DIFERENTES NÍVEIS DE NITROGÊNIO NO MEIO DE CULTURA
VIRGÍNIA MARIA TENÓRIO SABINO DONATO
1PATRÍCIA SCHOUBER GONÇALVES LIMA
2ARNÓBIO GONÇALVES DE ANDRADE
3JOSÉ GERALDO EUGÊNIO DE FRANÇA
4RESUMO – Plantas de cana-de-açúcar das cultivares
(SP71-6949, SP70-1143, Co 997 e CB 45-3), prove-nientes do cultivo in vitro de meristemas, foram subme-tidas a testes de infecção para verificar a presença de bactérias fixadoras. Após a diferenciação dos meris-temas, as plantas foram cultivadas em meio MS com diferentes níveis de nitrogênio (9,83; 7,37; 4,92; 2,46; 0,0 mM). Pelos testes de infecção, infere-se a presença das bactérias fixadoras de nitrogênio nas cul-tivares estudadas. Após 30 dias de cultivo, foram
ava-liados o ganho de biomassa e o conteúdo de nitrogênio total (NT) das plantas. A redução dos níveis de nitro-gênio no meio de cultura não afetou significativamente o crescimento das plantas, embora tenha reduzido o pe-so de matéria seca acumulada. A cultivar Co 997 apre-sentou maior ganho de biomassa e maior valor acumu-lado de NT quando cultivada na ausência desse elemen-to, sugerindo um maior potencial para a fixação bioló-gica do nitrogênio em relação às demais cultivares es-tudadas.
TERMOS PARA INDEXAÇÃO: Saccharum sp, biomassa, micropropagação.
IN VITRO SUGAR CANE CULTIVATED IN DIFFERENT NITROGEN
LEVELS IN THE CULTURE MEDIA
ABSTRACT – Sugar cane cultivars plants
(SP71-6949, SP70-1143, CO 997 and CB 45-3), from cultivation in vitro of shoot tips, were submitted to infection tests in order to verify the fixatives bacteria presence. After shoot tips differentiation the plants were cultivated in MS media with different nitrogen levels (9,83; 7,37; 4,92; 2,46; 0,0 mM). The infection tests indicated the nitrogen fixatives bacteria presence in the studied cultivar. After 30 days, were evaluated
the biomass gain and the total Nitrogen content (NT) of the plants. Nitrogen levels reduction in the cultured media did not affect significantly plants growth, however reduced the accumulated drought matter weight. Cultivar CO 997 showed larger biomass and total Nitrogen accumulation when cultivated in the absence of this element, suggesting a higher potential in Nitrogen biological fixation compered with the others studied cultivate.
INDEX TERMS: Saccharum sp, biomass, micropropagation. INTRODUÇÃO
A crise mundial de energia e a crescente preocu-pação com a preservação do meio ambiente desperta-ram no mundo inteiro interesse cada vez maior na pes-quisa relativa aos aspectos da fixação biológica do ni-trogênio atmosférico (DÖBEREINER, 1977). No Bra-sil, a cana-de-açúcar é cultivada com adição
relativa-mente baixa de fertilizantes nitrogenados, o que foi jus-tificado pelos resultados de 135 experimentos de campo realizados em todas as áreas importantes do Brasil que são cultivadas com cana-de-açúcar (URQUIAGA et al., 1992). Nesses experimentos, verificou-se que um au-mento significativo da produção devido à aplicação de fertilizantes nitrogenados ocorreu em apenas 19% das áreas estudadas (AZEREDO et al., 1986).
1. R. João Ramos, 285/1801, Graças - 52011-080 – Recife, PE. Bolsista CAPES,vmtsdonato@uol.com.br 2. Bolsista de iniciação científica do PIBIC/FACEPE.
3. Departamento de Química Vegetal/UFRPE, R. Dom Manoel de Medeiros s/n.- Dois Irmãos –52171-900 - Recife, PE. 4. Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária (IPA), Av. Gal. San Martin,1371 - Bongi, 50761-000, Recife, PE.
Subseqüentemente, Lima et al. (1987) constataram que a cultivar CB 47-89 tinha capacidade para obter uma contribuição considerável de nitrogênio fixado biologica-mente, estimada em 60% a mais do total de nitrogênio incorporado. Desde então, outros trabalhos foram con-duzidos, os quais levaram à descoberta de uma bactéria fixadora de nitrogênio, a Acetobacter diazotrophicus (CAVALCANTE e DÖBEREINER, 1988).
Existem evidências quanto à influência da culti-var na capacidade de fixação biológica do nitrogênio pelas bactérias. A SP70-1143 é uma das que conseguem bom desenvolvimento em condições de baixa fertilidade do solo, estando entre as cultivares comercialmente uti-lizadas e como uma das que mais se beneficiam do pro-cesso de fixação biológica do nitrogênio (URQUIAGA et al., 1987).
Estudos mais detalhados das bactérias fixadoras (A. diazotrophicus e Herbaspirillum spp.) associadas à cana-de-açúcar têm mostrado que elas ocorrem em grande quantidade não somente nas raízes dessa cultu-ra, mas também nos colmos e folhas; entretanto, rara-mente são encontradas no solo (BODDEY e DÖBEREINER, 1995). A identificação desses diazotró-ficos endofíticos como organismos provavelmente res-ponsáveis por grande parte da fixação biológica de ni-trogênio observada na cana-de-açúcar sugere que pode ser possível obter contribuições significantes para ou-tras gramíneas.
Utilizando a técnica do cultivo in vitro, é pos-sível controlar a atmosfera de crescimento das plantas, ao contrário dos experimentos conduzidos no campo, onde a significância agronômica dos dados é compro-metida (MATSUI et al., 1981). Por outro lado, a utili-zação do cultivo in vitro possibilita o conhecimento de tudo que é fornecido à planta. Dessa forma, permite es-tudar o potencial de fixação biológica do nitrogênio com maior segurança, já que é possível retirar inte-gralmente todas as fontes de nitrogênio do meio de cul-tura. No entanto, a interação entre as técnicas da cultu-ra de tecidos de plantas e bactérias fixadocultu-ras de nitro-gênio ainda não está estabelecida. Poucos estudos a res-peito do estabelecimento e análise da biologia e associação simbiótica com a cultura de tecidos de plantas foram re-latados por Giles e Vasil (1980). Os autores realizaram o co-cultivo de calos de cana-de-açúcar e Azospirillum brasiliense durante 18 meses em meios de cultura con-tendo baixa concentração de nitrogênio e constataram que houve considerável índice de redução de acetileno. Esse resultado indica a atividade da nitrogenase, enzi-ma responsável pela redução do N2 (NEVES e
RUMJANECK, 1992). Conduziu-se este trabalho com o objetivo de avaliar a contribuição do nitrogênio fixado biologicamente em cultivares de cana-de-açúcar culti-vadas in vitro em diferentes níveis de nitrogênio.
MATERIAL E MÉTODOS
O material vegetal utilizado foi fornecido pela Estação Experimental de Itapirema (Empresa Pernam-bucana de Pesquisa Agropecuária-IPA). As cultivares SP 71-6949, SP 70-1143, Co 997 e CB 45-3 tiveram inicialmente as gemas individualizadas devidamente tratadas com inseticida (nuvacron:água-2:1 mL.L-1) e fungicida (dithane:água-1:1 g.L-1) e, posteriormente, plantadas em bandejas contendo o substrato Plantmax esterilizado. Foram mantidas em câmara de germina-ção por aproximadamente 20 dias sob temperatura de 35±1oC e fotoperíodo com 16 horas de luz.
Posteriormente, os ápices caulinares foram iso-lados sob condições assépticas, em câmara de fluxo la-minar, e cultivados in vitro em meio de cultura consti-tuído dos sais de MS (MURASHIGE e Skoog, 1962), acrescido de tiamina (0,1 g.L-1), inositol (0,1 g.L-1), 6-Benzilaminopurina (BAP) (0,2 mg.L-1), 6-Furfurilaminopurina (KIN) (0,1 mg.L-1) e sacarose (20 g.L-1) (LIU, 1980). Após 60 dias de cultivo in vitro, a planta-matriz proveniente do ápice caulinar isolado, to-talmente diferenciada, foi submetida ao teste de infec-ção para verificar a presença das bactérias A. diazotrphi-cus e Herbaspirillum spp., utilizando-se a metodologia descrita por Döbereiner et al. (1995). Realizou-se tam-bém um estudo histológico para localizar e confirmar a presença das bactérias, seguindo o método descrito por PATRIQUIN e DÖBEREINER (1978).
Para avaliar a contribuição do nitrogênio fixado biologicamente, utilizaram-se propágulos das cultiva-res SP 71-6949, SP 70-1143, Co 997 e CB 45-3 prove-nientes do cultivo de ápices caulinares, submetidos ao teste de infecção. Os propágulos foram cultivados em frascos contendo 30 ml de meio nutritivo constituído pelos sais de MS, acrescido de 20 g.L-1 de sacarose, com reduções de 0, 25, 50, 75 e 100% na concentração de nitrogênio (NH4NO3 e KNO3) do meio de cultura.
O experimento foi constituído de 20 tratamentos com 10 repetições, formados a partir da combinação entre 4 cultivares (SP 71-6949, SP 70-1143, Co 997 e CB 45-3), e 5 concentrações de nitrogênio (9,83; 7,37; 4,92; 2,46 e 0,0 mM). Foi utilizado o delineamento ex-perimental inteiramente casualisado e os resultados fo-ram submetidos à análise de variância (ANOVA). A
comparação de médias foi realizada aplicando-se o Tes-te Tukey a 5%, por meio do programa BIOESTAT, ver-são 1.0, para Windows.
Com o objetivo de determinar o peso do explante inoculado (peso inicial), cada pote foi pesado antes e depois da inoculação das plantas, as quais, após inocu-ladas, sob condições assépticas, em meio de cultura modificado, foram mantidas em sala de crescimento com temperatura de 24±1 oC e fotoperíodo de 16 horas de luz durante 30 dias, determinando-se o peso final da matéria fresca. Para determinar a variação do ganho de matéria fresca, subtraiu-se o peso inicial do explante do seu peso final. A concentração de N total das plantas foi quantificada pelo método Micro–Kjedhal, segundo as normas da AOAC (1975).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Segundo os resultados dos testes de infecção efe-tuados após o isolamento e cultivo dos ápices caulinares de cana-de-açúcar, técnica utilizada para produzir plan-tas livres de microrganismos, constatou-se que as bacté-rias fixadoras A. diazotrophicus e Herbaspirillum spp. não foram eliminadas dos seus tecidos. Dessa forma, essa técnica não interfere na disseminação dessas bac-térias, que são benéficas a essa cultura. Por outro lado, Reis et al. (1999) observaram que esse protocolo supri-me as bactérias fixadoras de nitrogênio dos tecidos da cana-de-açúcar proveniente do cultivo in vitro. Sabe-se que essas bactérias ocupam os espaços intercelulares e vasos xilemáticosdaplanta (DONG et al., 1994; JAMES
et al., 1997). Portanto, no ato do isolamento do ápice caulinar, qualquer fragmento de tecido pode conter cé-lulas desses microrganismos, que se multiplicam dentro da planta, sem contaminar o meio de cultura.
Analisando o ganho de biomassa após 30 dias de cultivo, verificou-se que as cultivares estudadas não di-feriram significativamente nos diferentes níveis de ni-trogênio aos quais foram submetidas, com exceção da cultivar CB 45-3, que diferiu da Co 997 quando culti-vada na ausência de nitrogênio (Tabela 1).
Na ausência do nitrogênio, a cultivar Co 997 acumulou, aproximadamente, 40% a mais de biomassa que as cultivares SP 71-6949 e SP 70-1143 e 100% a mais que a CB 45-3. Além disso, o ganho de biomassa da cultivar Co 997, na ausência de nitrogênio, não dife-riu significativamente daqueles observados nos meios contendo 4,92 mM e 2,46 mM (Tabela 1).
Esses resultados são condizentes com aqueles observados para o conteúdo de nitrogênio total (NT), em que a cultivar Co 997 apresentou em torno de 20% a mais de nitrogênio que a CB45-3 e, aproximadamen-te, 44% a mais que as cultivares SP 71-6949 e SP 70-1143 (Tabela 2). Da mesma forma,Araújo et al. (1996) utilizaram o peso da matéria seca e o conteúdo de NT das folhas como parâmetros para estudar a eficiência da fixação biológica do nitrogênio em feijoeiro. Os au-tores verificaram que a simbiose feijoeiro-rizóbio foi capaz de fixar N atmosférico e suprir as necessida-des das plantas, proporcionando necessida-desenvolvimento semelhante àquelas que receberam adubação nitro-genada.
TABELA 1 – Peso da matéria seca acumulada (g) em plantas de cana-de-açúcar cultivadas in vitro, em diferentes
níveis de nitrogênio, após 30 dias de cultivo.(IPA- Sede, Recife – 2002).
Cultivares Níveis de N no meio de cultura1
SP 71-6949 SP 70-1143 Co 997 CB 45-3 9,83 mM 0,3069 a2A 0,2661 ab A 0,3728 a A 0,3489 a A 7,37 mM 0,3139 a A 0,2635 ab A 0,3726 a A 0,3166 a A 4,92 mM 0,3111 a A 0,2878 a A 0,3287 ab A 0,3464 a A 2,46 mM 0,3014 a A 0,3168 a A 0,3231 ab A 0,2819 a A 0,00 mM 0,1618 b AB 0,1622 b AB 0,2270 b A 0,1077 b B 1
Meio com sais do MS, acrescido de sacarose e diferentes níveis de N.
2
Médias seguidas pela mesma letra, minúsculas na vertical e maiúsculas na horizontal, não diferem a 5%, pelo teste tukey.
TABELA 2 – Concentração de nitrogênio total (g.Kg–1) em plantas de cana-de-açúcar, após 30 dias de cultivo in vitro, em meios de cultura com diferentes níveis de nitrogênio. (IPA- Sede, Recife – 2002).
Cultivares Níveis de N no meio de cultura1 SP 71-6949 SP 70-1143 Co 997 CB 45-3 --- g.kg –1--- 9,83 mM 45,38 a A2 41,80 a A 45,50 a A 43,00 a A 7,37 mM 39,45 b A 37,15 a A 36,70 b A 40,20 a A 4,92 mM 32,85 c AB 31,60 b AB 33,58 b A 29,10 b B 2,46 mM 21,43 d A 21,60 c A 25,55 c A 21,23 c A 0,00 mM 11,78 e B 11,75 d B 21,18 c A 16,80 c A 1
Meio com sais do MS, acrescido de sacarose e diferentes níveis de N.
2
Médias seguidas pela mesma letra, minúscula na vertical e maiúscula na horizontal, não diferem a 5%, pelo teste Tukey.
Quando se aborda a fixação biológica do nitro-gênio (FBN) em plantas não-leguminosas, são comuns relatos em que o genótipo da planta exerce forte in-fluência sobre esse processo. Oliveira (1994) observou diferenças consideráveis na contribuição do nitrogênio fixado biologicamente em 40 cultivares de arroz. Da mesma forma, Miranda et al. (1990) verificaram que havia diferenças no percentual de nitrogênio prove-niente da fixação biológica entre ecótipos de Panicum maximum. Em milho, Salomone e Döbereiner (1996) observaram que genótipos responderam diferentemente à inoculação de Azospirillum, alguns com aumento de produção de até 100%. Em cana-de-açúcar, a impor-tância do genótipo para o bom desempenho do processo da fixação biológica do nitrogênio já havia sido ressal-tado desde os primeiros ensaios conduzidos por Urqui-aga et al. (1992). Entretanto, nos últimos anos, não e-xistem relatos relacionados ao desempenho de novas cultivares quanto à capacidade de fixação biológica do nitrogênio. Provavelmente, a ausência de avaliação contínua e utilização dessas características nos progra-mas de melhoramento pode proporcionar perdas gené-ticas em relação à capacidade de associação com as bac-térias fixadoras de N2.
Utilizando a técnica do cultivo in vitro, é possí-vel controlar a atmosfera de crescimento das plantas, ao contrário dos experimentos conduzidos no campo, onde a significância agronômica dos dados é comprometida (MATSUI et al., 1981). Em experimentos conduzidos em canteiros, Urquiaga et al. (1992) também
observa-ram que as cultivares CB 45-3 e SP 70-1143 apresenta-ram larga contribuição de N fixado biologicamente, participando com valores entre 40 e 60% do N da plan-ta. No entanto, problemas metodológicos, como o cons-tante declínio do nitrogênio mineral do solo enriqueci-do com 15N, transporte do nitrogênio nas raízes e base dos colmos, de uma safra para a outra, e o sombrea-mento da cultura controle não permitiram a determina-ção correta do nitrogênio fixado biologicamente. Por outro lado, a utilização do cultivo in vitro possibilita o conhecimento de tudo que é fornecido à planta. Dessa forma, pode-se estudar o potencial de fixação biológica do nitrogênio com maior segurança, já que é possível retirar integralmente todas as fontes de nitrogênio do meio de cultura.
De acordo com os resultados obtidos neste traba-lho, pode-se sugerir que a cultivar Co 997 é mais eficiente no processo de FBN que a cultivar SP 70-1143, relatada por Urquiaga et al. (1992), como a culti-var que mais se beneficia desse processo. Didonet et al. (1996) também observaram que os microrganismos fi-xadores de nitrogênio interagiram de maneira diferen-ciada em plantas de trigo, de acordo com as cultivares em que foram inoculados. Anteriormente, Ruschel et al. (1978) já haviam observado que diferenças entre culti-vares influem na atividade da nitrogenase. Os autores demonstraram que a cultivar CB 46-47 fixou mais N no período de 24 horas (1,79 µg de N) que as demais cul-tivares estudadas, todas oriundas da mesma mãe, porém de pais diferentes.
Sabe-se que o processo de fixação biológica do nitrogênio pode contribuir com um aumento considerá-vel no conteúdo de nitrogênio da planta hospedeira. De acordo com Bergersen (1980), esse aumento pode ser estimado por meios diretos, como a determinação do N total e proteína. Verificou-se que para o conteúdo de NT, as cultivares estudadas não diferiram entre si quando cultivadas na maioria dos níveis de nitrogênio (TABELA 2).
A cultivar Co 997 apresentou o maior valor acumulado de N total quando cultivada na ausência de nitrogênio, representando em torno de 53% do nitrogê-nio acumulado quando cultivada na maior concentração de N (9,83mM). Além disso, a média geral do conteúdo de NT determinado nas plantas cultivadas na ausência desse elemento foi inferior à obtida pela cultivar Co 997 nas mesmas condições de cultivo, sugerindo que essa cultivar apresenta maior potencial de fixação biológica do nitrogênio ou melhor capacidade de interação com as bactérias. Bohrer e Hungria (1998) também utiliza-ram a concentração de NT e o peso da matéria seca como parâmetros para determinar cultivares de soja com maior capacidade de fixação biológica de nitrogê-nio e verificaram que esses parâmetros são suficientes para essa finalidade.
De acordo com Bergersen (1980), Mengel e Kirkby (1987) e Larcher (1995), o nitrogênio compre-ende em torno de 2-4% do peso da matéria seca da planta. Neste trabalho, para estimar a variação do N to-tal encontrado nas plantas cultivadas sem nitrogênio, considerou-se que 4% do peso da matéria seca do ex-plante inicial foi referente ao nitrogênio. Assim, foi possível verificar que para a cultivar Co 997, quando cultivada por 30 dias sem nitrogênio, houve variação de 57% na concentração do N total em relação ao esti-mado para o explante inicial, apontando essa cultivar como de maior potencial na fixação biológica do ni-trogênio. No entanto, para as demais cultivares, ob-servou-se que houve variação negativa, ou seja, o ni-trogênio estimado no explante inicial foi superior ao encontrado após 30 dias de cultivo na ausência de N, que provavelmente foi proveniente da reserva do explante inicial.
Por outro lado, observou-se que a redução dos níveis de N não afetou significativamente o crescimento das cultivares estudadas (Tabela 1). Então, consideran-do que o ganho de biomassa de uma planta é essen-cialmente limitado pelo suprimento de nitrogênio (LARCHER, 1995), acredita-se que o crescimento das plantas na ausência de N, medido pelo peso da matéria
seca, possivelmente foi sustentado pela fixação biológi-ca do N2.
CONCLUSÕES
a) A cultivar Co 997 apresenta maior ganho de biomassa e maior valor acumulado de NT quando cultivada na ausência de nitrogênio, sugerindo um maior potencial para a fixação biológica de nitrogê-nio em relação às cultivares SP 71-6949, SP 70-1143 e CB 45-3.
b) A redução dos níveis de nitrogênio não afeta, consideravelmente, o crescimento das plantas. Mas, pa-ra um melhor crescimento in vitro, recomendam-se meios de cultivo com doses mínimas de N.
c) O cultivo de ápices caulinares de cana-de-açúcar não elimina as bactérias fixadoras do nitrogênio existentes em seus tecidos.
d) A ausência de N no meio de cultura reduziu o peso de matéria seca acumulada.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ARAUJO, F. F.; MUNHOZ, R. E. V.; HUNGRIA, M. Início da nodulação em sete cultivares de feijoeiro ino-culadas com duas estirpes de Rizobium. Pesquisa
Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 31, p. 435-443,
1996.
ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis of the
official analytical chemists. 12. ed. Washington, 1975.
1094 p.
AZEREDO, D. F.; BOLSANELLO, J.; WEBER, M.; VIEIRA, J. R. Nitrogênio em cana-planta doses e fra-cionamento. STAB, Piracicaba, v. 4, p. 26-32, 1986.
BERGERSEN, F. J. Measurement of nitrogen fixation by direct means. In: ______. Methods for evaluating
biological nitrogen fixation. New York: A
Wiley-Interscience, 1980. cap. 2, p. 65-110.
BODDEY, R. M.; DÖBEREINER, J. Nitrogen fixation associated with grasses and cereals: recent progress and perspectives for the future. Fertilizer Research, The Hague, v. 4, p. 1-10, 1995.
BOHRER, T. R. J.; HUNGRIA, M. Avaliação de culti-vares de soja quanto á fixação biológica do nitrogênio.
Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 33, p.
CAVALCANTE, V. A.; DÖBEREINER, J. A New acid-tolerant nitrogen-fixing bacterium associated with sugarcane. Plant and Soil, The Hague, v. 108, p. 23-31, 1988.
DIDONET, A. D.; RODRIGUES, O.; KENNER, M. H. Acúmulo de nitrogênio e de massa seca em plantas de trigo inoculadas com Azospirillum brasilense. Pesquisa
Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 31, p. 645-651,
1996.
DÖBEREINER, J.; BALDANI, V. L. D.; BALDANI, J. I. Como isolar e identificar bactérias diazotróficas
de plantas não-leguminosas. Brasília:
EMBRAPA-CNPAB, 1995. 60 p.
DÖBEREINER, J. Fixação de nitrogênio em gramí-neas. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Campi-nas, v. 1, p. 1-54, 1977.
DONG, Z.; CANNY, M. J.; MCCULLY, M. E.; ROBORETO, M. R.; CABADILLA, C. F.; ORTEGA, E.; RODÉS, R. A nitrogen -fixing endophyte of sugarcane stems: a new role for the apoplast. Plant Physiology, Minneapolis, v. 105, p. 1139-1147, 1994.
GILES, K. L.; VASIL, I. K. Nitrogen fixation and plant tissue culture. In: VASIL, I. K. (Ed.). Perspectives in
plant cell and tissue culture. New York: Academic,
1980. p. 81-97.
JAMES, E. K.; OLIVARES, F. L.; BALDANI, J. I.; DÖBEREINER, J. Herbaspirillum, an endophytic diazotroph colonizing vascular tissue in leaves of Sorghum bicolor L. Moench. Journal of
Experimental Botany, Oxford, v. 48, p. 785-797,
1997.
LARCHER, W. Physiological plant ecology. 3. ed. Berlin: Verlag Berlin Heidelberg, 1995. 506 p.
LIMA, E.; BODDEY, R. M.; DÖBEREINER, J. Quantification of biological nitrogen fixation associated with sugar cane using a 15 N aided nitrogen balance.
Soil Biology and Biochemistry, Elmsford, v. 19, p.
165-170, 1987.
LIU, M. C. In vitro methods applied to sugarcane improvement. In: THORPE, T. A. (Ed.). Plant tissue
culture. New York: Academic, 1980. p. 99-323.
MATSUI, E.; VOSE, P. B.; RODRIGUES, N. S. R.; RUSCHEL, A. P. Use of 15N enriched gas to determine N2-fixation by undisturbed sugar cane plant in the field.
In: VOSE, P. B.; RUSCHEL, A. P. (Eds.). Associative
N2 fixation. Boca Roton: CRC, 1981. v. 2, p. 153-161.
MENGEL, K.; KIRKBY, E. A. Principles of plant
nutrition. 4. ed. Switzerland: International Potash
Instituti, 1987. 687 p.
MIRANDA, C. H. B.; URQUIAGA, S.; BODDEY, R. M. Selection of ecotyps of Panicum maximum for associated biological nitrogen fixation using the 15N isotope dilution technique. Soil Biology and Biochemistry, Elmsford, v. 22, p. 657-663, 1990.
MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A. Revised medium for rapid growth and bioassays with tabacco tissue cultures.
Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 15, p.
473-497, 1962.
NEVES, M. C. P.; RUMJANECK, N. G. Bioquímica e fisiologia da fixação de nitrogênio. In: CARDOSO, E. J. B. N.; TSAI, S. M.; NEVES, M. C. P. (Eds.).
Mi-crobiologia do solo. Campinas: Sociedade Brasileira de
Ciência do Solo, 1992. cap. 10, p. 141-155.
OLIVEIRA, O. C. Quantificação da fixação biológica
de nitrogênio em arroz (Oryza sativa L.) inundado.
1994. 235 f. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Itaguaí, 1994.
PATRIQUIN, D. G.; DÖBEREINER, J. Light microscopy observations of tetrazolium-reducing bacteria in the endorhizosphere of maize and other tropical grasses in Brazil. Canadian Journal of Microbiology, Ottawa, v. 24, p. 734-742, 1978.
REIS, V. M.; OLIVARES, F. L.; OLIVEIRA, A. L. M. de; REIS JÚNIOR, F. B. dos; BALDANI, J. I.; DÖBEREINER, J. Technical approaches to inoculate micropropagated sugar cane plants with Acetobacter diazotrophicus. Plant and Soil, The Hague, v. 206, p. 205-211, 1999.
RUSCHEL, A. P.; VICTORIA, L. R.; SALATI, E.; HENIS, Y. Nitrogem fixation in sugar cane (Saccharum officinarum). In: GRANHALL, V. (Ed.).
Enviromental role of nitrogen-fixing bluegreen algae and asymbiotic bacteria. Uppsala: Swedish Natural
SALOMONE, I. G. de; DÖBEREINER, J. Maize genotype effects on the response to Azospirillum inoculation. Biology
and Fertility of Soils, Berlin, v. 21, p. 193-196, 1996.
URQUIAGA, S.; CRUZ, K. H. S.; BODDEY, R. M. Con-tribution of nitrogen fixation to sugarcane: nitrogen - 15 and nitrogen - balance estimates. Soil Science Society
American Journal, [S.l.], v. 56, p. 105-114, 1992.
URQUIAGA, S.; BOTTEON, P. B. L.; BODDEY, R. M. Selection of sugarcane cultivars for associated biological nitrogen fixation using 15N- labelled soil. In: INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON NITROGEN FIXATION WITH NON-LEGUMES, 4., 1987, Rio de Janeiro. Proceedings… [S.l.]: Developments in Plant and Soil Sciences, 1987. p. 311.
