Aos meus amigos e técnicos do laboratório, Advaldo Nunes, Norma de Araújo e Wagner Nunes, por todo o apoio técnico de excelente qualidade e pelo constante carinho em nosso convívio. Waguity, seus toques artísticos são sempre especiais, muito obrigada.
Aos meus queridíssimos pais e irmãos que me acompanharam nesta etapa de vida, sempre com muito amor. Mãe, obrigada pela constante preocupação com a minha alimentação! Fê, sua ajuda foi espetacular. Valeu maninha!
Aos meus familiares, familiares de coração (do meu namorado) e amigos que souberam compreender minha ausência em muitos momentos dos finais de semana e até dos eventos sociais.
Ao amor da minha vida não teria palavras para agradecer todo o companheirismo. Quantas foram às vezes que fomos alimentar os ratinhos nos finais de semana? E todas as economias feitas para me acompanhar nos congressos? Sem falar de quanto teve que me ouvir falar por horas e horas da tese! Obrigada por estar sempre ao meu lado e apoiar o meu trabalho. Lipe, te amo.
E, principalmente, a DEUS, que me permitiu realizar com satisfação este trabalho.
LISTA DE ABREVIATURAS
ACTH – adrenocorticotropic hormone (hormônio adrenocorticotrófico) AgRP – agouti-related peptide (peptídeo relacionado à proteína agouti) AMPc – adenosina monofosfato cíclico
ATP – adenosina trifosfato
BAT – brown adipose tissue (tecido adiposo marrom)
CAR – constitutive androstane receptor (receptor constitutivo de androstano) CRH – corticotropin-releasing hormone (hormônio liberador de corticotrofina) D1 – desiodase tipo 1
D2 – desiodase tipo 2 D3 – desiodase tipo 3
GH – growth hormone (hormônio do crescimento) IMC – índice de massa corporal
Ob-R – ob receptor (receptor de leptina)
Ob-Rb - ob receptor isoform b (isoforma longa do receptor de leptina)
MCH – melanin-concentrating hormone (hormônio concentrador de melanina) MCR – melanocortin receptor (receptor de melanocortina)
MSH – melanocyte-stimulating hormone (hormônio estimulador de α-melanócitos ou melanocortina)
NPY – neuropeptídeo Y POMC - proopimelanocortina
RNAm – ribonucleic acid mesanger (ácido ribonucléico mensageiro) rT3 – 3, 3,’ 5’triiodotironina
STAT – signal transducers and activators of transcription (sinal ativador de transcrição e tradução)
SNC – sistema nervoso central SULTs - sulfotransferases TMB – taxa metabólica basal
TSH – thyroid stimulating hormone (hormônio estimulador da tireóide ou tireotrofina)
TSH-R – receptor de TSH T3 – 3, 5, 3’ triiodotironina
T4 – 3, 5, 3’, 5 tetraiodotironina ou tiroxina
TR – thyroid hormone receptor (receptor de hormônio tireoideano) UGTs – uridinas difosfato-glicuronosiltransferases
RESUMO
A obesidade é considerada uma epidemia mundial. O risco aumentado de morbidade e mortalidade associado à obesidade tem sido alvo de muitos estudos. A restrição alimentar determina perda de peso corporal e reverte o quadro de obesidade. Todavia, durante o processo de emagrecimento, mecanismos homeostáticos operam para resistir à perda de peso. A redução na taxa metabólica basal, determinada, em parte, pela redução dos hormônios tireoideanos, contribui para essa resistência. O objetivo desse estudo foi avaliar o uso de L-tiroxina (T4, 1,0 e 5,0 µg/100 g p.c.) para o controle do sobrepeso durante a restrição alimentar (60% da ad libitum) em ratos. Para tal avaliou-se peso corporal, gordura retroperitoneal, concentração sérica de T3, T4 e leptina e atividade enzimática da desiodade tipo 1 (D1). Ratos Wistar que desenvolvem, espontaneamente, obesidade com a idade foram separados em dois grupos, por idade, sendo classificados como controle (3 meses) e sobrepeso (6 meses). A restrição alimentar foi eficaz em conduzir à perda de peso e de gordura corporais, porém o T4 não foi capaz de potencializar o efeito da restrição durante a perda de peso corporal. Apenas a dose de 5,0 µg de T4 determinou significativa redução de gordura retroperitoneal. Durante a restrição, houve significativa redução da atividade da D1 e o T4 exógeno reverteu a atividade desta enzima. Esses resultados sugerem que a resistência à perda de peso, mesmo após a administração de T4, pode ser determinada pela mudança na metabolização periférica dos hormônios tireoideanos.
ABSTRACT
Obesity is considered a world-wide epidemia. The increased risk of morbidity and mortality associated with obesity has been described by several studies. Food restriction determines loss of weight and overcomes the obesity disorders. However, during caloric restriction weight loss resistance occurs probably due to homeostatic mechanisms that operate to resist further loss of weight. The reduction in basal metabolic rate, in part determined by a decrease in thyroid hormones levels, contributes to this resistance. Wistar rats, which progressively develop obesity with ageing, were used and separated into two groups: control (3 months) and overweight (6 months). The aim of this study was analyze the effects of T4 administration (1.0 and 5.0 µg/100 g b.w.) in overweight rats submitted to food restriction (60% of food intake). So, we evaluated body weight, retroperitoneal fat, serum levels of T3, T4 and leptin and the activity of hepatic type 1 deiodinase (D1). Food restriction leads to significantly reduced body weight and retroperitoneal fat, however T4 administration did not potentiate the effects of food restriction. Only 5.0 µg of T4 determined significant reduction in retroperitoneal fat. During food restriction, there was a significant reduction in hepatic D1 activity and T4 normalized the activity of this enzyme. Our results suggest that serum T4 normalization during food restriction is not sufficient to promote further weight loss, probably due to changes in the peripheral metabolism of thyroid hormones.
SUMÁRIO
Lista de abreviaturas vii
Resumo ix Abstract x Sumário xi INTRODUÇÃO 1 I. Obesidade: epidemiologia, diagnóstico, métodos e fundamentos 1
Índice de massa corporal 2 II. Balanço energético 4 Termogênese obrigatória 6
Termogênese facultativa 6
III. Fatores envolvidos na gênese da obesidade 7
Fatores ambientais 7
Fatores genéticos 8
IV. Repercussões endócrinas da obesidade 9 IV.1 Hormônios tireoideanos 10
Desiodase tipo 1 13 Desiodase tipo 2 16 Desiodase tipo 3 17 IV.2 Leptina 18 Os genes ob e db 19 Regulação da síntese 21
O papel da leptina na homeostase energética 22 OBJETIVOS 27
METODOLOGIA 28
I. Tratamento dos animais 28
I.1 Restrição alimentar 28
I.2 Controle do peso corporal 29
I.3 Administração de T4 29
I.4 Coleta de sangue 30
II. Sacrifício dos animais 31
III. Análises 32
III.1 Radioimunoensaios 32
T3 e T4 32
Leptina 32
III.2 Atividade da enzima iodotironina desiodase tipo 1 (D1) 33
Purificação do rT3 – 125I 33
Ensaio da atividade de D1 34
IV. Análise estatística 35
RESULTADOS 36
I. Peso corporal e de gordura retroperitoneal 36 II. Concentrações séricas hormonais 42
III. Atividade da enzima D1 no fígado 48
DISCUSSÃO 50
INTRODUÇÃO
A obesidade é provavelmente uma das enfermidades metabólicas mais antigas que se conhece. Pinturas e estátuas em pedra com mais de 20 mil anos já representavam figuras de mulheres obesas. As mesmas evidências foram vistas em múmias egípcias, pinturas e porcelanas chinesas da era pré-cristianismo, em esculturas gregas e romanas e, mais recentemente, em vasos dos maias, astecas e incas na América pré-colombiana (Repetto, 1998).
Ainda no século XXI, os mecanismos moleculares envolvidos na gênese do excesso de peso são obscuros e desencadeiam grande interesse na busca de soluções para um problema de abrangência mundial.
I - OBESIDADE: EPIDEMIOLOGIA, DIAGÓSTICO, MÉTODOS
E FUNDAMENTOS
A prevalência da obesidade aumentou consideravelmente nos últimos anos nos países industrializados. Dados da National Health and Nutrition
Examination Survey indicam que, aproximadamente, 20% das crianças
americanas e 1/3 (58 milhões) dos americanos adultos são obesos. Na Inglaterra, a proporção de obesos duplicou entre 1980 e 1990. No Brasil, o percentual de indivíduos obesos aumentou de 4,7% para 6,9% em homens e de 12% para 12,5% em mulheres (Villares, 1998).
A obesidade inexoravelmente aumenta o risco de mortalidade, pois se associa à alta prevalência de doenças cardiovasculares (coronariopatias, hipertensão arterial, trombose venosa), alterações metabólicas (diabetes, dislipidemias), afecções pulmonares, renais, biliares e, a certos tipos de neoplasias. Essas evidências tornam a obesidade um enorme problema de Saúde Pública, cujos custos apresentam progressão assustadora (Villares, 1998).
No Brasil, as poucas análises existentes não nos permitem realizar um cálculo de custos fidedignos. No entanto, podemos afirmar que o custo é alto e tende a aumentar, à semelhança do resto do mundo (Monteiro CA, 1998).
Define-se obesidade como excesso de gordura corporal relacionado à massa magra. A obesidade coincide com o aumento do peso, embora esta condição possa eventualmente não estar presente. De modo inverso, nem todo aumento de peso está relacionado à obesidade (Monteiro CA, 1998).
Em 1983, o National Center for Health Statistical (NCHS) distinguiu excesso de peso de obesidade, esclarecendo que o primeiro refere-se a um excesso de peso para a altura, enquanto obesidade é um excesso de massa gordurosa relacionada à massa magra. Excesso de peso, assim, não significa excesso de gordura, ainda que muitas vezes se tenha utilizado esse termo neste sentido (Monteiro JC, 1998).
Diagnosticar e avaliar a obesidade significa conhecer a composição corporal. Os métodos mais utilizados são as aferições do peso corporal e, especialmente, o Índice de Massa Corporal (IMC). Também é importante caracterizar a distribuição da gordura, já que em igual grau de obesidade o risco metabólico é maior se a gordura localiza-se na região central e/ou superior do corpo. Para avaliar a distribuição da gordura, são úteis as medidas: relação cintura/quadril e perímetro do quadril (Monteiro JC, 1998), além de técnicas mais recentes como a tomografia computadorizada de abdômen.
Índice de Massa Corporal (IMC):
Caracteriza-se pelo uso prático, simples, reprodutível, com valor diagnóstico e prognóstico. Atualmente, é um dos meios diagnósticos mais utilizados, todavia, o IMC pode se encontrar elevado na ausência de obesidade, em atletas com importante desenvolvimento muscular, ou em pacientes com edema, etc.
É calculado dividindo-se o peso, expresso em quilogramas, pela altura, expressa em metros, elevada ao quadrado:
IMC = Peso (Kg) Altura2 (m)
Costuma-se classificar a obesidade em classes, determinadas pelo valor do IMC. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), o sobrepeso e a obesidade são classificados conforme os valores demonstrados na tabela 1.
Classificação IMC (kg/m2) Baixo peso < 18,5 Peso normal 18,5 – 24,9 Excesso de peso ≥ 25,0 - sobrepeso 25,0 – 29,9 - obeso classe I 30,0 – 34,9 - obeso classe II 35,0 – 39,9 - obeso classe III ≥ 40,0
Tabela 1 – Classificação do IMC pela OMS/98 (Adaptado de Monteiro JC, 1998).
O IMC tem sido utilizado para avaliar o risco de morbi-mortalidade derivado da obesidade. Esse risco pode ser ainda maior se o excesso de peso coexiste com algumas das seguintes situações ou fatores de risco:
Relação cintura/quadril ou perímetro da cintura elevados; Diabetes mellitus ou resistência à insulina;
Hipertensão arterial;
Hiperlipidemia ou dislipidemia; Hipertrofia ventricular esquerda; Apnéia do sono ou elevação do PCO2;
Hisurtismo ou elevada relação entre o hormônio luteinizante e folículo estimulante;
Tabagismo.
A obesidade em humanos e roedores é usualmente associada com a distribuição de gordura corporal. O predomínio de tecido adiposo na região abdominal é um fator de risco à saúde que se correlaciona diretamente com o surgimento de anormalidades metabólicas (Monteiro JC, 1998).
Em humanos, utilizam-se os valores numéricos das medidas da relação cintura/quadril (valores superiores a 1,0 para os homens e 0,85 para as mulheres) ou apenas o perímetro da cintura (valores superiores a 102 cm para os homens e 88 cm para as mulheres) como indicadores de risco. O aumento da reserva lipídica estocado sob a forma de triglicerídeos na região intra-abdominal (retroperitoneal) é comumente associado a um conjunto de doenças metabólicas, como diabetes tipo 2, hipertensão arterial, dislipidemias e doenças cardiovasculares. Esta síndrome tem sido denominada “síndrome X”, “síndrome metabólica” ou “síndrome de resistência à insulina” (Reaven, 1994). Os componentes dessa síndrome são caracterizados por hiperinsulinemia e diferentes intensidades teciduais de resistência à insulina, que explicam a relação entre várias anormalidades e a obesidade (Reaven, 1994).
Similarmente ao observado em humanos, constatou-se que nos ratos da linhagem Wistar, o acúmulo excessivo de tecido adiposo também está associado à presença de alterações metabólicas como à resistência à insulina e à leptina (Carvalheira e cols., 2001).
Nos ratos machos, a gordura corporal pode ser estocada em quatro regiões (epididimal, mesentérico, subcutâneo e retroperitoneal) que apresentam composição e celularidade diferentes. O aumento da reserva adiposa é modulado por essa diferença regional. Recentemente, foi demonstrado que a prole lactente de ratas tratadas com leptina, durante os três últimos dias de lactação, apresenta o dobro de tecido retroperitoneal comparado aos outros tecidos adiposos (Lins e cols., 2005).
II- BALANÇO ENERGÉTICO
A sobrevivência dos inúmeros organismos é dependente da capacidade de procurar, usar e conservar energia eficientemente. Humanos e outros mamíferos possuem complexos mecanismos desenvolvidos para manter constante o suporte energético necessário ao funcionamento celular.
A cada refeição, consumimos calorias (energia) a mais do que seriam requeridas para o uso imediato de nossas necessidades metabólicas. O excesso ingerido é estocado, principalmente como gordura, para uso posterior, em situações de restrição ou privação de alimentos. A capacidade quase que ilimitada dos estoques de gordura e as eficientes respostas neuroendócrinas e metabólicas nos resguardam da depleção total dos estoques energéticos durante o jejum. Desse modo, é concebível que a atual epidemia da obesidade seja o resultado conjunto de uma ingestão alimentar exagerada associada à alta eficiência energética (Ahima, 2000).
Os mecanismos fisiopatológicos que levam ao aumento de peso e estoque excessivo de massa gordurosa são parcialmente identificados. Sabe-se que a obesidade resulta do desequilíbrio crônico entre a ingestão alimentar e o gasto energético, conduzindo a um balanço energético positivo.
A balança energética é mantida segundo os princípios da termodinâmica. A reserva energética proveniente da ingestão alimentar (aporte energético) deve ser igual ao gasto energético.
BALANÇO EQUILIBRADO → APORTE ENERGÉTICO = GASTO ENERGÉTICO
A energia dispendida diariamente relaciona-se com as termogêneses obrigatória (taxa metabólica basal) e facultativa (efeito térmico do alimento, exposição ao frio, atividade física) (Ravussin & Walder, 1998).
Em todos os animais, pode haver liberação de calor quando há transformação da energia em seus vários estados. A energia química, por exemplo, contida nos substratos energéticos (alimentos) é liberada lentamente durante a oxidação de açúcares e gorduras, sendo armazenada temporariamente na forma de ATP. A partir de então, através de hidrólise do ATP ocorre um novo processo de transformação energética resultando em trabalho biológico (transporte de íons, síntese de proteínas, contração muscular, etc), neste caso uma parte de energia é liberada na forma de calor. Essa aparente ineficiência termodinâmica, no entanto, desempenha importante papel no
controle da temperatura corporal dos organismos (homeotermia), otimizando o funcionamento das células, dos tecidos e sistemas (Bianco, 2000).
Termogênese obrigatória (Taxa Metabólica Basal -TMB):
A taxa metabólica basal (TMB) é definida como o somatório de todo o calor produzido no organismo em repouso, sendo, portanto, a energia gasta por um indivíduo em repouso no leito, pela manhã, em estado de jejum sob condições ambientais confortáveis. A TMB corresponde à manutenção dos sistemas integrados e da temperatura homeotérmica em repouso, contribuindo com aproximadamente 60% do gasto energético diário em um indivíduo de 70 Kg (Ravussin & Walder, 1998).
Termogênese facultativa:
Define-se termogênese facultativa como todo o calor produzido além da TMB, como resultado do aumento do turnover de ATP.
Pode ser dividida em termogênese derivada de tremor e não derivada de tremor. A termogênese facultativa tem intensidade variável, pois é dependente da magnitude do estímulo desencadeador. Pode ser induzida por processos involuntários, tais como: o tremor muscular (tiritação) associado à exposição ao frio e à digestão após uma dieta hipercalórica ou ainda ser derivada de processos voluntários, tais como: a contração muscular durante atividades diárias mínimas ou à prática de esportes (Bianco, 2000).
O efeito térmico do alimento como forma de termogênese contribui para aproximadamente 5%-15% dos gastos energéticos diários. Muitos fatores influenciam o efeito térmico do alimento: o tamanho da refeição e sua composição, a palatabilidade do alimento, a hora da refeição, bem como a constituição genética do indivíduo, idade, forma física e sensibilidade à insulina. Estas influências, e ainda os aspectos técnicos, como a posição do indivíduo e a duração da refeição, tornaram o efeito térmico do alimento o componente mais difícil de ser medido e o menos reprodutível (Ravussin & Walder, 1998).
A atividade física é o componente mais variável do gasto diário de energia, contribuindo de forma importante para a redução de peso corporal em pessoas muito ativas. No entanto, adultos sedentários exibem uma faixa de atividade física que representa somente 20%-30% do gasto energético total. A atividade física reduzida como causa da obesidade é hipótese óbvia e atraente. A energia gasta durante uma atividade física é bem variável e o aumento secular da obesidade é paralelo ao estilo de vida sedentário (Ravussin & Walder, 1998).
III- FATORES ENVOLVIDOS NA GÊNESE DA OBESIDADE
Embora os excessos alimentares e o sedentarismo (fatores ambientais) estejam envolvidos no aumento global da prevalência da obesidade, há muitas evidências de que a genética contribua substancialmente para a regulação do peso corporal. Acredita-se que a dieta ocidental e o estilo de vida sedentário favoreçam o desenvolvimento da obesidade nos indivíduos geneticamente predispostos (Isomaa e cols., 2001). A obesidade não é uma doença singular, e sim um grupo heterogêneo de condições com múltiplas causas que, em última análise, refletem no fenótipo obeso (Jebb, 1999).
A rede de vias neuroquímicas hipotalâmicas que controla a ingestão alimentar e o gasto energético está por trás da base genética da obesidade (Jebb, 1999), que ainda não esta bem esclarecida.
Fatores ambientais:
O início da manutenção de um balanço energético positivo relativo às necessidades do organismo pode ser conseqüência tanto do aumento na ingestão calórica, como da redução no gasto calórico total, ou dos dois fatores combinados (Pereira e cols., 1999).
O processo de modernização e a transição econômica que se tem observado na maioria dos países têm promovido alterações na industrialização da produção alimentícia e contribuindo para o consumo de dietas ricas em lipídeos e conseqüentemente, hipercalóricas (Pereira e cols., 1999).
Em animais, a alimentação hiperlipídica é um componente importante na etiologia da obesidade, já que as dietas ricas em lipídeos comprovadamente levaram ao excesso de gordura corporal em macacos, cães, suínos, esquilos, hamsters e ratos (Willet, 1998).
Além das mudanças na composição da dieta, atualmente, há maior disponibilidade de alimentos prontos para o consumo, enquanto a demanda energética da vida moderna tem diminuído drasticamente através do uso de transportes motorizados e equipamentos mecanizados (Pereira e cols., 1999).
Desse modo, o sedentarismo e os hábitos nutricionais parecem representar o principal fator de risco no desenvolvimento da obesidade mundial (Pereira e cols., 1999).
Fatores genéticos:
As formas monogênicas de obesidade humana são exceção. Os artigos de atualização anual do mapa genético da obesidade de Pérusse e cols., 1996 e Chagnon, Pérusse e Bouchard, 1998, descreveram que este fenótipo faz parte de 24 doenças com transmissão mendeliana. Nove entre essas são autossômicas dominantes, 10 autossômicas recessivas e 5 ligadas ao cromossomo X. Essas doenças são geralmente graves, iniciando-se na infância, associadas a má formações, doenças endócrinas e neuropsiquiátricas (Villares, 1998).
As crianças de pais obesos apresentam risco de se tornarem obesas quando comparadas às crianças cujos pais apresentam peso normal. Se os dois pais são obesos, a criança tem 80% de risco de se tornar obesa. Se o pai ou a mãe é obeso o risco é de 40%. Em uma família em que os pais não são obesos o risco é de 10% (Villares, 1998).
A base genética da obesidade é complexa. Na maior parte dos casos, a obesidade humana não segue a herança mendeliana. Provavelmente, ocorre a interação de vários genes de susceptibilidade (herança poligênica); cada gene, individualmente, apresenta pouco efeito na variância do peso corporal, mas a contribuição cumulativa de vários genes de susceptibilidade torna-se significativa quando ocorre a interação com os fatores ambientais, em particular
em relação à ingestão alimentar e ao exercício físico, destarte predispondo à expressão do fenótipo obesidade (Villares, 1998).
O estudo da obesidade em humanos, provavelmente, responderia muitas dúvidas correntes neste tópico. No entanto, as pesquisas com humanos têm óbvias limitações éticas e financeiras. Além disto, animais de laboratório podem ser mantidos em condições rigidamente controladas consumindo dieta manipulada e mantidos livres de patógenos e germes. O fato de animais de laboratório também se tornarem obesos espontaneamente, se alimentando de ração comercial abriu novas áreas para pesquisa na área da obesidade (Pereira e cols., 1999).
Estudos sobre as causas e tratamentos da obesidade têm sido desenvolvidos em animais que apresentam esta característica através de lesão neural, alterações endócrinas, alimentares e genéticas (Pereira e cols., 1999).
A pesquisa genética, na obesidade, está apenas começando; mais de 21 genes ou regiões candidatas são suspeitos de contribuir com o fenótipo. Nos roedores existem numerosos modelos de obesidade mono e poligênica.
Alguns genes (agouti, ob, db, fat, tubby) que desenvolvem a obesidade monogênica foram clonados em camundongos e em modelos poligênicos, recentemente, foram identificadas várias regiões genéticas que possibilitaram gerar camundongos caracterizados por um grande painel de fenótipos ligados à obesidade (Villares, 1998). Essas formas de obesidade multifatorial demonstram o impacto do meio ambiente alimentar e suas interações com o genótipo. Deste modo, elas ilustram modelos interessantes para as obesidades humanas (Villares, 1998).
IV- REPERCUSSÕES ENDÓCRINAS DA OBESIDADE
O sobrepeso (IMC ≥ 25 Kg/m2) e a obesidade (IMC > 30 Kg/m2)
caracterizam-se pela presença de várias anormalidades no sistema endócrino. Essas modificações podem ser importantes para a patogênese do excesso ponderal ou ser apenas secundárias à crescente elevação do conteúdo e
distribuição da massa adiposa. Portanto, no último caso, as alterações endócrinas secundárias seriam, potencialmente, reversíveis após a redução de peso (Medeiros, 1998). No entanto, a redução de peso em indivíduos obesos não é tão fácil.
Um significativo e desencorajante fator para os que tentam perder peso é a existência de mecanismos homeostáticos que operam na resistência à perda de peso corporal (Spiegelman & Flier, 2001). A maior barreira homeostática é a redução da TMB durante períodos de reduzida ingestão calórica. Os hormônios tireoideanos T3 (triiodotironina) e T4 (tiroxina) são os principais reguladores da taxa metabólica basal. As concentrações séricas desses hormônios apresentam correlação direta com o gasto energético, diminuindo significativamente durante o jejum (LiVolsi, 1989). Todavia, os mecanismos que regulam a função tireoideana e os níveis séricos de hormônios tireoideanos durante a perda de peso ainda não são bem compreendidos.
IV.1- HORMÔNIOS TIREOIDEANOS:
Os hormônios T3 e T4 desempenham papel crítico na diferenciação, no crescimento e no metabolismo celulares. Seus principais efeitos estão vinculados à regulação do consumo de oxigênio e da taxa metabólica, por isso são fundamentais para o funcionamento normal de quase todos os tecidos (Yen, 2001). De acordo com Bianco (2000), os hormônios tireoideanos são os mediadores da homeotermia, pois um dos seus principais efeitos biológicos é a aceleração do metabolismo energético e do turnover de ATP com resultante consumo de energia e produção de calor. Mamíferos com hipotireoidismo, incluindo o ser humano, podem apresentar hipotermia e intolerância ao frio, perdendo parte da capacidade de adaptação ao meio ambiente (Bianco, 2000).
A redução da ingestão calórica (dietas hipocalóricas e/ou jejum) leva ao decréscimo de T3 e T4 séricos com simultânea elevação do T3 reverso (rT3), um derivado metabólico inativo. Esse fenômeno também é observado em pacientes com obesidade mórbida após terem sido submetidos a gastroplastia redutora
(Medeiros, 1998). Admite-se que não só a diminuta entrada de nutrientes, como também a seletiva queda na ingestão de carboidratos sejam determinantes para a diminuição das concentrações de T3 e T4 circulantes (Medeiros, 1998).
A síntese dos hormônios tireoideanos é realizada pela glândula tireóide que se localiza abaixo da cartilagem cricóide e é composta por dois lobos unidos por um istmo, estando aderida às regiões anterior e lateral da laringe e da traquéia (Larsen e cols., 1998). O iodo é essencial para a biossíntese hormonal, sendo necessário que esteja disponível em concentrações adequadas para que quantidades normais de hormônios sejam sintetizadas pelas unidades morfo-funcionais, os folículos (Larsen e cols., 1998).
A tireóide, assim como outras glândulas do sistema endócrino, está sob a regulação do eixo hipotálamo-adenohipófise. A função de todo este complexo é regulada por um modelo básico de retroalimentação negativa envolvendo o hormônio liberador de tireotrofina (TRH) produzido pelo hipotálamo, o hormônio tireotrófico (TSH) produzido pela hipófise e os hormônios tireoideanos (T3 e T4) (Larsen e cols., 1998).
O principal regulador da função tireoideana é o TSH. Células da adenohipófise denominadas tireotrofos são as responsáveis pela síntese e secreção de TSH. O TSH é uma glicoproteína e possui duas cadeias peptídicas, alfa e beta. Para que o TSH possa influenciar a função tireoideana, é necessário que as células foliculares expressem o receptor para este hormônio. O receptor do TSH pertence à superfamília dos receptores acoplados à proteína G: Gs e Gq (Raspe & Dumont, 1992). Assim, quando o TSH liga-se ao seu receptor na membrana das células foliculares, ocorre ativação da adenilato ciclase e, quando em altas concentrações, também há ativação da fosfolipase C (Dumont & Vassart, 2001). Como conseqüência, ocorre uma série de modificações no metabolismo da célula folicular, que leva ao estímulo da produção hormonal e também ao crescimento da glândula (Larsen e cols., 1998)
Existem três hormônios de grande importância no controle da síntese e secreção do TSH: o T3, que têm ação inibitória, o TRH, que apresenta efeito estimulatório, e a somatostatina, que tem ação inibitória.
O TRH é sintetizado como um precursor, o pré-pró-TRH. Após o processamento, há formação do tripeptídeo modificado, o TRH. Quando o TRH liga-se ao seu receptor nos tireotrofos adenohipofisários ocorre estímulo da síntese de ambas subunidades do TSH, assim como do seu processamento pós-traducional (Larsen e cols., 1998). O jejum e as dietas hipocalóricas determinam seletiva diminuição na produção de TRH no núcleo paraventricular que, por sua vez, resulta na diminuição da síntese de TSH. Acredita-se que a aguda redução de leptina, durante situações de privação energética, seja a responsável pela diminuição da síntese de TRH no núcleo paraventricular (Krotkiewski, 2002).
Apesar do TRH agir em balanço com reguladores hipotalâmicos inibitórios, como a somatostatina e a dopamina, os hormônios tireoideanos exercem o controle mais importante do feedback negativo, isto é, são capazes de inibir a secreção de TSH, agindo diretamente nos tireotrofos (Scanlon, 2001).
O principal produto secretado pela tireóide é o T4, no entanto, o T3 é o principal hormônio metabolicamente ativo. Sendo assim, o T4 sofre alterações metabólicas nos tecidos periféricos, gerando T3 na periferia. As enzimas responsáveis por essas alterações são denominadas iodotironinas desiodases, pois catalisam reações de retirada de um iodo por vez das iodotironinas. A família dessas selenoproteínas compreende três subtipos que são as desiodases tipos 1, 2 e 3 (D1, D2 e D3) (Bianco e cols., 2002).
A conversão do T4 a T3 é catalisada pelas enzimas D1 e D2 através da desiodação do anel externo (5’-desiodação). As reações de inativação do T3 e do T4 são catalisadas pelas enzimas D1 e D3 através da desiodação do anel interno (5-desiodação), como demonstrado no esquema da figura 1 (Bianco e cols., 2002). Portanto, a D1 é a única selenodesiodase que funciona como iodotironina desiodase do anel externo e interno, enquanto a D2 apresenta atividade exclusivamente de desiodação externa e a D3 exclusivamente interna (Bianco e cols., 2002).
CH2- CH - COOH NH2 3’ 5’ 5 3 O HO I I I I 3,5,3`,5` - tetraiodotironina (tiroxina, T4) CH2- CH - COOH NH2 5’ O HO I I I CH2- CH - COOH NH2 5 O HO I I I CH2- CH - COOH NH2 5’ 5 O HO I I 3,3`,5` - triiodotironina (T3 reverso) 3,5,3` - triiodotironina (T3) 3,3` - diiodotironina Ativação (D1), D2 (D1), D3 Inativação D1, D2 Inativação (D1), D3
Figura 1 – Esquema representativo das reações de ativação e inativação do T4pelas desiodases tipos 1 (D1), 2 (D2) e 3 (D3) (Adaptado de Bianco e cols., 2002).
Desiodase tipo 1 (D1)
Foi a primeira isoenzima reconhecida através de ensaios bioquímicos de conversão de T4 em T3 e também foi a primeira a ser clonada. Desse modo, há mais conhecimentos bioquímicos sobre a D1 do que sobre as outras enzimas (Bianco e cols., 2002).
A D1 é expressa em diversos tecidos. Em ratos, está presente no fígado, rim, SNC, hipófise, tireóide, intestino e placenta. Em humanos, não há atividade no SNC, mas seu RNAm está presente no fígado, rim, hipófise e tireóide (Bianco e cols., 2002).
A maior parte do T3 plasmático é proveniente da atividade da D1. A provável localização, da D1, na membrana plasmática facilita o acesso do T4 circulante à enzima, assim como a entrada, no plasma, do T3 produzido a partir do T4 (Bianco e cols., 2002).
A síntese da D1 pode ser influenciada por substâncias, agentes ou condições. Os mais potentes reguladores são os hormônios tireoideanos que induzem o aumento da sua atividade, estimulando a transcrição gênica.
Entretanto, a expressão da D1 também sofre influências nutricionais. Em situações de privação de energia como ocorrem no jejum e na restrição alimentar (dietas hipocalóricas) observa-se diminuição do T3 circulante relativo ao T4 e aumento do rT3. Essas alterações podem ser interpretadas como decorrentes de modificações na conversão extra-tireoideana de T4 em T3 pela D1 (Bianco e cols., 2002).
Os mecanismos envolvidos na diminuição da conversão de T4 em T3 durante as situações de privação de energia, podem estar vinculados à menor produção hepática da D1, pois sua síntese é dependente da ingestão mínima de carboidratos (aproximadamente 400 Kcal/dia) (Medeiros, 1998). Há ainda a possibilidade de a D1 catalisar, preferencialmente, a desiodação do anel interno, diminuindo a formação do hormônio ativo (T3) e aumentando a formação do inativo (rT3) (Maglich e cols., 2004).
A metabolização periférica dos hormônios tireoideanos envolve inúmeras outras reações além das desiodações, conforme demonstrado pela figura 2. HO I I CO2H NH2 O I O O I I OH HO HO HO2C CO2H NH2 O I I HO I I CO2H NH2 O I I O I I CO2H NH2 O I I HO3S O I I CO2H NH2 O I HO3S Glicuronase (UGT) T4 D1 Sulfotransferase (SULT) Anel interno Anel externo T4G T4S T3 rT3S
Figura 2 – Esquema representativo do metabolismo periférico dos hormônios tireoideanos. T4–
tiroxina e T3– triiodotironina. T4G– tiroxina glicuronada, T4S– tiroxina sulfatada, D1– desiodase tipo 1, rT3S- triiodotironina reversa sulfatada (Adaptado de Maglich e cols., 2004).
O T4 pode ser o substrato das reações enzimáticas de conjugação fase II que incluem a glicuronação pelas uridinas difosfato-glicuronosiltransferases (UGTs) e a sulfatação pelas sulfotransferases (SULTs).
As UGTs representam uma família (UGT1A e UGT2B) de isoenzimas de membrana localizadas no retículo endoplasmático de tecidos hepáticos e extra-hepáticos. A glicuronação dos hormônios tireoideanos torna-os mais hidrofílicos e, portanto, excretados mais rapidamente através da excreção biliar. A glicuronação dos hormônios tireoideanos determina redução dos níveis de T3 e T4 circulantes (Findlay e cols., 2000).
A sulfatação é uma reação de desintoxicação que aumenta a solubilidade em água de vários compostos (endógenos e exógenos) lipofílicos, facilitando a excreção biliar e/ou urinária. Entretanto, o principal efeito da sulfatação sobre os hormônios tireoideanos é facilitar sua degradação pela D1 (Kester e cols., 1999).
Quando o T4 é sulfatado, a desiodação do anel externo (formação de T3) pela D1 torna-se indetectável, enquanto a atividade de desiodação interna (formação de rT3) aumenta mais de 130 vezes (Maglich e cols., 2004).
Pode-se concluir que o efeito da metabolização periférica hepática dos hormônios tireoideanos é a produção de metabólitos hormonais menos ativos ou mais rapidamente excretados (Mol &Visser, 1985). Todavia, a contribuição do metabolismo conjugativo de sulfatação e glicuronação sobre a regulação dos hormônios tireoideanos ainda é pouco conhecida. Postula-se o envolvimento do receptor constitutivo de androstano (CAR, também nomeado NR1I3 ou NR1I4) (Shiraki e cols., 2003).
O CAR é um receptor órfão nuclear expresso principalmente no fígado, que desempenha importante papel protetor no organismo em resposta ao uso de drogas e moléculas tóxicas (Shiraki e cols., 2003). Maglich e cols., em 2004, afirmaram que este receptor também pode ter efeitos sobre o estresse metabólico e nutricional. Eles demonstraram que durante a restrição alimentar o receptor CAR altera o metabolismo dos hormônios tireoideanos. Esse receptor parece estar envolvido na modulação da expressão dos genes Sult e Ugt das
enzimas sulfotransferases e glicuronases, respectivamente (Maglich e cols., 2004). Camundongos sem o receptor CAR (Car-/-) submetidos à restrição
calórica não apresentaram: a) aumento na expressão dos genes Sult e Ugt, b) reduções significativas nas concentrações séricas de T3 e T4 e c) resistência à perda de peso, contrariamente ao observado nos animais selvagens. Esses dados sugerem que a privação de energia determinada pela redução (dieta) ou ausência (jejum) de ingestão alimentar (calorias/energia) é um sinal reconhecido pelo organismo como estresse. Assim, o receptor CAR protege o organismo modulando o metabolismo dos hormônios tireoideanos (Maglich e cols., 2004).
O CAR aumenta a expressão dos genes Sult e Ugt e, conseqüentemente das respectivas enzimas sulfotransferase e glicuronase, determinando rápida eliminação pelas excreções biliar e urinária e inativação pela atividade D1 das formas ativas dos hormônios tireoideanos. A redução nas concentrações circulantes de T3 e T4 (metabólitos ativos) leva a menor mobilização de energia pelo organismo, dificultando a redução de peso corporal em situações desejadas como o sobrepeso e a obesidade.
Todavia, os dados de Maglich e cols., em 2004, também demonstraram que reduções de T3 e T4 circulantes são ainda desencadeadas por outros mecanismos independentes de CAR, já que os camundongos knockout para CAR apresentaram uma redução, embora não significativa, nas concentrações séricas desses hormônios.
Desiodase tipo 2 (D2)
A principal contribuição da D2 sobre o metabolismo hormonal extra-tireoideano é regular os níveis intracelulares do T3 em tecidos criticamente dependentes deste. No SNC, no tecido adiposo marrom e na adenohipófise, a atividade dessa enzima está aumentada durante o hipotireoidismo e a deficiência de iodo. Este aumento da conversão local de T4 para T3 pode ser visto como um mecanismo adaptativo em resposta à queda dos níveis circulantes dos hormônios tireoideanos (Bianco e cols., 2002).
Desiodase tipo 3 (D3)
A D3, assim como a D1, protege os tecidos dos excessos de hormônios tireoideanos, removendo o átomo de iodo do anel interno da iodotironina (Bianco e cols., 2002).
Depois de ser perifericamente gerado pelas iodotironinas desiodases, o T3 pode exercer seus efeitos que são mediados por diferentes subtipos de receptores nucleares (TR), os TRα e TRβ. Os TR são expressos, praticamente, em todos os tecidos periféricos, como por exemplo, no osso, coração, tecido adiposo e fígado. Além do papel exercido sobre o metabolismo energético, o T3 também pode regular importantes funções tecido-específicas (Yen, 2001).
Os hormônios tireoideanos mostram-se necessários ao desenvolvimento e funcionamento dos tecidos adiposos marrom (BAT) e branco. No entanto, os mecanismos pelos quais são capazes de induzir a diferenciação tecidual ainda não estão esclarecidos, mas parece envolver a regulação transcripcional de importantes genes-alvo (Yen, 2001). No tecido adiposo branco, T3 induz a atividade de enzimas lipogênicas como acetil CoA carboxilase, a enzima málica, glicose-6-fosfato-desidrogenase, ácido graxo sintase e spot 14. Todavia, a expressão desses genes pode ser modulada por outros fatores como dieta hiperglicídica, insulina e AMPc. Adicionalmente, o T3 também regula a lipólise de maneira coordenada com a lipogênese (Yen, 2001).
A gordura marrom também é alvo dos hormônios tireoideanos. Este tecido apresenta grande número de receptores de T3 que se encontram 70% ocupados à temperatura ambiente e quase 100% ocupados durante exposição do animal ao frio. Na verdade, o BAT dispõe de um mecanismo próprio gerador de T3, graças à atividade local da enzima D2. A atividade dessa enzima e a concentração de T3 aumentam durante atividade simpática do tecido adiposo marrom, que está fortemente relacionado à termogênese facultativa em roedores (Bianco, 2000).
Humanos têm pouca gordura marrom. O principal sítio de termogênese facultativa do organismo humano parece ser o músculo esquelético. A
termogênese facultativa pode ser desencadeada pela exposição ao frio ou pela dieta hipercalórica (Bianco, 2000).
Tendo em vista os efeitos fisiológicos dos hormônios da tireóide sobre o metabolismo energético, observa-se atualmente, o uso indiscriminado de fármacos contendo esses hormônios com a finalidade de emagrecer. A administração de doses variáveis de L-T3 ou L-T4 a pacientes obesos em restrição calórica leva à elevação de T3 sérico e aumento do ritmo metabólico, mas, conseqüentemente, determina aumento do catabolismo com redução de peso corporal devido, em parte, à perda de massa muscular (Medeiros, 1998; Krotkiewski, 2002).
Freqüentemente, encontram-se sérias alterações da função tireoideana em obesos, interpretadas como decorrentes da administração iatrogênica de T3 em doses abusivas (Medeiros, 1998).
A maioria dos casos de obesidade apresenta etiologia multifatorial, fator que a torna uma desordem metabólica de complexo entendimento e de difícil tratamento. O perfeito conhecimento das inúmeras vias intracelulares que regulam o metabolismo energético e a ingestão alimentar é fundamental para que novas drogas possam ser desenvolvidas.
IV.2- LEPTINA:
Indícios da existência de um sistema fisiológico responsável pela regulação homeostática do peso corporal foram acumulados durante quatro décadas.
A descoberta da Leptina em 1994 pelo grupo do doutor Friedman representou importante marco para o entendimento molecular do controle da ingestão alimentar (Ahima e cols., 2000).
Hoje, após a clonagem dos genes da leptina e de seu receptor, busca-se compreender os mecanismos interativos envolvidos na regulação neuroendócrina da ingestão e do gasto energético (Maffei e cols., 1995).
Os genes ob e db
A leptina é o produto do gene ob expresso, principalmente, mas não exclusivamente, no tecido adiposo branco. A síntese de leptina por outros tecidos, não-adiposos, é observada na placenta, na mucosa fúndica estomacal, no músculo esquelético e no epitélio mamário (Masuzaki e cols., 1997).
O gene ob codifica um RNAm de 4.5 Kb que origina uma proteína com 167 aminoácidos. Na corrente sangüínea, a leptina circula como uma proteína não glicosilada de 16 kDa com 146 aminoácidos. Há forte correlação positiva entre os níveis de RNAm para leptina no tecido adiposo e suas concentrações séricas (Considini e cols., 1996). Análises estruturais indicam semelhanças entre a leptina e as citocinas e revelam a presença de uma ligação dissulfídica em sua estrutura de cadeia interna que se mostra necessária para sua atividade biológica (Ahima & Flier, 2000).
Mutações no gene ob levam à deficiência de leptina. Camundongos ob/ob apresentam hiperfagia, hipotermia, obesidade mórbida, e ainda, inúmeras anormalidades metabólicas e neuroendócrinas. Em humanos, o quadro de deficiência de leptina é caracterizado por hiperfagia, obesidade mórbida e hipogonadismo hipotalâmico. E, diferentemente, dos camundongos ob/ob que apresentam hiperinsulinemia, hiperglicemia, hipercortisolismo e hipotermia, essas disfunções ainda não foram observadas em humanos leptino-deficientes (Montague e cols., 1997). Ainda são desconhecidas as razões que levam a essas diferenças entre as espécies, mas elas sugerem que existam substanciais divergências nas ações fisiológicas da leptina entre humanos e roedores (Ahima, 2000)
Os efeitos da leptina são evidenciados através de sua interação com o seu receptor (Ob-R) codificado pelo gene db. O receptor da leptina pertence à família de receptores de citocinas classe 1. O gene db pode codificar 6 isoformas de receptor (Ob-Ra, b, c, d, e, f) (Bjorbaek e cols., 1997). Todas as isoformas possuem o mesmo domínio extracelular amino-terminal de ligação ao hormônio. Porém, apenas a isoforma Ob-Re não apresenta domínio
transmembrana, sendo que todas as isoformas apresentam diferentes domínios intracelulares (Ahima & Flier, 2000).
A isoforma Ob-Rb, conhecida como isoforma longa é a única que contém regiões intracelulares que requerem ativação da via de sinalização Janus-Kinase (Jak) e do sinal ativador de transcrição e tradução (STAT). Essa via é conhecida como via Jak-STAT. As isoformas curtas são capazes de ativar a via Jak, mas incapazes de ativar o STAT, inviabilizando a ação da leptina sobre a ingestão alimentar (Ahima & Flier, 2000).
A leptina se liga com alta afinidade ao homodímero Ob–R, desencadeando a ativação da JAK2. Alterações nessa via de sinalização, como atenuação da fosforilação do STAT-3 ou diminuição da expressão do receptor inviabilizam a ação da leptina conforme demonstrado em ratos Wistar idosos (Galaz e cols., 2002). Em outro estudo também utilizando ratos Wistar idosos, um modelo clássico de resistência periférica à insulina e central à leptina, encontrou-se inibição da atividade Jak por um membro da família de supressores da sinalização de citocinas (SOCS-3) (Peralta e cols., 2002). No hipotálamo, a leptina aumenta os níveis de RNAm do SOCS-3, sugerindo ser este um mediador da resistência leptínica (Peralta e cols., 2002).
Ob-Rb está presente em regiões hipotalâmicas, co-localizado com o fator de transcrição STAT3 e com os neuropeptídios importantes para a ação leptínica, como o neuropeptídio Y (NPY) e a proopiomelanocortina (POMC) (Hakansson e cols., 1998). Em contraste, as isoformas curtas (Ob-Ra, c, d, e, f) são expressas no plexo coróide, no endotélio vascular, e em tecidos periféricos como os rins, o fígado, os pulmões e as gônadas (Elmquist e cols., 1998). O efeito da leptina sobre o metabolismo energético parece ser mediado apenas pela isoforma longa, enquanto que as isoformas curtas parecem ser responsáveis pelo transporte da leptina até o local de ação hormonal e por ações periféricas (Ahima e cols., 2000).
Mutações no gene db causam, em camundongos, insensibilidade a leptina, hiperfagia, obesidade mórbida, anormalidades metabólicas e neuroendócrinas, incluindo hipercortisolismo e hipogonadismo hipotalâmico
(Halaas e cols., 1995). Em humanos, as mutações no Ob-R são extremamente raras e assim como as mutações no gene ob causam hiperfagia, surgimento precoce da obesidade e hipogonadismo hipotalâmico. Além dessas alterações ainda há comprometimento nas secreções de TSH e hormônio do crescimento (GH). Diferente do camundongo db/db, a mutação db em humanos não está associada com hiperglicemia, hipercortisolismo e hipotermia (Clement e cols., 1998).
Regulação da síntese
A síntese da leptina é influenciada pelo status energético proveniente do tecido adiposo. O tamanho do adipócito é um importante determinante da síntese, pois quanto maior é o tamanho da célula, maior é o conteúdo de leptina como observado em um mesmo indivíduo com diferentes tamanhos de adipócitos (Hamilton e cols., 1995). A correlação entre os níveis sangüíneos de leptina e o conteúdo corporal de tecido adiposo é direta.
Em ratos, observa-se o aumento da concentração sérica de leptina após uma refeição e em humanos, após alguns dias de superingestão alimentar. No entanto, em ambas espécies a concentração de leptina decai algumas horas após o início do jejum (Saladin e cols., 1995). As alterações na expressão da leptina em resposta ao jejum e à ingestão não correspondem proporcionalmente às alterações de peso ou de gordura corporais, sugerindo que a leptina funcione como indicador do estoques energéticos assim como mediador do balanço energético (Ahima e cols., 2000).
O efeito dos nutrientes sobre a regulação da leptina parece ser mediado, em parte, pela insulina. Em humanos, observa-se forte correlação entre o aumento da expressão de leptina e o pico de secreção de insulina durante os ciclos alimentares. Em cultura de células adiposas, a insulina estimula diretamente a síntese de leptina (Kolaczynski e cols., 1996). Durante o jejum a queda nos níveis de insulina é seguida do declínio nos níveis de leptina (Boden e cols., 1996).
A expressão da leptina é regulada por vários fatores mostrados na tabela 2, dentre eles destacam-se os hormônios tireoideanos. Em roedores, a administração desses leva à diminuição dos níveis de leptina. Todavia, em humanos ainda não há consenso sobre a relação entre a leptina e os hormônios tireoideanos (Escobar-Morreale e cols., 1997).
Local Aumenta Diminui
Tecido Hiperfagia Jejum Adiposo Obesidade Testosterona
Insulina Agonistas β-adrenérgicos Glicocorticóides Hormns. Tireoideanos (?) Infecção aguda Frio
Citocinas
Placenta Insulina Fumo
Glicocorticóides Baixo peso ao nascer Hipoxia
Músculo
Esquelético (rato) Glicose Lipídeos
Estômago (rato) Ingestão
Colecistocinina
Tabela 2 – Regulação tecido-específica da expressão da leptina (Adaptado de Ahima, 2000).
O papel da leptina na homeostase energética
A classificação da leptina como fator anti-obesidade é baseada na sua capacidade de inibir a ingestão alimentar, diminuir o peso corporal e a adiposidade.
Baseando-se em dados anatômicos e funcionais, a leptina parece exercer seus efeitos sobre o metabolismo energético atuando, principalmente no cérebro. Lesões hipotalâmicas ventrobasais desencadeiam anormalidades no balanço energético que se assemelham àquelas descritas nas mutações de camundongos ob/ob e db/db. Injeções intravenosas de leptina ativam neurônios hipotalâmicos localizados nos núcleos arqueado, ventromedial, dorsomedial e nos circuitos neuronais do tronco cerebral que regulam o comportamento alimentar e o balanço energético (Ahima e cols., 2000).
Os neuropeptídeos hipotalâmicos envolvidos na ação da leptina podem ser classificados em dois grupos como peptídeos orexígenos que são inibidos pela leptina e apresentam aumento em seus RNAm em resposta à deficiência de leptina e como peptídeos anorexígenos que são estimulados pela leptina e tendem a diminuir em resposta a sua deficiência (Sawchenko, 1998). Classificados como orexígenos incluem o neuropeptídeo Y (NPY), o peptídeo relacionado à proteína agouti (AgRP), o hormônio concentrador de melanina (MCH) e a orexina. Os anorexígenos incluem o hormônio estimulante de α-melanócitos (α-MSH), o transcrito regulado por cocaína e anfetamina (CART) e o hormônio liberador de corticotrofina (CRH) (Ahima & Flier, 2000).
Os efeitos da leptina se dão através de sua interação com o receptor de isoforma longa expresso no núcleo hipotalâmico arqueado. No núcleo arqueado lateral são co-expressos os neuropeptídeos anorexígenos proopiomelanocortina (POMC, precursor do α-MSH) e CART e no núcleo arqueado medial os orexígenos NPY e AgRP. Os neurônios-alvo da leptina posicionam-se próximos à eminência média. Através das junções comunicantes presentes nos capilares da eminência, a leptina pode alcançar outros núcleos hipotalâmicos como o ventrobasal, e ainda, ser transportada pelo líquido cerebroespinhal (Ahima, 2000). A figura 3 demonstra a interação neuroendócrina da leptina.
Tecido Adiposo Sistema Nervoso Simpático Tecido Adiposo Apetite
Hipotálamo
Núcleo Arqueado Neurônios Hipofisiotróficos Núcleo Lateral
NPY AGRP POMC (αMSH) CART Sistema Porta TRH SS GHRH Leptina ObRb JEJUM OU RESTRIÇÃO ALIMENTAR Hipófise MCH (? Orexina) T4/T3 Cortisol Esteróides sexuais Crescimento ( CRH) GH LH/FSH TSH ACTH Tireóide Gônodas Adrenal Tecidos alvo
Figura 3 – Esquema representativo da fisiologia neuroendócrina da leptina durante a privação
de energia. ObRb–isoforma longa do receptor de leptina, NPY–neuropeptídeo Y, AGRP– peptídeo relacionado à proteína agouti, POMC–proopiomelanocortina, α-MSH–melanocortina, CART–transcrito regulado por cocaína e anfetamina, GHRH–hormônio liberador de hormônio do crescimento, CRH–hormônio liberador de corticotrofina, SS-somatostatina, TRH–hormônio liberador de tireotrofina, MCH–hormônio concentrador de melanina, ACTH–hormônio adenocorticotrófico, TSH–tireotrofina, T4–tiroxina, T3-triiodotironina, LH–hormônio luteinizante, FSH–hormônio folículo estimulante, GH-hormônio do crescimento (Adaptado de Ahima, 2000).
A POMC é um pró-hormônio que sob a ação de pró-hormônio convertases, origina os peptídeos bioativos: corticotrofina (ACTH), as melanocortinas – MSH (α, β, γ) e a β-endorfina (Pritchard e cols., 2002).
Os peptídeos derivados da POMC agem através da ligação com os receptores de melanocortinas (MC1R a MC5R), os quais pertencem ao grupo dos receptores ligados à proteína G, com 7 alças transmembranas, que estimulam a adenilato-ciclase. Eles se encontram amplamente distribuídos em tecidos periféricos e no SNC (Catania e cols., 2000).
Os receptores MC3R e MC4R, estão envolvidos na regulação do peso corporal: o MC3R modula o gasto energético e o MC4R, a ingestão alimentar. O MC3R é expresso principalmente no SNC, mas também na placenta, intestino, timo e adipócitos (Van Der kraan e cols., 1998). O MC4R é densamente
encontrado no hipotálamo e a ativação desse receptor pelo α-MSH reduz a ingestão alimentar (Cone, 1999).
Camundongos homozigotos para mutação no MC4R apresentam obesidade, com início na maturidade, associada a hiperfagia e aumento do crescimento linear, sem alterações da função adrenal nem da capacidade reprodutiva. Os heterozigotos apresentam peso corporal intermediário entre o peso dos homozigotos e aquele dos camundongos selvagens, sendo o sexo feminino mais afetado que o masculino (Huszar e cols., 1997). Este fenótipo é semelhante ao observado na obesidade humana, razão que motivou a procura de mutações do MC4R (O’ Rahilly, 2002).
O MC4R também parece exercer papel sobre a regulação do comportamento alimentar. Branson e cols., em 2003, examinaram o gene MC4R em 469 adultos com obesidade grave e identificaram mutações ou polimorfismos em 5,1% deles. A prevalência do transtorno de compulsão alimentar periódica foi de 26,4% na população estudada. Todos os indivíduos portadores de mutações MC4R apresentaram transtorno de compulsão alimentar periódica, enquanto apenas 14,2% dos indivíduos-controle obesos, e nenhum dos indivíduos com peso normal, apresentaram o distúrbio alimentar (Branson e cols., 2003).
Apesar da mutação MC4R representar a forma monogênica de obesidade mais prevalente, as etiologias das formas mais comuns, poligênicas, ainda não foram definidas. Os conhecimentos adquiridos a partir dessa mutação têm levado ao desenvolvimento de drogas melanocortina-símiles, que podem ser úteis para outras formas de obesidade. Camundongos knockout para o gene POMC (chubby mice), tratados com um agonista sintético do α-MSH denominado MCT II, perderam peso rapidamente em virtude da redução da ingestão alimentar e do aumento da lipólise, o mesmo ocorrendo em camundongos leptino-deficientes (ob/ob) (Stepherson,1999; Forbes e cols., 2001). Em humanos com peso normal, a administração intranasal de MSH/ACTH por 6 semanas, 2 vezes ao dia, foi capaz de reduzir o peso e a gordura corporais (Fehm e cols., 2001).
O efeito da leptina sobre o controle alimentar é provavelmente mediado pela via da melanocortina. Durante o jejum a redução sérica de leptina inviabiliza a ação do α-MSH, porém a administração de MCT II impede a supressão da expressão do gene do pró-TRH quando administrado intra-cerebroventricularmente (300 mg de 6 em 6 h durante 3 dias de jejum) e também aumenta os níveis de T4 livre circulantes (Krotkiewski, 2002).
Sob certas condições, a regulação do eixo tireoideano através do mecanismo de feedback pode ser desfeita. Durante a restrição alimentar há redução das concentrações séricas de T3 e T4, diminuição ou concentrações normais de TSH e redução na expressão de TRH. Este quadro parece ser mediado pela redução sérica de leptina que suprime a regulação do eixo através da reduzida expressão do RNAm do TRH no núcleo paraventricular. Esse efeito da leptina parece ser mediado indiretamente pelos neurônios do núcleo arqueado que expressam POMC e NPY e diretamente através dos receptores Ob-R colocalizados com os neurônios paraventriculares que expressam TRH e ainda, regulando a atividade da região promotora do gene do TRH (Ahima, 2000).
Ortiga e cols., em 2002, demonstraram que a leptina exerce efeito estimulatório sobre o eixo tireoideano durante condições fisiológicas. Todavia, ainda é desconhecida a influência da leptina sobre o eixo TRH-TSH-tireóide no sobrepeso. Em pacientes obesos, sem restrições alimentares, sabe-se que a concentração de leptina no fluido espinhal correlaciona-se positivamente com a concentração sérica de T4. E que ao serem submetidos a dietas hipocalóricas apresentam subseqüentemente diminuição da concentração de leptina no fluido espinhal que se correlaciona à diminuição nas concentrações séricas dos hormônios tireoideanos (Krotkiewski, 2002).
Uma vez que os efeitos da dieta sobre a estabilização na taxa de redução de peso corporal são determinados, pelo menos em parte, pela diminuição sérica dos hormônios tireoideanos, neste trabalho, administrou-se T4 com o propósito de avaliar sua eficácia no tratamento do sobrepeso.
OBJETIVOS
Neste estudo objetivamos avaliar os efeitos da restrição alimentar associada ou não à reposição de diferentes doses de T4 em ratos de 3 (peso normal) e 6 (sobrepeso) meses, observando os seguintes aspectos:
• redução do peso corporal;
• conteúdo de gordura retroperitoneal; • concentrações séricas de T3, T4 e leptina; • atividade da D1 no fígado;
METODOLOGIA
I -TRATAMENTO DOS ANIMAIS
Foram utilizados ratos da linhagem Wistar, machos com 3 e 6 meses de idade, mantidos em gaiolas individualizadas sob condições de temperatura (23ºC) e ciclo claro/escuro (12 h) controladas. Todos os animais tiveram água e ração oferecidos ad libitum até o momento de se iniciar a restrição alimentar.
I.1 RESTRIÇÃO ALIMENTAR
Os animais foram separados por idade, em dois grupos e classificados como controle aos 3 meses de idade e sobrepeso aos 6 meses, de acordo com o peso corporal. Na literatura, o rato Wistar é classificado como obeso aos 12 meses de idade (peso = 419,9 ± 9,8 g) (Seraphim, e cols., 2001). Neste estudo, os animais apresentam os seguintes pesos corporais: grupo controle (peso = 191,8 ± 7,0 g) e grupo com sobrepeso (peso = 421,5 ± 7,4 g).
Com o intuito de estabelecer a ingestão diária de cada animal, a ração ingerida foi controlada durante 1 semana. Para tanto, os animais foram alocados em gaiolas individualizadas. Cada animal teve acesso a 100 gramas de ração por 24 horas. No mesmo horário em que a ração foi oferecida, pesou-se o que restou em cada gaiola, conhecido como Resto-Ingestão (RI). Ao final de 1 semana foi realizado o cálculo da ingestão diária média.
A ingestão entre os grupos foi diferente e o cálculo para a restrição baseou-se nos valores médios encontrados. O grupo controle ingeriu 21,9 ± 1,2 g e o grupo com sobrepeso ingeriu 17,0 ± 0,7 g. De acordo com dados da literatura (Salih e cols., 1993; Gazdag e cols., 1999; Davidson e cols., 2002) foi estabelecido o valor de 60% da ingestão média para ser oferecido aos animais em restrição alimentar.
Aleatoriamente, a metade de cada grupo foi selecionada para receber a restrição alimentar. Diariamente às 12:00 h foi colocada a quantidade de ração
previamente determinada para cada animal em restrição. Os animais controle receberam ração ad libitum.
Este procedimento foi realizado até o dia do sacrifício.
I.2 CONTROLE DO PESO CORPORAL
Durante todo o experimento o peso corporal dos animais foi aferido utilizando-se balança digital (Precision) com variação de duas casas decimais.
A primeira fase experimental consistiu no controle da ração oferecida e do peso corporal. Este foi realizado a cada 2 dias como medida de controle da perda de peso. Após, aproximadamente, 15 dias, os animais em restrição alimentar apresentaram diminuições na taxa de perda de peso e, neste momento, foi iniciada a segunda fase experimental, na qual além da restrição alimentar, foi administrado ou não o hormônio tireoideano tiroxina (T4).
I.3 ADMINISTRAÇÃO DE T4
Diante da estabilização da perda de peso corporal, foi administrado T4 por via subcutânea (s.c.), diariamente no mesmo horário da oferta de ração (12:00 h) durante 15 dias. Novamente, o critério de seleção aleatória foi utilizado para separar os animais que receberam o T4. As doses administradas foram de 1,0 e 5,0 µg/100 g de peso corporal (p.c.). A dose de 1,0 µg/100 g p.c. corresponde à dose de reposição hormonal capaz de normalizar o nível sérico de T4 em animais hipotireóideos (Grozovsky, 2002; Ferreira e cols., 2005). A administração de 5,0 µg/100 g p.c. ocasiona aumento no nível sérico de T4 circulante (Oppenheimer e cols., 1991).
Os animais que não foram tratados com T4 receberam 100 µL de solução salina.
Figura 4 - Quadro representativo dos grupos experimentais.
I.4 COLETA DE SANGUE
Em dois momentos do experimento foram coletadas as amostras de sangue.
1º coleta: aconteceu, aproximadamente, quando os animais estavam em restrição alimentar por 2 semanas e sem o uso do T4. O procedimento foi realizado com os animais previamente anestesiados usando uma mistura de cetamina (5,0 mg/100 g de peso corporal) e xilasina (0,5 mg/100 g de peso corporal), por via intraperitoneal. Foram retirados 3 mL de sangue da jugular de cada animal.
2ª coleta: no dia do sacrifício, quando os animais já estavam em restrição alimentar por, aproximadamente, 4 semanas e recebendo ou não T4 durante 15 dias. Os animais foram sacrificados por decapitação e o sangue coletado.
Para a obtenção do soro foi realizada a centrifugação (3000 rpm 15 minutos 4ºC) do sangue em tubos individualizados com a retirada do sobrenadante (soro). As amostras de soro foram aliquotadas em 2 tubos e
Animais de 3 meses (Grupo Controle):
Controle - (C) C + T41,0 µg - (CT1) C + T45,0 µg - (CT5) Restrição - (R) R + T41,0 µg - (RT1) R + T45,0 µg - (RT5)
Animais de 6 meses (Grupo Sobrepeso):
Sobrepeso - (S) S + T41,0 µg - (ST1) S + T45,0 µg - (ST5) Sobrepeso Restrição - (SR) SR + T41,0 µg - (SRT1) SR + T45,0 µg - (SRT5)
Animais de 3 meses (Grupo Controle):
Controle - (C) C + T41,0 µg - (CT1) C + T45,0 µg - (CT5) Restrição - (R) R + T41,0 µg - (RT1) R + T45,0 µg - (RT5)
Animais de 6 meses (Grupo Sobrepeso):
Sobrepeso - (S) S + T41,0 µg - (ST1) S + T45,0 µg - (ST5) Sobrepeso Restrição - (SR) SR + T41,0 µg - (SRT1) SR + T45,0 µg - (SRT5)
II SACRIFÍCIO DOS ANIMAIS
A data do sacrifício foi determinada pelo controle do peso corporal. Como os animais prosseguiam em restrição alimentar perdendo peso sem a administração de T4 por aproximadamente 15 dias, foi mantido o mesmo período para o tratamento com o T4 e marcada a data do sacrifício.
O sangue foi coletado para avaliação das concentrações séricas T3, T4 e leptina determinadas por radioimunoensaios (RIE) específicos.
O fígado foi excisado e armazenado a –80oC para posterior dosagem da
atividade da enzima D1.
A gordura retroperitoneal total foi retirada, pesada e relacionada com o peso corporal do animal no dia do sacrifício.
Figura 5 - Esquema representativo da metodologia experimental.
da da Controle Controle ingestão ingestão 1 semana
Sangue SacrifícioSacrifício
Restrição Restrição Alimentar 60% Alimentar 60% T4 ou salina Fígado Desiodase (D1) Sangue RIE (T3,T4 e leptina) Gordura retroperitoneal Pesar e relacionar ao peso corporal 15 dias 15 dias da da Controle Controle ingestão ingestão 1 semana
Sangue SacrifícioSacrifício
Restrição Restrição Alimentar 60% Alimentar 60% T4 ou salina Fígado Desiodase (D1) Sangue RIE (T3,T4 e leptina) Gordura retroperitoneal Pesar e relacionar ao peso corporal 15 dias 15 dias da da Controle Controle ingestão ingestão da da Controle Controle ingestão ingestão 1 semana
Sangue SacrifícioSacrifício
Restrição Restrição Alimentar 60% Alimentar 60% T4 ou salina Fígado Desiodase (D1) Sangue RIE (T3,T4 e leptina) Gordura retroperitoneal Pesar e relacionar ao peso corporal 15 dias 15 dias
III ANÁLISES
III.1 RADIOIMUNOENSAIO (RIE)
T3 e T4
As concentrações séricas de T3 e T4 foram determinadas através de Kit comercial para RIE de T3 (DLS – 3100 Active, TX, EUA) e T4 (DLS – 3200, Active, TX EUA) totais, contendo anticorpos específicos aderidos à parede dos
tubos de polipropileno e com T3 e T4 ligados ao radiotraçador (125I) com
atividade específica de 5 µCi (185 KBq). As curvas padrão foram realizadas com T3 e T4 em soro de rato livre de iodotironinas (soro zero) nas concentrações de (25 a 1000 ng/dL) e (1 a 50 µg/dL), respectivamente. Todo o procedimento foi realizado seguindo-se as recomendações do fornecedor.
Leptina
As dosagens de leptina sérica foram feitas por RIE específico, empregando um kit fornecido pela Linco Research, Inc. (Rat Leptin RIA Kit –
RL-83K) que é constituído por reagentes prontos para o uso: tampão de amostra,
leptina murina purificada em concentrações de 0.5, 1, 2, 5, 10, 20 e 50 ng/mL para a curva padrão, anticorpo anti-leptina murina (1º anticorpo), leptina purificada por HPLC e marcada com 125I , atividade específica de 135 µCi/µg e
anticorpo anti-IgG (2º anticorpo). Para a realização do RIE utilizamos o protocolo fornecido pelo fabricante.
A contagem da radioatividade dos RIEs foi realizada em um cintilador de fase sólida (1470 Wallac WizardTM automatic gamma counter). Os resultados
foram expressos em ng/mL para a leptina, em ng/dL para o T3 e em µg/dL para o T4.
