ESTIMATIVA DO CARBONO DA BIOMASSA MICROBIANA:
MÉTODO DE FUMIGAÇÃO -EXTRAÇÃO
(Vance et al., 1987) 1. CARBONO DA BIOMASSA
1.1. INTRODUÇÃO
Dentre os nutrientes imprescindíveis aos microrganismos destacam-se o carbono, na forma de aminoácidos, ácidos graxos e açúcares, e o nitrogênio, como amônia e nitratos, que são absorvidos pelos microrganismos decompositores e o nitrogênio molecular atmosférico pelos fixadores deste elemento (Piccolo, 1996) (Tabela 1.1)
A avaliação da biomassa é útil para:
- Obter informações rápidas sobre mudanças nas propriedades orgânicas do solo;
- Detectar mudanças causadas por cultivos ou por devastação de florestas; - Medir regeneração dos solos após a remoção da camada superficial; - Avaliar os efeitos dos poluentes como metais pesados e pesticidas.
Além disso, a biomassa reflete a dinâmica da decomposição da matéria orgânica, influindo na disponibilidade de nutrientes para as plantas e alterando as propriedades físicas do solo. O conhecimento sobre a biomassa é mais útil quando combinado com outros componentes do solo, como os estudos sobre interação trófica, funcionamento dos ecossistemas, atividades do solo e produtividade primária, ou mesmo em conjunto com avaliações sobre estresses e alterações ecológicas (Siqueira, 1994)
Por fim, pode-se dizer que a biomassa varia consideravelmente em termos temporais e espaciais determinados por fatores abióticos e bióticos. O desafio para o futuro será determinar as conseqüências diretas dessas variações nos ecossistemas e na produtividade dos sistemas agrícolas auto-sustentáveis.
Tabela 1.1. Principais classes de compostos orgânicos no solo (Manahan, 1994)
Tipo de compostos Composição Significado
Húmus Resíduos de plantas resistentes a
degradação, principalmente C, H e O
Componente orgânico mais abundante, melhora propriedades físicas do solo, troca nutrientes,
reservatório de N fixo. Ácidos graxos, resinas e
ceras
Lipídios extraíveis por solventes orgânicos
Em geral, uma pequena percentagem da matéria orgânica do solo pode, desfavoravelmente,
afetar as propriedades físicas pela sua característica hidrofóbica e vir a ser fitotoxica Sacarídeos Celulose, amidos, hemicelulose e gomas Principal fonte de alimento para os
microrganismos do solo, auxilia na estabilização dos agregados do solo
Moléculas contendo N Nitrogênio ligado ao humus, aminoácidos, aminoaçúcares, outros compostos
Produz nitrogênio para fertilidade do solo
Compostos com fósforo (P)
Ésteres de fosfato, fosfatos de inositol (ácido fítico), fosfolipídeos
1.2. PRINCÍPIO
Esta metodologia analisa a biomassa microbiana extraível em solução aquosa de sulfato de potássio (K2SO4)a 0,5 M (Vance et al., 1987). A fumigação do solo com o
clorofórmio, além de matar, rompe as células microbianas liberando o constituinte microbiano, principalmente o citoplasma, para o solo e permitindo assim sua extração (Powlson & Jenkinson, 1976). Esta metodologia pode ser usada para estimar a biomassa microbiana (BM-C) do solo tanto em solos neutros como ácidos.
1.3. MATERIAIS Vidros de 50 mL Dessecador Bomba de vácuo Erlenmeyer (125 mL) Funil (Usar os de plástico)
Papel de filtro quantitativo (faixa preta; 11 cm Ø)
Agitador horizontal Bloco de digestão Tubo de digestão
Capela para exaustão de gases Câmara com temperatura controlada (25°) Pipetas de 2, 8, 15 mL Pipeta automática de 1 e 5 mL Bureta graduada Agitador magnético Bastão magnético Funil de condensação
Obs: Se não houver funil de condensação, pode ser utilizado funil de vidro comum pequeno (Ø=5cm) como improviso.
1.4. REAGENTES
Clorofórmio purificado – livre de álcool (CHCl3) ou estabilizado com amileno
Sulfato de potássio P.A. (K2SO4)
Dicromato de potássio P.A. (K2Cr2O7)
Ácido sulfúrico P.A. (H2SO4)
Sulfato ferroso amoniacal hexahidratado [(NH4)2Fe(SO4)2.6 H2O]
Ácido fosfórico P.A. (H3PO4)
Difenilamina
1.5. PREPARO DAS SOLUÇÕES
CUIDADO: ADICIONAR, SEMPRE, ÁCIDO SOBRE A
ÁGUA, EM CAPELA DE EXAUSTÃO
Sulfato de Potássio (K2SO4) 0,5 M: dissolver 87,14 g de K2SO4 (PM = 174,26) em 800
mL de água destilada sob aquecimento e agitação, em seguida completar para 1 L, em balão volumétrico.
Dicromato de Potássio (K2Cr2O7) 66,7 mM: dissolver 19,616 g de K2Cr2O7 (PM =
294,22)(seco a 130o C por 1 hora) em 800 ml de água destilada e completar para 1 L, em balão volumétrico.
Obs: Depois de seco na estufa, deixar esfriar à Tª ambiente (+/- 15 min.) dentro de um
dessecador seco contendo sílica gel, que deverá estar na cor azul.
Ácido Sulfúrico (H2SO4) 0,4 M: diluir 22,3 mL de H2SO4 (PM = 98,08; Pureza = 96%;
Densidade = 1,835) em 800 mL de água destilada e completar para 1 L, em balão volumétrico.
Sulfato Ferroso Amoniacal (NH4)2Fe(SO4)2.6H2O 33,3 mM: dissolver 13,058 g de sulfato ferroso amoniacal (PM = 392,13) em 24 mL de ácido sulfúrico 0,4 M (PM = 98,08; D = 1,835) e completar para 1 L de água destilada, em balão volumétrico. OBS: o ácido sulfúrico é usado para a estabilidade do meio. Impedir que na momento da titulação o Dicromato se transforme em Cromato (isto ocorre em meios básicos).
CUIDADO: ADICIONAR, SEMPRE, ÁCIDO FORTE (H2SO4)SOBRE O ÁCIDO
FRACO (H3PO4).
TRABALHAR EM CAPELA DE EXAUSTÃO
H2SO4/H3PO4 2:1: medir 300 mL de ácido fosfórico concentrado, em uma proveta e 600 mL de ácido sulfúrico concentrado, em outra proveta, obtendo-se uma mistura total de 900 mL (em capela de exaustão).
Difenilamina (1%): dissolver 1 g de difenilamina em solução contendo 20 mL de água destilada mais 80 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado. (Guardar em vidro
escuro ou envolto em papel de alumínio na geladeira)
1.6. PADRONIZAÇÃO DE SULFATO FERROSO AMONIACAL (SFA) 0,0333 M Pipetar 3 mL de solução de K2Cr2O7 a 0,0667 M em um erlenmeyer de 125
mL, 50 mL de água destilada, 15 mL de ácido sulfúrico 0,4 M e 3 gotas de indicador Difenilamina 1%. Procede-se a titulação com sulfato ferroso amoniacal, utilizando-se bureta digital, que já está estabelecida para uso do sulfato ferroso amoniacal.
Determina-se o ponto final quando a solução passar de azul para verde. Molaridade do SFA = 6 x Volume (mL) de K2Cr2O7 x Molaridade K2Cr2O7 (mol/L)
Volume (mL) de (NH4)2Fe(SO2).6H2O
Exemplo: Repetição 1 = 35,6 mL
Repetição 2 = 35,7 mL Média = 35,65 mL
Molaridade do SFA = 6 x 3 (mL) x 0,0667 (mol/L) = 0,0337 35,65 (mL)
OBS: O valor 6 da multiplicação se refere a estequiometria da reação entre o K2Cr2O7
com o SFA em meio ácido. (6 SFA: 1 K2Cr2O7)
Fc (Fator de correção) = Molaridade real = 0,0337 =1,012 Molaridade desejada 0,0333
1.7. PROCEDIMENTO
1.7.1. Extração do carbono com K2SO4 a 0,5 M
Oito (8) amostras de um solo, cada uma correspondente a 20 g cada, são pesadas, 4 em beckers para serem fumigadas (Figura 1.1) e 4 em erlenmeyer (controle, não fumigado).
Não fumigado: As 4 amostras controle serão extraídas imediatamente com 50 mL de K2SO4 (0,5 M), como descrito abaixo (*)
Fumigação: As outras 4 amostras que serão fumigadas deverão ser umedecidas a 60% da CMRA (gota a gota), a fumigação será feita num dessecador (forrado com papel toalha úmido) contendo aproximadamente 25 mL de clorofórmio purificado (livre de álcool) em uma placa de Petri pequena. O dessecador é tampado, onde é feito um vácuo (utilizar bomba de vácuo) até atingir uma pressão de 15 psi (repetir 3X). Incuba-se à 25 oC por 24 h no escuro.
Após este período retira-se a placa com clorofórmio do dessecador dentro da capela, fecha-se novamente o dessecador e efetua-se vácuos sucessivos (3X) para retirar o excesso do fumigante, após a retirada do vácuo abrir a tampa e deixar sair o cheiro ao ar livre. Após esse processo proceder à extração, assim como para as amostras controle, como descrito abaixo (*).
(*) Para a extração, a amostra de solo é transferida para erlenmeyer de 125 mL, adicionando-se 50 mL de K2SO4. (Após a transferência do solo para o erlen, pipetar o
K2SO4 em duas vezes, transferindo todo o conteúdo do becker para o erlenmeyer).
O conjunto é agitado por 45 minutos (150 rpm) e a suspensão resultante é filtrada com papel de filtro faixa preta - 11 cm Ø (Fig. 2).
O extrato pode ser armazenado em geladeira em frascos com tampa até a sua utilização para análise (nunca além de duas semanas).
OBS: a) Para obter uma melhor separação do sobrenadante, pode-se usar uma centrífuga.
b) Se o solo for muito rico em MO, aumentar a proporção entre o solo e o extrator.
Fig. 1. Fumigação com clorofórmio das amostras de solo no dessecador.
1.7.2. Oxidação do carbono pelo dicromato (Anderson & Ingram, 1993)
Na presença de ácido forte, a matéria orgânica é oxidada e o crômio (+VI) é reduzido ao crômio (+III). O dicromato remanescente é quantificado por titulação.
- Pipetar 8 mL do extrato filtrado do solo (Tª ambiente) e transferir para um tubo digestor, identificado de acordo.
Fig. 3- Tubo digestor
- Acrescentar 2 mL de K2Cr2O7 66,7 mM e 15 ml da mistura ácido sulfúrico P.A.
(H2SO4)/ácido fosfórico P.A. (H3PO4) (2:1)
- Efetuar a digestão ácida, colocando os tubos com pequenos funis de condensação, em bloco digestor a 90oC por 30 minutos (preparar 4 brancos, todos os reagentes menos o solo).
Obs: como descrito anteriormente, se não houver funil de condensação, poderá ser improvisado com funil de vidro comum pequeno (Fig. 4).
Fig. 4- Tubo de digestão com funil de vidro comum
- Deixe resfriar, e ao retirar os funis de condensação lave-os com 2 mL de água destilada (2x), com o auxílio de uma piseta, voltando o condensado para o tubo, e transfira o volume dos tubos para um erlenmeyer de 125 mL, lavando os tubos com duas porções de 10 mL de água destilada.
- O excesso de K2Cr2O7 é determinado por titulação com sulfato ferroso amoniacal,
usando difenilamina (4 gotas) como indicador até a mudança da cor azul escuro para a cor verde garrafa. Nas amostras em branco utiliza-se o mesmo procedimento, exceto que o extrato é somente de K2SO4 evitando assim interferência dos reagentes.
1.8. EXEMPLO DE CÁLCULO
A quantidade de K2Cr2O7 consumida é calculada pela diferença entre uma
digestão “em branco” de 8 ml de extrator (K2SO4) menos aquela que sobra na digestão
do extrato de solo. Passos:
a) Fazer a média aritmética das titulações dos brancos. Ex. 23,5 mL. b) Determinar a quantidade de dicromato que reage com 1 mL de sal.
Ex. para 2 mL K2Cr2O7 --- gastou 23,5 mL de sal
X mL K2Cr2O7 --- para 1 mL de sal
X = 0,085106 mL K2Cr2O7
c) Determinar a quantidade de dicromato que reagiu (oxidou) com o carbono. Ex. Dados: média da amostra = 15,5 mL
média do branco = 23,5 mL
Diferença entre o branco e a amostra resulta na quantidade de sal que não reagiu com dicromato, que significa a parte do dicromato que oxidou o carbono.
Então: 23,5 mL – 15,5 mL = 8 mL de sal que não reagiu.
Pois sabe-se que 1 mL do sal reage com 0,085106 mL K2Cr2O7, então:
1 mL de sal --- 0,085106 mL K2Cr2O7
8 mL de sal --- X mL de K2Cr2O7
X = 0,6808 mL K2Cr2O7 que não reagiu
d) Determinar a quantidade de carbono na amostra.
Assume-se que 1 mL de K2Cr2O7 é equivalente a 1.200 g de carbono.
Então: 1 mL K2Cr2O7 ---1.200 g de C
0,6808 mL K2Cr2O7 --- X g de C
X = 816,96 g de C
Pois 816,96 g de C em 8 mL no extrator, sendo que foi usado para extração 100 mL do mesmo.
Então: 8 mL K2SO4 --- 816,96 g de C
100 mL K2SO4 --- X g de C
X = 10.212 g de C e) Determinar para g de C/g de solo seco
Descontar o teor de água contida na amostra.
Após, dividir a quantidade de carbono na amostra pela massa de solo usando na extração. Ex. 30 g de solo --- 10.212 g de C 1 g de solo --- X g de C X = 340,4 g de C.g solo seco-1 f) Por último: BM-C = F – NF kec Onde: - BM-C = g de C.g solo seco-1 - F = amostra fumigada - NF = amostra não fumigada
- kec = fator de correção 0,30 proposto por Feigl et al. (1995), específico para
1.8. VALORES ENCONTRADOS NA LITERATURA
Tabela 1.2. Biomassa microbiana determinada pelo método de fumigação extração em diferentes ecossistemas
Ecossistema Local/Solo Amplitude/Valor Referência
g C g solo seco-1
Floresta
Amazônia/PVd 817 Pfenning et al., 1992
Paragominas PA/ LVd 476 Geraldes etal., 1995
Nova Zelândia 202-422 Sparling et al., 1993
Nigéria 359-409 Wick et al., 1998
Paulo deFaria SP/TR 428 Marchiori-Junior e Melo, 1999
Poços de Caldas MG 750 Carneiro et al., 1999
Mata recém-queimada Amazônia/Lad 109 Pfenning et al., 1992
Pinus sp Viçosa/LV 215 Gama-Rodrigues et al., 1997
Nova Zelândia 230-750 Yeates et al., 1997
Senna sp Nigéria 129-144 Wick et al., 1998
Piptadenia rigida Viçosa/LV 85 Gama-Rodrigues et al., 1997
Capoeira (25 anos) Viçosa/LV 75 Gama-Rodrigues et al., 1997
Pastagem nativa Poços de Caldas MG 1600 Carneiro et al., 1999
Pastagem (1 ano) Amazônia/Lad 572 Pfenning et al., 1992
(4 anos) Paragominas PA/LVd 754 Geraldes etal., 1995
(15 anos) Paragominas PA/LVd 203 Geraldes etal., 1995
(20-25 anos) São Paulo/TR 363-402 Marchiori-Junior e Melo, 1999
(30 anos) Itaguaí RJ/PL 88 Rodrigues et al., 1994
Várzea Amazônia/G 219 Pfenning et al., 1992
Cultura perene Pará PA/LA 175 Pfenning et al., 1992
Anual Pará PA/LA 283 Pfenning et al., 1992
Algodão Paulo de Farias SP/TR 143 Marchiori-Junior e Melo, 1999
Hortaliças Itaguaí RJ/PVd 104 Rodrigues et al., 1994
Hortaliças Três Marias MG/LV 707 Dias-Junior et al., 1998
Sistema Alley Cropping
Leucena-Milho Nigéria 83-122 Wick et al., 1998
Tomate (convencional)(1) Davis USA 47-55 Guanapal e Scow, 1998
(orgânico/baixo input)(2) Davis USA 93-106 Guanapal e Scow, 1998
Área recém minerada Poços de Caldas MG 60 Carneiro, 2000
Área minerada com plantio de Eucalyptus (15
anos)
Poços de Caldas MG 150 Carneiro, 2000
Solo contaminado com metais pesado sem
vegetação
Três Marias MG/LV 99-140 Dias-Junior et al., 1998
Solo contaminado com metais pesado com
vegetação
Três Marias MG/LV 92-725 Dias-Junior et al., 1998
1\ Aplicação de 246 kg de fertilizantes por ha 2\ Aplicação de 94 kg de fertilizantes por ha.
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