AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA MICROBIOLÓGICA DO ISOLADO Staphylococcus xylosus LQ3

AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA MICROBIOLÓGICA DO

ISOLADO Staphylococcus xylosus LQ3

C. E. S. Cruxen

_{, C. W. Ames}

_{, J. L. Marques}

_{, G. D. Funck}

_{, W. P. Silva}

_{, A. M.}

Fiorentini

_.

1 – Programa de Pós -Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos - Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial – Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel - Campus Capão do Leão – Universidade Federal de Pelotas, s/n CEP 96010-900 Caixa Postal 354 – Pelotas – RS – Brasil, Telefone: (53) 32757284 – email: (camilaames@hotmail.co m)*_.

RESUMO - A caracterização de isolados nativos é uma alternativa para a produção de embutidos cárneos, pois esses micro-organismos já encontram-se adaptados às condições ambientais, tecnológicas e ecológicas. Por essa razão, isolados nativos podem se desenvolverem de forma mais eficiente e dominar a microbiota presente. No entanto, antes de utilizá-los, na composição de culturas iniciadoras é necessário verificar alguns aspectos de segurança. Sendo assim, obje tivou-se avaliar a segurança microbiológica do isolado Staphylococcus xylosus LQ3 em relação a atividade antagonista contra bactérias patogênicas, bem como a resistência a antimicrobianos, atividade hemolítica e DNase. O isolado LQ3 não apresentou atividade antagonista contra bactérias patogênicas, mostrou-se sensível aos antimicrobianos testados e não apresentou nenhum gene de resistência, bem como ausência de atividade hemolítica e DNase, demostrando segurança microbiológica nos quesitos avaliados.

ABSTRACT – The characterization of native isolates is an alternative for the production of meat sausages, because these microorganisms are already adapted to the environmental, ecological and technological conditions. For this reason, native isolates can develop more efficiently and dominate the microbiota. However, before using them in the composition of starter cultures it is necessary to check some safety aspects. Thus, this study aimed to assess the microbiological safety of the isolated

Staphylococcus xylosus LQ3 against antagonistic activity against pathogenic bacteria, as well as

antimicrobial resistance, hemolytic activity and DNase. Isolated LQ3 showed no antagonistic activity against pathogenic bacteria, proved sensitive to antimicrobials tested and did not show any resistance gene as well as the absence of hemolytic activity and DNase, showing the microbiological safety issues assessed.

PALAVRAS-CHAVE: embutidos cárneos fermentados; culturas nativas; estafilococos coagulase negativa; aspectos de segurança.

KEYWORDS: fermented meat sausage; native cultures; coagulase-negative staphylococci; safety aspects.

1. INTRODUÇÃO

A competição entre diferentes micro-organismos ocorre de forma natural, fazendo com que algumas bactérias consigam inibir o desenvolvimento de outras através da produção de me tabólitos antimicrobianos. As bactérias ácido láticas (BAL) e estafilococos coagulase negativa (ECN) possuem

a capacidade de inibir diversas bactérias patogênicas através da produção de ácidos orgânicos, peróxido de hidrogênio e/ou pela produção de peptídeos, denominados bacteriocinas (Gaggia et al., 2011; Holzapfel, 2002). O principal efeito antimicrobiano das culturas iniciadoras na fermentação é a acidificação dos alimentos, o qual somado à redução da atividade de água e a exclusão competitiva, contribui para a redução da microbiota patogênica (Simonová et al., 2006).

Pesquisas têm demostrado que estafilococos coagulase negativa isolados de produtos cárneos não apresentam atividade antagonista in vitro, bem como não são capazes de produzir bacteriocinas (Bonomo et al., 2009; Fiorentini et al., 2009; Ruaro et al., 2013). Em contra partida, Villani et al. (1997) descreveram a atividade inibitória de substâncias antagonistas produzidas por Staphylococcus

xylosus contra Listeria monocytogenes e outras bactérias Gram-positiva. A atividade inibitória

promovida pela síntese de bacteriocinas produzidas por estafilococos pode fornecer controle adicional contra patógenos em embutidos cárneos (Simonová et al., 2006).

No entanto, além da atividade antagonista é importante avaliar a resistência a antimicrobianos quando se pretende utilizar isolados de ECN como culturas iniciadoras em alimentos, para garantir a segurança microbiológica. Segundo Levy e Marshal (2004), micro-organismos que possuem genes de resistência transmissíveis configuram um risco à saúde pública, Chajecka-Wierzchowska et al. (2015) demostraram por meio de análises fenotípicas e genotípicas que algumas espécies de ECN têm apresentado genes de resistência a antimicrobianos, podendo transmitir esses genes para bactérias patogênicas.

Outros critérios de seleção, para culturas com potencial aplicação em alimentos, referem-se às atividades hemolítica e DNase, consideradas marcadores de virulência e, portanto, sua ausência é de fundamental importância para a saúde do consumidor. As hemolisinas são agentes citotóxicos, sendo que sua ação pode auxiliar no poder invasivo da bactéria. Algumas espécies de Staphylococcus podem produzir essas hemolisinas, dentre as quais, destacam-se a α-hemolisina e β-hemolisina que diferem entre si de acordo com a ação lítica que causam nos eritrócitos (Butt et al., 1998). A α-hemolisina possui capacidade de lisar hemácias e atuar na membrana celular de leucócitos, promovendo o extravasamento do conteúdo da célula e morte celular. A α-toxina está sobre controle do gene regulador agr e é produzida durante a fase pós-exponencial do crescimento bacteriano (Bhakdi e Tranum-Jensen, 1991). A detecção da atividade DNase serve para verificar a hidrólise de ligações fosfodiéster entre os nucleotídeos que compõe o DNA (Çitak, Varlik e Gündogan, 2003).

Diante do exposto, objetivou-se avaliar a segurança microbiológica do isolado

Staphylococcus xylosus LQ3, em relação a atividade antagonista contra bactérias patogênicas, bem

como a resistência a antimicrobianos, atividade hemolítica e DNase.

2. MATERIAL E MÉTODOS

Para a avaliação da segurança microbiológica do isolado LQ3 foram realizadas as análises , descritas a seguir.

2.1. Atividade antagonista contra bactérias patogênicas

Utilizou-se a técnica spot-on-the-lawn descrita por Schillinger e Lucke, (1989), com

adaptações.

O meio de cultura utilizado foi o ágar TSA suplementado com 0,6% de extrato de

levedura, 0,4% de sacarose e 0,1% de lactose. Após a esterilização do meio (121°C/15min),

resfriou-se até 50 °C e adicionou-se a concentração de 10

_{a 10}

_UFC.mL

_{das seguintes}

cepas:

Enteretidis ATCC 13076, Escherichia coli O157:H7 ATCC 43895. Foram adicionadas alíquotas de 10 μL da suspensão de S. xylosus LQ3 e de Lactobacillus plantarum ATCC 8014 (controle positivo). Posteriormente, as placas foram incubadas em aerobiose por 24 h a 37 °C. O aparecimento de halos de inibição indica atividade antagonista e o resultado foi expresso em milímetros.

2.2. Avaliação da resistência fenotípica e genotípica a antimicrobianos

A avaliação fenotípica da resistência aos antimicrobianos foi realizada pelo método de disco difusão em ágar, utilizando-se ágar Mueller-Hinton - MH (Merck). Foram utilizados os antimicrobianos: ampicilina (10 μg), penicilina G (10 U), amoxicilina (10 μg), tetraciclina (30 μg), eritromicina (15 μg), ciprofloxacina (5 μg), estreptomicina (10 μg), gentamicina (10 μg), cloranfenicol (30 μg), rifampicina (5 μg) e sulfametoxazol trimetoprima (1.25/23.75 μg) adquiridos pela Laborclin®. Como controle das análises, foi utilizada a cepa Staphylococcus aureus ATCC 25923. A resistência ou sensibilidade aos antimicrobianos foi verificada conforme as normas do Clinical and

Laboratory Standards Institute (CLSI, 2015). As análises genotípicas foram avaliadas através da

técnica de Polymerase Chain Reaction (PCR) para as seguintes classes e seus respectivos genes: β-Lactâmicos (blaZ), inibidores da síntese de folato (sul1, sul2, dfrG), macrolídeos (ermB, ermC), tetraciclinas (tetA, tetB, tetK, tetL, tetM, tetO, Tn916-1545), e aminoglicosídeos (strA, strB), de acordo com: Martineau et al., (2000); Grape et al, (2003); Kerrn et al, (2002); Bertsch et al, (2013); Jensen, (1999); Strommenger et al, (2003); Frech and Schwarz, (2000); Frech and Schwarz, (2000); Strommenger et al, (2003); Pang et al (1994); Strommenger et al, (2003); Li, Sherwood e Logue, (2007), respectivamente.

2.3. Atividade Hemolítica

A atividade hemolítica do isolado foi avaliada de acordo com o protocolo descrito por Ruaro

et al. (2013).

Atividade positiva para da β-hemólise resulta em uma lise completa dos

eritrócitos com aparecimento de um halo claro em torno da colônia, enquanto uma reação α-

hemólise envolve a lise parcial dos eritrócitos.

2.4. Atividade DNase

A atividade DNase de LQ3 foi determinada conforme American Public Health Association -

APHA (2001), utilizando-se como controle positivo Staphylococcus aureus ATCC 25923.

O

aparecimento de zonas claras em torno do crescimento celular indica atividade DNase

positiva.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

O isolado S. xylosus LQ3 não apresentou atividade antagonista contra as bactérias patogênicas testadas. Geralmente, ECN não apresentam essa característica in vitro como se pode observar em outros estudos. Fiorentini, et al. (2009) analisaram a capacidade antagonista de S. xylosus (AD1 e U5) contra as cepas patogênicas de L. monocytogenes NTC 098630, E. coli ATCC 25922 e S.

aureus ATCC 12598 e verificaram que os isolados não possuíram atividade antagonista. Porém,

alguns ECN são capazes de produzir bacteriocinas que atuam como antimicrobianos inibindo o desenvolvimento de patógenos, em especial bactérias Gram-positiva. Villani et al. (1997) descreveram a atividade inibitória de substância antagonista produzidas por S. xylosus 1E contra L. monocytogenes em salames.

Quanto a avaliação da resistência aos antimicrobianos, o isolado LQ3 demonstrou ser sensível a todos os antimicrobianos testados e não apresentou nenhum dos genes de resistência avaliados. Chajęcka-Wierzchowska et al. (2015) detectaram que 51,7% (15/29) dos isolados identificados como S. xylosus apresentaram resistência fenotípica a pelo menos um antibiótico testado e que desses isolados, 93% (14/15) apresentaram um ou mais genes de resistência . Estudos apontam que ECN podem ser resistentes aos antimicrobianos bem como portadores de genes de resistência e, uma vez estando no alimento ou no intestino humano, podem disseminar genes de resistência , por via horizontal, a outros grupos taxonômicos, tornando-os um risco para saúde pública (Levy e Marshall, 2004). Sendo assim, torna-se indispensável avaliar através de testes fenotípicos e genotípicos a resistência aos antimicrobianos em isolados de ECN que se destinam a aplicação como culturas iniciadoras.

Observou-se, neste estudo, que o isolado S. xylosus LQ3 não apresentou atividade para hemólise e DNase. Ruaro et al. (2013) testaram isolados pertencentes ao grupo ECN para atividade hemolítica e observaram que 31% (24/77) apresentaram atividade, sendo 17 para β-hemólise e 7 para α-hemólise. O mesmo autor constatou que a maior expressão fenotípica de fatores de virulência ocorreu em isolados identificados como S. aureus. No entanto, verificou que dos 145 isolados identificados como ECN, 9% apresentaram atividade hemolítica e que 26,2% demostraram atividade DNase. Em trabalho recente pesquisadores isolaram BAL a partir de leite de cabra e verificaram que nenhum isolado apresentou atividade para DNase (Almeida Júnior et al., 2015). Como se pode perceber vários pesquisadores têm avaliado atividade hemolítica e DNase em isolados que se destinam à aplicação em alimentos como é o caso de BAL e ECN. Sendo assim, é recomendável que isolados que serão aplicados futuramente em alimentos não apresentem esses fatores de virulência.

4. CONCLUSÕES

O isolado Staphylococcus xylosus LQ3 não apresentou atividade antagonista contra as bactérias patogênicas testadas. Porém, apresentou segurança microbiológica quanto aos aspectos de resistência a antimicrobianos, atividade hemolítica e DNase. Análises toxicológicas serão necessárias para proporcionar maiores informações sobre a segurança do isolado.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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