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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO MARIA CAROLINA BRAGA NORTE ESTEVES

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

MARIA CAROLINA BRAGA NORTE ESTEVES

Identificação das mutações 35delG no gene da

conexina 26 (gene GJB2) e del(GJB6-D13S1830) e

del(GJB6-D13S1854) no gene da conexina 30 (gene

GJB6) como causadoras de perda auditiva

autossômica recessiva não sindrômica em famílias

da região de Marília-SP, Brasil

RIBEIRÃO PRETO 2013

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MARIA CAROLINA BRAGA NORTE ESTEVES

Identificação das mutações 35delG no gene da

conexina 26 (gene GJB2) e del(GJB6-D13S1830) e

del(GJB6-D13S1854) no gene da conexina 30 (gene

GJB6) como causadoras de perda auditiva

autossômica recessiva não sindrômica em famílias

da região de Marília-SP, Brasil

Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do Título de Doutor em Ciências Médicas.

Área de Concentração: Mecanismos

Fisiopatológicos nos Sistemas Visual e Audio-Vestibular.

Orientador: Profa. Dra. Myriam de Lima Isaac

RIBEIRÃO PRETO 2013

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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA

Esteves, Maria Carolina Braga Norte

Identificação das mutações 35delG no gene da conexina 26 (gene GJB2) e del(GJB6-D13S1830) e del(GJB6-D13S1854) no gene da conexina 30 (gene GJB6) como causadoras de perda auditiva autossômica recessiva não sindrômica em famílias da região de Marília-SP, Brasil. Ribeirão Preto, 2013.

159p.: 44il.; 30 cm

Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP. Área de Concentração: Mecanismos Fisiopatológicos nos Sistemas Visual e Audio-Vestibular.

Orientador: Isaac, Myriam de Lima.

1. Perda auditiva; 2. Biologia molecular; 3. Surdez genética; 4. Perda Auditiva Hereditária Não Sindrômica.

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FOLHA DE APROVAÇÃO

Aluno: Maria Carolina Braga Norte Esteves

Título: Identificação das mutações 35delG no gene da conexina 26 (gene

GJB2) e del(GJB6-D13S1830) e del(GJB6-D13S1854) no gene da conexina 30 (gene GJB6) como causadoras de perda auditiva autossômica recessiva não sindrômica em famílias da região de Marília-SP, Brasil.

Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do Título de Doutor em Ciências Médicas.

Área de Concentração: Mecanismos

Fisiopatológicos nos Sistemas Visual e Audio-Vestibular. Aprovado em:____/____/____ Prof. Dr. ________________________________________________________ Instituição: ______________________________________________________ Assinatura: ______________________________________________________ Prof. Dr. ________________________________________________________ Instituição: ______________________________________________________ Assinatura: ______________________________________________________ Prof. Dr. ________________________________________________________ Instituição: ______________________________________________________ Assinatura: ______________________________________________________ Prof. Dr. ________________________________________________________ Instituição: ______________________________________________________ Assinatura: ______________________________________________________ Prof. Dr. ________________________________________________________ Instituição: ______________________________________________________ Assinatura: ______________________________________________________

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Dedicatória

Ao meu querido marido Denis, pelo incentivo incondicional em todos os momentos, em especial nos de incerteza, tão comuns a quem busca novos caminhos; pela compreensão das muitas ausências e pelo companheirismo e carinho sempre.

Ao meu amado filho Henrique, razão principal de todo e qualquer esforço para evoluir nesta vida.

Aos meus pais Mariangela e Sergio, pelo amor, pela orientação e fé que me prepararam para os obstáculos da vida. E, principalmente, pelo exemplo.

Aos meus irmãos Janaina e Diego, companheiros leais e amigos para sempre.

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Agradecimentos Especiais

À Profa. Dra. Myriam de Lima Isaac, o meu reconhecimento especial por partilhar o seu profundo saber na realização deste estudo, bem como meu respeito e minha admiração pela sua serenidade e confiança em mim depositadas.

À Profa. Dra. Anete Maria Francisco, pelo apoio e pela confiança em todos os momentos.

Ao Prof. Dr. Alfredo Rafael Dell’Aringa, o meu agradecimento sincero por despertar sempre o desejo de progredir.

(7)

Agradecimentos

Às funcionárias do Departamento de Otorrinolaringologia da Faculdade de Medicina de Marília, Rosângela, Fátima e Lira, pelo suporte com os pacientes, pela solicitude e prontidão.

À assistente social Maria do Carmo, pelo carinho e respeito aos pacientes e pelo tempo dispensado a esta pesquisa.

Às fonoaudiólogas do Departamento de Otorrinolaringologia da Faculdade de Medicina de Marília, em especial, Ana Helena Banwart

Dell’Aringa, pela ajuda e pelo apoio durante esses anos.

Aos funcionários e docentes do Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Cristiane Ayres Ferreira,

Greice Andreotti de Molfetta, Prof. Dr. Victor Evangelista de Faria Ferraz e Prof. Dr. Wilson Araújo da Silva Junior, pela paciência,

disponibilidade e pelos serviços prestados.

À minha secretária Janaina, por ajudar a conciliar minha vida acadêmica e profissional.

À “vó” Lenilde, que foi “meus olhos e meu coração” para meu filho nas minhas ausências.

Aos pacientes e seus familiares, que permitiram que esta pesquisa fosse realizada.

A todos, que direta e indiretamente contribuíram para o desenvolvimento deste estudo.

(8)

Epígrafe

"Deus nos concede, a cada dia, uma página de vida nova no livro do tempo. Aquilo que colocarmos nela, corre por nossa conta."

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Resumo

ESTEVES, M.C.B.N. Identificação das mutações 35delG no gene da

conexina 26 (gene GJB2) e D13S1830) e del(GJB6-D13S1854) no gene da conexina 30 (gene GJB6) como causadoras de perda auditiva autossômica recessiva não sindrômica em famílias da região de Marília-SP, Brasil. 159f. Tese (Doutorado) -

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.

Introdução: A perda auditiva é a deficiência sensorial mais prevalente

na população humana; pode ter causas ambientais ou genéticas e estar ou não associada a síndromes. São consideradas causas genéticas de perdas auditivas congênitas quando a história gestacional é negativa para fatores ambientais, e as formas não sindrômicas representam 70% das perdas auditivas congênitas hereditárias. As perdas auditivas autossômicas herdadas de forma recessiva representam 80% das não sindrômicas e, entre elas, um único gene é responsável por 50% das perdas, o GJB2 (gap junction beta 2 protein). Uma única mutação, a c.35delG, destaca-se como a mais prevalente nesse gene e é causadora de perda auditiva. Mutações no gene GJB6 são corresponsáveis por perdas auditivas em pacientes com apenas um alelo mutado para c.35delG. Objetivo: Identificar a mutação c.35delG no gene da conexina 26 (gene GJB2) como causadora de perda auditiva autossômica recessiva não sindrômica em famílias da região de Marília, São Paulo, Brasil, bem como as mutações D13S1830) e del(GJB6-D13S1854) no gene da conexina 30 (GJB6), nos pacientes que se apresentaram heterozigotos para a primeira mutação citada. Casuística

e Métodos: Foram estudados 97 indivíduos, que apresentaram perda

auditiva sensorioneural, condutiva ou mista, hereditária, de caráter autossômico recessivo e não sindrômica; residentes na região de Marília, São Paulo, Brasil e estes foram submetidos à avaliação otorrinolaringológica; audiológica; coleta de sangue e extração de DNA; testes moleculares por meio de PCR alelo específico e PCR multiplex.

Resultados: Foram encontrados dois indivíduos com genótipo

homozigoto para c.35delG/GJB2; oito heterozigotos para a mesma mutação e apenas um apresentou característica heterozigota composta para c.35delG(GJB2) / del(GJB6-D13S1830). Conclusão: A prevalência da mutação del(GJB6-D13S1830), entre os heterozigotos para c.35delG, esteve de acordo com a literatura. O aconselhamento genético deve considerar a complexidade dos fatores genéticos envolvidos e as limitações da triagem atual, dadas as diferenças fenotípicas encontradas entre os genótipos estudados.

Palavras-chave: Perda auditiva; Biologia Molecular; Surdez genética;

(11)
(12)

Abstract

ESTEVES, M.C.B.N. Identification of mutations c.35delG in the

connexin 26 gene (GJB2) and D13S1830) and del(GJB6-D13S1854) in the connexin 30 (GJB6) as cause of hearing loss in autosomal recessive nonsyndromic families from Marília-SP, Brazil.

159f. Thesis (Doctoral) - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.

Introduction: Hearing loss is the most prevalent sensory impairment in

the human population; causes can be genetic or environmental and it can be either associated with syndromes or not. The genetic causes of congenital hearing loss are considered when environmental factors in the gestational history are negative and nonsyndromic ones represent 70% of hereditary congenital hearing loss. Inherited autosomal recessive hearing losses represents 80% of those that are non-syndromic and, among them, a single gene, GJB2 (Gap junction beta-2 protein), is responsible for 50% of the losses. A single mutation, c.35delG, stands out as the most prevalent in this gene, causing hearing loss. Mutations in GJB6 are co-responsible for hearing loss in patients with only one mutant allele for c.35delG. Aim: Identify the c.35delG mutation in the connexin 26 gene (GJB2) as the cause of autosomal recessive nonsyndromic hearing loss in families in the region of Marília, São Paulo, Brazil, as well as del(GJB6-D13S1830) and del(GJB6-D13S1854) mutations in the connexin 30 (GJB6), in patients who presented heterozygouses for the first mutation mentioned.

Patients and Methods: Ninety-seven individuals, residents in Marília,

São Paulo, Brazil, with sensorineural, conductive or mixed, hereditary, autosomal recessive character, nonsyndromic hearing loss, were studied and these underwent ENT and audiological evaluation, blood collection and DNA extraction, molecular testing by allele specific PCR and multiplex PCR. Results: Two subjects were homozygous for c.35delG/GJB2; eight were heterozygous for the same mutation; and only one showed individual characteristic compound heterozygous for c.35delG(GJB2) / del(GJB6-D13S1830). Conclusion: The prevalence of the del(GJB6-D13S1830) mutation, among heterozygotes for c.35delG, was consistent with the literature. Genetic counseling should consider the complexity of the genetic factors involved and the limitations of current screening, given the phenotypic differences found between genotypes.

Keywords: Hearing loss; Molecular biology; Genetic deafness;

(13)
(14)

Lista de Figuras

Figura 1: Fluxograma com causas de perdas auditivas ...29

Figura 2: Formas de herança mendeliana ...41

Figura 3: PCR mostrando mutação c.35delG em suas formas homozigota e heterozigota...78

Figura 4: PCR mostrando mutação del(GJB6-D13S1830) em

sua forma heterozigota ...80

Figura 5: Distribuição percentual da população total das famílias normouvintes e com perda auditiva registrada. ...81

Figura 6: Distribuição percentual das causas de perda auditiva, entre as famílias registradas...83

Figura 7: Distribuição percentual das causas de perda auditiva, entre os indivíduos afetados registrados ...84

Figura 8: Distribuição percentual do total dos indivíduos com perda auditiva por causas autossômica recessiva ou desconhecida...85

Figura 9: Distribuição percentual das causas de exclusão das famílias ...86

Figura 10: Distribuição percentual das causas ambientais de

perda auditiva das famílias excluídas...87

Figura 11: Distribuição percentual das causas genéticas de

perda auditiva das famílias excluídas...87

Figura 12: Distribuição percentual das síndromes entre as famílias excluídas ...88

Figura 13: Distribuição percentual dos casos de perda auditiva

entre as famílias selecionadas...89

Figura 14: Distribuição percentual do total dos indivíduos afetados com exames audiométricos realizados ...90

Figura 15: Distribuição percentual dos indivíduos afetados com

informações audiométricas ...91

Figura 16: Distribuição percentual quanto ao gênero dos

(15)

Lista de Figuras

Figura 17: Distribuição percentual quanto à época de aparecimento da perda auditiva entre os indivíduos afetados que tinham audiometria...93

Figura 18: Distribuição percentual dos tipos de perda auditiva

entre os indivíduos afetados que tinham audiometria ....94

Figura 19: Distribuição percentual das perdas auditivas mistas

em relação aos indivíduos afetados e seus familiares ...95

Figura 20: Distribuição percentual das perdas auditivas mistas

em relação à época de aparecimento da mesma ...95

Figura 21: Distribuição percentual dos graus de perda auditiva

entre os indivíduos afetados que tinham audiometria ....96

Figura 22: Distribuição percentual do lado de acometimento da

perda auditiva entre os indivíduos afetados que tinham audiometria ...97

Figura 23: Distribuição percentual das perdas auditivas unilaterais em relação à época de aparecimento das mesmas...98

Figura 24: Distribuição percentual das perdas auditivas unilaterais em relação ao lado acometido...99

Figura 25: Distribuição percentual da forma da curva audiométrica da perda auditiva entre os indivíduos afetados que tinham audiometria...100

Figura 26: Distribuição percentual da progressão da perda auditiva entre os indivíduos afetados que tinham audiometria. ...101

Figura 27: Distribuição percentual do total de amostras de

sangue entre os indivíduos afetados...102

Figura 28: Distribuição percentual das amostras de DNA

analisadas entre os indivíduos afetados ...103

Figura 29: Distribuição percentual da análise molecular para

c.35delG/GJB2 nos 97 indivíduos com amostras de DNA ...104

(16)

Lista de Figuras

Figura 30: Distribuição percentual do gênero entre os heterozigotos para c.35delG/GJB2 e para

c.35delG/GJB2 e del(GJB6-D13S1830) ...107

Figura 31: Distribuição percentual quanto à época do início de aparecimento da perda auditiva entre os heterozigotos para c.35delG/GJB2 e para c.35delG/GJB2 e del(GJB6-D13S1830) ...108

Figura 32: Distribuição percentual dos graus de perda auditiva entre os indivíduos heterozigotos para c.35delG/GJB2 e para c.35delG/GJB2 e del(GJB6-D13S1830) ...109

Figura 33: Distribuição percentual da forma da curva audiométrica da perda auditiva entre os indivíduos heterozigotos para c.35delG/GJB2 e para c.35delG/GJB2 e del(GJB6-D13S1830) ...110

Figura 34: Distribuição percentual dos indivíduos heterozigotos para c.35delG/GJB2 e para c.35delG/GJB2 e del(GJB6-D13S1830), segundo a progressão da perda auditiva ...111

Figura 35: Distribuição percentual dos indivíduos segundo a análise molecular para a mutação del(GJB6-D13S1830) nos oito indivíduos heterozigotos para c.35delG/GJB2...112

Figura 36: Heredograma da família 03 ...113

Figura 37: Heredograma da família 09 ...115

Figura 38: Heredograma da família 108 ...117

Figura 39: Heredograma da família 111 ...119

Figura 40: Heredograma da família 119 ...120

Figura 41: Heredograma da família 132 ...121

Figura 42: Heredograma da família 133 ...122

Figura 43: Heredograma da família 135 ...123

(17)
(18)

Lista de Quadros

Quadro 1: Características dos sujeitos homozigotos para c.35delG/GJB2, identificados pelos números das respectivas amostras, segundo o gênero e as manifestações da perda auditiva... 105

Quadro 2: Características dos sujeitos heterozigotos para c.35delG/GJB2, identificados pelos números das respectivas amostras, segundo o gênero e as manifestações da perda auditiva... 105

Quadro 3: Características do sujeito heterozigoto para c.35delG/GJB2 e del(GJB6-D13S1830), identificado pelo número da respectiva amostra, segundo o gênero e as manifestações da perda auditiva... 106

Quadro 4: Características dos familiares acometidos do probando

da família 03 segundo o gênero e as manifestações da perda auditiva ... 114

Quadro 5: Características dos familiares acometidos do probando

da família 09 segundo o gênero e as manifestações da perda auditiva ... 116

(19)
(20)

Lista de Tabelas

Tabela 1: Total da população das famílias registradas ...82

Tabela 2: Distribuição das causas de perda auditiva entre as famílias registradas ...83

Tabela 3: Distribuição das causas de perda auditiva entre os indivíduos afetados registrados...84

Tabela 4: Total dos indivíduos com perda auditiva de causas autossômica recessiva ou desconhecida...84

Tabela 5: Causas de exclusão das famílias...86

Tabela 6: Distribuição das causas ambientais de perda auditiva das famílias excluídas ...86

Tabela 7: Distribuição das causas genéticas de perda auditiva das famílias excluídas...86

Tabela 8: Distribuição das síndromes entre as famílias excluídas ...88

Tabela 9: Distribuição dos casos de perda auditiva entre as

famílias selecionadas ...89

Tabela 10: Total dos indivíduos afetados com exames audiométricos realizados ...90

Tabela 11: Distribuição dos indivíduos afetados com informações audiométricas ...90

Tabela 12: Distribuição quanto ao gênero dos indivíduos afetados que tinham audiometria...91

Tabela 13: Época de aparecimento da perda auditiva entre os

indivíduos afetados que tinham audiometria...92

Tabela 14: Distribuição dos tipos de perda auditiva entre os

indivíduos afetados que tinham audiometria...93

Tabela 15: Distribuição das perdas auditivas mistas em relação

aos indivíduos afetados e seus familiares ...94

Tabela 16: Distribuição das perdas auditivas mistas em relação

(21)

Lista de Tabelas

Tabela 17: Distribuição dos graus de perda auditiva entre os

indivíduos afetados que tinham audiometria...96

Tabela 18: Lado de acometimento da perda auditiva entre os

indivíduos afetados que tinham audiometria...97

Tabela 19: Distribuição das perdas auditivas unilaterais em

relação à época de aparecimento das mesmas...98

Tabela 20: Distribuição das perdas auditivas unilaterais em

relação ao lado acometido...98

Tabela 21: Distribuição da forma da curva audiométrica da

perda auditiva entre os indivíduos afetados que tinham audiometria ...99

Tabela 22: Progressão da perda auditiva entre os indivíduos

afetados que tinham audiometria... 100

Tabela 23: Total de amostras de sangue entre os indivíduos

afetados... 101

Tabela 24: Distribuição das amostras de DNA analisadas entre

os indivíduos afetados ... 102

Tabela 25: Análise molecular para c.35delG/GJB2 nos 97 indivíduos com amostras de DNA... 103

Tabela 26: Distribuição do gênero entre os heterozigotos para

c.35delG/GJB2 e para c.35delG/GJB2 e

del(GJB6-D13S1830) ... 106

Tabela 27: Época de aparecimento da perda auditiva entre os

heterozigotos para c.35delG/GJB2 e para c.35delG/GJB2 e del(GJB6-D13S1830) ... 107

Tabela 28: Distribuição dos graus de perda auditiva entre os

indivíduos heterozigotos para c.35delG/GJB2 e para c.35delG/GJB2 e del(GJB6-D13S1830) ... 108

Tabela 29: Distribuição da forma da curva audiométrica da

perda auditiva entre os indivíduos heterozigotos para c.35delG/GJB2 e para c.35delG/GJB2 e

(22)

Lista de Tabelas

Tabela 30: Distribuição dos indivíduos heterozigotos para c.35delG/GJB2 e para c.35delG/GJB2 e

del(GJB6-D13S1830), segundo a progressão da perda auditiva ... 110

Tabela 31: Análise molecular para a mutação del(GJB6-D13S1830) nos oito indivíduos heterozigotos para c.35delG/GJB2... 111

Tabela 32: Análise molecular para a mutação del(GJB6-D13S1854) nos oito indivíduos heterozigotos para c.35delG/GJB2... 112

(23)
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Lista de Símbolos e Abreviaturas

AAP- American Academy of Pediatrics

AIDS- Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

CLDN14- Claudina 14

COCH- Coclina

COL11- Colágeno 11

dB- Decibel

DFNA- Nonsyndromic deafness autosomal dominant

DIAPH1- Protein diaphanous homolog 1

EYA4- Eyes absent homolog 4

FAMEMA- Faculdade de Medicina de Marília GJB- Gap Junction β Protein

HDIA1- Anti-diaphanous 1

HIV- Virus da Imundeficiência Humana

JCIH- Joint Committee on Infant Hearing

KCNQ- Potassium voltage-gated channel

OMS- Organização Mundial de Saúde

OTOF- Otoferlina

PAIR- Perda auditiva induzida por ruído

PCR- Reação em cadeia de polimerase

PDS- Phytoene desaturase

Slc12a2- Sodium/potassium/chloride transporters

USH1B- Síndrome de Usher Tipo 1B

(25)

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ... 25 2. REVISÃO DE LITERATURA ... 43 3. OBJETIVOS ... 67 3.1. Geral... 68 3.2. Específicos... 68 4. CASUÍSTICA E MÉTODOS ... 69 4.1. Metodologia... 70 4.2. Considerações Éticas ... 71 4.3. Casuística... 72 4.3.1. Critérios de inclusão... 73 4.3.2. Critérios de exclusão ... 74 4.4. Métodos ... 74 4.4.1. Avaliação otorrinolaringológica ... 74 4.4.2. Avaliação audiológica complementar com fonoaudiólogas

especializadas ... 75 4.4.3. Coleta de amostra de sangue e extração de DNA... 76 4.4.4. Estudo molecular ... 77 4.5. Análise de dados ... 80

5. RESULTADOS ... 81

5.1. Caracterização das famílias analisadas ... 88 5.2. Análise Molecular ... 101

5.2.1. Características audiológicas dos indivíduos homozigotos para c.35delG/GJB2... 104 5.2.2. Características audiológicas dos indivíduos heterozigotos

para c.35delG/GJB2... 105 5.2.3. Características audiológicas do indivíduo heterozigoto para

c.35delG/GJB2 e del(GJB6-13S1830) ... 106 5.3. Descrição das Famílias que apresentaram as mutações

c.35delG/GJB2 e del(GJB6-13S1830) ... 113 6. DISCUSSÃO ... 125 7. CONCLUSÕES ... 137 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 139 ANEXOS ... 149 APÊNDICES ... 155 ANEXO DE PUBLICAÇÃO

(26)
(27)

Introdução 26

A perda auditiva é hoje a deficiência sensorial mais prevalente na população humana (Kelsell et al., 1997; Steel, 2000; Willems, 2000; Kokitsu-Nakata et al., 2004), podendo levar a alterações de linguagem, de cognição e do desenvolvimento psicossocial. Estima-se, atualmente, uma prevalência de mais de 275 milhões de indivíduos afetados pela perda auditiva de grau moderado a profundo, entre a população mundial (WHO, 2012), incluindo perdas auditivas congênitas e ambientais, independente da época de início da manifestação clínica. Estima-se que uma criança a cada 1000 nascidos vivos apresente perda auditiva congênita (Kelsell et al., 1997; Steel, 2000; Resendes et al., 2001; Tekin et al., 2001). Atualmente, acredita-se que a prevalência das perdas auditivas varia de 01 entre 300 a 01 entre 1000 nascidos vivos. No Brasil, essa frequência é estimada em quatro a cada 1000 nascimentos (Cordeiro-Silva et al., 2010). Devido a esta alta prevalência, o Joint Committee on Infant Hearing (JCIH) recomenda a triagem em todos os neonatos e intervenção precoce naqueles com perda auditiva (AAP; JCIH, 2007). Sabe-se, ainda, que, na população na faixa etária acima de 70 anos, a prevalência da perda auditiva sobe, afetando mais de 60% desses indivíduos (Steel, 2000). As perdas auditivas genéticas representam aproximadamente 50% das perdas auditivas congênitas em países desenvolvidos (Tekin et al., 2001). Há autores que afirmam que até 60% das perdas auditivas de grau severo e manifestação pré-lingual tem origem genética (Lubianca Neto; Kurc, 2012). Entre as perdas auditivas genéticas congênitas, as não sindrômicas representam 70% delas (Coser, PL; Coser, VM, 2003).

Em relação à nomenclatura utilizada para se referir à perda auditiva encontram-se outros termos tais como deficiência auditiva, disacusia, hipoacusia e surdez (Lopes-Filho, 2005). Tanto o termo perda auditiva quanto deficiência auditiva ou surdez podem ser empregados para qualquer grau de perda auditiva, embora geralmente surdez seja empregada para os casos de perda auditiva de grau profundo.

(28)

Introdução 27

Disacusia significa distúrbio da audição, ou seja, diminuição da capacidade auditiva em maior ou menor intensidade, podendo ser progressiva ou não, com alteração na percepção do som. A hipoacusia caracteriza a diminuição da audição, sem alteração da qualidade de percepção do som (Moussalle et al., 2003). As hipoacusias geralmente são condutivas e, dependendo da causa, podem ser reversíveis com o tratamento.

A perda auditiva pode ser classificada de acordo com o segmento do sistema auditivo comprometido em: perda auditiva condutiva quando a alteração encontra-se nas orelhas externa e/ou média; sensorioneural quando o acometimento é na orelha interna; mista quando estão comprometidos o sistema condutivo e a orelha interna (Moussalle et al., 2003). Também pode ser classificada em central quando o distúrbio auditivo ocorre por lesão em qualquer ponto das vias auditivas centrais causando transtorno de processamento da informação auditiva e, por fim, perda auditiva funcional quando há uma disfunção sem a presença de lesões em qualquer parte do sistema auditivo, seja periférico ou central, podendo a causa ser de fundo emocional (Lopes-Filho, 2005).

Em relação ao grau da perda auditiva, também há classificações, segundo diversos autores. De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), a perda auditiva pode ser classificada como leve quando os limiares tonais forem de 26 a 40 dB; moderada quando os limiares tonais estiverem entre 41 a 60 dB; severa quando os limiares tonais forem de 61 a 80 dB ou profunda quando houver limiares acima de 81 dB (WHO, 2011).

A perda auditiva ainda pode ser classificada de acordo com a época, em relação à aquisição da linguagem oral, em que houve sua manifestação. As perdas auditivas congênitas e as que se manifestam até os três anos de idade causam dificuldade na aquisição da linguagem oral e, por isso, são chamadas de pré-linguais. A perda auditiva, quando se manifesta após a aquisição da linguagem oral, é denominada

(29)

Introdução 28

de pós-lingual. Toda perda auditiva congênita é pré-lingual, mas nem toda perda auditiva pré-lingual é congênita (Smith et al., 2012).

As perdas auditivas congênitas podem ser hereditárias, ou seja, herdadas geneticamente, ou ainda adquiridas no período intrauterino.

As perdas auditivas não congênitas podem se manifestar na infância, adolescência ou ainda na fase adulta.

Quanto às causas, as perdas auditivas podem ser ambientais ou genéticas, estarem ou não associadas a síndromes e ser divididas em (Morton, 1991):

• Ambientais - aproximadamente 50%

• Genéticas - aproximadamente 50%, sendo: o 30% Sindrômicas

o70% Não sindrômicas, subdividindo-se ainda em: - Autossômicas dominantes - 15%

- Autossômicas recessivas - 80% - Ligadas ao X - 2 a 3%

- Mitocondriais - menos de 1%

Para melhor visualização dos tipos de perdas auditivas congênitas e suas causas, foi reproduzido um fluxograma, segundo Morton (1991), na Figura 1.

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Figura 1: Fluxograma com causas de perdas auditivas congênitas (Morton, 1991). Introdução 29 50% 50% 70% 30% 15% 80% 2-3% <1%

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Introdução 30

As causas de perda auditiva ambiental, segundo Valle et al. (2003), podem ser:

A) Causas Ambientais

Perda auditiva não congênita

Entre essas se destacam:

- Otite média secretora: perda auditiva condutiva, geralmente de grau leve a moderado.

- Otite média crônica: perda auditiva condutiva de grau variado, podendo apresentar componente sensorioneural. - Sífilis: a perda auditiva sensorioneural pode ocorrer nos

casos de neurossífilis e sífilis latente.

- HIV: a perda auditiva sensorioneural ou mista pode ocorrer em portadores de HIV e pacientes com Aids instalada. A causa exata ainda é desconhecida, podendo estar associada à infecção direta do sistema nervoso central, causando perda auditiva central; pode também ser devida à ototoxicidade das drogas usadas no tratamento, às infecções oportunistas, como neurocriptococose, sífilis, leucoencefalite progressiva multifocal, ou ainda aos tumores, como linfoma primário de sistema nervoso central, metástase de sarcoma de Kaposi e alguns casos de schwannomas vestibulares.

- Outras infecções virais: sarampo, caxumba e gripe também podem causar perda auditiva.

- Doença de Lyme: perda auditiva sensorioneural associada à paralisia facial.

- Meningite: perda auditiva sensorioneural de grau profundo e bilateral, mais associada à infecção por pneumococo, podendo também ter causa viral.

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Introdução 31

- Hiperbilirrubinemia: perda auditiva bilateral e simétrica, geralmente sensorioneural, resultante da encefalopatia bilirrubínica.

- Ototóxicos: as drogas ototóxicas incluem desde analgésicos e antibióticos até desinfetantes (clorexidina, iodo, benzalcônio) e metais pesados. A radiação, em região de cabeça e pescoço, também pode causar perda auditiva sensorioneural, bem como o uso de agentes antineoplásicos.

- Exposição a ruído: perda auditiva induzida pelo ruído (PAIR) acarretando perda auditiva lenta e progressiva, sensorioneural, simétrica e irreversível.

- Distúrbios metabólicos: perda de audição uni ou bilateral, de intensidade leve à moderada, geralmente decorrente de prejuízos à microcirculação da orelha interna. Estes podem ser devidos a alterações no metabolismo do açúcar (diabetes melito, hipoglicemia, hipo e hiperinsulinemia), dislipidemias (hipertrigliceridemia e hipercolesterolemia), nefropatias (retenção de metabólicos tóxicos à orelha), disfunções hormonais da supra-renal, tireoide ou ovários. Geralmente são do tipo sensorioneural.

- Apoptose: perda auditiva sensorioneural decorrente de autodestruição celular induzida por estímulos genéticos, hormonais ou químicos.

- Presbiacusia: perda auditiva sensorioneural lenta, progressiva e simétrica relacionada à idade e influenciada por diversos fatores, entre eles, dieta, exposição a ruído, estresse, hábitos e hereditariedade.

- Doença de Ménière: perda auditiva sensorioneural, geralmente unilateral e flutuante, associada à vertigem.

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Introdução 32

- Doenças imunomediadas da orelha interna: perda auditiva sensorioneural, bilateral e progressiva. Pode preceder ou ser concomitante a uma doença autoimune sistêmica.

- Fístulas perilinfáticas: perda auditiva progressiva, súbita ou flutuante decorrente de má formação na orelha, ou traumatismo craniano ou bárico, geralmente sensorioneural. - Doenças vasculares: a perda auditiva sensorioneural

progressiva é o sintoma mais comum, sendo decorrente de hipocirculação sanguínea nas artérias terminais ou ainda na microcirculação, devido a alterações nos grandes vasos como as más formações ou aneurismas, compressões externas nas carótidas, dislipidemias, vasculites inflamatórias, hipertensão arterial, entre outras causas.

- Tumor glômico: pode ser do glomo jugular ou timpânico e cursa com perda auditiva, geralmente condutiva.

- Tumores do ângulo pontocerebelar: schwannomas, meningiomas, tumores metastáticos, cistos epidermoides e outros tumores causam perda auditiva unilateral sensorioneural, insidiosa, progressiva e predominante nas altas frequências.

- Esclerose múltipla: 4 a 10% dos pacientes irão apresentar perda auditiva sensorioneural progressiva ou súbita, uni ou bilateral, simétrica ou assimétrica.

- Surdez súbita: perda auditiva sensorioneural unilateral, permanente ou não, de etiologia geralmente viral, ou ainda de causa vascular (Moussalle et al., 2003).

- Trauma sonoro: qualquer som súbito acima de 85 dB pode ser agente desencadeante de perda auditiva sensorioneural ou condutiva.

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Introdução 33

Perda auditiva congênita

- Rubéola gestacional: perda auditiva sensorioneural de grau severo e curva assimétrica, pode associar-se a problemas oculares e má formação cardíaca (tríade de Greig), além de sequelas neurológicas. Outras infecções durante a gestação, como toxoplasmose, podem também levar à perda auditiva. - Citomegalovirose gestacional: perda auditiva sensorioneural

progressiva e simétrica, principalmente nas frequências agudas, podendo ser ainda unilateral e assimétrica.

- Sífilis gestacional: perda auditiva sensorioneural presente em até 38% dos casos, podendo manifestar-se nos primeiros anos de vida ou até na segunda década. O quadro clínico é semelhante à Doença de Ménière, com perda auditiva progressiva e flutuante, zumbido, plenitude auricular e vertigens.

- Hipotireoidismo congênito: má formação das orelhas médias e internas por carência de iodo na gestação, gerando perda auditiva sensorioneural.

- Colesteatoma congênito: perda auditiva condutiva por envolvimento da orelha média ou sensorioneural por acometimento coclear.

- Drogas: o uso de ototóxicos ou teratogênicos durante a gestação pode levar à perda auditiva sensorioneural no feto, além de outras más formações, bem como o uso de álcool, que pode provocar a Síndrome alcoólica fetal (Moussalle et al., 2003).

Além disso, alterações metabólicas e desnutrição materna, radiação no primeiro trimestre de gestação, eritroblastose fetal, hipóxia no parto e prematuridade podem ser causas de perda auditiva (Moussalle et al., 2003).

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Introdução 34

As causas de perda auditiva genética, segundo Valle et al. (2003), podem ser:

B) Causas Genéticas

As causas genéticas, de perdas auditivas congênitas ou não congênitas, são consideradas quando a história gestacional é negativa para fatores ambientais e podem ser classificadas como parte de uma síndrome ou não.

Sindrômicas

As principais síndromes que incluem a perda auditiva como manifestação fenotípica serão citadas a seguir:

- Síndrome de Alport (MIM #301050) (OMIM, 2013): perda auditiva sensorioneural bilateral de herança ligada ao X ou autossômica recessiva, aparecimento na segunda infância em geral, acompanhada de nefropatia hematúrica, catarata, miopia e nistagmo (Van Camp; Smith, 2012).

- Neurofibromatose tipo II ou Doença de von Recklinghausen (MIM #101000): perda auditiva, geralmente sensorioneural, associada a tumores neurais múltiplos, lesões pigmentadas na pele e hamartomas da íris pigmentada. Pode apresentar schwannoma vestibular uni ou bilateral, de acordo com a forma da doença. Tem herança autossômica dominante.

- Osteogênese imperfeita ou Doença de van der Hoeve (MIM #166200): perda auditiva condutiva por otosclerose ou fratura ossicular, associada à fragilidade óssea e de ligamentos, escleras azuis, fácies triangular e odontogênese imperfeita, de caráter autossômico dominante.

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Introdução 35

- Doença de Paget (MIM #602080): perda auditiva condutiva, sensorioneural ou mista, de caráter autossômico dominante, associada à osteíte deformante.

- Síndrome de Richards-Rundle (MIM %245100): transmissão autossômica recessiva; perda auditiva sensorioneural com rápida progressão, além de deficiência mental, hipogonadismo e ataxia.

- Doença de Friedreich (MIM 136600): perda auditiva sensorioneural, atrofia óptica, ataxia, nistagmo espontâneo e comprometimento vestibular, de caráter autossômico recessivo.

- Síndrome de van Buchem (MIM #239100): autossômica recessiva, a perda auditiva sensorioneural é acompanhada de hiperostose cortical generalizada, fácies leonina, atrofia óptica e maxila quadrada.

- Síndrome de Cockayne (MIM #133540): perda auditiva sensorioneural de caráter progressivo e de grau moderado a severo, associada à atrofia do nervo óptico, retardo mental e alterações motoras, de transmissão autossômica recessiva. - Síndrome de Alström (MIM #203800): herança autossômica

recessiva, a perda auditiva sensorioneural é progressiva e acompanhada por retinite pigmentar, diabetes melito e obesidade.

- Síndrome de Engelmann (MIM #131300): perda auditiva mista progressiva autossômica dominante, além de displasia diafisiária dos ossos longos e do crânio.

- Doença de Albers-Schönberg ou osteopetrose (MIM #166600): perda auditiva mista ou condutiva autossômica recessiva, paralisia dos nervos cranianos, espessamento esclerótico dos ossos, podendo levar à atrofia de medula óssea e morte por anemia severa.

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Introdução 36

- Síndrome de Refsum (MIM #266500): perda auditiva sensorioneural progressiva com retinite pigmentar atípica, ictiose, polineuropatia periférica e ataxia cerebelar de transmissão autossômica recessiva.

- Doença de Norrie (MIM # 310600): transmissão recessiva ligada ao X, perda auditiva progressiva sensorioneural, além de pseudotumor retiniano e retardo mental (Van Camp; Smith, 2012).

- Distrofia córnea de Fehr (MIM #217800): perda auditiva sensorioneural e perda visual progressivas, de caráter autossômico recessivo.

- Síndrome de Flynn-Aird (MIM %136300): perda auditiva sensorioneural, miopia progressiva, catarata, retinite pigmentar, ataxia e sintomas articulares, com herança autossômica dominante.

- Síndrome de Herrmann (MIM 172500): perda auditiva sensorioneural, fotomioclonia, diabetes melito, demência progressiva, pielonefrite e glomerulonefrite, de caráter autossômico dominante.

- Síndrome de Hurler e de Hunter ou doença do metabolismo de

mucopolissacarídeos (MIM #607014): perda auditiva

sensorioneural associada à deficiência metabólica com depósitos anormais de mucopolissacarídeos nos tecidos, de transmissão recessiva.

As principais síndromes que apresentam perda auditiva ao nascimento, ou seja, congênita, estão resumidamente dispostas a seguir:

- Atrofia óptica e polineuropatia (MIM #311070): perda auditiva sensorioneural progressiva, herdada recessivamente ou ligada ao cromossomo X.

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Introdução 37

- Síndrome de Usher (MIM #276900): perda auditiva sensorioneural de grau moderado a severo, progressiva ou não, autossômica recessiva, associada à retinite pigmentar progressiva e, em alguns casos, comprometimento vestibular. - Síndrome de Waardenburg (MIM #277580): perda auditiva

sensorioneural progressiva ou não, de grau moderado a profundo, transmissão autossômica dominante, associada ao estrabismo, epicanto, hiperplasia dos cílios, heterocromia da íris e mecha branca frontal.

- Síndrome de Pendred (MIM #274600): perda auditiva sensorioneural de transmissão autossômica recessiva, associada ao bócio, podendo apresentar hipoplasia da cóclea e alargamento do aqueduto vestibular. Pode também instalar-se mais tardiamente, até a adolescência, e instalar-ser progressiva. - Síndrome de Fanconi (MIM #227650): perda condutiva

congênita ou hipoacusia sensorioneural progressiva, herança autossômica recessiva, associada à anemia congênita, pigmentação cutânea, anomalias esqueléticas e retardo psicomotor.

- Síndrome de Marfan (MIM #154700): perda auditiva sensorioneural ou mista, progressiva ou não, de caráter autossômico dominante, em indivíduos magros, longilíneos com aracnodactilia, peito de pombo e escoliose.

- Acondroplasia (MIM #100800): perda auditiva condutiva podendo ser progressiva, transmissão autossômica dominante, associada ao nanismo, extremidades curtas, cabeça grande, nariz em sela, proeminência frontal e mandibular.

- Doença de Pyle (MIM %265900): herança autossômica dominante; é caracterizada por perda auditiva progressiva e usualmente mista, podendo ser apenas condutiva ou

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Introdução 38

sensorioneural, acompanhada de displasia craniometafisária, com paralisia de nervos cranianos, atresia coanal, prognatismo, atrofia óptica e aparência ampliada dos ossos longos.

- Albinismo (MIM #203100): pode ter caráter autossômico dominante, recessivo ou ligado ao sexo; e a perda auditiva sensorioneural pode ser bilateral e profunda (Moussalle et al., 2003).

- Doença de Crouzon (MIM #123500): perda auditiva mista, autossômica dominante, com disostose craniofacial, exoftalmia e atresia dos condutos auditivos (Moussalle et al., 2003).

- Doença de Fabry (MIM #301500): perda auditiva sensorioneural bilateral, associada a angioqueratoma corporal difuso, lesões cardíacas, renais, oculares e no sistema nervoso central. Esta síndrome é herdada de forma dominante ligada ao cromossomo X (Moussalle et al., 2003). - Hiperpigmentação (MIM 129510): perda auditiva

sensorioneural profunda, associada à anomalia pigmentar com manchas escuras progressivas na pele, de caráter autossômico recessivo (Moussalle et al., 2003).

- Onicodistrofia (MIM %220500): perda auditiva sensorioneural profunda, mais comum em homens com distrofia congênita das unhas das mãos e dos pés, que se apresentam curtas e pequenas, de caráter recessivo (Moussalle et al., 2003).

- Síndrome de Jervell (MIM #220400): herança autossômica recessiva apresenta perda auditiva sensorioneural profunda bilateral, associada à cardiopatia (Moussalle et al., 2003). - Síndrome de Klippel-Feil (MIM #118100): perda auditiva

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Introdução 39

espinha bífida, herdada de forma autossômica dominante (Moussalle et al., 2003).

- Trissomia 13 (MIM #309580): anomalia cromossômica com as malformações mais graves como displasia labiríntica, ausência de condutos auditivos externos e de orelhas médias, microcefalia, lábio leporino e fenda palatina, microftalmia, aplasia do nervo óptico. É letal nos primeiros meses de vida (Moussalle et al., 2003).

- Trissomia 18 (MIM %300484): Displasia labiríntica, micrognatia, dedos flexionados e sobrepostos, além de defeitos cardíacos e renais graves que levam a óbito precoce (Moussalle et al., 2003).

- Trissomia 21 ou Síndrome de Down (MIM #190685): é a anomalia cromossômica mais comum, apresenta perda auditiva condutiva, sensorioneural ou mista em 40 a 77% dos acometidos.

Não sindrômicas

As perdas auditivas de causas genéticas podem ainda ser não sindrômicas e as principais serão citadas a seguir:

- Hipertensão perilinfática: displasia Mondini-like, de caráter recessivo, apresentando perda auditiva condutiva progressiva e zumbido.

- Otospongiose: perda auditiva condutiva, sensorioneural ou mista autossômica dominante.

- Perda auditiva sensorioneural familiar progressiva: várias formas clínicas, podendo ser de herança dominante, recessiva ou mitocondrial.

Quanto à Neuropatia auditiva ou Dissincronia Auditiva, esta se manifesta com perda auditiva sensorioneural bilateral, simétrica ou não, de intensidade moderada, maior nas frequências graves, associada

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Introdução 40

à alteração de discriminação vocal e ausência de reflexos estapedianos, além de ausência de respostas na audiometria de tronco cerebral, a partir da onda I (Valle et al., 2003). Pode associar-se a causas ambientais como infecções (toxoplasmose, rubéola, citomegalovírus, herpes, sífilis), hiperbilirrubinemia, distúrbios imunológicos, uremia ou ainda à história familiar e síndromes genéticas, sendo, portanto, uma perda auditiva com causas ambiental ou genética (Hurley, A; Hurley, RM, 2007).

As perdas auditivas genéticas não sindrômicas são, em sua maioria, monogênicas e altamente heterogêneas. A perda auditiva autossômica dominante costuma ter grau mais leve do que a autossômica recessiva (Coser PL; Coser VM, 2003). Os genes autossômicos recessivos são responsáveis por perdas auditivas pré-linguais, de grau leve a profundo e sensorioneurais, em sua maioria. Os genes autossômicos dominantes podem originar perdas auditivas condutivas, sensorioneurais ou mistas, podendo aparecer mais tardiamente e até na vida adulta (Resendes et al., 2001). A Figura 2 ilustra as formas de herança mendelianas citadas.

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Introdução 41

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Introdução 42

As perdas auditivas autossômicas, herdadas de forma recessiva, representam 80% das não sindrômicas e, um único gene, o gap junction beta-2 protein (GJB2) é responsável por 50% dessas perdas. Uma única mutação, a c.35delG, destaca-se como a mais prevalente nesse gene e é causadora de perda auditiva (Sartorato et al., 2000).

Tendo em vista a alta prevalência de mutações no gene GJB2, em especial a c.35delG, como possíveis causadoras de perda auditiva sensorioneural congênita, este estudo teve por objetivo investigar a presença da mutação c.35delG/GJB2 em sujeitos com perda auditiva, moradores na região de Marília, cujo diagnóstico etiológico para tal perda não tivesse sido determinado, ou ainda cujo heredograma apontasse para tal diagnóstico, já que poucos estudos brasileiros demonstraram essa prevalência.

No decorrer do estudo, foi considerada a recomendação para que deleções no gene gap junction beta-6 protein (GJB6) fossem investigadas, logo após a mutação do GJB2, nos indivíduos que tivesse sido detectada uma única mutação neste gene (Lubianca-Neto, 2007). Foram, então, investigadas as mutações del(GJB6-D13S1830) e del(GJB6-D13S1854) nos indivíduos heterozigotos para c.35delG/GJB2.

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Revisão de Literatura 44

Atualmente, estão listados na “Hereditary Hearing Loss Home Page” (Van Camp; Smith, 2012), pelo menos 77 genes responsáveis por perdas auditivas não sindrômicas, sendo 40 ligados à herança recessiva, 27 à herança dominante, três ao cromossomo X e ainda sete mutações mitocondriais distintas catalogadas que levam à surdez não sindrômica, localizadas em dois genes mitocondriais. Um panorama permanentemente atualizado pode ser acessado no referido site.

Convencionou-se chamarem os diferentes loci (localizações cromossômicas) das formas de perdas auditivas genéticas não sindrômicas com a sigla DFN (do inglês deafness), acrescida ou não das letras A e B, de acordo com a forma de transmissão autossômica ou recessiva, respectivamente. O número que se segue obedece a uma ordem cronológica de acordo com a data de identificação do locus (Resendes et al., 2001). Quando a sigla DFN aparece seguida da letra X, refere se à transmissão ligada ao cromossomo X (Smith et al., 2012).

O primeiro locus para perda auditiva não sindrômica autossômica recessiva, DFNB1, foi identificado por Guilford et al. (1994) que demonstraram sua localização no cromossomo 13 em duas famílias consanguíneas da Tunísia. Outros estudos foram realizados com famílias consanguíneas de outras etnias e famílias caucasianas não consanguíneas, encontrando a mesma ligação entre perda auditiva recessiva e o locus DFNB1. A variação fenotípica, observada entre as famílias caucasianas, sugeriu a existência de uma heterogeneidade alélica no DFNB1. A descoberta de uma forma de perda auditiva não sindrômica autossômica dominante (DFNA3), localizada no mesmo cromossomo 13, reforçou a hipótese dessa heterogeneidade (Scott et al., 1998).

Dentre as perdas auditivas autossômicas recessivas, um único gene foi considerado responsável por pelo menos 50% delas, o GJB2, ou ainda Conexina 26 (Cx26) (Kokitsu-Nakata et al., 2004; Tekin et al.,

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Revisão de Literatura 45

2001), localizado no cromossomo 13 (13q12), como proposto por Guilford et al. (1994).

Kelsell et al. (1997) levantaram a hipótese de uma mutação específica no gene GJB2 (localizado no DFNB1) ser causa de perda auditiva não sindrômica herdada em caráter autossômico recessivo, já que até então era conhecida apenas sua herança autossômica dominante (DFNA3). Foi identificado um gene numa grande família paquistanesa, com parentes consanguíneos, que traziam em seu fenótipo perda auditiva profunda. Esse gene foi o primeiro a ser associado à perda auditiva não sindrômica e considerado recessivo, localizado no locus do cromossomo 13q11-12.

Alguns autores, como Lubianca-Neto (2006), atribuem até 80% dos casos de perdas auditivas autossômicas recessivas a mutações nesse gene. Segundo Matsunaga et al. (2006), Mahdieh e Rabbani (2009) e Martinez et al. (2009), mais de cem mutações no gene GJB2 têm sido associadas à perda auditiva não sindrômica, o que contribui para essa alta prevalência.

Scott et al. (1998) estudaram, então, sete famílias com perda auditiva não sindrômica autossômica recessiva, rastreando, por meio de sequenciamento genético após amplificação do DNA por PCR (Reação em cadeia de polimerase), mutações no gene GJB2. Essas mutações foram encontradas em seis dessas famílias, incluindo duas mutações previamente conhecidas e duas novas, entre elas a deleção de um único par de bases no nucleotídeo 35, a qual chamaram de 35delG. Essa deleção resultaria em deslocamento do módulo de leitura desse aminoácido, já que uma Guanina é substituída por uma Valina no cromossomo 12, sendo seguida, então, por um códon de parada no aminoácido 13. Desenvolveram, posteriormente, primers de PCR para cada mutação específica a fim de determinarem rapidamente os indivíduos afetados como portadores ou não da mutação.

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Revisão de Literatura 46

Alguns autores consideram que esta única mutação específica, a c.35delG, seria responsável por 70% dos casos em populações caucasianas europeias, norte americanas e mediterrâneas (Denoyelle et al., 1997; Estivill et al., 1998).

A mutação c.35delG é uma deleção de base guanina, em uma sequência de seis guaninas, que se estendem da posição 30 a 35 dos nucleotídeos do gene GJB2, resultando num códon de terminação prematuro. Devido a esta mutação, o produto do gene, a proteína de mesmo nome, conexina, não exerceria suas funções normalmente, mesmo a cóclea estando inalterada estruturalmente, já que a deleção resultaria na formação de um polipeptídeo incompleto com 12 aminoácidos, diferentemente do normal com 226 aminoácidos (Cordeiro-Silva et al., 2010). Sendo assim, pode-se considerar que 20 a 30% de todas as perdas auditivas sensorioneurais congênitas ou pré-linguais são secundárias a mutações no gene GJB2 (Lubianca Neto; Kurc, 2012).

Uma equipe de pesquisadores da Unicamp demonstrou que aproximadamente 0,97% da população pode ser portadora da mutação c.35delG, em heterozigose, nesse gene (Sartorato et al., 2000). Tekin et al. (2001) consideraram a frequência de portadores heterozigotos da mutação variando de 1,5 a 2,5% nas populações caucasianas citadas acima. Matsunaga et al. (2006) consideraram uma taxa de portadores dessa mutação variando entre 2 a 4% também entre caucasianos. No Brasil, 1:100 recém-nascidos apresenta a mutação, sendo de 1:32 na Itália, 1:40 em Portugal e 1:45 na Espanha, perfazendo a média de 1:45 (Lubianca-Neto, 2006).

De acordo com a literatura, em pacientes com perda auditiva, a heterozigose para c.35delG, no gene GJB2, aparece em 10 a 42% dos casos (Piatto et al., 2005b). No Brasil, existem estudos que relatam prevalência de 12,12 % (Piatto et al., 2004), 6,45% (Oliveira et al., 2002) e 2,66% (Pfeilsticker et al., 2004). Essas diferenças podem ser

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Revisão de Literatura 47

explicadas por serem as características étnicas e regionais da população brasileira, extremamente heterogêneas.

Uma segunda mutação no GJB2, a 167delT, é comum entre os judeus, com frequência de portadores variando entre 3 a 4% (Tekin et al., 2001; Matsunaga et al., 2006).

Apesar da perda auditiva causada por mutações no GJB2 ser menos comum entre asiáticos, uma única mutação 235delC é responsável por essa perda, quando ocorre nessa população, principalmente entre japoneses e coreanos (Abe et al., 2000; Kudo et al., 2000), com frequência estimada de 1 a 2% de portadores. Outras mutações no gene GJB2, encontradas na população japonesa, foram: V37I, G45E, Y136X e R143W. Não foram observadas as mutações c.35delG ou 167delT entre os japoneses (Abe et al., 2000; Matsunaga et al., 2006).

Ainda no gene GJB2, a mutação R143W foi encontrada também em indivíduos africanos; a mutação Q124X foi identificada em uma família indiana e as mutações W24X e W77X foram detectadas em famílias paquistanesas e indianas. Em um estudo de Maheshwari et al. (2003), o envolvimento da mutação W24X, como causa de perda auditiva, esteve presente em 13,33% dos indivíduos analisados, sugerindo ser este um alelo do gene GJB2 comum na Índia. Já a c.35delG, a mais comum entre outras populações, foi encontrada em apenas uma família estudada, sugerindo não ser a causa principal de perdas auditivas sensorioneurais autossômicas recessivas naquele país.

O fenótipo, usualmente relacionado às perdas auditivas recessivas, secundárias a mutações no gene GJB2, consiste em perda auditiva sensorioneural, pré-lingual, não progressiva (2/3 dos casos), de grau moderado a profundo. Embora variações no grau e progressão dessas perdas auditivas tenham sido observadas, entre os indivíduos até da mesma família, estas não apresentaram relação com alterações vestibulares ou anormalidades radiológicas da orelha interna. A

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Revisão de Literatura 48

inconsistência fenotípica da mutação c.35delG sugere a possibilidade de outros fatores modularem a expressão do gene mutante. É possível, ainda, que uma segunda proteína conexina possa atuar como um substituto em determinadas condições (Piatto et al., 2007).

Mutações no GJB2 podem também ser responsáveis por perdas auditivas de caráter dominante (DFNA3 - nonsyndromic deafness autosomal dominant) e sindrômico (com ceratodermia palmo plantar ou mutilante) (Tekin et al., 2001).

Apesar de mais de 70 loci terem sido descritos como responsáveis por genes de perda auditiva não sindrômica autossômica recessiva (Van Camp; Smith, 2012), um único locus, o DFNB1, abriga o gene GJB2. Mais de 70 mutações nesse gene já foram relatadas (Lubianca Neto; Kurc, 2012).

Scott et al. (1998) salientaram que indivíduos com perda auditiva sensorioneural, de grau severo a profundo, apresentaram genótipo heterozigoto para c.35delG e nenhuma outra mutação foi detectada na região de codificação da conexina 26. Os autores sugeriram que mutações, fora dessa região, provavelmente desempenhem algum papel na perda auditiva sensorioneural autossômica recessiva nesse mesmo locus, o DFNB1.

Sabe-se hoje, que alterações em outras conexinas podem ser responsáveis pela perda auditiva. Mutações na conexina 31 (codificada pelo gene GJB3), por exemplo, são responsáveis por casos de perda auditiva de caráter recessivo ou dominante (DFNA2), além de determinarem patologias dermatológicas, de caráter autossômico dominante, não associadas à perda auditiva. Mutações no gene GJB1 (conexina 32) resultam na Síndrome de Charcot-Marie-Tooth que apresenta perda auditiva como uma de suas características (Tekin et al., 2001).

Uma mutação envolvendo o gene GJB6 (codificador da proteína conexina 30) mostrou ser causa de perda auditiva de caráter dominante

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(DFNA3). Pesquisas recentes indicam que deleções neste mesmo gene, adjacente ao GJB2 no cromossomo 13 (locus DFNB1), podem também ser causas de perda auditiva de caráter recessivo. Essas deleções podem ser causas de perda auditiva em caráter homozigoto ou heterozigoto quando associadas a uma mutação também heterozigota do GJB2 (Ballana et al., 2012). Essa hipótese surgiu pelo fato de que 10 a 50% dos indivíduos, com perda auditiva autossômica recessiva secundária a mutações no GJB2, apresentarem apenas um alelo mutado. Assim, o gene GJB6 parece representar o primeiro caso de herança digênica para perda auditiva não sindrômica (Del Castillo et al., 2003). As proteínas conexina 26 e conexina 30 possuem 76% dos aminoácidos idênticos e estreita proximidade em sua localização cromossômica, sendo, por isso, consideradas corresponsáveis por certas perdas auditivas (Del Castillo et al., 2002). Santos et al. (2005) também salientaram essa associação. Entre as deleções que envolvem o gene GJB6, duas são consideradas mais prevalentes, sendo elas del(GJB6-D13S1830) e del(GJB6-D13S1854).

Del Castillo et al. (2002) descobriram uma nova mutação no gene GJB6 relacionada às perdas auditivas decorrentes de mutações em apenas um alelo do GJB2. Sendo assim, existiriam indivíduos duplamente heterozigotos para mutações distintas nos genes GJB2 e GJB6 com fenótipo de perda auditiva. Uma hipótese para tal situação é a existência de um elemento regulador essencial para a expressão do gene GJB2 na orelha interna. Este elemento hipotético estaria localizado a montante dos genes GJB2 e GJB6 e sua deleção suprimiria o nível de expressão do GJB2 o suficiente para produzir um fenótipo de perda auditiva. Uma interpretação alternativa é que a deleção no GJB2 inativaria um segundo gene, cuja proteína codificada estivesse funcionalmente associada à conexina 26. Evidências experimentais suportam a hipótese de que o GJB6 seja esse segundo gene, pelos motivos que seguem: 1) a conexina 26 e a conexina 30 se expressam

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nas mesmas estruturas da orelha interna em ratos; além disso, ambas as proteínas foram encontradas na parede lateral do órgão de Corti em fetos humanos de 22 semanas; 2) a conexina 26 e a conexina 30 podem se ligar para formarem canais intercelulares do tipo gap; 3) a mutação no GJB6 foi reportada numa família com perda auditiva autossômica dominante; 4) três indivíduos com perda auditiva e comprometimento do GJB6, porém alelos intactos no GJB2. De modo geral, este estudo demonstrou a concepção de que o locus DFNB1 é complexo e contém dois genes (GJB2 e GJB6), cuja perda de quaisquer dois de seus quatro alelos resultaria em perda auditiva. Concluíram, ainda, que os achados sugeriam que a deleção del(GJB6-D13S1830) é a segunda causa genética mais frequente (depois da c.35delG/GJB2) de perda auditiva pré-lingual não sindrômica na população da Espanha.

Em um estudo multicêntrico, envolvendo nove países, a prevalência da mutação del(GJB6-D13S1830) variou entre 5,9 a 9,7%, (Del Castillo et al., 2003). Outros estudos consideraram a frequência dessas deleções no gene GJB6 variando entre 5 e 15% em indivíduos com apenas um alelo mutado no gene GJB2 (Batissoco et al., 2009).

Estudos de expressão gênica sugeriram que os genes GJB2 e GJB6 exerceriam função similar na cóclea, mas essa possível redundância de função das duas proteínas codificadas por esses genes, parece ter sido excluída por um estudo que supôs que a total falta da proteína GJB6 (caráter homozigoto) resultaria num fenótipo de perda auditiva severa. Hipóteses surgiram para explicar os mecanismos subjacentes ao fenótipo de perda auditiva. A primeira sugere um efeito digênico puro, já que a remoção de duas partes de GJB6 ou uma parte de GJB6 e uma parte de GJB2 resultaria em número insuficiente de connexons para o correto transporte dos íons de potássio. A segunda hipótese sugere expressão diminuída do alelo GJB2 normal, visto que a deleção removeria elementos regulatórios específicos para a cóclea e/ou alteraria a conformação da cromatina, resultando numa função

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deficiente ou nula do alelo GJB2 e a perda auditiva seria proveniente de déficit apenas do gene GJB2. A terceira e última seria uma combinação de ambas (Pallares-Ruiz et al., 2002).

Piatto et al. (2005a) resumiram, com primazia, a fisiologia molecular da audição. É sabido que, após o estímulo sonoro, a energia mecânica do som é transformada em energia elétrica nas células ciliadas externas da cóclea. O som movimenta, por vibração, o estribo e, este, a janela oval, fazendo circular o líquido (endolinfa) que banha as células ciliadas externas. Os estereocílios são microvilosidades especializadas constituídas de actina e revestidas de miosina; projetam-se no ápice das células ciliadas externas e oscilam em resposta a este movimento, permitindo a abertura dos canais de transdução, existentes nos mesmos. Esta abertura provoca a passagem do potássio da endolinfa para as células ciliadas externas e internas, despolarizando, assim, a membrana celular e ativando os canais de cálcio da membrana. Esse influxo de cálcio provoca a liberação de vesículas, contendo neurotransmissores, nos terminais sinápticos do nervo vestíbulo-coclear (VIII par craniano). Dessa forma, as células ciliadas, após o estimulo sonoro, estão hiperpolarizadas e com alta concentração de potássio intracelular, e, para que nova excitação dessas células seja possível, o potássio deve ser removido. A remoção desses íons das células ciliadas para as células de sustentação e, destas para a endolinfa, é feita por meio de comunicações intercelulares especializadas, chamadas de junções comunicantes ou do tipo gap. As conexinas 26, 30 e 31 são responsáveis pela codificação dessas junções. Elas codificam subunidades de proteínas que formam canais intercelulares na membrana plasmática para transportar líquidos e pequenas moléculas. O conjunto de seis subunidades de conexina forma um hemicanal, chamado de “connexon”, e o encaixe de dois “connexons”, a partir de células adjacentes, estabelece a junção comunicante ou do tipo gap (Tekin et al., 2001).

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A reciclagem do potássio e a manutenção do equilíbrio da endolinfa devem ser entendidas para que se saiba como as mutações genéticas, principalmente nos genes GJB2 e GJB6, podem ocasionar perdas auditivas.

Em resumo, a reciclagem do potássio na escala média da cóclea se inicia quando sua entrada estimula as células ciliadas que vão removê-lo, via canal de potássio (codificado pelo gene KCNQ4). Estes íons passam, então, através da rede de junções comunicantes de células adjacentes ao ducto coclear e estria vascular, na parede lateral do ducto, e, em seguida, são bombeados para as células estriadas com a ajuda da bomba Na-K-Cl (codificada pelo gene Slc12a2 - sodium/potassium/chloride transporters) e voltam à endolinfa via canais iônicos (codificados por produtos dos genes KVLQT1 e KCNE1). Esse mecanismo todo é regido por proteínas codificadas por diferentes genes e uma mutação, em qualquer um destes genes, pode desestruturar esse equilíbrio perfeito, provocando perda auditiva, indicando que o funcionamento correto do equilíbrio iônico nas células ciliadas é essencial para manter a audição (Steel, 2000).

A seguir serão citadas as principais proteínas envolvidas na fisiologia da audição e as mutações conhecidas que podem acometer os genes que as codificam (Piatto et al., 2005a).

Entre as proteínas que atuam diretamente nas células ciliadas estão as Miosinas que se dividem em 16 classes. Elas são proteínas motoras responsáveis pela expansão da membrana citoplasmática nos movimentos das vesículas sinápticas e no sinal de transdução das células ciliadas externas e internas.

A Miosina VIIA é codificada pelo gene MYO7A, localizado no cromossomo 11, e se expressa nos estereocílios, próximo à junção das células ciliadas e de sustentação. Mutações nesse gene são responsáveis por perda auditiva profunda de caráter autossômico recessivo - DFNB2 e também de caráter autossômico dominante -

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DFNA11. Quando essas mutações atingem as células retinianas, o fenótipo caracteriza a Síndrome de Usher Tipo1B (USH1B). Os estudos que demonstraram que uma mutação no gene MYO7A pode causar DFNB2, DFNA11 e USH1B foram os primeiros a exemplificar que um único gene pode determinar a perda auditiva, tanto sindrômica quanto não sindrômica.

A Miosina XV é codificada pelo gene MYO15, localizado no cromossomo 17, e se expressa restritamente nas células ciliadas. Mutações nesse gene determinam DFNB3 (Lubianca Neto; Kurc, 2012).

O gene MYO6, localizado no cromossomo 6, codifica a Miosina VI e mutações nele determinam DFNA22 e DFNB37.

Por fim, a Miosina III é codificada pelo gene MYO3A, presente no cromossomo 10. A DFNB30 acontece quando mutações ocorrem neste gene.

Outra proteína, atuante nas células ciliadas, é a Harmonina codificada pelo gene USH1C, localizado no cromossomo 11. Mutações nesse gene podem causar DFNB18 e USH1C.

A Vilina, proteína codificada por um gene de mesmo nome, presente no cromossomo 9, quando mutante, é responsável pela DFNB31.

A Caderina-23 é codificada pelo gene CDH23, localizado no cromossomo 10. Ela se expressa em ambas as células ciliadas da cóclea e, mutações neste gene, foram detectadas em indivíduos com DFNB12 e USH1D.

No cromossomo 5, o gene DIAPH1 (protein diaphanous homolog 1) ou HDIA1 (anti-diaphanous 1) codifica a proteína Diáfano-1, encontrada nas células ciliadas e de sustentação externas. Mutações nesse gene ocasionam a DFNA1.

O gene KCNQ4, mapeado no cromossomo 1, codifica uma proteína de mesmo nome, expressa nas células ciliadas externas e internas e é responsável pela passagem do potássio dessas células para

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