Toxicidade in vitro da planta Pteridium aquilinum: avaliação em
sangue bovino
Elcio Airton Fidelis1, Mary Anne Tomacheski1, Claudia Consuelo do Carmo Ota2
1 Acadêmicos do curso de Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia da Universidade Tuiuti
do Paraná (Curitiba, PR);
2 Bióloga, Prof. Dnda. Universidade Tuiuti do Paraná
Endereço para correspondência: Elcio Airton Fidelis, elcioairtonfidelis@hotmail.com
RESUMO: O presente trabalho teve como objetivo avaliar a citotoxicidade do
extrato de Pteridium aquilinum em eritrócitos bovinos, obtidos de sangue periférico. Foram avaliadas diferentes extratos obtidos a partir do broto, da folha e broto/folha. Todos os extratos foram avaliados nas seguintes diluições 2:1; 1:1 e 1:2 (extrato + células). Os quais foram incubados com 2x 106 células levados à agitação por 20 minutos. Em seguida foram feitas a contagem e a viabilidade das células, em câmaras de Neubauer com auxílio de microscópio de luz. Como também foi realizado o teste MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina), para verificar a viabilidade celular para possível comparação das análises, através de três diluições.
Palavras-chave: Pteridium aquilinum, citotoxicidade, planta tóxica.
ABSTRACT .The present work had as objective to evaluate the cytotoxicity of the extract of the toxic plant Pteridium aquilinum in bovine erythrocytes, gotten of peripheral blood. Different extracts gotten from the sprout had been evaluated, of the leaf and sprout/leaf. All the extracts had been evaluated in the following dilutions 2:1; 1:1 and 1:2 (extract + cells). Which had been incubation with 2x106 cells taken to the agitation for 20 minutes. After that the counting and the viability of the cells had been made, in chambers of Neubauer with aid of light microscope. As well as test MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl bromide tetrazolina) was carried through to verify the cellular viability for possible comparison of the analyses,through three dilutions.
Keywords: Pteridium aquilinum, cytotoxicity, toxic plant.
INTRODUÇÃO
A planta Pteridium aquilinum é conhecida popularmente como samambaia, samambaia das taperas e samambaia do campo (TOKARNIA, et al 2000, 2002). É uma planta perene, rizomatosa, herbácea, ereta e ramificada, medindo entre 50 a 180 cm de altura. (MARÇAL, 2002).
A P. aquilinum é muito conhecida como planta invasora, porém, no Brasil, poucos sabem ou aceitam que ela é uma das plantas tóxicas mais importantes. Ela é encontrada em regiões tropicais e temperadas. Distribui-se, praticamente, por todo o Brasil, mas é encontrada principalmente na região sul do país, como também há indícios de sua presença na América do Norte e América Central, na Cordilheira do Andes e África (PAGE, 1976). Esta planta é encontrada em solos ácidos, arenosos e de baixa fertilidade. Isto ocorre, devido o excesso de hidratos de carbono armazenado em seu rizoma, ocorrendo crescimento rápido e com propagação em matas ciliares, capoeiras, beiras de matas e estradas (CRUZ, et.al. 2004).
Para o gado, um dos principais fatores que envolvem à ingestão da planta é a superlotação do pasto e, principalmente, a fome. Os princípios ativos tóxicos presentes na planta são responsáveis pelas intoxicações. Entre eles, encontra-se o ptaquilosídeo um grupo glicosídeios norsesquiterpenos iludano que causa intoxicação aguda. Este composto produz tumor intestinal e de bexiga. E é principalmente encontrado nos brotos aéreos, caule subterrâneo e folhas (MARÇAL, 2001). A toxicidade também varia em função do estágio de crescimento da planta e da época do ano, sendo mais tóxica as plantas mais jovens. As porções do caule que ficam enterradas e as folhas novas da
samambaia também contém o principio tóxico em concentração cinco vezes a mais do que a encontrada nas folhas maduras (RIET-CORREA, et.al 2001).
Nos ruminantes, ocorrem duas síndromes principais. A ingestão das plantas por duas a quatro semanas causa doença hemorrágica amplamente conhecida como intoxicação por samambaia. A ingestão de quantidades bem menores de samambaias durante muitos anos provoca hematúria enzoótica bovina. (Hirono, et al. 1972)
Essa intoxicação pela samambaia em ruminantes manifesta-se pela redução da atividade da medula, aumentando as fragilidades capilares, ocorrendo hemorragia nas paredes da bexiga de forma intermitente, resultando em perda contínua de sangue. As mortes são causadas pela anemia decorrente dessa hemorragia (OTTO, et. al. 2002).
Inicialmente, ocorrem perdas da condição da saúde, secura e falta de elasticidade da pele. Os sintomas clínicos manifestam-se de maneira súbita e consistem em febre alta (40,5 – 43º C), diarréia intensa com disenteria ou melena na maioria dos casos, sangramentos pelas narinas, olhos e vagina, bem como salina pendente da boca (OTTO, et. al. 2002).
Deste modo este trabalho teve por objetivo verificar a toxicidade da planta P. aquilinum em meio a eritrócitos bovinos, pelo teste de ação hemolítica in vitro e pelo teste do 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina (MTT).
MATERIAIS E MÉTODOS
Foram coletadas amostras da planta P. aquilinum, na Chácara Domacoski (Rodovia dos Minérios, km 15,5, Almirante Tamandaré / PR). As plantas, ainda na fase jovem, em desenvolvimentos (formação de brotos), foram levadas ao Biotério do Jardim Botânico, situado na Rua Eng°. Ostoja
Roguski – bairro Jardim Botânico para sua identificação pelo biólogo Eraldo Barbosa.
Estas amostras foram separadas para preparação de três extratos (folha, broto e broto/folha) sendo maceradas com o auxílio de um gral. Depois foram pesadas (para cada amostra) 5 gramas da planta para obter um extrato de 5% com a solução de PBS (Phosphate Buffered Saline).
As amostras de sangue bovino foram coletadas em tubos específicos com anticoagulante EDTA antes das avaliações. As amostras (n=5) foram cedidas voluntariamente pela fazenda Veterinária da UFPR e por dois proprietários situados na região de Almirante Tamandaré – PR.
Teste de avaliação hemolítica
A metodologia utilizada para a análise foi baseada nas análises de PEQUENO (et. al, 2005), com algumas modificações.
As análises de toxicidade foram feitas em tubos de ensaio. Para cada tubo de ensaio utilizado no experimento, foram feitas as seguintes diluições:
• 2:1 → Extrato + células. • 1:1 → Extrato + células. • 1:2 → Extrato + células.
Nas análises realizadas foram feitas em triplicatas, com cada uma contendo os seguintes controles:
•Número de células 2x106 .
•Número de células mais solução de PBS (controle negativo); •Número de células mais solução hemolítica (controle positivo); •Número de células mais extrato do broto P. aquilinum;
•Número de células mais extrato do broto e folha P. aquilinum; e, •Número de células mais extrato da folha P. aquilinum.
Após as respectivas diluições, as amostras foram levadas à incubação sob homogeneização contínua por 20 minutos em um agitador. Logo após, foi feita a contagem das células com o auxilio da Câmara de Neubauer.
O corante utilizado para a avaliação da viabilidade celular foi o corante Azul de Tripan à 0,4%. A viabilidade das células foi avaliada por observação direta das preparações em Câmara de Neubauer, em microscopia óptica, conforme a exclusão do corante. As células que se coraram em azul estavam mortas, enquanto que as brilhantes e refringentes à luz internas quando da contagem 99% das células linfóides estavam vivas.
Teste do MTT
A metodologia utilizada para a análise do MTT foi baseada nas análises de PEREZ (et. al, 2008), com algumas modificações.
Após a coleta do sangue, foi feita a contagem de células na Câmara de Neubauer com o corante Azul de Tripan à 0,4%. Cada amostra utilizada teve uma concentração de células de 2x106.
As análises de toxicidade foram feitas em microtúbulos (ependorfs). As amostras foram feitas em triplicatas e para cada variável utilizada foram feitas as seguintes doses:
• Dose I → 1:2 (extrato+ células). • Dose II → 1:1(extrato+ células). • Dose III → 2:1(extrato+ células).
Após realizadas as dosagens, aguardaram-se 30 minutos. Logo adiante, as amostras foram levadas à centrifugação a 1.200 rpm por 8 minutos, o sobrenadante foi descartado. Foram pipetados 10 µl de MTT e 90 µl de meio enriquecido a 5 % de solução de soro fetal bovino em meio RPMI. As amostras foram encubadas por 3 horas a 37 º C em uma estufa.
Logo após a incubação, as amostras foram levadas à centrifuga nas mesmas condições anteriormente citadas. O sobrenadante foi desprezado. E as amostras foram ressuspensas com 100 µl da solução DMSO. As amostras foram colocadas em placa ELISA, agitadas e analisadas em espectrofotômetro (ELISA) em comprimento de onda de 550 nm.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os métodos de obtenção e técnicas empregadas permitiram verificar a viabilidade das células e sua citotoxicidade nos extrato da planta Pteridium aquilinum. A viabilidade das células pode ser verificada nos gráficos abaixo:
folha broto broto e folha 0 20 40 60 80 100 inicial 2:1 1:1 1:2 animal % d e c é lu la s v iá v e is
Gráfico 01: teste de avaliação hemolítica
Os resultados da análise de ação hemolítica no sangue bovino exposto ao extrato da planta Pteridium aquilinum, encontram-se sumarizados no gráfico 01, no qual apresenta o número de células ainda viáveis nas seguintes diluições: 2:1, 1:1, 1:2, para os extratos da folha, broto e broto/folha.
Foram evidenciados no gráfico, alterações nos resultados sobre a toxicidade da planta nas seguintes proporções:
• Para o extrato folha/broto, foi verificado que na diluição 2:1, apresentaram um resultado próximo a 20% de células viáveis, seguido de 30% das folhas e 50% do broto, em comparação com o controle sem a adição de extrato.
• Para o extrato da folha/broto, foi verificado que na diluição 1:1, apresentaram um resultado próximo a 20 % de células viáveis, seguidos de 30% das folhas e 70% do broto,em comparação com o controle sem a adição de extrato.
• Para o extrato do broto, foi verificado que na diluição 1:2 apresentou um resultado próximo à 40 % de células viáveis, seguidos de 45% das folhas e 45% do folha/broto, em comparação com o controle sem a adição de extrato.
Todos os resultados foram analisados conforme o padrão utilizado de 100% de células viáveis.
Gráfico 02. Teste avaliação MTT nas doses, controles positivo e negativo (amarelo), dose 1:2 (preto), dose 1:1 (azul) e dose 2:1 (vermelho).
Os resultados da análise do MTT em sangue bovino contaminado com o extrato da planta Pteridium aquilinum, encontram-se sumarizados no gráfico 02, no qual apresenta o número de células ainda viáveis nas seguintes diluições:1:2 , 1:1 e 2:1 para os extratos da folha, broto e broto/folha.
Foram evidenciados no gráfico, alterações nos resultados sobre a toxicidade da planta nas seguintes proporções:
• Para o extrato do broto, foi verificado que em todas as diluições ele foi o mais tóxico dentre as variáveis.
• Para o extrato da folha, foi verificado que a maior toxicidade ocorreu na diluição 1:1, seguido da diluição 1:2 e 2:1.
• Para o extrato da folha/broto, foi verificado que na diluição 1:2 apresentou a maior toxicidade, seguido da diluição 2:1 e 1:1.
Com relação as análises realizadas podemos verificar que há uma grande toxicidade no sangue bovino com o extrato da planta P. aquilinum, por não existir um tratamento eficaz dessa intoxicação aos bovinos o único tratamento existente é profilático, que envolve apenas a remoção das samambaias nas pastagens como também o abate do animal.
Por questões financeiras, o produtor leva o animal doente para abatedouros, repassando essa toxicidade para consumidor final. Sendo este tema um caso de saúde publica.
CONCLUSÃO:
Pode-se concluir através de ensaios preliminares que o extrato aquoso do broto/folha da planta P. aquilinum , para o teste de hemólise, nas diluições 1:1 e 2:1 são os mais tóxicos, seguido do extrato da folha. E em comparação com o teste do MTT, os extratos do broto foram os mais tóxicos, seguidos do extrato broto/folha, conclusão obtida devido a presença de saponinas no extrato aquoso do broto, pois esta interfere na parede celular hemolisando a célula.
REFERÊNCIAS:
CAMARGO, Mariana I. ; PARIZOTTO JR, Nelson; CARVALHO, Marcos C. ; MARÇAL, Wilmar S. Aferição da concentração do ácido siálico em novilhas da raça nelore expostas e não expostas à samambaia (Pteridium aquilinum). Semina: Ciências Agrárias, Londrina, v. 29, n. 2, p. 393-398, abr./jun. 2008.
CRUZ, Guilherme D.; BRACARENSE, Ana Paula F. R. L. Toxicidade da samambaia ( Pteridium aquilinum (L.) Kuhn) para a saúde humana e animal. Semina: Ciências Agrárias, Londrina, v. 25, n. 3, p. 249-258, jul./set. 2004.
EVANS, I.A. Braken carcinogenicity. Research Vet. Science, v . 26, p. 339-348. 1979.
FRANÇA, Ticiana do N. ; TOKARNIA, Carlos H.; PIXOTO, Paulo V. Enfermidades determinadas pelo principio radiomimético de Pteridium aquilinum (Polypodiaceae). Pesquisa veterinária brasileira, v. 22, n. 3, p. 85-96, jul./set. 2002
HIRONO, I.; SHIBUYA, C.; SHIMIZU, M; FUSHIMI, K. Carcinogenic activity of processed bracken used as human food. J. Nature cancer Institute, v. 48, p. 1245-1250, 1972.
MARÇAL, Wilmar S. Aspectos clinico-epidemiologicos da toxidez da samambaia em bovinos. Ciência vet. tróp. Recife –PE, v.5, n. 2 e 3, p. 61-69, mai./dez. 2002.
MARÇAL, Wilmar S.; GASTE, Laurenil; REICHERT NETTO, Ney C.; MARQUES, Marcelo C. G.;FERNANDES, Reginaldo P.; MONTEIRO, Alexandre A. Ocorrência de intoxicação aguda em bovinos pela samambaia (Pteridium aquilinum, L. Kuhn) no norte do Paraná-Brasil. Semina: Ciências Agrárias, Londrina, v. 22, n. 2, p.139-144, jul/dez. 2001.
PAGE, C. N. The taxonomy and phytogeography of braken – a review. Bot. J. Linn, Soc, v. 73, p. 1-34, 1976.
PERES, Luis A. Batista; DELFINO, Vinicius D. Alves; MOCELIN, Altair J.; TUTIDA, Lissa A.; FAVERO, Maria E.;MATSUO, Tiemi. Padronização do Teste do MTT em Modelo de Preservação a Frio como Instrumento de Avaliação da Viabilidade Celular Renal. J. Brasileiro de Nefrologia, v 30, n. 1, p. 48-53. 2008.
PEQUENO, Nebson F.; SOTO- BLANCO, Benito. Toxicidade in vitro de plantas tóxicas: avaliação do teste de ação hemolítica. Acta Scientia e Veterinariae, v. 34, p. 45-48. ago. 2005.
RIET-CORREA, Franklin; MEDEIROS, Rosane M.T. Intoxicações por plantas em ruminantes no Brasil e no Uruguai: importância econômica, controle e riscos para a saúde pública. Pesquisa veterinária brasileira, v. 21, n. 1, p. 38-42, jan./mar. 2001.
TOKARNIA, Carlos H.; DÖBEREINER, Jürgen; PEIXOTO, Paulo V. Plantas tóxicas do Brasil. Editora Helianthus, p.178-187. 2000.
OTTO M. RADOSTILS, CLIVE C. GAY DOUGLAS C.KENNETH. Clínica Veterinária - Um Tratado de Doenças dos Bovinos, Ovinos, Suínos, Caprinos e Eqüinos. Clínica veterinária. Editora Guanabara. P. 1497 – 1502.
