Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Programa de Pós-Graduação em Neurociências – Instituto do Cérebro DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
IMPLANTAÇÃO DA TÉCNICA DE REGISTRO DE CÉLULAS DE LUGAR UTILIZANDO MICRODRIVES DE TETRODOS MÓVEIS EM RATOS
IMPLEMENTATION OF PLACE CELL RECORDINGS USING MOVABLE TETRODES IN RATS
Estudante: Rafael Hugo de Andrade Pedrosa
Orientador: Prof. Dr. Adriano Bretanha Lopes Tort Co-orientador: Prof. Dr. Hindiael Aeraf Belchior
Natal / RN 2018
IMPLANTAÇÃO DA TÉCNICA DE REGISTRO DE CÉLULAS DE LUGAR UTILIZANDO MICRODRIVES DE TETRODOS MÓVEIS EM RATOS
por
Rafael Hugo de Andrade Pedrosa Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Neurociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Neurociências.
Orientador: Prof. Dr. Adriano Bretanha Lopes Tort Co-orientador: Prof. Dr. Hindiael Aeraf Belchior Natal / RN 2018
2
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Árvore do Conhecimento - Instituto do Cérebro - ICE
Pedrosa, Rafael Hugo de Andrade.
Implantação da técnica de registro de células de lugar utilizando microdrives de tetrodos móveis em ratos / Rafael Hugo de Andrade Pedrosa. - Natal, 2018.
102f.: il.
Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Instituto do Cérebro. Programa de Pós-Graduação em Neurociências.
Orientador: Adriano Bretanha Lopes Tort. Coorientador: Hindiael Aeraf Belchior.
1. Célula de lugar. 2. Microdrive. 3. Tetrodo. 4. Oscilações. 5. Hipocampo. 6. Labirinto linear. I. Tort, Adriano Bretanha Lopes. II. Belchior, Hindiael Aeraf. III. Título.
RN/UF/Biblioteca Setorial Árvore do Conhecimento, Instituto do Cérebro. CDU 612.82
Elaborado por ISMAEL SOARES PEREIRA - CRB-15/741
Agradecimentos
Agradeço antes de tudo a minha mãe e meu pai por todo o apoio e paciência ao longo desses 2 anos. Foram meus financiadores e budas em todo o processo. Também agradeço a meu irmão pelo apoio quase filosófico que me fez ser um humano menos ignorante.
Agradeço imensamente ao professor Adriano Tort por ter me aceitado e confiado no meu trabalho. Antes mesmo de trabalharmos em conjunto, você já era uma inspiração para mim. Hoje, mais que tudo, é um exemplo do cientista que almejo ser. É uma referência que com certeza vou levar pro resto da minha vida. Enfim, no mais, eu espero que tenha correspondido minimamente suas expectativas.
Ao meu pai científico, Hindiael Belchior. Seu respeito, paciência e confiança só me fizeram querer crescer. Além disso, nunca se inibiu de me ensinar qualquer coisa de seu conhecimento, é uma virtude que poucos conseguem ter. Foi muito gratificante trabalhar esse tempo desde a iniciação científica com você, levo seu nome no meu currículo com muito orgulho.
A Richardson pela ajuda material para que eu tivesse condições de fazer os experimentos, e Katarina por todas as dicas e conselhos ao longo do meu tempo no ICe. Além disso, ambos, juntamente com Diego Laplagne se disponibilizaram em me acompanhar durante o mestrado.
Ao meu Robin científico, Alan Michel, que sem sua proatividade e cooperação esse trabalho não poderia ter sido feito.
Aos meus colegas e ex de laboratório Lockmann, Bryan, Robinho maravilha, Vitor, Zé, Rodrigo, Arthur, Pavão, César e Izabela por me ajudar sempre que precisei.
Aos iceanos Annie, João Patriota, Renzo, Ana Raquel, Daniel Filho, Bruna, Ingrid, Daiane, Davi, Jéssica, Lyvia, Martin, Janine, Andressa, Carolina e que me ajudaram de alguma forma ou foram efetivos na manutenção da minha saúde mental. Também agradeço ao corpo de funcionários do Instituto do Cérebro.
A algumas companhias que facilitaram o trabalho: Sci-hub, Monster, Open Ephys e Google.
“Hamlet” - William Shakespeare
Resumo
A formação de mapas espaciais depende do hipocampo e de estruturas associadas. A atividade eletrofisiológica na região CA1 do hipocampo codifica representações espaciais através de aumentos da taxa de disparos de neurônios piramidais, conhecidos por células de lugar. O presente trabalho visou a implementação da técnica de registro eletrofisiológico hipocampal através da utilização de microdrives de múltiplos tetrodos móveis. Para isso, desenvolvemos um protótipo de microdrive e fizemos cirurgias estereotáxicas em ratos para o implante crônico bilateral. O novo protótipo de microdrive conteve 16 tetrodos móveis e permitiu o posicionamento progressivo individual dos tetrodos na camada piramidal da região CA1 do hipocampo dorsal. Após a recuperação cirúrgica dos animais, realizamos o registro da atividade eletrofisiológica extracelular da região CA1 enquanto ratos buscavam por recompensa de água nas extremidades de um labirinto linear. As formas de onda dos potenciais de ação registrados foram então classificadas como unidades neuronais individuais por algoritmos de classificação semi-automáticos. Cada disparo de um dado neurônio foi então associado à posição instantânea do rato no labirinto linear, e assim detectamos campos receptivos das células de lugar. Dessa forma, pudemos validar o protótipo de microdrive desenvolvido e, com isso, fornecer uma base metodológica importante para futuros estudos almejando entender a codificação espacial do ambiente e a formação de memórias espaciais.
Palavras chave: Células de lugar, Microdrive, Tetrodos, Hipocampo, Labirinto linear.
Abstract
The formation of spatial maps depends on the hippocampus and associated structures. Electrophysiological activity in the CA1 region of the hippocampus encodes spatial representations through increases in the firing rate of pyramidal neurons, known as place cells. The present work aimed the implementation of hippocampal electrophysiological recording technique through the use of microdrives of multiple movable tetrodes. For this, we developed a microdrive prototype and performed stereotaxic surgeries in rats for bilateral chronic implant. The new prototype microdrive contained 16 movable tetrodes and allowed the individual progressive positioning of the tetrodes in the pyramidal layer of CA1 region of the dorsal hippocampus. After the surgical recovery of the animals, we recorded the extracellular electrophysiological activity of the CA1 region while rats searched for water reward at the ends of a linear track. The waveforms of recorded action potentials were then classified as individual neural units by semi-automatic classification algorithms. Each firing of a given neuron was then associated with the instantaneous position of the rat on the linear track, and thus we detected place fields of the place cells. Thus, we validated the microdrive prototype developed and, thereby, provide an important methodological basis for future studies aiming to understand the spatial encoding of the environment and the formation of spatial memories.
Keywords: Place cell, Microdrive, Tetrodes, Hippocampus, Linear track.
Lista de abreviaturas
MRO - Movimento rápido dos olhos (Rapid eye movement). SOL - Sono de ondas lentas (Slow wave sleep).
CA1 - Cornu Ammonis area 1. CA2 - Cornu Ammonis area 2. CA3 - Cornu Ammonis area 3. CE - Córtex entorrinal.
GD - Giro denteado.
PRE - Sessão de sono anterior à tarefa espacial. POS - Sessão de sono posterior à tarefa espacial. PCL - Potencial de campo local.
V1 - Velocidade 1. V2 - Velocidade 2. V3 - Velocidade 3. A1 - Aceleração 1. A2 - Aceleração 2. A3 - Aceleração 3. IM - Índice de modulação.
CNC - Comando numérico computadorizado.
PSD - Power spectral density (densidade de potência espectral).
8
Lista de figuras
Figura 1 | Esquema das subdivisões hipocampais e suas projeções. Figura 2 | Esquemático das principais projeções hipocampais. Figura 3 | Ritmos oscilatórios do cérebro de roedores.
Figura 4 | Ilustração de 4 células de lugar que apresentam potenciais de ação
associados às posições em que o rato se encontra no espaço.
Figura 5 | Esquema ilustrativo da classificação de unidades neuronais a partir do
registro eletrofisiológico feito com tetrodo.
Figura 6 | Ilustração de um microdrive implantado em um rato.
Figura 7 | Comparação entre os diferentes tipos de microdrives que existem
atualmente.
Figura 8 | Processo de manufatura do tetrodo e microdrive. Figura 9 | Microdrive de 8 tetrodos móveis.
Figura 10 | Microdrive de 16 tetrodos móveis.
Figura 11 | Testes de deslocamento e tensão na base de proteção. Figura 12 | Reposicionamento dos tetrodos ao longo dos dias.
Figura 13 | Ilustração do protocolo de labirinto linear utilizado na tarefa
comportamental.
Figura 14 | Exemplo de classificação autônoma utilizando o Klustakwik.
Figura 15 | Exemplo de classificação autônoma utilizando o modelo de misturas
de gaussianas desenvolvido em nosso laboratório.
Figura 16 | Posições do animal no labirinto linear em diferentes sessões. Figura 17 | Atividade neuronal registrada por um tetrodo.
Figura 18 | Seleção de candidatos a células de lugar.
Figura 19 | Seletividade espacial de neurônio de CA1 dorsal.
Figura 20 | Células de lugar ao longo da trajetória percorrida no labirinto linear. Figura 21 | Neurônio de CA1 dorsal seletivo e acoplado em teta.
Figura 22 | Potencial de campo local de CA1 durante uma travessia no labirinto
linear.
Figura 23 | Potenciais de campo local de CA1 em alguns estados.
Figura 24 | Comodulograma de estados do animal. Figura 25 | Lesão eletrolítica e histologia.
Figura 26 | Ilustração do protocolo de velocidades e acelerações da tarefa. Figura 27 | Ilustração da tarefa de locomoção na esteira.
Figura 28 | Exemplo de oscilações delta (1-4 Hz) durante a exploração do animal
no labirinto linear.
Figura 29 | Análise espectral durante três protocolos de velocidades constantes
(20, 30 e 40 cm/s).
Figura 30 | Análise espectral durante a aceleração (2,5 cm/s²) no protocolo da
esteira.
Figura 31 | Análise espectral do PCL hipocampal em três protocolos de
aceleração (2, 2,5 e 3 cm/s²).
Figura 32 | Pico da frequência e amplitude normalizado em delta e teta através
dos 20 segundos binados.
Figura 33 | Frequência respiratória durante a corrida de velocidade constante na
esteira.
Figura 33 | Comodulograma da fase-amplitude e a energia por fase dos três
protocolos de velocidade constante.
Sumário
Resumo 5 Abstract 6 Lista de abreviaturas 7 Lista de figuras 8 Apresentação 11 I - Introdução geral 12 A formação hipocampal 13 Eletrofisiologia hipocampal 16
Microdrive de tetrodos móveis 23
II - Capítulo 1: Desenvolvimento dos microdrives de tetrodos móveis 27
1. Objetivos 28
2. Métodos 28
3. Resultados 31
III - Capítulo 2: Implantação da técnica de registro de células de lugar utilizando
microdrives de tetrodos móveis em ratos 35
1. Objetivos 37
2. Métodos 38
3. Resultados 45
4. Conclusão 58
IV - Capítulo 3: Velocidade de corrida modula a oscilação delta no hipocampo de
ratos 60 1. Objetivos 61 2. Métodos 62 3. Resultados 64 4. Conclusão 76 V. Discussão geral 77
VI. Animais implantados 81
VII. Referências 82 VIII. Anexos 96
11
Apresentação
O presente trabalho constitui uma síntese das atividades de pesquisa desenvolvidas durante o curso de mestrado. A dissertação tem como tema central a atividade eletrofisiológica do hipocampo de roedores durante a realização de comportamentos exploratórios, protocolos de exercícios físicos, e ciclos de sono/vigília. Para integrar os assuntos, o texto foi dividido em uma introdução geral seguida de três capítulos que abordam principalmente (1) a implementação de técnicas de registro neurofisiológico intracerebral utilizando microdrives de tetrodos móveis; (2) a realização de registros da atividade de disparo de células de lugar e do potencial de campo hipocampal durante a exploração de um labirinto linear; e (3) a realização de registros eletrofisiológicos do hipocampo de roedores durante corridas de velocidades crescentes e constantes em uma esteira elétrica controlada por computador. Além disso, os capítulos apresentam as respectivas análises dos sinais neurais, comportamentais, e interpretações dos resultados obtidos de modo a trazer contribuições originais a cada um desses campos individualmente.
I - Introdução geral
_________________________________________________________________________________
13
A formação hipocampal
O hipocampo é uma estrutura cerebral localizada no lobo temporal medial que exerce papel fundamental na codificação de memórias declarativas ou explícitas (Scoville e Milner, 1954; Buzsáki e Moser, 2013), além de codificar representações espaciais durante a navegação juntamente com o córtex entorrinal (CE) (Hafting et al, 2005; Buzsáki e Moser, 2013). A anatomia hipocampal começou a ser conhecida no final do século XIX a partir dos trabalhos iniciais de Camilo Golgi e Santiago Ramón y Cajal. Eles desenvolveram uma técnica de coloração por nitrato de prata capaz de marcar o meio intracelular dos neurônios, sendo assim possível visualizar as unidades neuronais através do microscópio óptico (Bentivoglio e Swanson, 2001). A partir dessa técnica, foi possível observar que o hipocampo possui subdivisões com diferentes características e projeções (Bentivoglio e Swanson, 2001; Insausti, 1997; Freund e Buzsáki, 1996).
A anatomia hipocampal hoje é separada em três subáreas chamadas de
Cornu Ammonis: CA1, CA2 e CA3 (Figura 1-A). Uma das principais projeções neuronais para o hipocampo se dá pelo CE a partir de duas vias (Insausti, 1997). (1) A via perfurante, que tem início na camada II do CE e que cruza o subiculum até chegar no giro denteado (GD) e em CA3. O GD se projeta para o CA3 a partir das fibras musgosas (mossy fibers), e CA3 se conecta com CA1 pelas colaterais de Schaffer . (2) A via temporoamônica, que se origina na camada III do CE e 1 projeta diretamente para CA1 (Figura 1-B). Tanto a via perfurante (CE II - DG) quanto a temporoamônica (CE III - CA1) enviam projeções unidirecionais para o hipocampo, as camadas IV e V do CE por sua vez recebem projeções hipocampais originadas em CA1 (Insausti, 1997; van Groen, 2003). No geral, a atividade excitatória e inibitória do CE é composta de neurônios piramidais glutamatérgicos e interneurônios GABAérgicos, respectivamente. Nas duas vias de projeção para o hipocampo (perfurante e temporoamônica), os neurônios de projeção do CE são excitatórios.
1 Essa conexão que envolve o CE até CA1 a partir do GD e CA3 é conhecida como via trisináptica
(Amaral e Witter, 1989; Insausti, 1993). É a maior comunicação entre o hipocampo e o córtex.
Figura 1: Esquema das subdivisões hipocampais e suas projeções. (A) A imagem mostra uma visão do hipocampo a partir de um corte coronal com coloração Nissl à esquerda e à direita um esquemático com as subdivisões de CA1, CA2, CA3 e giro denteado. Em (B) uma ilustração das projeções hipocampais. Modificado de Andersen et al, 2007.
A citoarquitetura do hipocampo é formada por uma complexa rede de neurônios piramidais e diferentes classes de interneurônios. Em CA1, CA2, CA3 e GD é possível observar uma alta densidade neuronal, composta de um agrupamento de neurônios piramidais. Modulando a atividade dos neurônios piramidais, interneurônios GABAérgicos projetam seus axônios em diferentes níveis do corpo celular piramidal (Freund e Buzsáki, 1996; Klausberger e Somogyi, 2008). Os interneurônios são classificados de acordo com suas características de
projeção sobre o neurônio piramidal, sendo eles: axo-axônicas (chandelier cells) , 2
basket cells , oriens lacunosum-moleculare (OLM) cells e bistratified cells . 3 4 5
A organização morfológica dos interneurônios e das células piramidais separa as regiões de CA1, CA2, CA3 e GD em 5 diferentes lâminas ou estratos:
stratum oriens, stratum pyramidale (onde se localiza o corpo celular dos neurônios piramidais), stratum lucidum, stratum radiatum e stratum lacunosum-moleculare
(Figura 2). Exclusivamente em CA3 o perfil laminar se dá pelas 5 camadas, sendo os stratum lucidum, pyramidale e oriens alvos de projeções do DG. CA2 por sua vez é composto de apenas 4 camadas, todas com exceção do stratum lucidum
(Amaral e Witter, 1989). Sua principal via de entrada se dá pelo stratum lacunosum-moleculare com inputs do CE II, e oriens que recebe projeções das colaterais associativas. Similar à CA2, CA1 apresenta as mesmas 4 camadas, onde sua principal vía de entrada é o stratum lacunosum-moleculare que recebe projeção do CE III. CA1 tem como principal camada de saída o stratum oriens que tem projeções de feedback para as camadas V e VI do EC. Além disso, CA1 recebe inputs de CA3 no stratum radiatum pelas colaterais de Schaffer (Amaral et al, 2006).
2 As chandelier cells são interneurônios que possuem seu corpo celular junto ao do neurônio
piramidal no stratum pyramidale e têm conexão axo-axonal (Freund e Buzsáki, 1996).
3 Interneurônio de alta taxa de disparo que inibem a região peri-somática dos neurônios piramidais
(Freund e Buzsáki, 1996).
4 As células OLM regulam a atividade dos neurônios piramidais e possuem corpo no stratum oriens
com projeções axonais no stratum lacunosum-moleculare.
5 Essas células apresentam seus somas no stratum pyramidale e atividade inibitória nos dendritos
das células piramidais no stratum oriens (Klausberger e Somogyi, 2008; Wheeler et al, 2015).
Figura 2: Esquemático das principais projeções hipocampais. Na figura pode-se ver as principais projeções de entrada e saída do hipocampo nas diferentes camadas celulares. O CE e GD fornecem projeções de entrada (em verde musgo e rosa). CA1 gera projeções de saída (verde).
Eletrofisiologia hipocampal
As trocas iônicas entre os meios intracelular e extracelular para que ocorra o potencial de ação neuronal desencadeiam uma diferença de potencial capaz de ser identificada por meio de eletrodos, como foi descrito por Luigi Galvani no século XVIII ( Verkhratsky et al, 2006 ). O conjunto dessas ativações neuronais gera um sinal elétrico extracelular chamado de potencial de campo local (PCL) (da Silva, 2009). O PCL representa uma propagação espacial em torno do eletrodo de aproximadamente 400 µm na horizontal e 1 mm na vertical . Quando medido no 6 hipocampo, o PCL apresenta diferentes bandas de frequências que se relacionam
6 Essa dispersão é discutida atualmente por influência da condição de volume local x global.
Trabalhos atualmente descrevem sua influência como sendo de uma área entorno de 6 mm (Kajikawa e Schroeder, 2011).
com diferentes estados comportamentais (Buzsaki, 2006; O'Keefe e Reece, 1993; Csicsvari et al, 2003; Senior et al, 2008; Sirota e Buzsaki, 2008). As principais bandas podem ser resumidamente separadas em: delta (1-4 Hz), teta (5-10 Hz), beta (10-30 Hz ), low gamma (LG) (30-50 Hz) e high gamma (HG) (50-80 Hz) (Figura 3). Em estudos mais recentes, foi possível observar que esses ritmos oscilatórios podem coexistir e estar acoplados. É possível encontrar uma relação de fase-amplitude-frequência entre dois diferentes ritmos, em geral esse acoplamento se dá entre uma oscilação de alta frequência e uma de baixa frequência (Scheffer-Teixeira e Tort, 2016; Scheffer-Teixeira e Tort, 2017; Colgin et al, 2009).
Figura 3: Ritmos oscilatórios do cérebro de roedores. (A) Espectro de potência de diferentes ritmos hipocampais durante o sono. (B) Diferentes classes de ritmos oscilatórios do cérebro por bandas de frequências. Modificado de Buzsáki e Draguhn, 2004.
No geral, o estado global do cérebro é definido como “alerta” e “quieto” a partir das oscilações predominantes no hipocampo (Battaglia et al, 2011; Kirov et al, 2009): oscilações delta (1-4 Hz) caracterizam o estado quieto, e as oscilações teta (5-10 Hz) o estado alerta. Teta ocorre fortemente associado a oscilações gama (30-80 Hz), que estão relacionadas a processos cognitivos (Sheffzuk et al, 2011; Tort et al , 2009; Kirov et al, 2009). Delta, teta e gama são atualmente os ritmos hipocampais mais estudados, e podem estar envolvidos no processo de transmissão de informações entre as áreas cerebrais. Por isso, introduziremos abaixo seus principais aspectos individuais:
Delta. A oscilação delta é descrita como uma oscilação lenta entre 1 e 4 Hz, predominante no hipocampo de roedores durante estados de anestesia geral, imobilidade na vigília e em períodos de sono descrito como sono de ondas lentas (do inglês, slow wave sleep ou “SOL”). O ritmo delta reflete períodos tônicos de despolarização e hiperpolarização cortical referidos como estados “up” e “down” (Steriade et al, 1993). O estado up é descrito como o aumento do balanço entre a atividade excitatória e a inibitória dos potenciais pós-sinápticos na comunicação do hipocampo com o córtex, que gera um aumento do potencial de membrana nessas áreas (Haider et al, 2006; Headley e Paré, 2017). Além disso, durante as oscilações delta, um evento de alta frequência chamado de complexo sharp wave ripple (SWR) (150-250 Hz) ocorre periodicamente durante o início do estado up
(Isomura et al, 2006; Battaglia et al, 2004). O SWR é caracterizado pela sincronização de neurônios piramidais de CA1 com interneurônios de CA3, e exerce um papel fundamental no processo de consolidação de memória (Ylinen et al, 1995; Girardeau e Zugaro, 2011).
Teta. A oscilação teta no hipocampo dorsal de roedores pode variar entre 5 e 10 hz, e é presente tanto em atividades voluntárias, como andar, correr, pular, e nadar dentre outras, quanto atividades involuntárias como durante o alerta e o sono de movimento rápido dos olhos (MRO) ( Vanderwolf, 1969; Buzsáki, 2002 ). Além disso, foi mostrado que a oscilação teta apresenta funções cognitivas, como tomada de decisão, aprendizagem, memória espacial e associação contextual (Belchior et al, 2014; O’Keefe e Recce, 1993; Tort et al, 2009; Benchenane et al, 2010). Sua atividade é dependente da banda medial/diagonal
do septo, que possui projeções GABAérgicas, colinérgicas e glutamatérgicas para o hipocampo (Buzsáki, 2002; Lee et al, 1994). Trabalhos anteriores mostraram que lesões no septo e via septohipocampal abolem a atividade do ritmo teta tanto em GD quanto em CA1 (Sainbury e Bland, 1981; Andersen et al, 1979). Além disso, Quilichini et al, 2010 mostraram que lesões no CE também influenciam a atividade do ritmo teta em todo o hipocampo, o que indica uma função do CE como um modulador externo do teta hipocampal.
A atividade de teta ao longo do tempo foi extremamente explorada por ser o principal ritmo durante o estado alerta do cérebro de roedores. Dentre esses estudos, McFarland et al em 1975 observaram a correlação desse ritmo com a atividade locomotora de roedores. Ao mostrar que há um aumento da amplitude e da frequência de teta durante a locomoção, seu trabalho se tornou precursor de uma série de estudos seguintes que relaciona esse ritmo à dedicação física do indivíduo. Em 1998, Slawińska e Kasicki mostraram que o aumento da frequência teta durante a locomoção tem um fator motivacional inserido que modifica sua dinâmica a partir de influências emocionais. Mais recentemente, Kuo e colaboradores (2011) descobriram que essa dinâmica de atividade de teta é variável com o tempo. Eles mostraram que no início da corrida há um aumento de amplitude e de frequência dessa banda, mas que com o passar do tempo a frequência retorna a um nível basal. Em outro trabalho publicado em 2014, Kuo e Li também mostraram que há diferença na ritmicidade de teta entre corridas voluntárias e involuntárias (Li et al, 2014). Os resultados mostram que nas 7 corridas involuntárias os animais apresentaram uma maior potência na frequência de teta quando comparado com as corridas voluntárias. Nas corridas involuntárias também foram encontrados aumentos nos batimentos cardíacos. Os autores sugerem que interações emocionais e sensoriais durante a corrida podem estar relacionadas com essas diferenças de atividade cerebral e cardíaca.
Em suma, a oscilação teta é fundamental para a aprendizagem e consolidação de memória, além de estar envolvida nas principais ações do indivíduo durante seu estado de vigília. Sua atividade modula diversos processos
7Experimentos executados em uma roda de correr e em uma esteira controlada por computador.
cognitivos, dentre eles a formação de mapas espaciais (Buzsáki e Moser, 2013), que será discutido mais à frente.
Gama. As oscilações gama possuem frequência entre 30 e 80 Hz. Sua atividade ocorre ao longo do córtex, hipocampo e estriado tanto durante o sono MRO quanto na vigília. A geração do ritmo gama é bastante estudada, sendo atualmente dividida em dois modelos: (1) Modelo baseado na comunicação inibitória de interneurônios, que se dá através de drives excitatórios que agem em uma rede de interneurônios inibitórios. Quando esses drives atingem um determinado nível de atividade, os interneurônios acabam silenciando temporariamente sua própria rede, causando uma sincronia de disparos quando saem da inibição. Essa atividade se torna cíclica e contínua (Wang e Buzsáki, 1996). (2) Em outro modelo, os neurônios piramidais ativam os interneurônios que causam um feedback de inibição. Com o diminuir dessa inibição, as células piramidais voltam a disparar, excitando novamente as pequenas redes de interneurônios, que por sua vez voltam a prover feedback de inibição (Borges e Kopell, 2003). Essa atividade também se torna cíclica e gera uma oscilação na banda gama.
Atualmente, o ritmo gama observado em CA1 é dividido em dois componentes que apresentam frequência, origem e funções diferentes. O low gamma (LG) (30-50 Hz) é oriundo de CA3 e apresenta relação com a codificação de memórias hipocampo-dependentes (Colgin e Moser, 2010). Enquanto o high gamma (HG) (50-80 Hz) possui origem no CE e participa de processos de associações espaciais (Colgin e Moser, 2010; Quilichini et al, 2010). Trabalhos mostram que há um maior acoplamento entre teta e gama em tarefas que exigem demandas associativa e cognitiva (Igarashi et al, 2014; Tort et al, 2009; Bott et al, 2016).
Dessa forma, durante a navegação espacial no ambiente, o hipocampo possui atividade oscilatória de teta (5-10 Hz) e gama (30-80 Hz). Essas oscilações modulam a atividade de disparos de potenciais de ação de diversas classes de neurônios, dentre elas os neurônios piramidais (células principais). Foi descoberto que alguns desses neurônios piramidais modulados por teta e gama apresentam
preferência de disparo em um lugar específico no ambiente (O’Keefe e Dostrovsky, 1971) e participam portanto da codificação espacial, tópico da próxima seção.
Células de Lugar
Em 1971, O’Keefe e Dostrovsky observaram que neurônios piramidais no hipocampo de ratos disparam potenciais de ação em locais específicos do ambiente (O’Keefe e Dostrovsky, 1971); estes neurônios são hoje em dia chamados de “células de lugar” (do inglês, place cells). Essa descoberta deu suporte à teoria do Mapas Cognitivos, a qual postula que no hipocampo são integradas informações sensoriais recebidas de áreas corticais primárias, criando assim uma representação espacial do ambiente (O’Keefe e Nadel, 1978). Por outro lado, desde a descrição do caso do paciente H.M., já havia sido proposto que o hipocampo e estruturas parahipocampais desempenham uma função primordial na formação de novas memórias declarativas (Scoville e Milner, 1954). Atualmente, de acordo com essa teoria, as células de lugar forneceriam o substrato neural fundamental para a construção de representações dos contextos envolvidos na memória episódica (Eichenbaum, 2000b; Wood et al., 2000). Contudo, a interligação entre essas duas teorias ainda permanece por ser esclarecida.
Mais recentemente, em um labirinto linear com recompensas de água nas extremidades, foi possível observar o disparo sequencial de populações de células de lugar em função da posição e da direção do animal no espaço (Figura 4) (Wilson e McNaughton, 1994; Jensen e Lisman, 2005; Dragoi e Buzsaki, 2006; Foster and Wilson, 2006). Foi visto também que a sequência de células de lugar ativas ao longo do percurso era frequentemente reativada durante os momentos de vigília quieta e durante os episódios de sono pós-experimento (Louie e Wilson, 2001; Foster e Wilson, 2006). Essas reativações acontecem acompanhadas de sharp-wave/ripples (150-250 Hz) (Buzsáki, 1998; Battaglia et al., 2011; Carr et al., 2011). Uma série de estudos demonstrou que a interrupção das sharp-wave ripple afeta o processo de aprendizagem e a consolidação de novas memórias (Girardeau et al., 2009; Ego-Stengel e Wilson, 2010; Girardeau e Zugaro, 2011).
Figura 4: Ilustração de 4 células de lugar que apresentam potenciais de ação associados às posições em que o rato se encontra no espaço (o exemplo mostra a plataforma de um labirinto linear). À direita tem-se a representação espacial do campo de lugar em escala de cor. Retirado de Nakazawa e colaboradores (2004).
Os desenvolvimentos técnicos e a evolução das ferramentas computacionais para análise de dados permitiram avanços na compreensão da atividade eletrofisiológica do hipocampo. Por exemplo, (1) foi observado que a ativação das células de lugar está acoplada a determinadas frequências do potencial de campo local (PCL), como as oscilações teta (5-10 Hz) e gama (30-80 Hz) (O'Keefe e Reece, 1993; Csicsvari et al., 2003; Senior et al., 2008). Observou-se ainda que (2) as oscilações teta e gama acontecem no hipocampo de roedores não somente durante os estados de alerta e de exploração ativa da vigília, mas também surgem durante o sono MRO (Buzsaki, 2002; Scheffer-Teixeira et al., 2012). Além disso, as análises da relação entre a fase das oscilações e os disparos de potenciais de ação mostraram que (3) os disparos das células de lugar ao longo do seu campo receptivo espacial variam em função da fase do ciclo da oscilação teta subjacente (O'Keefe e Reece, 1993). Essa variação de fases acontece de maneira ordenada, dando origem a uma precessão das fases da onda onde os disparos acontecem à medida que o animal atravessa o campo espacial dessa célula (Jensen e Lisman, 2000; O'Keefe e Reece, 1993). Além da relação com as oscilações teta, acredita-se que (4) a coordenação
temporal exercida pelo PCL sobre os disparos de grandes populações de neurônios permita a formação de assembleias neuronais (Harris et al., 2003), descrita por Donald Hebb em 1949 como agrupamentos de neurônios que se ativariam juntos para codificar uma representação mental (Hebb, 1949).
Mais recentemente, Hafting e colaboradores (2005) registraram no córtex entorrinal medial, uma região que envia projeções ao hipocampo, e descobriram neurônios que disparam potenciais de ação periodicamente no espaço, com campos espaciais em formato de grades, chamando-lhes assim de células de grade (do inglês, grid cells). Esse achado, acompanhado da descoberta das células de lugar ocorrida no anos 70, fez com que John O’Keefe, Edvard Moser e May-Brit Moser fossem agraciados com o Prêmio Nobel de Medicina e Fisiologia em 2014 (Moser, Moser e O’Keefe, 2014).
Microdrive de tetrodos móveis
Uma dificuldade técnica para a obtenção de registros extracelulares da atividade de disparos de unidades neuronais individuais no hipocampo de roedores decorre do fato de as camadas celulares CA1, CA2 e CA3 apresentarem os corpos celulares altamente compactadas em densas camadas. Para sobrepor essa dificuldade, foram desenvolvidas duas técnicas para discriminar potenciais de ação provenientes de diferentes neurônios a partir de registros extracelulares. Inicialmente, foram usados estereotrodos (McNaughton et al., 1983), que se caracterizam por dois eletrodos de mesmo material e espessura, agrupados paralelamente e girados sobre o próprio eixo (O'Keefe e Reece, 1993; Wilson e McNaughton, 1993). Posteriormente, foram usados tetrodos, caracterizados como quatro eletrodos agrupados da mesma forma (Figura 5-A). Esses eletrodos registram os mesmos disparos provenientes de uma pequena população neuronal, e análises computacionais posteriores permitem então a caracterização de unidades neurais individuais de acordo com os parâmetros do formato de onda dos potenciais de ação registrados simultaneamente nos diferentes canais do tetrodo (Figura 5-B). Esses desenvolvimentos metodológicos tornaram o registro
utilizando tetrodos a principal técnica eletrofisiológica para o estudo de populações de neurônios individuais no hipocampo de roedores, e assim permitiram a caracterização detalhada da atividade de disparos das células de lugar.
Figura 5: Esquema ilustrativo da classificação de unidades neuronais a partir do registro eletrofisiológico feito com tetrodo. A figura à esquerda (A) representa um esquemático de um tetrodo localizado nas proximidades de 3 neurônios representados pelas cores vermelho, verde e azul. A figura à direita (B) mostra um exemplo do processo de registro e classificação neuronal. O sinal eletrofisiológico bruto é filtrado em baixas (1-1000 Hz) e altas (500-6000 Hz) frequências para se obter o potencial de campo local e os disparos neuronais, respectivamente. A classificação dos disparos é feita a partir da discrepância do formato de onda do disparo de cada neurônio, mostrado na figura pelas cores seguindo os neurônios da figura (A). Figura ilustrada por Rodrigo Pavão e modificada por Rafael Pedrosa.
Junto das técnicas de estereotrodo e tetrodo, foi desenvolvido também um sistema para a movimentação progressiva dos eletrodos após a cirurgia de implante, o microdrive. Esse aparelho permite a execução de ajustes finos no posicionamento de modo que a ponta dos eletrodos esteja o mais próximo possível dos neurônios registrados. Dependendo da necessidade, os eletrodos podem se mover juntos ou individualmente, múltiplas vezes, e até mesmo com os animais acordados. O uso dos microdrives também permite que o experimentalista atinja o alvo no cérebro em diferentes camadas a partir de um sistema móvel de parafuso que controla a altura do eletrodo no cérebro após a cirurgia. Um exemplo de microdrive é mostrado na Figura 6.
Figura 6: Ilustração de um microdrive implantado em um rato. Em (A) e (B) temos um exemplo de um animal implantado com um microdrive revestido de um papel laminado. (C) mostra o microdrive pós implantado. Figura retirada de J. Yamamoto e Matthew Wilson (2008).
Os primeiros microdrives eram construídos usando componentes de metal e plástico líquido, mas hoje em dia sua principal base é feita de componentes plásticos produzidos por impressoras 3D. A principal vantagem desses componentes plásticos é o baixo peso, alta precisão, baixo custo e a velocidade da produção, consumindo muito menos tempo que o modelo anterior. Além disso, as versões mais recentes se aprimoraram também em utilizar um maior número de canais para registro, juntamente com técnicas de manufatura mais rápida.
Atualmente, o foco de melhorias nessa técnica ainda está voltado para o aumento de número de tetrodos para controle individual juntamente com redução do peso. Dos microdrives disponíveis no mercado atualmente, o flexDrive® é o que apresenta uma melhor versão da relação peso/tetrodos, sendo o mais
utilizado nos laboratórios que trabalham com registro de unidades neuronais em larga escala (Figura 7).
Figura 7: Comparação entre os diferentes tipos de microdrives que existem atualmente. O eixo X é o número individual de agrupamento de eletrodos que se podem mover individualmente. Em Y o peso de cada microdrive. A linha cinza é o peso limite que um camundongo pode sustentar. Retirado de Voigts et al (2013).
O assunto abordado nesse tópico da introdução será necessário para o
entendimento do capítulo 1 desta dissertação. A saber, o trabalho desenvolvido visou a implementação da técnica de registro eletrofisiológico através da utilização de microdrives de múltiplos tetrodos móveis, uma tecnologia ainda incipiente no Instituto do Cérebro da UFRN e no Brasil. Conforme visto nos outros tópicos abordados nesta introdução, o desenvolvimento de tal tecnologia permitirá a realização de pesquisas sobre importantes temas atuais da eletrofisiologia hipocampal, como o estudo da atividade das células de lugar e de suas relações com as oscilações neuronais.
II - Capítulo 1: Desenvolvimento de microdrives de
tetrodos móveis
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A técnica de microdrive de tetrodos móveis, além de ser a mais eficaz quanto ao quesito de número de neurônios registrados, vem sendo extremamente utilizada em diversos laboratórios ao redor do mundo. Apesar de haver avanços em sua eficiência, esse sistema ainda é dependente de peças e ferramentas específicas produzidas por empresas ou grupos que monopolizam o mercado, e, com isso, o valor individual de compra de cada microdrive ainda é inviável para muitos laboratórios de países em desenvolvimento. Pensando nisso, e com interesse em implementar a técnica no Brasil, desenvolvemos dois diferentes protótipos de microdrives utilizando uma impressora 3D e uma máquina de comando numérico computadorizado (CNC).
1. Objetivos
1.1 Objetivo geral
Desenvolver um novo protótipo de microdrives de tetrodos móveis e implantar sua técnica no Laboratório de Neurofisiologia Computacional do Instituto do Cérebro da UFRN.
1.2 Objetivos Específicos
1 – Desenvolver um protótipo de microdrive móvel para implantes em ratos.
2 – Utilizar o método de montagem em blocos para facilitar sua manufatura.
2. Métodos
2.1 Microdrive de tetrodos móveis
Desenvolvemos um protótipo próprio de microdrive inspirado em modelos já existentes na literatura. Foram testadas tanto estratégias de confecção dos protótipos via CNC quanto através de impressão 3D, e utilizados polylactic acid (PLA) e acrylonitrile butadiene styrene (ABS). Foram empregados conectores
Omnetics® para a conexão do microdrive ao sistema de registro. Além disso, parafusos e cânulas mais baratos foram adaptados aos microdrives desenvolvidos.
2.2 Tetrodos
Os tetrodos foram formados por quatro microeletrodos de nicromo ou tungstênio de 12,5 µm de diâmetro, revestidos de Teflón® (Politetrafluoretileno), e emaranhados a partir de giros em relação ao seu eixo principal. Antes da cirurgia de implante, os microeletrodos tiveram sua impedância corrigida para aproximadamente 70 KΩ a 100 KΩ a partir da eletrólise em solução de ouro contendo nano tubos de carbono, e de acordo com Redish e colaboradores (2009).
2.3 Manufatura do microdrive de tetrodos móveis
Para a manufatura do microdrive é necessário imprimir e construir as partes (usando a impressora 3D): 1) Support board - placa central em que o microdrive será montado; 2) Protection base – estrutura tipo um cone que prevê sua proteção; 3) Guide platforms – componentes para guiar o tetrodo, controlados por parafusos; 4) Guiding base – peça encaixada embaixo da protection base e usada para a distribuição espacial dos tetrodos no eixo XY; 5) Microdrive cover - tampa para a proteção do microdrive quando não estiver em uso. A Figura 11 mostra um passo a passo do processo de manufatura. As peças podem ser encontradas para impressão no link: https://github.com/tortlab/Open-Source-Microdrive.
Figura 8: Processo de manufatura do tetrodo e microdrive. (A) Para a manufatura do tetrodo, cortamos dois pedaços de fio revestido de 20 cm de comprimento (níquel-cromo ou tungstênio, 12,5 µm diâmetro), dobramo-os juntos em forma de U e prendemos o laço na presilha pelas 4 pontas. B) & C) Abaixamos o suporte para suavemente prender a presilha no imã magnético para começar o protocolo de giro. D) depois do giro, usamos a heatgun para grudar os fios. Em seguida, cortamos o tetrodo perto da presilha e removemos cuidadosamente. E) Materiais usado para a confecção dos tetrodos/microdrive com o sistema de aquisição. Soldamos o conector Omnetics na
printed circuit board (PCB) usando solda em pasta. Parafusos e porcas foram usados para prender a PCB na Support board. O terra (fio de prata ou aço inoxidável) também foi soldado na PCB e preso aos parafusos na ponta. F) Partes 3D do Microdrive: Microdrive cover, Support board, Guide platforms, Protection base e Guiding base. Cada uma das 16 guiding units é composta de barras de 19Ga, parafuso, porcas e uma cânula de 22Ga. Para cada guiding unit, tem-se 3 furos radialmente alinhados com a Support board para a barra, parafuso e cânula de 22Ga. Um pequeno tubo de sílica (que vai carregar o tetrodo) foi inserido dentro da cânula de 22Ga, e colado nele junto da Guide platform. A Guide platform desce pelo apoio da barra de 19Ga a partir do giro do parafuso, onde carrega a cânula de 22Ga e o pequeno tubo de sílica para a Support board. Dentro da Support board, o pequeno tubo de sílica desliza dentro de um tubo de sílica maior de 27G. A
Support board encaixa na Protection base e essa por sua vez na Guiding base. G) Um passo adicional no conjunto do microdrive é o ancoramento das guiding units e das sílicas maiores de 27Ga (azul) dentro da Support board. Note que o pequeno tubo de sílica (verde) vai dentro do tubo da sílica de 27Ga (azul). Em outra etapa, as guiding units são baixadas a partir do giro dos parafusos, sendo ambas as sílicas cortadas na parte superior da Guiding base. Depois, eles são movidos de volta para cima e os tetrodos são carregados e colados nos pequenos tubos de sílica. H) Vista superior do microdrive sem as guiding units. A Support board possui 3 filas circulares de furos, através das quais são inseridas a cânula de 22Ga (fileira interna), o parafuso (fileira do meio, porca marcando em verde) e a barra de 19Ga (fileira externa). I) Vista frontal/lateral da Protection base, Guiding base (fixada dentro por resina acrílica) e o tubo de sílica de 27Ga ainda não cortada. Figura retirada de capítulo submetido.
3. Resultados
3.1 Microdrives
3.1.1 Microdrive de 8 tetrodos móveis
O primeiro protótipo de microdrive desenvolvido promove o movimento simultâneo de 8 tetrodos que convergem na mesma região. O microdrive (5,0 cm de altura; 1,4 cm de raio) apresenta uma parte móvel associada a 8 tetrodos guiados por um parafuso de bronze com um passo de 0,28 mm a cada volta (Figura 9). Uma placa de circuito impresso de fenolite foi desenvolvida para conexão dos tetrodos e fio terra com o conector Omnetics®. As placas base foram feitas com cortes precisos em uma CNC de modelo 3020. Os tetrodos se encontram presos à sílica guia que se movimenta proporcionalmente ao passo dado pelo parafuso guia. Em paralelo, as sílicas base estão fixadas à cânula presa à placa base para estabilizar e direcionar a sílica guia com os tetrodos.
Figura 9: Microdrive de 8 tetrodos móveis. Na figura vemos o esquemático do microdrive, sendo a primeira figura à esquerda, a representação de perspectiva do protótipo, seguido da vista lateral e por último da vista superior. São indicadas por letras as peças: a - tetrodos; b - parafuso guia; c - Base de proteção; d - Conector Omnetics®; e - Sílica guia; f - Sílica base; g - Placas base.
Ao todo 5 ratos foram implantados com esse modelo de microdrive, dos quais foram obtidos registros de apenas 3. Os tetrodos foram progressivamente aprofundados até a região do hipocampo. Os registros foram iniciados um dia após observadas características eletrofisiológicas típicas do hipocampo, como a ocorrência de SWR, oscilações teta de alta amplitude, rajadas (“bursts”) de disparos de neurônios (típicos de neurônios piramidais). Ao fim de cada sessão de registro, os tetrodos foram levemente aprofundados para o registro de novos neurônios na sessão seguinte com intervalo mínimo de 20 horas entre sessões.
3.1.2 Microdrive de 16 tetrodos móveis
Com o objetivo de ampliar o número de tetrodos por implante, de se obter movimentação individualizada, posicionamento preciso dos tetrodos de registro, e de aumentar a quantidade de neurônios registrados, um segundo protótipo de microdrive foi desenvolvido para o implante e registro bilateral da atividade eletrofisiológica dos hipocampi de ratos. O microdrive (3,6 cm de altura; 2,3 cm de raio e 14 gramas de peso) possui um sistema móvel de 16 tetrodos guiados individualmente por 16 parafusos de bronze com um passo de 0,32 mm a cada volta (Figura 10). Uma placa de circuito impresso de fenolite (modelo disponível online pelo projeto Open ephys) foi utilizada para conexão dos 64 canais trilhados
com conectores Omnetics® (2 conectores com 32 canais cada). As peças plásticas para a montagem do corpo do microdrive foram impressas em PLA por uma impressora 3D com bico extrusor de 0,4 mm de precisão aquecido a 220 °C, a partir de um modelo desenvolvido 3D por nós.
No total, 5 ratos foram implantados com o microdrive de 16 tetrodos móveis, dos quais foram obtidos registros de apenas 3 animais. Por enquanto, nem todos os registros colhidos foram analisados (ver na seção “VI - Animais implantados”).
Figura 10: Microdrive de 16 tetrodos móveis. Na figura vemos um protótipo 3D do microdrive, sendo apresentado na sequência as vistas de perspectiva, frontal e superior. As peças são indicadas por letras: a - Tetrodos; b - Base de proteção; c - Plataforma guia; d - Conector Omnetics®; e - Base guia.
3.1.2.1 Testes de resistência da Base de proteção
Testes de deslocamento e tensão (von Mises Stress) foram feitos para o desenvolvimento de uma melhor estrutura de proteção do Microdrive (Figura 11). Em simulação, foram definidos parâmetros como: material Abs, base fixada na região inferior da Base de proteção e uma força de 2 N na região superior/lateral para uma simulação de uma eventual batida forte do animal após implantado.
A simulação mostra que a peça apresenta maior deslocamento na região superior, onde não há contato direto com nenhuma outra parte do microdrive (Figura 11-A), podendo assim se movimentar sem que haja qualquer dano na
estrutura. A parte inferior, que é fixada na cabeça do animal com acrílico, não apresentou qualquer movimentação no teste, proporcionando assim uma baixa força de cisalhamento entre o implante e o acrílico.
Figura 11: Testes de deslocamento e tensão na base de proteção. Em (A) vemos um mapa de
calor do deslocamento da estrutura quando aplicada uma força de 2 N (representada pela seta branca). Note que a região inferior da Base de proteção, a qual será fixada no animal, segue intacta a qualquer movimento. (B) mostra o von Mises Stress, um tipo de medida de tensão da peça. Perceba que existe pouco estresse no geral e que o vazamento ajuda na dissipação da tensão.
O von Mises Stress é uma medida de tensão baseada na relação da energia de cisalhamento com o limite máximo de tensão do objeto. Foi observado que houve pouco estresse na estrutura no geral (Figura 11-B). Os vazamentos da peça ajudam na dissipação da tensão sofrida na base e na diminuição do peso, influenciando assim na durabilidade do implante.
3.2 Posicionamento dos tetrodos
Como já dito anteriormente, uma das principais vantagens do uso de microdrives é o reposicionamento dos tetrodos para registro de diferentes neurônios ao longo do tempo. Como forma de validar o funcionamento do passo dos parafusos, fizemos implantes crônicos dos microdrives em ratos com alvo em CA1 e registramos sua atividade ao longo de diferentes camadas do tecido cerebral (mais informações no capítulo 2). Sabendo que cada volta completa no parafuso representa 0,32 mm, descemos os tetrodos progressivamente no decorrer dos dias. Inicialmente o dado de cada tetrodo colhido foi filtrado entre
500-6000 Hz para detecção dos disparos e seus formatos de onda foram armazenados. Em seguida analisamos a diferença de pico/pico de dois canais em diferentes tetrodos ao longo de seu deslocamento no tecido cerebral (Figura 12). Com propósito de registrar a camada piramidal de CA1 dorsal (2,3 mm de profundidade a partir do início do córtex), espera-se que aproximadamente 7,2 voltas no parafuso seja suficiente para atingir o alvo. Nos registros da figura 12, a camada piramidal foi atingida com 7,5 e 7,2 voltas no parafuso.
Nossos resultados mostram também que no decorrer da descida dos tetrodos, particularidades da camada piramidal puderam ser observadas, como maiores agrupamentos de disparos (Figura 12- A e B). Vimos também que, quando no alvo, um leve torque no parafuso é suficiente para avistar novos agrupamentos de disparos (Figura 12-C). Esse resultado se assemelha com o do Flexdrive® já mostrado por Voigts e colaboradores, 2013.
Figura 12: Reposicionamento do tetrodo ao longo dos dias. Em (A) e (B) vemos dois tetrodos em diferentes alturas no tecido cerebral, onde comparamos o pico/pico de 2 canais. Em cinza temos
um provável alvo da camada piramidal. (C) Representa um tetrodo possivelmente na camada piramidal que apresenta diferença de agrupamentos no decorrer de pequenas descidas.
III - Capítulo 2:
Implantação da técnica de registro de células
de lugar utilizando microdrives de tetrodos móveis em ratos
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Embora o estudo dos correlatos neurais da codificação espacial constitua uma área extremamente ativa de pesquisa atual, até o presente momento nenhum laboratório no Brasil publicou estudos envolvendo registro de células de lugar, o que portanto caracteriza um atraso científico de mais de 40 anos em relação aos laboratórios de países desenvolvidos. O Laboratório de Neurofisiologia Computacional do Instituto do Cérebro da UFRN, coordenado pelo orientador do aluno de mestrado da presente dissertação, possui grande interesse nesta área de pesquisa, e, de fato, já vem contribuindo para tal através da análise computacional de registros de células de lugar colhidos por terceiros e que estão disponíveis na internet em sites de compartilhamento de dados científicos (por exemplo, ver
www.crcns.org). Contudo, por já estarem colhidos, as perguntas que podem ser respondidas por estes dados são restritas. Neste sentido, a fim de ganhar mais autonomia científica, torna-se necessário que o laboratório, além de sua expertise na análise computacional dos registros, também desenvolva expertise experimental na coleta de seus próprios dados de atividade de células de lugar. Para tanto, uma primeira etapa crucial é a implementação da tecnologia de registros eletrofisiológicos do hipocampo através do uso de microdrives de tetrodos móveis. Portanto, almejamos aqui uma validação da técnica, que servirá de importante base para estudos futuros visando compreender a formação de novas memórias espaciais dependentes do hipocampo.
Assim, o presente estudo visou implementar um sistema de registro eletrofisiológico utilizando o novo protótipo de microdrive contendo 16 tetrodos móveis desenvolvido no presente projeto (ver capítulo 1). Para validar este protótipo, registramos a atividade de populações de células de lugar na região CA1 do hipocampo dorsal de ratos durante uma tarefa de exploração de um labirinto linear associado a recompensas de água nas extremidades.
1. Objetivos
1.1 Objetivo geralImplementar no Laboratório de Neurofisiologia Computacional do Instituto do Cérebro da UFRN a técnica de registro de potenciais de ação de células de lugar no hipocampo de ratos utilizando um novo protótipo de um microdrive de tetrodos móveis.
1.2 Objetivos Específicos
1 – Utilizar o novo protótipo de microdrive para o implante crônico de 16 tetrodos móveis que possam ser precisamente posicionados após a cirurgia de implante.
2 – Utilizar tetrodos para registro eletrofisiológico do potencial de campo local e da atividade de neurônios hipocampais individuais.
3 – Realizar o registro eletrofisiológico de potenciais de ação e de potenciais de campo local na subárea CA1 do hipocampo dorsal de ratos enquanto os animais
buscam recompensa de água nas extremidades de um labirinto linear e durante o sono pré e pós tarefa para futuras análises.
4 – Aplicar ferramentas de classificação de disparos (“spike sorting”) para identificação de unidades neuronais individuais a partir das propriedades das formas de onda do potencial de ação.
5– Fazer a análise do registro eletrofisiológico para quantificação da taxa de
disparos neuronal em relação à posição do animal ao longo do labirinto linear, a fim de detectar células de lugar.
Métodos
2.1 Sujeitos experimentaisUtilizamos 10 ratos wistar machos adultos (Rattus Norvegicus) entre 2 e 4 meses de vida. Os animais foram mantidos em gaiolas coletivas sob ciclo claro-escuro de 12 horas com água e ração ad libitum. Os experimentos foram realizados em sua maioria na fase clara do ciclo. Todos os experimentos seguiram as normas éticas estabelecidas pelo comitê de ética animal (CEUA 058/2016).
2.2 Protocolo de aprendizado espacial
Os animais foram submetidos a uma tarefa de aprendizado espacial para obtenção de recompensa de água em labirinto linear. Alguns animais também foram submetidos a sessões de sono de uma hora de duração antes e após a execução da tarefa (Figura 13). Os animais foram privados de água durante as 18 horas que antecederam os experimentos. Ao final das sessões diárias de experimento, os animais receberam água ad libitum durante 6 horas. A cada dia
do protocolo da tarefa, o animal foi submetido a uma sessão de exploração do labirinto linear (180 cm de comprimento por 21 cm de largura) com duração de 30 minutos. A tarefa consistiu do deslocamento espacial do animal a partir de uma extremidade do labirinto até a outra para a obtenção de uma recompensa de água. A presença dos animais foi detectada por sensores de infravermelho instalados nas paredes do labirinto e localizados a 25 cm do local de recompensa. Ao passar pelos sensores, a presença do animal ativa um sistema automatizado que aciona a liberação de 60 µL de água. A próxima recompensa liberada por esse sensor só pode ser acionada após o animal visitar a outra extremidade do labirinto. Foram registrados automaticamente os instantes de tempo em que o animal atravessa os sensores. O comportamento dos animais foi registrado por meio de uma câmera de vídeo digital (Logitech® c920) localizada aproximadamente 200 cm acima do labirinto linear. Os arquivos foram adquiridos à taxa de 30 imagens por segundo e armazenados em disco rígido para análise posterior.
Figura 13: Ilustração do protocolo de labirinto linear utilizado na tarefa comportamental. O labirinto
é feito de madeira em suas extremidades e revestido de acrílico em suas paredes, sendo ele conectado a sensores de infravermelho próximos à extremidade para detectar a presença do animal e liberar a recompensa de água. Um LED vermelho é acoplado com o sensor infravermelho para a sincronização do registro eletrofisiológico por vídeo.
2.3 Neurocirurgia para implante de microdrive
Cada animal foi submetido a uma cirurgia estereotáxica para o implante permanente de um microdrive contendo oito ou dezesseis tetrodos móveis. Os animais foram anestesiados através da administração intramuscular de sulfato de
atropina (0,04 mg/kg), seguido de cloridrato de cetamina (100 mg/kg) e cloridrato de xilazina (8 mg/kg). Durante a cirurgia, o nível da anestesia era periodicamente verificado através de alterações das frequências cardíaca e respiratória, e de outros sinais fisiológicos como o reflexo da cauda. Doses suplementares de cetamina (metade da dose inicial) eram administradas quando necessário. Todos os esforços foram empregados para minimizar o sofrimento animal durante os procedimentos experimentais. Após tricotomia, o animal foi posicionado em um aparelho estereotáxico (Kopf). Lidocaína foi injetada no tecido subcutâneo craniano onde foi realizada uma incisão longitudinal, expondo o crânio. O centro e os quatro pontos marginais da craniotomia foram marcados segundo as dimensões do microdrive de tetrodos e segundo as coordenadas estereotáxicas da subárea CA1 do hipocampo dorsal (AP: -4,16 mm; ML: +2,4 mm; DV: 2,40 mm). Brocas dentais de diâmetro apropriado foram utilizadas para a realização da craniotomia de uma janela quadrada, e de seis pequenas perfurações para inserção de parafusos de sustentação e de dois parafusos de sustentação/aterramento. Os dois parafusos de sustentação/aterramento foram implantados na região occipital, e entraram em contato com o líquido cefalorraquidiano cerebelar, servindo como aterramento elétrico dos eletrodos de registro. Os parafusos de sustentação/aterramento foram soldados a fios de aço e conectados ao canal de referência da placa de circuito acoplada ao microdrive. Após craniotomia da janela, as meninges cerebrais foram cuidadosamente retiradas, expondo assim o córtex cerebral e permitindo a penetração dos tetrodos. Durante a cirurgia de implante, os tetrodos foram inseridos apenas superficialmente no tecido cerebral, aproximadamente 1 mm (equivalente a 3 voltas no parafuso-guia). O posicionamento final dos tetrodos na camada piramidal de CA1 foi realizado conjuntamente à visualização dos sinais captados, após a recuperação pós-cirúrgica dos animais. Acrílico dental polimerizável foi usado para confeccionar um capacete sobre o crânio, dando sustentação e estabilizando a posição final do microdrive. Após a cirurgia, os animais receberam antibiótico Fluotril (i.m.) na dose de 2,5 mg/kg. Os animais tiveram acesso livre diário a 200 ml de água contendo 20 gotas do analgésico paracetamol (200
