A r t i g o
RESUMO
As amebas de vida-livre (AVLs) são protozoários unicelulares encontrados em
di-versos ambientes como, por exemplo, solo, poeira, ar, piscinas, lagos, soluções
de limpeza de lentes de contato, esgotos, unidades de ar-condicionado etc. Os
gêneros com relevância em Saúde Pública são Naegleria e Acanthamoeba. O
ob-jetivo do trabalho foi o de avaliar a ocorrência de AVLs em amostras aleatórias de
solo e água de três lagos do município de Barretos-SP. Foram coletadas doze
amostras de solo através de raspado ao redor dos lagos e doze amostras de
água. Para o isolamento deAVLs foi utilizado o meio de cultura ágar-soja. Uma pequena
porção dos raspados de solo foram semeados no centro de cada placa com
ágar--soja. O isolamento das AVLs de amostras de água foi obtido por centrifugação e
o sedimento foi aspirado e semeado nas placas com meio de cultura. Após 48
ho-ras foi realizada a primeira análise microscópica, por exame direto. A identificação
das amebas foi feita pela observação de cistos, trofozoítos e flagelados. Das doze
amostras de solo, oito (66,66%) das amostras foram positivas para AVLs. Dentre
as amostras positivas, o gênero Naegleria apareceu em todas (100%) as amostras.
Já das doze amostras de água, dez (83,33) foram positivas para AVLs. Dentre as
amostras positivas, houve predomínio do gênero Naegleria e menor prevalência do
gênero Acanthamoeba e Vannella. Após uma semana realizou-se a segunda análise
das amostras para nova avaliação microscópica. Das doze amostras de solo, todas
apresentaram positividade para AVLs. Dentre as amostras positivas, houve
predo-mínio do gênero Naegleria, enquanto o gênero Vannella esteve presente em apenas
uma (8,33%) amostra. Enquanto que das doze amostras de água, onze (91,67%)
foram positivas para AVLs. Dentre as amostras positivas, houve predomínio do
gê-nero Naegleria, enquanto o cisto de Acanthamoeba esteve presente em 1 (8,33%)
amostra. Posteriormente, as amebas observadas com características morfológicas
do gênero Naegleria foram submetidas à prova de flagelação para confirmação do
gênero. Seis amostras de solo e duas de água foram positivas para a prova de
fla-gelação, já que estas apresentaram formas flageladas. Concluímos que, conforme
a literatura especializada, os gêneros Naegleria e Acanthamoeba
são frequentes na
natureza, especialmente no ambiente pesquisado. A caracterização das espécies
e o potencial patogênico das mesmas deverão ser estudados posteriormente para
as recomendações de medidas de profilaxia.
Palavras-chave: Amebas de Vida-Livre. Lago. Solo. Água. Naegleria e Acanthamoeba.
Patrícia Rodella*, Ana Cláudia Facio, Ana Paula Facioe Mônica Cristina Capella
Centro Universitário da Fundação Educacional de Barretos - UNIFEB *Correspondência (Professora orientadora) E-mail: pati.rodella@gmail.com
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE
AMEBAS DE VIDA LIVRE (AVL) EM
AMOSTRAS DE SOLO E ÁGUA DE LAGOS
DO MUNICÍPIO DE BARRETOS – SP
ISOLATION AND IDENTIFICATION OF
FREE-LIVING AMOEBA (FLA) IN SOIL AND WATER
SAMPLES FROM LAKES OF THE CITY OF
BARRETOS-SP
INTRODUÇÃO
As amebas de vida livre potencialmente patogênicas (AVLs) são protozoários aeróbios que estão amplamen-te distribuídos no meio ambienamplamen-te, sendo encontradas em todos os continentes e nas mais diversas altitudes. São altamente resistentes a temperatura, pH e a vários produ-tos desinfetantes, bem como ao cloro e a outros sistemas de desinfecção e a condições extremas do ambiente. As AVLs mais comumente encontradas com capacidade pa-togênica são as pertencentes ao gênero Acanthamoeba, e a espécie Naegleria fowleri. (BOTTONE, 1993; VIVES-VARA et al., 1993).
As AVLs não requerem um hospedeiro em seu ciclo vital (“vida livre”) e as infecções são consideradas acidentais (como nos casos de meningites agudas por Naegleria sp. (BOTTONE, 1993; VIVESVARA et al., 1993).
Atualmente, dentre as de interesse médico, são inclu-ídas várias espécies do gênero Acanthamoeba sp, além da Naegleria fowleri, já que estas são importantes cau-sas de infecções, principalmente em indivíduos debili-tados e imunocomprometidos. (BOTTONE, 1993; VIVES-VARA et al., 1993).
As AVLs são ubiquitárias no ambiente. Espécies de Naegleria preferem ambientes aquáticos, natural ou artificialmente aqueci-dos e o solo, enquanto espécies de Acanthamoeba ocorrem em qualquer ambiente. (BOTTONE, 1993; VIVESVARA et al., 1993).
A porta de entrada das amebas pode tanto ser o trato res-piratório quanto úlceras de pele, mucosas e microtraumatis-mos nos olhos, relacionadas à inalação de poeiras contami-nadas e contato (lazer, consumo e higiene pessoal e de lentes contato) com águas contaminadas (FERNANDEZ & CRESPO, 1992; MARTINEZ, 1985).
A infecção por Naegleria sp ocorre através da entrada de água contaminada nas vias nasais, com maior frequência ao mergulhar ou nadar em águas doces com deficiência no Sa-neamento Básico. O diagnóstico pode ser feito pelo exame microscópico do fluido cefalorraquidiano recém coletado, no qual se identificam amebas móveis. As infecções causadas pelas AVL são de caráter grave e podem levar a morte. O diagnóstico é de difícil realização e não há medicamentos que atuem eficazmente contra elas, por isso o tratamento geral-mente é composto de antifúngicos e antibacterianos (FER-NANDEZ & CRESPO, 1992; MARTINEZ, 1985).
most relevance in public health. The present study aims to evaluate the FLA
occur-rence in random samples of dirt and water of three lakes of the city of Barretos,
SP. Twelve samples of water and dirt from the shore of the lakes were collected.
To isolate the FLA, agar-soy was used as culture medium. Small part of the dirt
sample was spread in the center of the Petri dish containing the growth medium. To
isolate the FLA from the water, the liquid was centrifuged, the sediments were
col-lected and spread in the growth medium. After 48 hs of incubation the first analysis
was realized on the light microscope. The amoebas were identified by observation
of cists, trophozoites and flagellates. Eight of twelve (66.6%) of the dirt samples
were positive to FLA and all of them presented the Naegleria
genus. In the water samples, ten of them (83,3%) were positive to FLA; in these samples there was a
prev-alence of the Naegleria
genus, Acanthamoebae Vannella
genres were also observed in a small proportion. One week later, the second microscopic analysis was realized. At this time, all dirt samples were positive to FLA, showing prevalence of the Naegleria genus, theVannella
genus was observed in one sample (8,3%). In the water samples,
eleven (91,67%) were positive to FLA, showing prevalence of the Naegleria
genus, the Acanthamoeba cists were observed in one sample (8,3%).To confirm the genus,
amoebas showing morphological characteristics of Naegleria
were submitted to the flagellation test. Six samples of dirt and two samples of water were positive to the flagellation test. In conclusion, the dirt and water samples from the lakes used in this study contain the Naegleria and Acanthamoeba genres. Although this genres were usually observed in nature, the characterization and the pathogenic potential requires further analysis in order to prepare the prophylactic measures in these locations.A r t i g o
MATERIAL E MÉTODOS
Fontes de Isolamento das amebas
As amostras de água (120 mL) foram coletadas da su-perfície dos três lagos, em frascos estéreis de vidro, tota-lizando 12 amostras. Já as amostras de solo foram coleta-das através de raspado ao redor dos lagos, num total de 12 amostras de solo, ou seja, de 4 locais (pontos) de cada lago. Estas amostras foram escolhidas aleatoriamente. Meio de cultura
Para o isolamento de AVLs foi utilizado o meio ágar--soja (FORONDA, 1979), preparado da seguinte forma: 0,2 g de farinha de soja, 100 mL de água destilada esterilizada e 1,5g de ágar bacteriológico.
A farinha de soja foi dissolvida em água destilada e dei-xada em repouso por 24 horas. Após esse período essa suspensão foi filtrada em papel de filtro e o ágar bacterio-lógico foi acrescentado à solução. O meio foi autoclavado a 121ºC por quinze minutos e após resfriamento foi distri-buído em 24 placas de Petri (90 x 15 mm).
Semeadura
Uma pequena porção dos raspados de solo foram se-meados no centro de cada placa com ágar-soja.
O isolamento das AVLs de amostras de água foi obtido por centrifugação (2500 rpm por 5 minutos) e o sedimento foi aspirado e semeado em placas de Petri com ágar soja. As placas foram colocadas em sacos plásticos para evitar a dessecação e mantidas a temperatura ambiente. Após 48 horas foi realizada a primeira análise microscó-pica por exame direto. Para isto, cerca de 1 mL de água destilada esterilizada foi aplicada à placa e, após isso, par-te da suspensão foi retirada para avaliação microscópica. Após uma semana realizou-se a segunda análise mi-croscópica por exame direto. Para isso, utilizou-se 1 mL de água destilada esterilizada, a qual foi aplicada à placa e após isso parte da suspensão foi retirada para nova ava-liação microscópica.
A identificação das amebas foi feita pela observação de cistos, trofozoítos e flagelados. As amebas observadas com características morfológicas do gênero Naegleria fo-ram submetidas à prova de flagelação para confirmação do gênero.
Prova de flagelação
Para prova de flagelação, as amebas foram inoculadas no meio onde ocorreu seu isolamento e incubadas a 28ºC por 18 a 24 horas. O crescimento resultante foi coberto com água destilada esterilizada e incubado a 37ºC. A leitura foi fei-ta colocando-se uma gofei-ta do líquido entre lâmina e lamínula
e observando-se, ao microscópio, o aparecimento de formas flageladas ativamente móveis. Essa leitura foi feita a cada trin-ta minutos por quatro horas.
RESULTADOS
A ocorrência das amebas de vida livre observada dentre as doze amostras de solo e doze amostras de água coletadas em locais aleatórios dos lagos do município de Barretos-SP foi expressiva.
Amostras de solo
Na primeira análise microscópica, após lavagem das pla-cas, os resultados das amostras de solo do primeiro e segun-do lagos foram os seguintes: das quatro amostras coletadas, três (75%) foram positivas para AVLs, com formas flageladas sugestivas para o gênero Naegleria. Já nas amostras do ter-ceiro lago, das quatro amostras, apenas duas (50%) foram positivas para AVLs sugestivas para o gênero Naegleria.
Analisando a ocorrência das AVLs do gênero Naegle-ria nas amostras de solo coletadas ao redor dos três lagos, observou-se que as amostras dos lagos 1 e 2 foram as que apresentaram maior positividade. A única morfologia encon-trada nessas amostras foi a forma flagelada.
Após uma semana realizou-se a segunda lavagem das amostras para nova avaliação microscópica. Os resultados das amostras de solo do primeiro, segundo e terceiro lago foram os seguintes: das doze amostras coletadas, todas (100%) foram positivas para AVLs.
Amostras de água
Na amostra de água do primeiro e segundo lagos, das quatro amostras, três (75%) foram positivas para AVLs, sendo que na amostra de água do lago 1, observou-se formas flageladas su-gestivas para o gênero Naegleria com positividade de 75%. Os resultados do lago 2 podem ser verificados na Figura 1.
Na amostra de água do lago 2, observou-se 45% de po-sitividade com formas flageladas sugestivas para o gênero Naegleria e 30% para o gênero Vannella.
Figura 1. Porcentagem de AVL na amostra de água do Lago 2
30% 45% 25% Naegleria Negativo Vannella
Figura 2. Porcentagem AVL na amostra de água do Lago 3
Na amostra de água do lago 3, foram observadas as formas trofozoítica, cística e flagelada sugestivas do gênero Naegleria, a qual a positividade encontrada foi de 50% e para o gênero Vannella foi de 37,5%, sendo que em 12,5% das amostras foi encontrada a forma cística do gênero Acanthamoeba.
Analisando a ocorrência das AVLs dos gêneros Naegleria, Vannella e Acanthamoeba nas amostras de água coletadas da superfície dos três lagos, observou-se que as amostras do lago 3 foram as que apresentaram maior positividade.
Os resultados da segunda análise do lago 1 podem ser vistos na tabela abaixo:
Tabela 1. Resultado da presença de amebas de vida livre, nas amostras de água coletadas da superfície de 4 locais diferentes de cada lago (2ª análise)
Amostra de Água
Locais coletados Positivo Negativo % de positividade
Lago 1 3 1 75
Lago 2 4 0 100
Lago 3 4 0 100
Total 11 1 12
Na amostra de água do lago 1, visualizou-se as formas trofozoítica, cística e flagelada sugestivas do gênero Naegle-ria, a qual a positividade encontrada foi de 75%.
Na amostra de água do lago 2, visualizou-se as formas trofozoítica, cística e flagelada sugestivas do gênero Naegle-ria, a qual a positividade encontrada foi de 80% e visualizou--se também cistos do gênero Acanthamoeba com positivida-de positivida-de 20%.
Na amostra de água do lago 3, visualizou -se as formas trofozoítica, cística e flagelada sugestivas do gênero Naegle-ria, a qual a positividade foi de 100%.
Figura 3. Forma flagelada sugestiva do gênero Naegleria
A Figura 4 representa a forma trofozoítica do gênero Van-nella, as Figuras 5 representam estruturas císticas sugestivas do gênero Naegleria.
Figura 4. Forma trofozoítica do gênero Vannella
Figura 5. Morfologia típica de cistos de Naegleria
37,5% 12,5%
50% Naegleria A cant hamoeba Vannella
A r t i g o
Posteriormente, as amebas observadas com caracterís-ticas morfológicas do gênero Naegleria foram submetidas à prova de flagelação para confirmação do gênero. Esta prova foi realizada a partir da segunda análise microscópica, pois foi a que apresentou maior positividade. O resultado dessa prova, encontra-se nas Tabelas 2 e 3:
thamoeba, que ocorre em qualquer ambiente segundo
Bottone e colaboradores (BOTTONE, 1993), esteve
pouco presente nas amostras, e estas estavam apenas
na água dos lagos.
O gênero Vanella não possui nenhum relato na
li-teratura de patogenicidade, no entanto, pode carregar
alguns patógenos. Hoffmann e colaboradores
relata-ram a presença de um organismo Microsporidian-like
“KW19” dentro de Vannella proveniente de amostras de
água de torneira (HOFFMANN et al., 1998). De acordo
com o presente trabalho, o gênero foi facilmente
iden-tificado através da forma flutuante, característica de
Vannella.
Na primeira análise microscópica
não houve o crescimento em todas as amostras de solo e água deAVLs.
Das doze amostras de solo, oito (66,66%) foram
po-sitivas para AVLs. Dentre estas, o gênero Naegleria
apareceu em todas (100%) as amostras. Já das doze
amostras de água, dez (83,33%) foram positivas para
AVLs. Dentre as amostras positivas, houve predomínio
do gênero Naegleria e menor prevalência do gênero
Acanthamoeba e Vannella.
Desta maneira, foi necessária a realização de uma
segunda análise, após uma semana, a qual apresentou
maior positividade.
No presente estudo, a frequ
ência deAVLs nas
amostras de solo foi elevada. Foram encontradas
AVLs nas doze (100%) amostras de solo
coleta-das. Nas amostras de solo houve a predominância
do gênero Naegleria, enquanto o gênero Vannella
esteve presente em apenas uma (8,33%) amostra.
Tsvetkova e colaboradores (2004) encontraram uma
alta frequ
ência deAVLs em amostras de barro. Em
nosso trabalho, o local de coleta das amostras de
solo (ao redor dos lagos) se encontrava bem
úmi-do. Giazzi (1996) demonstrou a prevalência de AVLs
em 23 amostras de solo e outros locais e obteve um
percentual de 86,9% para espécies de
Acanthamo-eba e 39,1% para espécies de Naegleria. Os cistos
de Acanthamoeba
são bastante resistentes a inúmeras condições adversas inclusive à dessecação. Os cistos deNaegleria são menos resistentes a essa situação (
SINGH,
1997). A frequência por nós encontrada
não condiz com os achados anteriores, pois no nosso trabalho o gênero Naegleria apareceu em quase todas asamos-tras de solo analisadas, pois estas estavam úmidas,
facilitando então a sua viabilidade.
A frequência de AVLs nas amostras de água também
foi relativamente elevada. Das 12 amostras de água, 11
(91,67%) foram positivas para AVLs. Dentre as
amos-tras positivas houve predomínio do gênero Naegleria,
enquanto o cisto de Acanthamoeba esteve presente em
uma (8,33%) amostra.
Nas amostras positivas para AVLs, observou-se
maior predominância do gênero Naegleria (91,67%)
Tabela 2. Tempo de Incubação das amostras de solo positivas para amebas do Gênero Naegleria
Amostra de Solo (Gênero Naegleria) Tempo de Incubação (em min) Locais coletados 30 60 90 120 150 180 210 240
Lago 1 2 0 0 0 0 1 0 0
Lago 2 0 1 0 0 0 0 0 0
Lago 3 2 0 0 0 0 0 0 0
Total 4 1 0 0 0 1 0 0
Tabela 3. Tempo de Incubação das amostras de água positivas para amebas do Gênero Naegleria
Amostra de Água (Gênero Naegleria) Tempo de Incubação Locais coletados 30 60 90 120 150 180 210 240 Lago 1 0 0 0 0 0 0 0 0 Lago 2 0 0 0 1 0 0 0 0 Lago 3 0 0 0 0 0 0 1 0 Total 0 0 0 1 0 0 1 0 DISCUSSÃO
As AVLs
são protozoários aeróbios que estão distribuídosem diferentes lugares do mundo como solo, água
de rios, lagos, piscinas, além de serem encontradas
também em água mineral garrafadas e nas lentes de
contato. Espécies de Naegleria preferem ambientes
aquáticos, natural ou artificialmente aquecidos e o
solo, enquanto, espécies de Acanthamoeba ocorrem
em qualquer ambiente. (BOTTONE, 1993; VIVESVARA
et al., 1993). Conforme resultado do presente estudo,
pôde-se constatar nas amostras de solo e água
coleta-das dos três lagos a presença de AVLs com predomínio
do gênero Naegleria, as quais foram confirmadas
atra-vés da prova de flagelação. Enquanto o gênero
Acan-em amostras ambientais, no nosso trabalho,
represen-tantes do gênero Naegleria foram mais frequentes nas
amostras de solo e água.
A partir da segunda lavagem das placas e observação
microscópica realizou-se a prova de flagelação para
con-firmar o gênero Naegleria. Algumas amebas
pertencen-tes a outros gêneros podem apresentar características
morfológicas semelhantes, mas somente espécies de
Naegleria possuem a capacidade de flagelação dentro
das condições do teste.
O isolamento primário de AVLs é descrito na
lite-ratura através da semeadura de amostras (de diversas
origens) em placas de ágar contendo meio de cultura. A
manutenção da cultura é feita através dos repiques que
consistem na retirada de um pedaço de ágar contendo
cistos e/ou trofozoítos e posterior implantação no
cen-tro de uma nova placa. Para a purificação da cultura e
crescimento em cultura axênica (monoclonal), repiques
consecutivos são realizados e, em alguns casos, com
associação de antifúngicos e antibacterianos. Mesmo
após a cultura purificada e o crescimento em cultura
axênica, as placas de isolamento primário são
man-tidas, na maioria dos casos (SCHUSTER, 2002). Não
foram realizadas tentativas de purificação das culturas
por antifúngicos ou antibacterianos para preservar as
amebas inicialmente isoladas e para não diminuir as
populações de AVLs.
Como era esperado, houve contaminação das amostras por bactérias e fungos de esporos resistentes, especialmente naquelas que foram coletadas do solo, já que amostras am-bientais sempre são muito contaminadas.
Contudo, a contaminação das amostras de solo não im-possibilitou a visualização e a documentação das formas evo-lutivas das amebas.
Existe um meio de cultura definido para espécies pa-togênicas de Naegleria, uma vez que há diferenças na de-manda nutricional de espécies patogênicas e não patogê-nicas. Para as espécies não patogênicas, há a necessidade de maior aporte nutricional. No gênero Acanthamoeba, na maioria das vezes, espécies patogênicas e não patogêni-cas apresentam um bom crescimento no mesmo meio de cultura. O meio de cultura que melhor proporciona o cres-cimento de Acanthamoeba é o PPYG (proteose peptona ou peptona, extrato de levedura e glucose). As concentrações dos componentes desse meio podem variar (SCHUSTER, 2002). No Brasil, em 1979, a professora Dra. Annette Silva Foronda, em sua tese de doutorado, relatou a viabilidade do uso do meio de cultura ágar-infusão de soja (FORON-DA, 1979). A autora comparou o crescimento de amebas em diversos meios de cultura e constatou a eficácia do
Todas os lagos onde foram coletadas as
amos-tras de solo e água estão localizados em ambientes
abertos, isto é, ao ar-livre. Não se estabeleceu
ne-nhuma relação entre a presença de AVLs e o tipo
de ambiente, neste caso, aberto. No entanto, Górnik
e colaboradores (2004) analisaram amostras de
pis-cinas em ambientes fechados e ao ar-livre a fim de
estabelecer a frequ
ência deAVLs potencialmente
pa-togênicas. No estudo acima relatado foram
observa-das cepas patogênicas somente em piscinas ao
ar--livre, AVLs foram encontradas nos dois ambientes.
Como no presente estudo não foi realizado nenhum
teste de patogenicidade, não podemos afirmar sobre
essa característica nos gêneros encontrados,
embo-ra os gêneros Acanthamoeba e Naegleria contenham
espécies potencialmente patogênicas. Entretanto,
o autor acima referido afirma que a precipitação
at-mosférica e a poluição orgânica transportada pelos
banhistas para as piscinas ao ar livre podem
favore-cer o potencial de virulência das cepas encontradas
nesses ambientes.
Os lagos de onde foram obtidas as amostras de
solo e água estão situados em um local de lazer, ponto
turístico da cidade de Barretos, onde frequentemente
as pessoas fazem caminhadas, pescam, lancham e
encontram amigos. Como algumas crianças e
adoles-centes utilizam os lagos para banhar-se, esta atitude
se torna preocupante, uma vez que o estudo acima
concluiu que a poluição orgânica transportada pelos
banhistas, nesse caso para os lagos, pode favorecer o
potencial de virulência das AVLs.
Sabe-se hoje que algumas espécies de AVLs podem
comportar-se como parasitas facultativos de seres
hu-manos e de animais domésticos. Elas podem invadir
o sistema nervoso central e outros órgãos, causando
morte ou incapacidade permanente (GIAZZI,1996).
Atualmente, as espécies de maior importância
clí-nica são Naegleria fowleri e várias espécies do gênero
Acanthamoeba. A doença causada pelo agente
etioló-gico N. fowleri
é a doençaMeningoencefalite Amebiana
Primária (MAP), que é uma doença neurológica
caracte-rizada por lesões necrotizantes e hemorrágicas do
sis-tema nervoso central com uma evolução clinica rápida
e fatal.
Já a Encefalite Amebiana Granulomatosa (EAG) e
Ceratite por Acanthamoeba (infecção crônica da
cór-nea) podem ser causadas por várias espécies do gênero
Acanthamoeba. A Acanthamoeba pode causar também
infecções disseminadas, principalmente em pacientes
com AIDS ou transplantados (MURUKAWA et al., 1995).
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R E f E R ê N C I A S
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