UNIVERSIDADE ANHANGUERA DE SÃO PAULO - UNIAN-SP
DIRETORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA
MESTRADO PROFISSIONAL EM FARMÁCIA
HEBERT ALMEIDA RICCI
Atividade Anti-Leishmania de Compostos Cumarinicos
Complexados com Metais
SÃO PAULO
2015
HEBERT ALMEIDA RICCI
Atividade Anti-Leishmania de Compostos Cumarinicos
Complexados com Metais
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado Profissional em Farmácia da Universidade Anhanguera de São Paulo como requisito para obtenção do título de Mestre.
Orientadora: Profª. Drª. Márcia Regina dos Santos.
SÃO PAULO
2015
R379a Ricci, Hebert Almeida
Atividade Anti Leishmania de compostos cumarínicos complexados com metais. / Hebert Almeida Ricci. – São Paulo, 2015.
96 f.:il; 30 cm
Dissertação (Programa de Mestrado Profissional em Farmácia) – Coordenadoria de Pós- graduação, Universidade Anhanguera de São Paulo, 2015.
Orientadora: Profª.Drª. Marcia Regina Machado dos Santos
1. Leishmaniose. 2. Cumarina. 3. Compostos metálicos. I. Título II. Universidade Anhanguera de São Paulo.
HEBERT ALMEIDA RICCI
Atividade Anti Leishmania de Compostos Cumarinicos
Complexados com Metais
DISSERTAÇÃO APRESENTADA À UNIVERSIDADE ANHANGUERA DE SÃO PAULO, COMO EXIGÊNCIA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO DO
MESTRADO PROFISSIONAL EM FARMÁCIA
Presidente e Orientador
Nome: Profa. Dra. Marcia Regina Machado dos Santos
Titulação: Doutora em Parasitologia (UNIFESP)
Instituição: Universidade Anhanguera de São Paulo, UNIAN-SP
Assinatura:
SÃO PAULO
Agradecimento Especial
Agradeço a Professora Marcia Regina Machado, por ter sido muito mais que
uma orientadora. Expresso minha gratidão pela orientação, amizade,
companheirismo e, com certeza nunca esquecerei que estes momentos foram apenas o início de uma grande jornada.
AGRADECIMENTOS
Aos Professores do curso de mestrado, pelos ensinamentos e dedicação, fundamentais a minha formação.
Ao Professor Dr Luis Carlos Marques, coordenador do curso de Mestrado Profissional em Farmácia, por tornar possível a realização deste trabalho.
A Professora Dra Regina Mara Silva Pereira, por fornecer os compostos para a
realização deste trabalho.
Ao Professor Dr Rogério Alexandre Nunes dos Santos que cedeu o Laboratório de Investigação da Universidade Federal de Mato Grosso para o meu aperfeiçoamento de práticas laboratoriais e à doutoranda Suellen Iara Rosa que me acompanhou durante os procedimentos.
Ao Professor Dr Paulo Cezar Cotrim que possibilitou a realização de uma parcela dos eXperimentos no Laboratório de Doenças tropicais na Universidade de São Paulo e à Edite Kanashiro e Mussya Rocha que me acompanham nos experimentos.
Aos amigos e companheiros do mestrado Profissional em Farmácia em especial à
mestranda Silvana Coelho de Arruda Barbosa, à Dra Norma Estefania Ikeda e ao
doutorando Ivair Donizete Gonçalves.
À secretaria do Curso de Pós-graduação, pela presteza e colaboração.
A todos que de uma forma direta ou indireta participaram na realização deste trabalho.
RESUMO
Com perspectiva de desenvolvimento de novos compostos para tratamento da leishmaniose, este estudo teve como objetivo avaliar a atividade da cumarina complexada com metais de transição. Com o intuito de obter compostos bioativos com maior eficiência e menores efeitos colaterais, para tratamento das diferentes espécies de protozoários indutores da leishmaniose. Na avaliação da viabilidade celular utilizando células J774, o composto fenólico 4H3NC-Ni na concentração de 7,5µg, foi o composto que apresentou o melhor resultado quando comparado com o grupo controle e os demais compostos. A média dos valores de IC50 encontrados neste estudo, referente aos compostos metálicos, apresentam-se em concentrações menores que as encontradas no Glucantime e na Anfotericina, medicações de referencia para tratamento das Leishmanioses. A IC50 da Anfotericina e do Glucantime foi determinada em 0,304µg e 0,804µg, respectivamente, enquanto que a IC50 dos compostos metálicos utilizados neste estudo foi determinada em 0,016947µg para o 4H3NC-Ni, 0,07056µg para o 4H3NC-Fe, 0,01929µg para o 4H3NC-Cu e 0,03848µg para o 4H3NC-Zn.Diante dos resultados do presente estudo concluimos que os compostos metálicos apresentam atividade sobre as forma promastigotas de Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (L.) amazonensis e
Leishmania (L.) chagasi. Os estudos in vitro em células J774 mostraram que a
citotoxicidade dos compostos metálicos foi menor que a observada para o Anfotericina B. Quanto ao Indide de Infecção (IF) o composto 4H3NC-Zn apresentou atividade para a Leishmania (L.) chagase na forma amastigota, já os compostos 4H3NC-Fe e 4H3NC-Ni além da Anfotericina B e cumarina apresentaram boa atividade para as leishmania (L.) amazonensis e (V) brasiliensis na forma amastigota.
ABSTRACT
Parasitic Anti activity of coumarin compounds complexed with metals
Under the perspective of developing new compounds forleishmaniasis treatment, this study aimed to evaluate the activity of the complexed coumarin with transition metals. In order to obtain bioactive compounds with higher efficiency and fewer side effects for the treatment of different species of protozoa inducers of leishmaniasis.In the assessment of cell viability using J774 cells, 4H3NC-Ni phenolic compound at a concentration of 7,5μg was the compound that showed the best results when compared with the control group and the other compounds. The average values of IC50 found in this study, referred to the metal compounds, present themselve in lower concentrations than those found in Glucantime and amphotericin, reference medication for the treatment of Leishmaniasis. The IC50 amphotericin and Glucantime was determined in 0,304μg and 0,804μg, respectively, while the IC50 of metallic compounds used in this study was determined to 0,016947μg for 4H3NC-Ni, 0,07056μg for 4H3NC-Fe, 0,01929μg for 4H3NC-Cu and 0,03848μg for 4H3NC-Zn. With the results of this study the conclusionis that the metal compounds have activity against the promastigote form of Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (L.)
amazonensis e Leishmania (L.) chagasi. The in vitro studies showed that the J774
cells cytotoxicity of metal compounds was lower than that observed for Amphotericin B.As for the infection index the 4H3NC-Zn compound showed activity for Leishmania (L.) chagase as amastigote, and the 4H3NC-Fe and 4H3NC-Ni compounds beyondAmphotericin B and coumarin showed good activity for leishmania (L.) amazonensis and (V) brasiliensis in the amastigote form.
LISTA DE FIGURAS
Figura 01 – Estrutura química da cumarina (A) e 4-hidroxi-3-nitrocumarina- (Sigma-Aldrich)
20
Figura 02 – Ciclo de vida de Leishmania spp 24
Figura 3 – Lesão ulcerada franca, única, arredondada, com bordas elevadas,
infiltradas e fundo granuloso
30
Figura 4 – Lesão cutânea com aspecto ectimóide, localizada no punho. 30
Figura 5 – Ulcera com secreção purulenta abundante e necrose na região malar esquerda e lábio superior
31
Figura 6 – leishmaniose cutânea difusa 32
Figura 7 – Hepatoesplenomegania 33
Figura 8 – Ciclo Biossintético dos metabólitos secundários 34
Figura 9 – Cumarinas comumente encontradas na natureza 35
Figura 10 – Cumarinas em suas diferentes estruturas 35
Figura 11 – Cumarina e compostos similares 36
Figura 12 – Curva de Crescimento da L. (L.) amazonensis avaliada por
redução do MTT
47
Figura 13 – curva de inibição da L.(L.) amazonensisna forma promastigota frente ao Glucantime em tratamento de 24 h
48
Figura 14 – Curva de inibição da L. (L.) amazonensis frente a Anfotericina B em tratamento de 24 horas
50
Figura 15 – Citotoxicidade em L. (L.) amazonensis avaliada em diferentes
concentrações da substância 4H3NC-Ni
51
Figura 16 – Citotoxicidade em L.(L.) amazonensis do composto 4H3NC-Ni, com determinação da IC50%
51
Figura 17 – Citotoxicidade em L.(L.) amazonensis avaliada em diferentes
concentrações da substância 4H3NC-Fe
52
Figura 18 – Citotoxicidade da L.(L.) amazonensis em MTT frente ao composto composto 4H3NC-Fe, com determinação da IC50%
53
Figura 19 - Citotoxicidade da L. (L.) amazonensis avaliada em diferentes concentrações da substância 4H3NC-Cu
54
Figura 20 – Citotoxicidade da L.(L.) amazonensis em MTT frente ao composto composto 4H3NC-Cu, com determinação da IC50%
55
Figura 21 – Citotoxicidade da L. (L.) amazonensis avaliada em diferentes
concentrações da substância 4H3NC-Zn
56
Figura 22 – Citotoxicidade da L.(L.) amazonensis em MTT frente ao composto composto 4H3NC-Zn, com determinação da IC50%
Figura 23 – Atividade antiparasitária do composto metálico 4H3NC-NI em L. (L.)
chagasi, comparado aos antiparasitários de referencia e ao controle (sem
tratamento)
59
Figura 24 – Atividade antiparasitária do composto metálico 4H3NC-Fe em L.(L.)
chagasi, comparado aos antiparasitários de referencia e ao controle (sem
tratamento)
60
Figura 25 – Atividade antiparasitária do composto metálico 4H3NC-Cu sobre a
L.(L.) chagasi, comparado aos antiparasitários de referencia e ao controle (sem
tratamento)
61
Figura 26 – Atividade antiparasitária do composto metálico 4H3NC-Zn sobre a
L.(L.) chagasi, comparado aos antiparasitários de referencia e ao controle (sem
tratamento)
62
Figura 27 – Atividade antiparasitária do composto metálico 4H3NC-Ni sobre a L.
(V.) brasiliensis, comparado aos antiparasitários de referencia e ao controle
(sem tratamento)
64
Figura 28 – Atividade antiparasitária do composto metálico 4H3NC-Fe sobre a
L.(V.) brasiliensis, comparado aos antiparasitários de referencia e ao controle
(sem tratamento)
65
Figura 29 – Atividade antiparasitária do composto metálico 4H3NC-Cu sobre a
L.(V) brasiliensis, comparado aos antiparasitários de referencia e ao controle
(sem tratamento)
66
Figura 30 – Atividade antiparasitária do composto metálico 4H3NC-Zn sobre a
L.(V.)brasiliensis, comparado aos antiparasitários de referencia e ao controle
(sem tratamento)
67
Figura 31 – Avaliação da viabilidade das células j774 com relação às diferentes concentrações estudadas do composto 4H3NC-Ni
69
Figura 32 – Avaliação da viabilidade das células j774 com relação às diferentes concentrações estudadas do composto 4H3NC-Zn
70
Figura 33 – Avaliação da viabilidade das células j774 com relação às diferentes concentrações estudadas do composto 4H3NC-Cu
71
Figura 34 – Avaliação da viabilidade das células j774 com relação às diferentes concentrações estudadas do composto 4H3NC-Fe
71
Figura 35 – Índice en infecção da L. (L) amazonensis, forma amastigota em célula j774 tratados com os diferentes compostos em relaçao ao grupo controle
74
Figura 36 – Índice en infecção da L. (L) chagasi, forma amastigota em célula j774 com relação às diferentes compostos em relaçao ao grupo controle
75
Figura 37 – Índice en infecção da L. (V.) brasiliensis , forma amastigota em célula j774 com relação às diferentes compostos em relaçao ao grupo controle
77
Figura 38 – Comparação do Indice de Infecção nas tres especies de
Leishmania tratadas com os compostos complexados
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 – Concentração IC50 da L. (L.) amazonensis na forma
promastigota tratados com os compostos metalicos, Anfotericina B e Glucantime
56
Tabela 02 – Concentração do IC 50 de L. (L.) chagasi na norma
promastigota tratados com os compostos metálicos.
63
Tabela 03 – Concentração IC50 dos compostos metalicos em L. (V.)
brasiliensis na forma promastigota
68
Tabela 04 – Valores de IC50 em células J774 e IS das espécies L (L.) 72
amazonensis, L. (L.) chagasi, L. (V.) brasiliensis na forma promastigota
para
com os compostos 4H3NC-Ni, 4H3NC-Fe, 4H3NC-Cu e 4H3NC-Zn
Tabela 05 – Células j774 infectadas com Leishmania (L.) amazonensis,
formas amastigotas e índice de infecção (IF) calculado
73
Tabela 06 – Estudos in vitro de células j774 infectadas com Leishmania (L.)
chagasi, formas amastigotas, tratadas com os compostos metalicos,
glucantime e Anfotericina B. Os dados são comparados ao controle sem tratamento
75
Tabela 07 – Estudos in vitro de células j774 infectadas com Leishmania (V.)
brasiliensis, formas amastigotas
LISTA DE QUADROS
Quadro 01 - Espécies de Leishmania isoladas de pacientes e formas clínicas associadas
LISTA DE ABREVIATURAS gr gramas mg miligramas ng nanograma ml mililitro µl microlitro mm milimetro nm nanometro
ANOVA programa estatistico deanalise de variância Cu cobre Zn zinco Fe ferro Ni níquel Gp63 glicoproteina 63 GLP lipofosfoglicano IL interleucina CD células dendríticas
MHC complexo de moleculas de histocompatibilidade NK natural killer
IC50 concentração inibitória de 50% dos organismos em estudo NO2- nitrito
MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina) j774A.1 macrofagos (linhagem celular)
SBF soro fetal bovino CO2 gas carbonico Rpm rotação por minuto DMSO Dimetilsulfóxido
RPMI-1640 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) meios culturas células EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético
U unidade PBS Tampão fosfato-salina HE hematoxilina e eosina NO oxido nítrico M molar X média SD desvio padrão h hora Gluc glucantime Anf anfotericina Cont controle
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 17 2 REVISÃO DE LITERATURA 21 2.1 Leishmaniose 2.1.1 Ciclo biológico 2.1.2 O vetor 2.1.3 Gênero Lutzomya 2.1.4 Reservatório 2.1.5 Imunologia 2.1.6 Histopatologia 2.1.7 Aspectos clinicos 2.1.8 Leishmaniose cutânea 2.1.9 Leishmaniose mucocutânea 2.1.10 Leishmaniose cutânea difusa 2.1.11 Leishmaniose visceral
2.2 Produtos Naturais 2.3 Cumarina
2.3.1 Classificação quimica das cumarinas 2.9.2 Propriedades, extração e caracterização
21 22 24 24 24 25 27 28 28 30 31 32 33 37 37 37 3 JUSTIFICATIVA 39 4 OBJETIVO GERAL 40 4.1 Objetivos específicos 40 5 MATERIAL E MÉTODOS 41 5.1 Reagentes e drogas 5.2 Células 5.3 Parasitos
5.4 Obtenção da Cumarina e composto metálico isolados e modificados 41 41 41 42 5.5 MÉTODOS 42
5.5.1 Curva de Crescimento doa Parasitas avaliada por MTT 5.5.2 Avaliação da da citotoxicidadeL. (V.) Braziliensis, L. (L.)
Chagasise L. (L.) amazonesis
5.5.3 Determinação que inibe 50% do crescimento do parasita 5.5.4 Determinação da citotoxicidade(IC50%) dos compostos metálicos em células j774
5.5.5 Infecção de macrófagos com formas promastigotas 5.5.6 Indice de Seletividade 5.6 Análises estatísticas 42 42 43 44 45 45 46 6 RESULTADOS E DISCUSSÃO 47
6.1 Otimização da reação de MTT para Leishmania sp 47
6.2 Atividade dos compostos cumarínicos metálicos frente a L. (L.)
amazonensis
6.2.1 Curva de inibição da L. (L.) amazonensis frente ao Glucantime em tratamento de 24 h
48
6.2.2 Curva de inibição da L. (L.) amazonensis frente a Anfotericina B em tratamento de 24 horas
49
6.2.3 Citotoxicidade da L. (L.) amazonensis em forma promastigota avaliada em diferentes concentrações do composto 4H3NC-Ni
50
6.2.4 Citotoxicidade da L. (L.) amazonensis avaliada em diferentes 52
concentrações do composto 4H3NC-Fe
6.2.5 Citotoxicidade da L. (L.) amazonensis em forma promastigota avaliada em diferentes concentrações da substância 4H3NC-Cu
54
6.2.6 Citotoxicidade da L. (L.) amazonensis avaliada em diferentes concentrações da substância 4H3NC-Zn
56
6.2.7 Quadro resumido dos valores de IC 50 em L. (L.) amazonensis frente aos diferentes compostos
58
6.3 Atividade dos compostos em Leishmania (L.) (L.) chagasi 58
6.3.1 Atividade antiparasitária do composto metálico 4H3NC-NI sobre a L. (L.) chagasi
58
6.3.2 Atividade antiparasitária do composto metálico 4H3NC-Fe sobre a L. (L.) chagasi
59
6.3.3 Atividade antiparasitária do composto metálico 4H3NC-Cu sobre a L. (L.) chagasi
60
6.3.4 Atividade antiparasitária do composto metálico 4H3NC-Zn sobre a L. (L.) chagasi
61
6.3.5 IC 50 dos compostos metalicos contraLeishmania (L) chagasi 62
6.4 Atividade de compostos contra Leishmania (V.) brasiliensis 63
6.4.1 Atividade antiparasitária do composto metálico 4H3NC-Ni sobre a L. (V.) brasiliense
63
6.4.2 Atividade antiparasitária do composto metálico 4H3NC-Fe sobre a L. (V.) brasiliense
64
6.4.3 Atividade antiparasitária do composto metálico 4H3NC-Cu sobre a L. (V.) brasiliense
65
6.4.4 Atividade antiparasitária do composto metálico 4H3NC-Zn sobre a L. (V.) brasiliensis
66
6.4.5 IC50 dos compostos metalicos contra Leishmania (V. )
brasiliensis
68
6.5 Atividade dos compostos em Macrofagos j774 68
6.5.1 Viabilidade das células j774 com relação às diferentes concentrações estudadas do composto 4H3NC-Ni em 0,2 mL de cultura
69
6.5.2 Viabilidade das células j774 com relação às diferentes concentrações estudadas do composto 4H3NC-Zn em 0,2mL de cultura
70
6.5.3. Viabilidade das células j774 com relação às diferentes 71
concentrações estudadas do composto 4H3NC-Cu em 0,2 mL de cultura
6.5.4 Viabilidade das células j774 com relação às diferentes concentrações estudadas do composto 4H3NC-Fe em 0,2 mL de cultura
6.5.5 IC50% dos compostos metalicos contra L (L.) amazonensis, L.
(L.) chagasi, L. (V.) brasiliensis, forma promastigota e IC 50% em
células j774. Calculo do Indice de Seguranca (IS)
72
6.6 Estudos in vitro de células j774 infectadas com amastigotas de
leishmania sp
73
6.6.1 Avaliação da atividade antiparasitária dos compostos em
células j774 infectadas com Leishmania (L.) amazonensis forma amastigota
73
6.6.2 Avaliação da atividade antiparasitária dos compostos em células j774 infectadas com Leishmania (L.) chagasi, formas amastigotas
74
6.6.3 Avaliação da atividade antiparasitária dos compostos em células j774 infectadas com Leishmania (V.) brasiliensis, formas amastigotas
76
7. CONCLUSÃO 80
8. REFERÊNCIAS 83
18 1 INTRODUÇÃO
Uma das principais causas da morte de pessoas que vivem em comunidades pobres nos países em desenvolvimento são as doenças tropicais como a dengue, doença de chagas, leishmaniose, malária, esquistossomose, filariose linfática entre outras (FERREIRA et al, 2012).
No período de 1975 a 2004, somente 21 dos 1556 novos farmacos registrados foram desenvolvidos para o tratamento de doenças tropicais juntamente com a tuberculose, mesmo sendo as doenças tropicais responsáveis por 11,4% da causa mundial de quadros clínicos desabilitantes (CHIRAC e TORREELE, 2006).
Pela falta de investimentos por parte da indústria farmacêutica e pela carência de políticas públicas para à sua prevenção, estas enfermidades são conhecidas como doenças negligenciadas (FERREIRAl, 2012).
Foi realizado em 2007 por uma equipe da Organização Mundial da Saúde (OMS), uma análise focalizando o problema das doenças negligenciadas como causa e consequência da violação aos direitos humanos básicos como falhas no suprimento e na possibilidade de acesso à água tratada, rede e tratamento de esgoto, moradias adequadas e educação, aumentam a vulnerabilidade destas populações às mais variadas infecções (WHO, 2010).
Essas populações se encontram insentas da possibilidade de terem acesso do desenvolvimento científico e tecnológico obtido pela comunidade mundial, as pessoas acometidas por doenças negligenciadas têm seus direitos transgredidos em diversos parâmetros como no acesso a tratamentos eficientes e adequados, na dificuldade em encontrar trabalho e na discriminação que padecem em muitos lugares por serem portadores de uma doença debilitante e, muitas vezes, desfigurante (WHO, 2010).
Neste trabalho, do conjunto das doenças negligenciadas, será dado enfoque a uma parasitose causada por um protozoário da família dos tripanossomatídeos, a leishmaniose. Vários estudos foram realizados visando o desenvolvimento de fármacos, a partir de produtos naturais, para o tratamento dessas doenças (ANTHONY, 2005).
19
A leishmaniose é transmitida por insetos hematófagos conhecidos como flebótomos ou flebotomíneos, popularmente conhecidos como mosquito palha ou birigui. Esta doença é causada por mais de 20 espécies de protozoários flagelados do gênero Leishmania, pertencentes à família Trypanosomatidae, podendo se apresentar em três manifestações clínicas diferentes: leishmaniose cutânea ou tegumentar, leishmaniose mucocutânea e a leishmaniose visceral (WHO, 2010).
No Brasil, de acordo com estudo de Pelissari e colaboradores (2011), a média de casos de Leishmaniose visceral e Leishmaniose Cutânea no período de 2005 a 2009 foi de 3.679 e 24.684 caso/ano, respectivamente. No ano de 2009 foram registrados no estado do Mato Grosso 3.900 casos de leishmaniose tegumentar, sendo este, o maior número de casos registrados no país, tendo uma coeficiência de detecção de 129,0 casos por 100.000 habitantes, distribuídos em 95% dos municípios do estado. Quanto à Leishmaniose visceral, no estado de Mato Grosso no ano de 2009, foram confirmados 67 casos, distribuídos em 12 municípios, sendo o municípios de Rondonópolis com 79,1% dos casos. A Leishmaniose promoveu letalidade de 7,5%, enquanto 77,6% apresentaram cura clínica. A incidência foi de 2,2 casos por 100.000 habitantes. Sendo confirmados laboratorialmente 85,1% dos casos (BRASIL, 2011).
De acordo com o estudo de Kaye e Blackwell (2008), são diversos fatores que levaram ao crescimento significativo das leishmanioses na última década, dentre estes, degradação ambiental, urbanização não planejada e como recidiva de infecção assintomática em pacientes acometidos pela síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS). Contudo também nestes últimos anos foi observado um melhor entendimento da biologia da Leishmania incluindo o seqüenciamento do genoma de muitas espécies.
O medicamento utilizado como primeira escolha para o tratamento da leishmaniose no Brasil é um composto sintético, obtido a partir do ácido antimônico e da N-metil-glucamina, denominado antimoniato de metilglucamina, este é eficaz no tratamento de leishmaniose cutânea, mucocutânea e visceral (SERENO, 1997; BALANA-FOUCE, 1997). Outras drogas têm sido utilizadas no tratamento das leishmanioses, além dos antimoniais, entre as quais se destacam a pentamidina, anfotericina B, paromomicina e a miltefosine (RATH, 2003). Compostos bioativos de
20
plantas, pertencentes a várias classes de metabólitos especiais tais como alcalóides, terpenóides e flavonóides têm revelado resultados promissores em estudos imunofarmacológicos, quando associados com alvos terapêuticos bem definidos (SHUKLA, 2010).
Nas ultimas décadas houve um aumento significativo quanto à utilização de produtos naturais para a prevenção e combate de doenças, em virtude das suas propriedades farmacológicas e antimicrobianas (HOLETZ, 2002; SHALE, 2005; YATSUDA, 2005).
A medicina popular utiliza muitas plantas que são alvo de um amplo estudo e seu uso empírico precisa ser estudado mais cientificamente, para validar o conhecimento popular de suas aplicações para uso terapêutico, determinando se sua aplicabilidade não advém somente de um conhecimento popular (HOLETZ, 2002).
As cumarinas são amplamente difundidas no reino vegetal, estas pertencem a uma classe de metabólitos secundários provenientes do ácido cinâmico, podendo também ser encontradas em fungos e bactérias (MIRANDA, 2001).
A cumarina foi utilizada como aditivo alimentício por muitos anos até 1940, a partir desta data os Estados Unidos proibido seu uso como aditivo alimentício, devido à hepatotoxicidade e evidências carcinogênicas de algumas cumarinas (RUPPELT, 1991; PEREIRA, 1994).
Existem estudos que atribuem um grande número de atividades biológicas à
cumarina, tais como a ação antiinflamatória, antimicrobiana, antiviral,
antiespasmódica, antitumoral e antioxidante (LEE, 1994; BECKER, et al, 1993).
Pereira e colaboradores (1994) estudaram a atividade antiofídica da cumarina extraída da Mikania glomerata Sprengel frente ao veneno da jararaca (Bothrops
jararaca), obtendo resultados positivos.
O composto 4-hidroxi-3-nitrocumarina (4H3NC) é derivado da cumarina e este têm sido empregados no tratamento de doenças como o câncer. O composto 4H3NC foi utilizada como tratamento para evitar a recorrência melanoma maligno. Em estudos realizados por Rehman et al. (2013) demonstraram a atividade antimicrobiana e citotóxica de compostos derivados da nitrocumarina.
21 Figura 01: Estrutura química da cumarina (A) e 4-hidroxi-3-nitrocumarina-(Sigma-Aldrich) (B).
Fonte: (VENUGOPALA; RASHMI; ODHAV, 2013).
Estão sendo apontados como uma alternativa de grande importância de aquisição de novos compostos antiparasitários e antifúngicos, os complexos metálicos à base de cumarina. A síntese e caracterização de uma gama de compostos cumarínicos contendo grupos nitro ligados aos íons Cu(II), Zn(II), Fe(II) e Ni(II), buscam colaborar para o desenvolvimento de novos compostos com propiedades antiparasitárias (ALCÂNTARA, 2011).
Neste estudo pretende-se estudar o potencial de compostos cumarínicos contendo metais de transição da primeira série sendo estes Cu(II), Zn(II), Fe(II) e Ni(II), como antiparasitário, na tentativa de obter compostos bioativos para tratamento da leishmaniose.
22 2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Leishmaniose
O agente etiológico da leishmaniose é um protozoário dimórfico do gênero Leishmania, que pertence ao Reino Protista, sub-reino Protozoa, Ordem Kinetoplastida e família Trypanosomatidae (REY, 2008).
Morfologicamente pode-se identificar diferentes espécies de Leishmania. Para obter a classificação das espécies do gênero Leishmania, certas características devem ser consideradas: a) biológicos: morfologia, desenvolvimento nos vetores flebotomíneos, crescimento em meios de cultura, desenvolvimento nos hospedeiros vertebrados; (b) bioquímica: eletroforese de matrizes, o núcleo e a análise de DNA do cinetoplasto; c) imunológica: reatividade do parasita com anticorpos monoclonais e serotipagem do fator de excreção e taxonomia numérica para melhor definir a evolução molecular e a relação filogenética dos parasitas do gênero Leishmania (BONFANTE; BARRUELA, 2002).
Quadro 01 - Espécies de Leishmania isoladas de pacientes e formas clínicas
associadas
Espécie Forma clínica
L.(L.) amazonensis leishmaniose cutânea, leishmaniose cutânea difusa anérgica,
leishmaniose muco-cutânea, leishmaniose visceral (raramente)
L.(L.) chagasi leishmaniose visceral, leishmaniose cutânea (raramente)
L.(L.) sp. leishmaniose cutânea
L.(V.) braziliensis leishmaniose cutânea, leishmaniose muco-cutânea
L.(V.) guyanensis
leishmaniose cutânea, leishmaniose muco-cutânea
L.(V.) lainsoni leishmaniose cutânea
L.(V.) naiffi leishmaniose cutânea
L.(V.) shawi leishmaniose cutânea
Fonte: https://www.ufpe.br/biolmol/Leishmanioses-Apostila_on_line/origem_classificacao.htm. Em negrito estão destacadas as espécies utilizadas neste trabalho.
23 2.1.1 Ciclo biológico
As Leishmanias têm um ciclo de vida semelhante, sendo de grande importância conhecer cada uma das etapas a fim de compreender certas medidas de controle. A Leishmania completa seu ciclo de vida usando dois hospedeiros, porém, podem ocorrer diferentes ciclos, um principalmente silvestre, em que a Leishmania circula entre reservatórios naturais em que mantém o ciclo com a participação dos vetores silvestres da zona endêmica. Em um segundo ciclo, vetores infectados podem atacar o homem e animais domésticos ou peridomiciliar. Podendo produzir um terceiro ciclo, no qual o próprio paciente com leishmaniose constitui-se como reservatório (BRASIL, 2007).
O ciclo começa quando o vetor se alimeta de sangue de um vertebrado infectado, na alimentação, o vetor faz ingestão de macrófagos infectados com amastigotas presentes no vertebrado infectado. As amastigotas se diferenciam em promastigotas em um período de 24 a 48 horas. As promastigotas se multiplicam ativamente por divisão binária, no intestino do inseto. Após a replicação no intestino, as promastigotas migram para o esôfago e a faringe. No intestino da fêmea do vetor, as promastigotas são de estruturas fusiformes ou piriformes, seu corpo é flexível e se movendo pela ação de um flagelo livre, localizado na parte posterior e é quase do mesmo tamanho que o corpo do protozoário; o núcleo situa-se no centro da célula e o cinetoplasto se situa entre o núcleo e a extremidade anterior somática (DE GOPUGUI, 2003).
Quando o vetor infectado se alimeta de sangue nos vertebrados, inoculam entre 10 a 100 promastigotas que penetram na derme (DE GOPUGUI, 2003; PEARSON; DE QUEIROZ, 1997). Embora muitos promastigotas são destruídos pelos leucócitos polimorfonucleares, alguns vão se transformar em amastigotas nas células do sistema reticuloendotelial, em um período de 3 a 4 horas em média, eles permanecem nesta fase estacionária por cerca de 36 horas e então começam a reproduzir (HALL; TITUS, 1995).
A adesão entre os parasitas e os macrófagos é uma etapa fundamental para a invasão das células hospedeiras. Sobre a superfície da Leishmania foram identificados numerosos receptores, entre a mais importantes estão as glicoproteína
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63 (gp63) e o lipofosfoglicano (GLP), que são utilizados pelos parasitas para aderir aos macrófagos (TREMBLAY; OLIVER; BERNIER, 1996). As Espécies de Leishmanias desenvolveram vários mecanismos para resistir à atividade antimicrobiana e digestiva das células fagocitárias. As amastigotas são mais resistentes do que as promastigotas, quanto aos mecanismos antimicrobianos induzidos por citozinas dependentes de oxigênio, em que reflete numa adaptação ao crescimento intracelular (HALL, 1991).
As Amastigotas se multiplicam por divisão binária no interior dos vacúolos dos macrófagos parasitados, a multiplicação começa com a divisão do cinetoplasto, em seguida ocorre a divisão do núcleo por mitose. A quantidade de amastigotas pode chegar até 200, acontecendo em seguida a ruptura do macrófago parasitado. As amastigotas livres entram em novas células do sistema mononuclear fagocitário onde se multiplicam novamente (PEARSON; DE QUEIROZ, 1997; BONFANTE; BARRUELA, 2002).
Figura 2: Ciclo de vida de Leishmania spp. Fonte: CDC. 2.1.2 O vetor
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A Leishmaniose é transmitida pela picada do mosquito flebotomíneo, este mosquito é abundante durante a estação do verão nos trópicos, em áreas quentes e umidas. São conhecidos cinco gêneros de flebotomíneos sendo estes:
Phlebotominios, Sergentomya, Lutzomyia, Warileya e Brumptomya. São
reconhecidos dois vetores de Leishmania destes gêneros: na Europa, Ásia e África o gênero Phlebotomus, na América, o gênero Lutzomyia (REY, 2008).
2.1.3 Gênero Lutzomya
O mosquito do gênero Lutzomyia é conhecido popularmente com o nome de “mosquito palha” ou “birigui”, podem habitar áreas de deserto, florestas e nas áreas peridomiciliares. No entanto, este mosquito prefere lugares escuros e úmidos com abundante vegetação. As fêmeas do mosquito são hematófagas, sendo muito mais ativos ao entardecer. O lutzomyia é um mosquito pequeno com 1,5 a 3 mm de tamanho, seu corpo é coberto de pelos e tem asas eretas sob a forma de 'V'. A área de seu voo é de aproximadamente até 200 metros de onde ele é gerado; no entanto, ele pode ser transportado pelo vento a distâncias maiores. Eles são, em geral, mais encontrados ao entardecer entre 18 e 20 horas e gradualmente desaparece na noite (LAINSON, 1994).
2.1.4 Reservatório
Há uma grande variedade de animais selvagens e animais domésticos que podem ser reservatórios das espécies Leishmania na América. A relação ecológica é bastante estreita entre os vetores do parasita e seu reservatório animal (REY, 2008). No Brasil foi encontrado como reservatórios da L. (L) amazonensis os marsupiais e roedores Proechymis e Oryzomys; e da L. (V) guyanensis, o bicho preguiça (Choloepusdidactylus), tamanduá (Tamandua tetradactila), marsupiais e roedores; o da L. (V) brasiliensis, animais de estimação como cães, cavalos, mulas e roedores domésticos (BRASIL, 2007).
26 2.1.5 Imunologia
Na leishmaniose a imunidade depende da forma clínica e da resposta imune do hospedeiro. Ha alguns aspectos de fenótipos descritos que estão correlacionados com a intensidade da resposta imune. A imunidade tem uma influência chave na manifestação da doença (DIAZ; ZERPA; PONCE, 2002).
O parasita tem uma série de estratégias complexas para atacar, infectar e sobreviver dentro dos macrófagos. O hospedeiro falha no controle da doença devido à capacidade que têm algumas espécies em resistir a ação fagocitária dos macrófagos ativados e a diminuição da resposta imunoprotetora do hospedeiro (BONFANTE; BARRUELA, 2002). Existem fenótipos sensíveis e resistentes no ser humano. As lesões podem se curar espontaneamente em virtude da resposta positiva de células T antígeno específico, é comum nas formas viserais e cutaneas difusas, com uma resposta fraca ou ausente e na forma mucocutânea, com uma hiper resposta das células T (FARAH, 1999).
Os promastigotas quando são inoculados, para escapar da resposta imune inespecífica do hospedeiro, penetram nos macrófagos. Estas permanecem no espaço intracelular onde se multiplicam e invadem outros macrófagos.
Para que haja a adesão entre o parasita e os macrófagos nas células do hospedeiro, o protozoário apresenta em sua superficie uma proteína de soro Complemento C3, que reconhece certos receptores da membrana dos macrofagos. Foram identificados outros antigenos na superfície da Leishmania, como glicoproteína 63 (gp63) e o lipofosfoglicano (GLP), que são usados pelo parasita para penetrar nos macrófagos (TREMBLAY; OLIVER; BERNIER, 1996). Uma vez dentro dos macrofagos, os promastigotas são envolvidos em um vacúolo que se junta aos lisossomos que contêm as enzimas proteolíticas que podem matar e digerir a Leishmania.
Os promastigotas se diferenciam em amastigotas, que são mais resistentes às agressões e se multiplicarão, as células infectadas morrem lançando mais amastigotas no meio extracelular que infectarão outras células. As leishmanias destruídas pelos macrofagos liberam antigenos que são apresentados em suas superfícies aos linfócitos T CD4. A atividade leishmanicida é devida ao aumento na
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capacidade dos macrófagos em produzir agentes oxidantes em resposta ao interferon gama (FARAH, 1999).
A análise do perfil de citocinas sugere que o sistema imune do hóspedeiro tem um papel de imunoregulamentação na presença da doença. Assim, na leishmaniose cutânea as principais citocinas produzidas são a II-2 e o interferon gama, no mucocutânea e cutânea difusa, o IL-4 e IL-10. Isso se correlaciona com os estudos em modelos murinos em que a produção de Il-2 e interferon gama (Th1) intervém na cura da doença, enquanto o IL-4, IL-5 e IL-10 (Th2) estão associados com a progressão e a propagação da doença. Assim, de duas subpopulações de linfócito T-helper que auxiliam no sistema imunológico murino são críticos na indução de resistência ou susceptibilidade para a infecção (FARAH, 1999; BOURREAU, 2001).
Estudos de modelos murinos mostraram que durante as infecções sistêmicas
progressivas ha uma expansão de linfócitos T CD4+ Tipo Th2, que secretam IL-4,
mas não interferon gama ou IL-2 em resposta a antígenos das leishmaniais. A IL-4 suprime o desenvolvimento da resposta Th1 e a ativação de macrófagos por interferon gama. Em pacientes com leishmaniose visceral, a IL-10, mais que a IL-4,
é responsável pela supressão da resposta Th1. Os linfócitos CD8+ leishmania
específicos têm sido envolvidos na estimulação da secreção de IL-10 pelas células mononucleares no sangue periférico. A natureza crônica da leishmaniose cutânea parece ser devido à resposta Th2 dominante no local da infecção da pele (PEARSON; DE QUEIROZ, 1996; MATTE; OLIVER, 2002).
O principal mecanismo de defesa que o hospedeiro possui contra a leishmania é a ativação de macrófagos pelo interferon gama, derivados de células
de linfócitos T CD+. A ausência de interferon gama é responsável pelo
desenvolvimento da leishmaniose visceral e leishmaniose cutânea difusa. Na leishmaniose cutânea americana, Linfócitos T produzem interferon gama em resposta a antígenos de Leishmania e ativam os macrófagos para destruir o protozoátio. É possível que o desenvolvimento da doença dependa da resposta transitória de desregulação de células T durante a fase inicial da infecção (PEARSON; DE QUEIROZ, 1996).
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Já foi demonstrada a importância das interações entre microrganismos e células dendríticas (CD) e o papel central destas células na iníciação e regulação da resposta imune aos antimicrobianos. As CD imaturas na pele captam e processam estas respostas para sua apresentação através de moléculas mais complexas de histocompatibilidade (MHC). Posteriormente, as células dendríticas migram para os nódulos linfáticos transportanto os antigenos processados pelos linfócitos T, diferenciando-se em CD maduras, com uma capacidade para estimular linfócitos T em repouso, o que leva à produção de citocinas como IL-1, IL-6 ou IL-12, que modulam o desenvolvimento do tipo de resposta dos linfócitos T. Na leishmaniose, os protozoários são fagocitados por neutrófilos, macrófagos, fibroblastos e CD. Apenas as CD migram através da linfa transportando o antígeno desde a pele infectada para as áreas de linfócitos T e são capazes de fornecer o principal sinal para o início da resposta primária dos linfócitos T leishmania específico. Além disso, as células dendríticas retêm os antigenos do parasita de forma imunogênica por longos períodos, devido ao aumento da estabilidade dos complexos peptídeo do MHC da classe II e, portanto, permitem sustentar linfócitos T leishmania específicos, que mantem a imunidade frente às leischmanias. Estes achados sugerem que a interação entre com as CD de Leishmania é focada como iniciadores e reguladores da resposta imune específica. Constatou-se que IL-12 na fase inicial da infecção é fundamental para a determinação da imunidade inata, a atividade dos linfócitos natural Killer (NK) para a produção de interferon gama e a resposta adaptativa do hospedeiro através de indução seletiva de diferenciação das Th1. Este achado é a chave das CD como reguladoras da imunidade e para a elaboração de estratégias para a obtenção de vacinas (MOLL; BERBERICH, 2001).
2.1.6 Histopatologia
O padrão histológico, tanto na forma cutânea como na mucocutânea, apresenta-se como uma reação inflamatória granulomatosa crônica, e a aparência microscópica varia de acordo com o tempo das lesões do hospedeiro. As Lesões iniciais mostram um infiltrado granulomatoso cutâneo intenso de linfócitos, macrófagos parasitados, células epiteliais, plasmocitos e às vezes eosinófilos. Na
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derme superior, o número de neutrófilos é variável. A epiderme apresenta hiperceratose, e também pode apresentar atrofia, ulceração e abscessos intra-epidérmico. A hiperplasia pseudocarcinomatosa aparece em lesões de longo tempo (WEEDON; STRUTTON, 2002).
2.1.7 Aspectos clínicos
As manifestações clinicas são variadas e estão relacionadas com o tipo de cepa de leishmania infectante e a resposta himune do hospereido. São descritas quatro formas clinicas: Leishmaniose cutânea; Leishmaniose mucocutânea; leishmaniose visceral e Leishmaniose cutânea difusa.
2.1.8 Leishmaniose cutânea
O aparecimento de lesões de pele às vezes é encontrado associado com a picada do inseto vetor. Após a inoculação do protozoario o período de incubação pode variar de 2 semanas a 2 meses, ou mais. Posteriormente surge uma pequena lesão inicial muitas vezes visível, as lesões costumam aparecer em partes expostas, principalmente na face e nos membro inferiores. A aparência típica da lesão inicial é uma ligeira vermelhidão circunscrita, muitas vezes seguida de coceira, após alguns dias uma ligeira infiltração papulosa com cerca de 3 mm de diâmetro e muitas vezes com uma ou duas vesículas pequenas, podendo dar origem a uma minúscula escoriação, dando início a um processo ulcerativo. Algumas vezes a lesão regride expontaneamente iniciando a fase de um longo período assintomático (BRASIL, 2007; REY, 2008).
Tem se observado como um sinal precose de caso de leishmaniose cutânea o surgimento de gânglios linfáticos infartados na região correspondente. Há casos que os sinais linfáticos podem aparecer anteriormente, ao mesmo tempo ou depois da ulceração e, em casos muito raros, pode ser o único sinal de infecção de leishmaniose (LAINSON, 1994; REY, 2008).
Depois de alguns dias, a lesão inicial ulcera-se espontaneamente e é recoberta por um exsudato de cor amarelada e aderente que posteiormente dará
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lugar a uma crosta. Sob a crosta, a lesão se estende em superfície e profundidade. Podem aparecer lesões satélites que irão se juntar à lesão inicial, formando uma grande úlcera. A úlcera característica da leishmaniose é arredondada, indolor, com bordas elevadas e endurecidas que recorda a imagem de uma cratera. Quando se apresenta clara a crosta é uma formação granulomatosa limpa, com exsudato seroso não-purulento, possui tendência para sangrar. A ulcera não apresenta sinais flogisticos, tais como edema ou sinais de calor local. Se há uma infecção bacteriana sobreposta, a úlcera torna-se dolorosa, purulenta e exsudativa (LAINSON, 1994; BRASIL, 2007; REY, 2008)
Os linfonodos são acometidos ocorrendo linfadenite e linfangite regional. As lesões tendem a se estabilizar com a resposta imune do hospedeiro, a doença tende a evoluir para a cura espontânea em um período de seis meses a três anos. Apenas uma pequena percentagem tem recorrências ou complicações cutânea. (REY, 2008)
As espécies de leishmania e a resposta imune vão determinar a clínica e a cronicidade das lesões. Lesões causadas por L. mexicana tendem a ser pequenas e menos crônicas do que a L. Brasiliensis; na L. peruviana ocorre principalmente pápulas foliculares e nodulares; na leishmaniose cutânea causada pela L.
brasiliensis predomina a úlcera franca. Leishmaniose causada pela Leishmania L. guyanensis origina múltiplas úlceras, que se não tratadas podem estender-se para o
sistema linfático, em baixa porcentagem pode adquirir a forma mucocutânea. A L.
panamensis produz lesões ulcerativas não tendendo a cura espontânea. A
leishmaniose causada pela L. amazonensis raramente provoca enfermidades nos humanos e tende a produzir leishmaniose cutanea difusa resistente ao tratamento. A
L. lainsoni produz principalmente lesões na pele e são descritas várias formas
clínicas de leishmanioses com lesões não ulceradas, como papulosa, impetiginoide, verrucosa, nodular, vegetante e mistas (WHO, 2010).
31 Figura 3: Lesão ulcerada franca, única, arredondada, com bordas elevadas, infiltradas e fundo granuloso. Fonte: Ministério da saúde. Manual da Vigilância da Leishmaniose Tegumentar americana (2007).
Figura 4: Lesão cutânea com aspecto ectimóide, localizada no punho. Fonte: Ministério da saúde. Manual da Vigilância da Leishmaniose Tegumentar americana (2007).
2.1.9 Leishmaniose mucocutânea
As manifestações clínicas da forma mucocutânea se apresenta muitos meses ou anos depois de ter curado a forma cutânea, ocasionalmente aparecem quando ainda há manifestações cutâneas. Muitas vezes, o paciente já não está na área onde foi contraída a doença (LAINSON, 1994; REY, 2008).
As lesões mucosas são iniciadas principalmente no septo cartilaginoso e raramente na base do nariz. Porém, pode começar em outras partes das vias aéreas superiores. No início apresenta uma discreta produção de muco, semelhante com rinite ou um resfriado. Em seguida, ocorre a inflamação da mucosa nasal, que se
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torna eritematosa, edemaciada e dolorosa. Quando as lesões estão avançadas, apresenta exsudação e ulceração da mucosa. Então, a cartilagem é comprometida e ocorre a perfuração do septo. Se não tratada a doença progride e se aprofunda, o processo pode se estender para o lábio superior, palato, úvula e garganta, lesões na língua são raros (REY, 2008; BRASIL, 2007). Se não tratada, a doença pode levar à morte.
Figura 5: Ulcera com secreção purulenta abundante e necrose na região malar esquerda e lábio superior. Fonte: (Veloso et al, 2006).
2.1.10 Leishmaniose cutânea difusa
A Leishmaniose cutânea difusa ocorre quando há uma baixa resposta imune celular. A Doença inicia-se na forma de lesões localizadas de aspecto nodular, que se espalha gradualmente para todo o corpo. Os nódulos isolados ou agrupados, máculas, pápulas, úlceras e lesões verrucosas de limite impreciso, dando a aparência de hanseníase virchowiana. A doença invade órgãos internos (REY, 2008). Leishmaniose cutânea difusa pode ser causada por L. etiópica. Na América Central e do Sul é mais comumente causada pela L. mexicana amazonensis (WHO, 2010).
33 Figura 6: leishmaniose cutânea difusa. Fonte: (BERRUETA, 2014)
2.1.11 Leishmaniose visceral
A leishmaniose visceral é uma doença parasitária sistêmica que compromete a vida do hospedeiro, causada pelo complexo de L. donovania. A Doença é endêmica em muitos países tropicais e subtrópicais. O complexo Leishmania
donovani inclui o L. donovani no subcontinente indiano, Ásia e África, a L. infantum
no Mediterrâneo e L. chagasi na América do Sul. Nas cepas do Oriente Médio é encontrado a L. tropica (WHO, 2010; REY, 2008)
Na leishmaniose visceral, depois da picada do vector, há um período de incubação variando de 4 a 10 meses. Em alguns casos podem surgir lesões localizadas, já que a maioria do tempo passa despercebido, a doença possui um curso crônico. A progressão da leishmaniose visceral, geralmente ocorre entre 3 e 8 meses após a infecção, embora os primeiros casos foram relatados em duas semanas. Após a infecção, a maioria dos casos permanece assintomático ou associada a sintomas leves que, eventualmente, resolvem-se espontaneamente (WHO, 2010; REY, 2008)
As manifestações clínicas da leishmaniose visceral típica estão associados à febre, o que quase sempre é progressiva e alta, remetente ou intermitente, com duração de semanas. Há deterioração progressiva do hospedeiro, palidez e hepatoesplenomegalia. Na fase crônica, a esplenomegalia é muito forte e pode chegar à fossa ilíaca direita, com considerável saliencia do abdômen. Pode ser
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observado uma linfadenopatia generalizada, particularmente na região mesentérica epistaxe, sangramento gengival, edema e ascite. A leishmaniose visceral é freqüentemente fatal se não for realizado o tratamento. (WHO, 2010; REY, 2008; LAINSON, 1994).
Figura 7: Hepatoesplenomegania. Fonte: (BERRUETA, 2014).
2.2 Produtos naturais
Nos dias atuais existe uma urgência necessidade de drogas eficazes para substituir ou suplementar as de uso corrente em virtude os efeitos adiversos dos efeitos adversos e resistencia dos paratitas e pela falta de uma vacina contra leishmaniose leva a uma (ROCHA et al., 2005; ARAÚJO et al., 1998).
Não há duvidas de que o reino vegetal é uma importante fonte de novos agentes terapauticos. O extrato alcaloídico bruto das cascas do caule de Zanthoxylum chiloperone var. angustifolia (Engl.) Chodat & Hassler (Rutaceae) apresentou atividade in vitro contra várias cepas de Leishmania ssp. (Ferreira et al., 2002). Os isolados Triterpenóides do extrato metanólico das folhas de Pourouma guianensis (Moraceae) foram avaliados quanto a atividade inibitória contra as formas promastigota e amastigota intracelular de Leishmania amazonensis, dos compostos isolados apenas ácido ursólico e ácido oleanólico mostraram elevada atividade contra amastigota intracelular (TORRES-SANTOS, et al., 2004).
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Estudos realisados em dezoito análogos de uma chalcona natural ativa foram sintetizados a partir de xantoxilina e derivados e foram testados para atividade seletiva in vitro contra promastigotas e amastigotas intracelulares de L. amazonensis (Boeck et al., 2006). As chalcones atuaram inibindo a respiração celular dos parasitos, por alterar a estrutura das mitocôndrias dos mesmos, apresentando assim um alto poder de ação na forma promastigota, inativando sua capacidade de infecção (PINERO et al., 2006).
Em estudos realizados por Kaur et al. (2006) e Romero et al. (2007) em que estudaram os representantes das 8-aminoquinolonas, o sitamaquine se destacou e já se encontra na fase de ensaios clínicos para tratamento de leishimaniose visceral provocada por L. donovani (Romero et al., 2007). Em outro estudo com moléculas da classe das 8-aminoquinolonas, observou-se uma boa atividade da primaquina contra formas promastigotas de L. donovani.
Em estudos realizados por Plock et al. (2001) em que foi feito uma triagem preliminar de extratos de 50 diferentes plantas para avaliar suas possíveis atividades anti leishmania contra as formas promastigotas de L. mexicana amazonensis. Oito extratos apresentaram um mínimo de inibição de 50% a 100 μg/mL. E o extrato etanólico de Yucca fi lamentosa L. mostrou a atividade leishmanicida mais forte (100% de inibição a 5 μg/mL).
A espécie vegetal Chenopodium ambrosioides, encontrada no nordeste do Brasil foi utilizada como tratamento de úlceras leishmanióticas (França et al., 1996), grupos de pesquiza do Brasil e de Cuba comprovaram sua ação antileishmanial. Monzote et al. (2007) examinaram a atividade do óleo essencial do Chenopodium ambrosioides sobre a L. amazonensis e cutânea, o óleo essencial do Chenopodium apresentou uma boa atividade contra as formas amastigota e promastigota do parasito quando administrado via intraperitoneal e oral em relação à droga de referência, Anfoterecina B, foi avalioado o efeito de dez extratos de plantas medicinais em culturas de promastigotas de L. amazonensis. Os extratos hidroalcoólicos de Julocroton triqueter (Lam.) Didr. var. triqueter (Euphorbiaceae), Dichorisandra sp (Commelinaceae) e Tephrosia cinera (L) Pers. (Fabaceae) apresentaram maior eficácia em induzir a morte das promastigotas (BEZERRA et al., 2006; SOARES, 2002).
36 2.3 Cumarina
Cumarina (anidrido do ácido o-cumárico) obtidos naturalmente a partir de inúmeras plantas, como lavanda, morangos, canela entre outros, ou pode ser produzido sinteticamente a partir de um aminoácido, a fenilalanina. A cumarina possui um odor característico semelhante ao de baunilha. É usado para a preparação de aromas e fragrâncias. O núcleo de cumarina (benzo-2-pirono) é derivado do ácido cinâmico (esqueleto fenilacrílico) na biossíntese (EUROPEAN COMMISSION, 2006).
Inicialmente as cumarinas foram isoladas através de uma espécie de feijão, combinadas com glicose em 1820. A primeira síntese foi realizada em 1868, pelo químico inglês Sir William Henry Perkin (MIRANDA, 2001).
A síntese dos metabólitos secundários das plantas são produzidos através do metabolismo da glicose e dois intermediários centrais que são: ácido chiquímico e acetato.
A fenilalanina, triptofano e tirosina são três aminoácidos produzidos pela via do ácido chiquímico (chiquimato), que intermediam a biossíntese de numerosos produtos naturais aromáticos em plantas superiores (SHIMID; AMRHEIN, 1995) entre eles, os alcalóides, taninos, lignanas, ligninas e cumarinas.
37 Figura 8: Ciclo Biossintético dos metabólitos secundários. Fonte: (SANTOS, 1999).
São cumarinas de grande distribuição na natureza a umbeliferona (7-hidroxi
cumarina), esculetina (6,7-Diidrocumarina) e a escopoletina
(7-hidroxi-6-metoxicumarina) (EUROPEAN COMMISSION, 2006).
38 2.3.1 Classificação química das cumarinas
A cumarina per se é considerada quimicamente como a fusão dos anéis benzeno e 1,2-pirona (primeiro átomo numerado do ciclo é o oxigênio sem dupla ligação) é o esqueleto básico de todos os outros derivados (COSTA, 1994) e podem ser classificadas como: cumarinas simples, furanocumarinas, piranocumarinas, cumarinas com substituintes no anel pirona e cumarinas miscelâneas (MURRAY, 1989; BRUNETON, 1995; ROJAHN, 1956).
Figura 10: Cumarinas em suas diferentes estruturas. Fonte: (SOUZA, 2005).
2.3.2 Propriedades, extração e caracterização
Em estado livre a cumarina é solúvel em álcool e em outros solventes orgânicos como solventes clorados e éter, em que ela pode ser extraída. O anel lactônico em meio alcalino se abre, e se recupera o anel (relactonização) em acidificação em meio aquoso. A cumarina se apresenta como cristais prismáticos, incolor com odor de fragrância distinta e de sabor amargo e picante. (BRUNETON, 1995).
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É importante identificar quais cumarinas estão presente em extratos vegetais antes do tratamento químico, já que em pH ácidos ou alcalinos algumas cumarinas podem ser sensíveis, o que leva ao isolamento de artefatos ao invés do isolamento das cumarinas originais, usando a cromatografia de camada delgada as cumarinas podem ser com facilidade identificadas devido a característica de fluorescência da maioria das cumarinas sob luz ultravioleta (MURRAY, 1978).
Modificações na estrutura básica das cumarinas fornecem outras classes de compostos (figura 3). A importância de se explorar as propriedades desses
compostos pode ser explicada pelo 6-metóxi-8-hidróxi-3-metil-3,4-
dihidroisocumarina, que possui atividade antibiótica e é produzida pela cenoura após invasão por fungos (HOULT, 1988).
Figura 11: Cumarina e compostos similares. Fonte: (SOUZA, 2005).
Desta forma este estudo avaliou o potencial de compostos cumarínicos complexados com metais de transição da primeira série como antiparasitário, na tentativa de obter compostos bioativos menos tóxicos para tratamento da leishmaniose, nas fases aguda e crônica da doença.
40 3 JUSTIFICATIVA
As leishmanioses são zoonoses que afetam tanto o homem como cães domésticos e silvestres, no entanto não existe tratamento efetivo ou vacina que cure ou previna com seguraça esta enfermidade. Além disso, o uso rotineiro de drogas antimoniais, utilizadas no tratamento em humanos e também em cães, induz à remissão temporária dos sinais clínicos, porem não previne a ocorrência de recidivas, tendo seu efeito limitado na infectividade de flebotomíneos e leva ao risco de selecionar parasitos resistentes às drogas utilizadas para o tratamento humano. Desta forma, o tratamento das leishmanioses ainda constitui um desafio para a ciência, estimulando diversos grupos de pesquisa à descoberta de novos medicamentos mais efetivos e menos tóxicos.
Diversos estudos já validaram o efeito de produtos naturais como potenciais fontes de novos e seletivos agentes para o tratamento de doenças tropicais causados por protozoários e outros parasitas.
Podendo ser apontado como um mecanismo promissor contra as parasitoses, a cumarina e seus derivados possuem grande potencial como fonte de moléculas bioativas.
Algumas cumarinas têm recebido grande atenção nestes últimos anos, sendo realizadas extrações desta substância em determinadas espécies de plantas como, por exemplo o estudo em que se obteve das folhas da Calopphyllum brasiliense o extrato bruto de cumarina que apresentou atividade antiparasitária contra a espécie
Leishmania amazonensis (THATI, 2007). Da espécie Esenbeckiea febrífuga, da
família da Rutaceae, obeteve-se geranylo, xycoumarina, aurapten, composto cumarínico que apresenta uma atividade antiparasitária significativa contra o parasita Leishmania major, em que é endêmico na população humana nas regiões tropicais e subtropicais. Outros compostos cumarínicos têm demonstrado atividade significativa anti-leishmaniose (NAPOLITANO, 2004).
Desta forma este estudo avaliou o potencial de compostos cumarínicos contendo metais de transição da primeira série como (Cu(II), Zn(II), Fe(II) e Ni(II)) como antiparasitário, na tentativa de obter compostos bioativos menos tóxicos para tratamento da leishmaniose.
41 4 OBJETIVO GERAL
Estudar a susceptibilidade das diferentes espécias de leishmanias (L. (L.)
amazonensis, L.(V.) brasiliensis e L.(L.) chagasi, frente aos compostos metálicos
como controle e eliminação da forma amastigota intracelular destes parasitas.
4.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar o IC50% dos compostos contra forma promastigotas de diferentes
espécies do Leishmania;
Avaliar a atividade anti-Leishmania sp de compostos cumarínicos complexados
com metais em células hospedeiras.
Identificar a susceptibilidade dos compostos cumarinicos complexados com
metais na forma amastigota das diferentes especies do parasita.
Determinar o indice de segurança (IS) para utilização dos compostos metalicos
42 5 MATERIAL E MÉTODOS
5.1 Reagentes e drogas
Para este estudo foram utilizados os seguintes reagentes: tripsina (Gibco, NY, EUA), soro fetal bovino (SBF) (Cultilab, SP, Brasil), meio RPMI-1640 (Sigma, St. Louis, MO, USA) suplementado com os antibióticos, estreptomicina (10mg/mL), penicilina (6mg/mL) e canamicina (2mg/mL; Gibco, Grand Island, NY, USA)
5.2 Células
Macrófagos murinos da linhagem j774 A.1 (ATCCCR-107), tipo celular macrófago/monócito, oriundos do sarcoma de uma fêmea adulta da linhagem BALB/c, foram cultivados em meio de cultura celular RPMI-1640 (Sigma, St. Louis, MO, USA) suplementado com os antibióticos, estreptomicina (10mg/mL), penicilina (6mg/mL) e canamicina (2mg/mL; Gibco, Grand Island, NY, USA) e 10% de soro
fetal bovino (SBF), mantidos em estufa a 37ºC e 5% de CO2.
5.3 Parasitas
Formas promastigota de fase estacionária de L. (V.) braziliensis MHOM/BR/ 1975/M2903, L. (L.) chagasi MHOM/BR/1981/ phufms - 181, L. (L.) amazonensis, foram utilizadas e mantidas em meio de cultura RPMI-1640 (Sigma) suplementado com antibióticos estreptomicina (10mg/mL; Sigma, St. Louis, MO, USA) e penicilina (6mg/mL;Sigma, St. Louis, MO, USA) e 20% de soro fetal bovino (SBF; Cultilab, Campinas, SP, BR), mantidas a 26ºC em estufa incubadora B. O. D. Os parasitas utilizados foram obtidos de cultura celular de 6 a 7 dias de crescimento no período da fase estacionária das formas promastigota. As espécies de Leishmania foram gentilmente cedidas pelo Dr. Paulo Cotrim do Instituto de Medicina Tropical, USP-SP.
43 5.4 Obtenção da Cumarina e composto metálico isolados e modificados
A Cumarina, 4-hidroxi-3-nitrocumarina e mais quatro substâncias bioativas complexadas com metais (Cu(II), Zn(II), Fe(II) e Ni(II)) foram utilizadas para a avaliação da atividade citotóxica e antiparasitária nas três espécies de Leishmania. A Cumarina e as substâncias derivadas foram sintetizadas pela Dra. Regina Mara Silva Pereira do Laboratório de Química de Coordenação da Universidade Anhanguera de São Paulo – UNIAN-SP
5.5. MÉTODOS
5.5.1 Curva de crescimento dos parasitas avaliada por MTT
Os parasitas da espécie L. (L.) amazonensis, foram diluídos na concentração
de 3x104 parasitas por mL, em 2 mL de meio RPMI-1640 suplementado com 10mM
de HEPES, 24mM de bicarbonato de sódio, 1mg/L de estreptomicina, 1000 UI/L de penicilina, 10% de SFB, em tubo cônico estéril de 15mL, os tubos foram incubados em temperatura de 26 a 28°C. Este estudo foi realizado em triplicata, a cada hora foi adicionado a cada amostra 20μL de MTT na concentração de 0,5mg/mL e estes 3 tubos foram mantidos a 28°C por mais 4 horas. Ao final das 4 horas realizou-se a centrifugação do dos tubos por um período de oito minutos a 3500 rpm. O
sobrenadante foi desprezado, adicionou-se 500 μL de DMSO ao pellet antes da
leitura de absorbância a 570nm. Este procedimento foi realizado nos tempos de 1, 2, 3, 4, 5, 7 e 24 horas.
5.5.2 Avaliação da citotoxidade de L. (V.) braziliensis, L. (L.) chagasi, L. (L.) amazonensis
Foi utilizado o método de redução de MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio), para a determinação da citotoxicidade dos compostos, sendo avaliado através da capacidade das células viáveis reduzirem o MTT devido à liberação da enzima lactato desidrogenase para o meio extra mitocondrial.
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O método da redução do MTT é um dos métodos mais utilizados na avaliação da citotoxicidade de diferentes compostos devido à sua rapidez, versatilidade e alta reprodutibilidade. Este teste colorimétrico baseia-se na capacidade das células viáveis converterem o sal de tetrazólio solúvel (MTT) em um precipitado de formazan insolúvel.
Para aplicação do método MTT, inicialmente foram adicionados os compostos cumarínicos complexados com Zn, Cu, Fe ou Ni, de diferentes concentrações em
200 L de RPMI e realizadas diluições seriadas nos 9 pocos da fila de placa de 96
poços, contendo 100 L de meio de cultura Em seguida as espécias de Leishmania,
na forma promastigota foram adicionadas (3x104 células/100L) aos poços e
incubadas em estufa por um período de 24 horas (“overnight”) a 37ºC sob atmosfera
de 5% de CO2. Os poços contendo as células controle receberam apenas meio de
cultura, sem tratamento. As drogas Anfotericina B e Glucantime, usuais para tratamento da leishmaniose, foram utilizadas como referencia na concentração de IC50% descrita na literatura. Após o período de incubação, foram adicionado aos
poços 20 L de MTT e colocados em estufa por um período de 24 horas
(“overnight”) a 37ºC sob atmosfera de 5% de CO2, para redução do MTT em
formazam. Em seguida foram adicionado 50 L de DMSO aos poços para lise dos
parasitas. Finalizado esse período de tempo, realizou-se as leituras dos valores de absorbância a um comprimento de onda de 570nm. Experimentos realizados em duplicata.
5.5.3 Determinação da concentração que inibe 50% do crescimento do parasita (IC50)
Como ensaio de citotoxicidade in vitro, foi realizado o teste de redução do MTT¸ através do qual foi determinadas as curvas de atividade das diferentes concentrações dos compostos metálicos, medidas pela quantidade de formazam obtida em cada poço das placas, dado pela absorbância medida em leitor de ELISA (Bio-Tek, Elx800), utilizando-se o filtro de 570 nm. Os dados obtidos a partir dos valores das absorbâncias foram plotados em curva de regressão linear (Graph Pad Prism versão 5.02 para Windows, Graph Pad Software, San Diego Califórnia USA),