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RESPOSTA IMUNE ADAPTATIVA. Resposta Imune Humoral - Ac

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Academic year: 2021

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(1)

Resposta Imune

Humoral - Ac

RESPOSTA

IMUNE

ADAPTATIVA

IgG (memória )

¾atravessa a placenta (IgG1, IgG3, IgG4).

¾Fixa complemento. Liga (Fc) a M∅ e NK

¾resposta secundária (memória)

IgA (defesa mucosas)

¾elevada concentração nas secreções, saliva,

colostro e leite

IgM (fase aguda/recente)

¾anticorpo da resposta primária. Fixa complemento

IgE

¾liga-se a receptores específicos de mastócitos

aumentada em alergias do tipo I e parasitoses

IgD

(2)

PROPRIEDADES DAS Ig

IgG

IgA

IgM

IgE

IgD

PM (kD) 160 360

900 200 160

Coef. Sed.

7S

11S

19S 8S 7S

% carbohidratos

8

7 12 12

12

Subclasses 4 2

-

-

-[ ] plasma 800 150

50 0,002

-(mg/dL)

-1600 -400

200 0,005

-meia-vida (dias) 21

6

5

2

-Interação Ag-Ac:

especificidade, afinidade, reversibilidade

Menor afinidade: interação cruzada

ANTICORPOS MONOCLONAIS (AcMo) ANTICORPOS POLICLONAIS

- Marcadores tumorais

-Pesquisa e Caracterização

de moléculas

- Seleção de moléculas

recombinantes

- Seleção de moléculas

recombinantes

- Soros neutralizantes

PRODUÇÃO DE ANTICORPOS POLICLONAIS

Y

Y

Y

Y

(Ag)

imunização

Ac de

Especifi-cidades

(3)

Anticorpos Monoclonais

•1975: Kohler e Milstein

•Obtidos de linhagens celulares (hibridomas) ou clones provenientes de animais previamente imunizados com o antígeno de interesse.

•Hibridomas: São células otimizadas (“imortais”) in vitro, que

são capazes de secretar IgG monoclonal em grande quantidade, obtidas através da fusão de um linfócito B (de um animal previamente imunizado com o antígeno de interesse) com uma célula de mieloma

Anticorpos Monoclonais

• Células Mieloma: X63-Ag-8.653, SP2 • Não secretoras Hipoxantina-fosforil transferase deficiente

Tipos de Testes Imunológicos

Herceptin (AcMo) liga a HER-2, receptor para fator de crescimento de algumas células tumorais (câncer de mama e linfomas).

ANTICORPOS MONOCLONAIS

Porque produzir?

ANTICORPOS MONOCLONAIS (AcMo) ANTICORPOS POLICLONAIS

Especificidade

Y

Y

Y

Y

YY

ANTICORPOS MONOCLONAIS

Tipos de Técnicas:

Fusão Celular

Biologia Molecular

Ambas necessitam de Imunização

IMUNIZAÇÃO DOS ANIMAIS (fonte de Linfócito B = será imortalizado)

MIELOMAS

(Vida eterna + congelar + sobreviver em cultura)

™Etapas de produção

1.Imunização: insere-se o antígeno de interesse juntamente com fatores que auxiliam na ativação do SI (adjuvantes) na corrente sanguínea do animal (camundongo, coelho, cabra) semanalmente por cerca de 10 semanas, diminuindo a dose progressivamente;

2.Preparo das células do mieloma: células de mieloma são cultivados em meio contendo 8-azaguanina que garantirá sensibilidade ao meio utilizado após a fusão celular

(4)

™Etapas de produção

3. Fusão: linfócitos B presentes no baço/linfonodos do animal imunizado são retirados e fundidos separadamente com um mieloma, formando o hibridoma que crescerá e se multiplicará indefinidamente em um meio de cultura contendo principalmente albumina de soro bovino (BSA) e fatores de crescimento;

4. Sobrenadante: com o tempo, a quantidade de anticorpos secretados por esses clones do hibridoma no sobrenadante da cultura vai aumentando;

5. Separação [hibridoma x sobrenadante]: por centrifugação separa-se as células do separa-seu sobrenadante

™Etapas de produção

6.

Separação [IgG monoclonal x outras moléculas do sobrenadante]: •sob agitação magnética constante e à temperatura de 4°C •adicionam-se, aos poucos, 50% em massa de sulfato de amônio: precipitando principalmente o IgG e algumas proteínas •Centrifugação a 9500rpm por 30min e a 5°C: separação das proteínas (precipitado) das outras substâncias como água, sal e açúcares (sobrenadante)

•Adiciona-se 5% em volume de tampão fosfato (PBS) somente sobre o precipitado, ressuspendendo-o

•Faz-se uma diálise, sob agitação magnética e a 4°C em 3L de tampão PBS, onde a primeira troca é feita após 2 horas decorridas, seguindo over night.

™Etapas de produção

7.

Coluna de afinidade: purificação refinada com a resina Protein A

Sepharose 4 Fast Flow;

•Coluna de 10mL com filtro

•0,5mL da resina é suficiente (1 mL de resina liga 35mg de IgG) •primeiramente a solução de Anticorpo é submetida à agitação vertical por cerca de 4h, e cada 10mL passam pela resina

•para eluir a IgG da coluna, adicionam-se 10ml da solução de citrato de sódio com pH 3

•obtêm-se finalmente alíquotas de 1ml com gradiente decrescente de concentração e corrigido o pH com 10% (vol) tampão Tris 1M pH 6,8.

™Etapas de produção

8.

Caracterização do AcMo

A) Teste da reação entre o antígeno de interesse com os IgGs monoclonais de cada cultura de hibridoma:

ELISA indireto;

Imunofluorescência indireta; Western Blot;

B) Teste para verificação do grau de pureza da solução final purificada:

Eletroforese em gel (poliacrilamida).

PRODUÇÃO

IMUNIZAÇÃO DOS ANIMAIS

(fonte de Linfócito B = será imortalizado)

O Ag utilizado na imunização?

- Proteína = melhor antígeno

- Polissacarídeos = menor imunogenicidade

- Lipídeos, peptídeos sintéticos, ac nucléicos = baixa

imunogenicidade (tratados com carreadores)

Qual o protocolo utilizado de fusão celular?

- Fusão com baço ou linfonodo

PRODUÇÃO

IMUNIZAÇÃO DOS ANIMAIS

Qual via de imunização?

- IP (melhor via) para fusão com baço

- IM (difícil p/ camundongo)

- SC (Volume limitado)

- EV (recomendada na última dose e sem adjuvante)

- diretamente no órgão (perigosa e sem adjuvante)

Qual a quantidade de Ag?

(5)

PRODUÇÃO

IMUNIZAÇÃO DOS ANIMAIS

Como preparar o Ag ?

- Com adjuvante (Completo/incompleto de Freund)

ACF (óleo + BCG) = recomendado na 1a. dose

AIF (apenas óleo) = doses subsequentes

- Alguns Ag ou via de administração podem requerer

outro adjuvante (Ag particulado, lipossomos, alúumen,

etc.)

1a. dose

3a. dose (se necessário)

2a. dose

última dose (

±15d/EV/salina)

±15d

±15d

Coleta: Máximo 15% do vol. total ou 1% do peso corporal

Esquema de imunização:

- Volume (

µL

) = 50-500 (IP), 50-200 (SC e EV), 50-100

(baço/linfonodo), 50-100 (subplantar)

ANIMAIS DE PEQUENO PORTE

ACOMPANHAMENTO DA RESPOSTA

Dia 1a: Coleta = 1a imunização

Dia das demais coletas e demais doses

MONITORAR

ELISA

FUSÃO CELULAR

Em cultura por 1 semana

(6)

VIAS DE SÍNTEASE DE DNA Duas vias: 1 - Via DENOVO: 5-amino-imidazole-4carboxy-ribonucleotide aminopterina 2 - Via de Salvamento: GUANINE ou HIPOXANTYINE HPRT DNA DEOXYTHIMIDINEGUANINA Tk

DNA TK: timidina kinase

HPRT: hipoxantina fosforibosil transferase

POSITIVO

EXPANDE EM CULTURA/ASCITE

PURIFICAÇÃO

ISOTIPAGEM

PRODUÇÃO EM LARGA ESCALA

EXPANSÃO EM CULTURA

EXPANSÃO EM ASCITE

PURIFICAÇÃO

CROMATOGRAFIA

Ascite ou meio

=

“Immunoblotting”

CARACTERIZAÇÃO/ESPECIFICIDADE

AcMo

(7)

IMUNIZAÇÃO COM PROTEÍNA RECOMBINANTE

Giviziez et al., 2004

EX: Giviziez et al., 2004 AcMo em fagomídeos contra vírus de bronquite em galinha

Produtos

São produzidos anticorpos monoclonais contra:

- Antígeno de superfície do vírus da Hepatite b, visando o estudo da sua caracterização estrutural e funcional para a revisão da especificidade de seus subtipos e o desenvolvimento de conjuntos para o diagnóstico sorológico.

- Antígeno purificado GP51/25 do Trypanossoma cruzi, visando o desenvolvimento de reativo para diagnóstico para doença de Chagas.

- Antígeno b-galactosidase + peptídeo extraído do citosol de T. cruzy. - Duplete proteico de 28-30KDa do Mycobacterium bovis BCG. - Imunoglobulinas humanas G e M.

- Proteínas de membrana externa (OMPs), polissacarídeo e lipooligossacarídeo de Neisseria

meningitidis, visando o desenvolvimento da vacina contra meningite b.

- Antígenos de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni. - Proteínas de Salmonella typhi TO-S.2154. - Proteínas do vírus da Hepatite C. - Proteínas do vírus da Hepatite A. - Desenvolvimento de AcsMns para Citrinina. - Proteínas do vírus vacinal da Febre Amarela (17DD). - Proteínas do vírus vacinal do Sarampo (CAM 70). - Antígenos do Mycoplasma mycoides caprino. - Proteína NS1 do vírus da Dengue, tipo2, expressa em E. coli.

TCD4

TCD8

IMUNOFENOTIPAGEM

MARCADOR TUMORAL

Diagnóstico por imagem

Tumores da tireóide:

•A cintilografia por captação de iodo não é capaz de diferenciar

tumores benignos e malignos;

•A diferenciação é

importante pois os tumores benignos

normalmente não precisam ser removidos;

•O uso de anticorpos monoclonais baseia-se na expressão de

galectina-3 por células tireiodeanas neoplásicas enquanto nos

tumores benignos não há expressão dessa molécula.

(8)

Diagnóstico por imagem

Fragmentos bivalentes de anticorpos monoclonais:

•Rápida penetração em tecidos;

•Maior retenção no órgão-alvo;

•Rápida depuração plasmática;

Intacto

Dímero

Diagnóstico por imagem

Antígeno carcinoembriônico (CEA):

•Relacionado com câncer colorretal;

•Dímero anti-CEA marcado com

18

F para imagens por PET scan;

Diagnóstico por imagem

Partículas de ferro oxidada conjugadas com anticorpo contra

receptor HER2/neu no diagnostico de câncer de mama:

•Alta sensibilidade;

•Detecção de tumores de até 50 mg;

•Possibilidade de monitorização do tratamento;

•Pode-se associar outro anti-neoplásico na particula

Diagnóstico por imagem

Antes injeção Após injeção 1 hora após injeção 12 hora após injeção

Tratamento

Por que Anticorpos Monoclonais são tão efetivos?

•Bloquear receptores ou fatores de crescimento essenciais à célula;

•Induzir apoptose;

•Ligar-se a alvos celulares

•Recrutar funções como citotoxidade celular anticorpo-dependente

(ADCC) ou citotoxidade complemento-dependente (CDC), ou

distribuir partículas citotóxicas como os radioisótopos.

TERAPIA

anticorpos imunomoduladores como o anti-CD3 e

o anti-CD154 com aplicação na fase aguda da

rejeição, para terapêutica do câncer, como

marcadores tumorais ou em kit para diagnóstico.

(9)

Há fusão das cadeias variáveis leve e pesada do anticorpo de camundongo (em verde escuro), com as cadeias constantes humanas (em laranja), formando moléculas quimeras. Estas moléculas eram ainda imunogênicas, assim os protocolos mais modernos de humanização preconizam o transplante das CDR murinas (linhas verdes) para cadeias variáveis humanas (em amarelo). Esta molécula teria ainda as cadeias constantes de imunoglobulinas humanas como na quimera e se apresenta de forma suficientemente invisível para o sistema imune

Tratamento

Esquematização de processos de humanização de imunoglobulinas.

Tratamento

Anticorpos monoclonais no tratamento do câncer

2 abordagens:

• Ação direta do anticorpo sobre algum receptor celular de forma a

promover a morte celular ou inibir o crescimento tumoral.

• Uso de anticorpos monoclonais como agentes direcionadores da

terapia ligados à toxinas ou radioisótopos antitumorais.

Tratamento

Anticorpos monoclonais aprovados como antineoplásico no Brasil.

Anticorpo Nome Comercial Tipo Indicações

Rituximabe Mabthera (Roche) Quimérico Linfoma não-Hodkin Transtuzumabe Herceptin (Roche) Humanizado Câncer de mama

Bevacizumabe Avastin (Roche) Humanizado Carcinoma metastático de câncer de cólon e

reto

Cetuximabe Erbitux (MSD) Quimérico Câncer de cabeça, pescoço e colón. Gentuzumab

ozogamicina

Mylotarg (Wyeth) Humanizado Leucemia mielóide aguda Alentuzumabe Campath (Bayer) Humanizado Leucemia linf.crônica

Tratamento

Anticorpos monoclonais aprovados como antineoplásico no Brasil.

Tratamento

Anticorpos monoclonais utilizados como imunossupressores

Anticorpo Nome Comercial Tipo Indicações

Adalimumabe Humira (Abbott) Humanizado D.de Crohn, psoríase, artrite

reumatóide Daclizumabe Zenapax (Roche) Humanizado Transplante renal

Infliximabe Remicade (Schering-Plough) Quimérico D. de Crohn, psoríase, Artrite reumatóide, colite ulcerativa

Basilizimabe Simulect (Novartis) Quimérico Transplante renal e hepático Efalizumabe Efalizumab*

(Genentech)

Humanizado Psoríase

Tratamento

(10)

Tratamento

Outras aplicações de anticorpos monoclonais na terapia

Anticorpo Nome Comercial Tipo Indicações

Abiciximabe Reopro (Eli Lilly) Quimérico Infarto agudo do miocárdio, isquemia

miocárdica. Natalizumabe Tysabri (Biogen) Humanizado Doença de Crohn,

Esclerose Múltipla

Tocilizumabe Actemra (Roche) Humanizado Castleman's disease, artrite reumatóide

Tratamento

Outras aplicações de anticorpos monoclonais na terapia

Tratamento

Novas aplicações de anticorpos monoclonais na terapia

Tratamento da dor

• Bloqueio de neurotrofinas no SNC, pertencentes a família do fator de crescimento dos neurônios (NGF). • Uma das ações do NGF é mediada pela ligação ao trkA.

• A ligação promove a sobrevivência e desenvolvimento neuronal durante o desenvolvimento embrionário e também medeia as ações que provocam a dor.

Bibliografia

1) ANVISA. Consulta de produtos. Capturado em: 17/04/2009.

2) Baradaran, B. et al. Large Scale Production and Characterization of Anti-Human IgG Monoclonal Antibody in Peritoneum of Balb/c mice. American Journal of Biochemistry and Biotechnology, 1 (4): 189-192, 2005.

3) Committe on Methods of Producing Monoclonal Antibodies Institute for Laboratory Animal Researche National Council. Monoclonal Antibody Production, 1999.

4) Drewe, E., Powdel, R.J. Clinically useful monoclonal antibodies in treatment. J. Clin. Pathol, 55: 81-85, 2002.

5) Hefti, F.F. et al. Novel class of pain drugs based on antagonism of NGF. Trends in pharmacological science, 27 (2): 85-91, 2006.

6) MICROMEDEX Healthcare. Alentuzumab Drugdex evaluations. Capturado em: 17/04/2009. 7) Mousa, S. A. et al. Nerve growth factor governs the enhanced ability of opioids to suppress

Referências

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