XXI Congresso Brasileiro de Física Médica 24 a 27 de Agosto de 2016 Florianópolis
Validação da técnica de Biosusceptometria AC para avaliação de
perfis de biodistribuição de nanopartículas magnéticas
Validation of the AC Biosusceptometry system to assess biodistribution
patterns of magnetic nanoparticles
Guilherme Augusto Soares
1, Caio C. Quini
1, André G. Próspero
1, Marcos F. F.
Calabresi
1, Gustavo M. Moretto
1, Fábio Perez
1, Nicholas Zufelato
2, Patrícia Fidelis
3,
Andris F. Bakuzis
2, José R. A. Miranda
11Dep. Física e Biofísica – Instituto de Biociências de Botucatu – UNESP,Botucatu, São Paulo 2Instituto de Física – Universidade Federal de Goiás – UFG, Goiania, Goias 3Dep. de Fisiologia – Instituto de Biociências de Botucatu – UNESP, Botucatu, São Paulo
Resumo
Dentro das técnicas de biomagnetismo, a Biosusceptometria AC(BAC) é uma técnica inovadora, de baixo custo e versátil, com aplicação em diversas áreas de pesquisa. A partir de um sistema gradiométrico de bobinas, é possível obter sinais físico-biológicos, relacionados com materiais magnéticos em um determinado meio. Nanopartículas magnéticas (NPMs) apresentam uma nova perspectiva em diversas áreas da medicina. Como desafio, fica entender como se dá sua distribuição em um meio biológico, suas características perante parâmetros biológicos e relacioná-las a determinado órgão ou estrutura. O presente trabalho tem o objetivo de propor a utilização do sistema BAC como novo método para avaliação do perfil de biodistribuição de NPMs e validá-lo frente a uma técnica considerada padrão ouro (Espectroscopia por EPR – do inglês, Electron Paramagnetic Resonance).
Palavras-chave: biomagnetismo; biosusceptometria AC; nanopartículas magnéticas;biodistribuição.
Abstract
Among the available biomagnetic systems, the AC Biosusceptometry technique is a low-cost, versatile method, extensively applied to physiological studies. The ACB technique performs magnetic materials detection and monitoring by a gradiometric arrangement of pickup coils, which provides magnetic signal related to materials within biological systems. Magnetic nanoparticles present a new perspective in several research areas. However, it is indispensable to investigate how particles accumulate in organs of interest after administration. This study, therefore, applies the AC Biosusceptometry system to investigate magnetic nanoparticles biodistribution patterns, followed by a comparison between ACB and EPR (Electron Paramagnetic Resonance) results, since the last one is considered to be the gold standard technique
Keywords: biomagnetism; AC biosusceptometry; magnetic nanoparticles, biodistribution.
1. Introdução
Biosusceptometria de Corrente Alternada é uma técnica inovadora e bem estabelecida em algumas áreas de pesquisa, principalmente em relação à gastroenterologia, com princípios bem descritos pelo eletromagnetismo clássico. Por ser uma técnica que apresenta grande versatilidade, a Biosusceptometria AC apresenta notável desempenho em experimentação animal e humana, atuando em áreas diversas e permitindo a associação
de diferentes parâmetros.
A técnica tem evoluído por apresentar como vantagens ser um método não invasivo, livre de radiação ionizante, além de baixo custo e versatilidade.
Desde suas iniciais aplicações, a técnica vem mostrando avanços na instrumentação, o que possibilitou melhorias na relação sinal/ruído,
consequentemente fazendo que a mesma atinja um outro nível de detecção.1
Nanopartículas magnéticas são matérias que possuem grande versatilidade, devido ao seu tamanho reduzido e suas propriedades magnéticas2. Em um sistema biológico, é
possível que essas estruturas se relacionem de diversas formas diferentes. Uma das funcionalidades das NPMs é a realização de marcação e separação de certas estruturas de interesse, por meio de modificações químicas no revestimento destas partículas através de moléculas biocompatíveis. Terapias celulares com células tronco também já utilizam MNPs como marcadores associados às técnicas de ressonância magnética ou microscopia, com o intuito de estudar a chegada e alocação das células tronco em seu alvo 3. A distribuição de
utilização importante pois se aplicam NPMs biocompatíveis ligadas ao fármaco, permitindo guia-lo até a região de interesse, através de um campo magnético. Apresentam uma versatilidade considerável graças, principalmente, às suas características dimensionais, que podem variar de 4 até 100 nm.
Desta forma elas podem ser usadas para estudar e/ou interagir com praticamente qualquer estrutura biológica de interesse. O destino das NPMs é uma das principais preocupações quando estas são aplicadas em experimentos in vivo e procedimentos clínicos, pois características como carga superficial, potencial Zeta (afinidade eletrônica), tamanho, revestimento e núcleo das nanopartículas possibilitam diferentes alvos e destinos dentro
de um sistema biológico.
Como cada tecido ou órgão possui suas determinadas características morfofisiológicas, que determinam suas funções, a relação entres essas características e a biostribuição como um todo é alvo de vários estudos. Nanopartículas maiores do que 200nm são sequestradas por ação fagocitária de células presentes no fígado e no baço4, enquanto que
nanopartículas menores do que 5.5nm são rapidamente retiradas do sangue via depuração renal 5. A biodistribuição é
influenciada diretamente por outros fatores fisiológicos, como presença de processos inflamatórios, infecciosos e tumores. Neste caso, a biodistribuição é alterada devido ao efeito de permeabilidade e retenção (EPR – do inglês enhanced permeability and retention). Atualmente, poucas técnicas são utilizadas como método de avaliação de biodistribuição de NPMs em sistemas biológicos. Uma das mais utilizadas é a técnica de relaxometria que se baseia na observação dos tempos de relaxação longitudinal (T1) e transversal (T2) das partículas, quando estas estão sob influência de um campo magnético excitante pulsado, porém essa técnica necessita de amostras provenientes da estrutura a ser analisada através de biópsias, devidamente preparadas para a quantificação de material magnético presente na amostra, o que torna-se um processo invasivo [6].
A Espectroscopia por Ressonância Paramagnética Eletrônica (EPR – do inglês Electron Paramegnetic Resonace) também é utilizada como método de avaliação de biodistribuição. Porém as amostras devem ser cuidadosamente levadas a calibração do equipamento, o que torna difícil o manuseio da mesma, além de ser um técnica de alto custo.7 Este trabalho teve o intuito de
investigar a capacidade do sistema de Biosusceptometria AC para analisar o comportamento de nanopartículas magnéticas na corrente sanguínea e entender seus possíveis destinos finais,visando sua utilização para futuras experimentações de mapeamento de NPMs. Em termos gerais, o objetivo deste trabalho foi propor o sistema BAC como possível nova ferramenta para estudos de caracterização pré- clínica e biodistribuição de NPMs.
Para tanto, os objetivos específicos foram: Avaliação do perfil de acúmulo de NPMs em diferentes órgãos de interesse, além de como este perfil é alterado em função da dose, protocolo de administração e tempo. Avaliação do desempenho da BAC frente ao método de EPR em quantificações de parâmetros biodistributivos de NPMs.
2. Materiais e Métodos
2.1 Biosusceptometria AC
A Biosusceptometria de Corrente Alternada (BAC) consiste em bobinas de indução que aplicam um campo magnético de corrente alternada em um meio biológico e, através de bobinas de detecção mede-se o campo magnético proveniente da interação entre o primeiro campo induzido e o meio8, 9
A presença de um material magnético causa um desbalanceamento no fluxo magnético que é monitorado por meio de amplificadores lock-in,( Stanford Research Systems, Inc., USA) pois quando não material magnético próximo ao sistema de medida a resposta é reduzida, já ao se aproximar um material magnético próximo ao par de bobinas, ocorre um desbalanceamento do fluxo do sistema gradiométrico.
Figura 1.Fluxograma do funcionamento e aquisição de sinais do sistema BAC.
Foi utilizado um sistema BAC mono-sensor de 2,8 cm de diâmetro que apresentou uma resolução espacial de 1,70cm, aferido via meia largura da banda (FWHM – do inglês Full
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width at half maximum), frente a uma amostra contendo 0,3 ml de NPMs,
2.2 Nanopartículas Mágneticas
Utilizou-se NPMs de ferrita de manganês recobertas com ácido citrico (Ci-MnFe2O4) e sintetizadas por método de coprecipitação descrito anteriormente10.
2.3 EPR (do inglês Electron Paramagnetic Resonance)
A técnica de EPR (ou ESR – do inglês Electron Spin Resonance) é uma técnica de espectroscopia baseada no princípio de que sistemas de átomos ou íons na presença de um campo magnético externo variável, absorvem radiação eletromagnética, geralmente na ordem de microondas, resultando em alteração dos níveis de energia que esses sistemas de átomos ou íons se encontram. A técnica de EPR é comumente utilizada em caracterizações magnéticas devido a sua alta seletividade, já que sistemas de átomos e íons apresentam absorção de microondas em bandas muito estreitas de
campo magnético
Para validação a técnica de Biosusceptometria AC em relação a técnica padrão ouro, utilizou-se o espectrômetro de banda X da marca JEOL modelo JES-FA 200 (9,5GHz)
2.4 Procedimentos Experimentais 2.4.1 Curva de calibração
Construiu-se uma curva de calibração para comparar os resultados obtidos através da técnica de Biosusceptometria Ac para amostras de concentração conhecida de nanopartículas magnéticas. Após recolher o fígado de um rato macho, executou-se processos de liofilização e homogeneização de sete porções iguais, pesando 100 mg cada e colocou-se em frascos separados. Cada frasco recebeu 100 μl de uma solução contendo diluições diferentes (1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:50, 1:100 e 1:1000) da solução estoque de Ci-MnFe2O4 (23mg/mL 1.17x1015
np / mL).Repetiu-se o processo de medida três vezes afim de se obter valor médio do sinal.
Os valores obtidos pela Biosusceptometria AC foram comparados com a técnica de EPR. A figura 2 ilustra como os órgãos liofilizados foram posicionados sobre o sensor BAC para se obter o sinal magnético referente às concentrações escolhidas.
2.4.2 Dose
Foram selecionados 12 ratos machos (Rattus norvegicus albinus - Wistar, de Anilab, Paulínia - SP - Brasil), pesando entre 250 e 300g, em 3 grupos (G1, G2 e G3), correspondendo a 1, 2 e 3 infusões de NPMs de 300 μl (23 mg/mL- 1.17x1015 np/mL).
Todos os animais receberam NPMs intravenosamente através da veia femoral esquerda, por procedimento de canulação. Logo após a anestesia (uretano, 99%, 1,5 mg/kg).
2.4.3 Protocolo de Administração
Logo após a administração, os animais foram sacrificados e coletou-se o fígado, baço, pulmões, rins, coração e uma amostra de sangue de cada animal. A hipótese em relação à biodistribuição era se a mesma dose, porém administradas por diferentes protocolos de infusão, pode ocasionar diferentes padrões de acúmulos de NPMs. Assim, quatro ratos, formando o grupo 4, receberam uma única administração de 900 uL.O objetivo desse procedimento foi comparar com os resultados do G3, que recebeu três doses de 300 uL.(total de 900) em relação ao G4, que recebeu uma única
infusão de 900 uL.
Todos dados foram comparados com o EPR. Toda experimentação animal foi realizada com o parecer favorável do comitê de ética sob o número CEUA – IBB 409.
2.4.24 Tempo
Após análises da dose e da influência dos protocolos de administração no perfil de biodistribuição, avaliou-se como as NPMs acumulam em diferentes órgãos ao longo do tempo. Dividiu-se 16 ratos (Rattus norvegicus
AMOSTRA
SENSOR BAC
Figura 2.Ilustração do processo de quantificação de NPMs através do sistema BAC.Cada amostra foi posicionada sobre a sonda detectora(região cinzenta) e sinal BAC foi adquirido. Realizou-se o procedimento de aquisição de sinal tres vezes para obter a media.
albinus - Wistar, de Anilab, Paulínia - SP - Brasil), com peso de 250 a 300g, em 4 grupos (1, 4, 16 e 24 horas). Cada animal recebeu uma única injeção de 300 μl de Ci-MnFe2O4 por via intravenosa (administradas através da veia femoral) e foram mortos por decapitação no ponto de tempo de acordo com o seu respectivo grupo. Foram coletados fígado, baço, rins, pulmões, coração e uma amostra de sangue, afim de quantificar a concentração de partículas em cada órgão. Todos dados foram comparados com o EPR.
3. Resultados e Discussões
3.1 Curva de calibração
Figura 3. Variação do sinal sobre a concentração de partículas e o seu ajuste linear e coeficientes .
A fim de adquirir informações quantitativas sobre a concentração de partículas, foi realizado um teste de calibração do sistema de Biosusceptometria AC para medir o sinal magnético em diferentes frascos contendo amostras de tecidos com concentrações de
NPMs conhecidas.
Este processo de calibração permitiu relacionar a concentração de partículas em cada frasco para a intensidade de sinal obtido a partir da amostra, o que nos forneceu informação ex vivo quantitativa, para todos os seguintes estudos de biodistribuição.
A figura 4 mostra o mesmo procedimento para o sistema EPR Para fins de comparação, submeteu-se as mesmas amostras analisadas no sistema BAC para a curva de calibração.
Figura 4. Variação do sinal do sistema de EPR sobre a concentração de particulas de cada amostra
O sistema EPR também forneceu uma resposta linear para a variação de concentração das NPMs. Na figura 5, é exibido a comparação e correlação entre a Biosusceptometria AC e os dados de EPR para fins de validação.
Figura 5. Comparação in vitro entre a BAC e o sinal do sistema EPR para concentrações da mesma partícula(A) e BAC x EPR(B).
Estes dados demostram boa correlação entre as técnicas (R2 = 0,993) e permitiu quantificar
a concentração NPMs ex vivo em amostras de tecidos, fornecendo os dados necessários para apresentar todos os resultados baseados no número de partículas por amostra. Ainda assim, todas as amostras medidas no sistema BAC ex vivo também foram analisados na técnica EPR para validar o sistema BAC como uma nova ferramenta para estudos de biodistribuição
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3.2 Dose
As figuras 6-A e 6-B demonstram o número de partículas encontradas em cada órgão dos grupos G1, G2 e G3, respectivamente para técnica BAC(A) e sistema EPR(B) .
Figura 6. Biodistribuição de dados de NPMs para os grupos G1, G2 e G3, mostrando a média (e desvio padrão) do número de partículas obtidas em cada órgão. Figura 6-A mostra os dados obtidos pela técnica BCA, enquanto 6-B mostra os resultados de EPR.
Estes resultados indicam que o sistema BAC foi capaz de fornecer informações quantitativas sobre nanopartículas e seu perfil de biodistribuição para diferentes concentrações e diferentes tecidos.
Como esperado, ambos os sistemas demonstraram um sinal elevado para órgãos como o fígado e baço após as infusões. Através da figura 6-A, é possível perceber que diferença entre a primeira, a segunda e a terceira infusão para o baço, enquanto para o fígado e os pulmões ,a terceira e segunda, terceira e primeira administração foram significativamente diferentes. Figura 6-B mostrou também um perfil cada vez maior, com uma variação significante estatística, uma vez que as amostras de pulmões expressaram diferença significativa entre a primeiro e a terceira, enquanto o baço mostrou diferença entre terceira infusão O sinal de fígado, no entanto, foi significativamente diferente para todas as três injeções. Assim, estes resultados
indicam um aumento significativo de sinal devido a cada infusão de partículas.
3.3 Protocolo de Administração
As figuras 7-A e 7-B expressam a intensidade do sinal BAC e EPR de órgãos dos animas do grupo G3 e G4
Figura 7. Dados de biodistribuição de NPMs para os grupos G3 e G4, mostrando a média (e desvio padrão) para o número de partículas de cada órgão. Figura 7-A mostra os dados obtidos pela técnica BAC, enquanto 7-B mostra os resultados de EPR.
Quando se avalia resultados dos órgãos separadamente, todos os resultados não demonstraram diferença estatística considerável entre a técnica BAC e o sistema EPR, confirmando a capacidade do sistema para quantificar nanopartículas magnéticas. Ambas as técnicas apresentaram acumulação no fígado e no baço para o grupo G3, enquanto a concentração de NPMs na corrente sanguínea foi menor em relação ao grupoG4. Essa maior concentração nas amostras de sangue e menor acúmulo no fígado com relação ao grupo G4, sugere que houve menor retenção por parte do órgão, confirmando a hipótese de que a dose mais elevada causou um processo de saturação da atividade dos macrófagos neste tecido. De forma geral, essas dados refletem que diferentes perfis de acúmulo podem ser obtidos a partir de diferentes métodos de infusão, dependendo do objetivo de administração, tal como a preservação da função do órgão durante o tratamento de uma doença, ou causando a saturação transitória, para aumentar o tempo de circulação para os
sistemas de liberação de fármacos específicos.
3.4 Tempo
Foram selecionados os pontos de tempo 1,4,12 e 24 horas após a infusão de 300 μl de Ci-MnFe2O4 em todos os animais. Após o protocolo de eutanásia, foram coletados os órgãos de interesse de cada animal e medidos o sinal ACB e EPR a partir deles. A Figura 8 apresenta o ACB e sinais EPR adquiridos a partir de cada amostra.
Figura 8. Dados de biodistribuição para diferentes pontos de tempo ,mostrando a média(e desvio padrao) para o número de partículas de cada órgão.Figura 8-A apresenta os dados obtidos pela técnica BAC, enquanto 8-B apresenta os resultados do sistema EPR.
Após 1 hora, os sinais mais elevados foram obtidos a partir do fígado e baço, e mais baixos nos rins, devido ao tamanho das partículas, existem certa concentração na corrente sanguínea, indicado pelo alto sinal. Essa concentração pode ser responsável pelo maior número significativo de partículas encontradas no fígado e pulmões por técnica BAC. 4 horas após a administração, não há partículas circulantes e o baço apresenta o seu maior valor de intensidade. O sinal BAC de fígado diminui significativamente a partir de sua intensidade anterior, enquanto que o sinal EPR não apresentou variação significativa. Uma vez que ambos os sistemas não apresentaram o mesmo comportamento, não pudemos determinar que um processo de apuramento começou neste ponto do tempo. Pode-se assumir, no entanto, a existência de um processo biológico, que altera a susceptibilidade magnética da amostra, fazendo com que a diminuição do sinal de
BAC, que devido a propriedades do sistema EPR, pode ser influenciado, ocasionando detecção e sensibilidade do sistema.
Assim, esta hipótese sugere um processo de degradação inicial de nanopartículas, o que explicaria a perda de sinal magnético através da BAC e nenhuma variação no sinal EPR. São necessários, a fim de realizar uma avaliação apropriada, mais estudos focados neste parâmetro, com um maior número de animais e os pontos de tempo mais longos, uma vez que o fígado, coração, pulmões e do sangue, também mostraram perfis de sinal decrescentes.
4. Conclusões
Como conclusão do estudo de biodistribuição apresentou dados sobre concentração de NPMs na corrente sanguínea após 1 hora da administração, o que proporciona maior retenção instantânea no fígado, e posteriormente com maior concentração no baço após 4 horas da administração. O estudo também proporcionou perceber que o sinal diminuiu sua intensidade após 12 horas logo depois da infusão, provavelmente indicando degradação das partículas no sistema biológico,
Foi possível validar a técnica de Biosusceptometria AC com a técnica padrão ouro, que no caso foi o sistema EPR, pois obteve-se dados correlativos, na qual a primeira pode ser uma tecnologia acessível para fornecer informações quantitativas ex vivo sobre partículas no sistema biológico.
Agradecimentos
À FAPESP e ao CNPq pelo auxilio e investimento.
Referências
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