Resposta Imune
Humoral - Ac
RESPOSTA
IMUNE
ADAPTATIVA
IgG (memória )
¾atravessa a placenta (IgG1, IgG3, IgG4).
¾Fixa complemento. Liga (Fc) a M∅ e NK
¾resposta secundária (memória)
IgA (defesa mucosas)
¾elevada concentração nas secreções, saliva,
colostro e leite
IgM (fase aguda/recente)
¾anticorpo da resposta primária. Fixa complemento
IgE
¾liga-se a receptores específicos de mastócitos
aumentada em alergias do tipo I e parasitoses
IgD
PROPRIEDADES DAS Ig
IgG
IgA
IgM
IgE
IgD
PM (kD) 160 360
900 200 160
Coef. Sed.
7S
11S
19S 8S 7S
% carbohidratos
8
7 12 12
12
Subclasses 4 2
-
-
-[ ] plasma 800 150
50 0,002
-(mg/dL)
-1600 -400
200 0,005
-meia-vida (dias) 21
6
5
2
-Interação Ag-Ac:
especificidade, afinidade, reversibilidade
Menor afinidade: interação cruzada
ANTICORPOS MONOCLONAIS (AcMo) ANTICORPOS POLICLONAIS
- Marcadores tumorais
-Pesquisa e Caracterização
de moléculas
- Seleção de moléculas
recombinantes
- Seleção de moléculas
recombinantes
- Soros neutralizantes
PRODUÇÃO DE ANTICORPOS POLICLONAIS
Y
Y
Y
Y
(Ag)
imunização
Ac de
≠
Especifi-cidades
Anticorpos Monoclonais
•1975: Kohler e Milstein•Obtidos de linhagens celulares (hibridomas) ou clones provenientes de animais previamente imunizados com o antígeno de interesse.
•Hibridomas: São células otimizadas (“imortais”) in vitro, que
são capazes de secretar IgG monoclonal em grande quantidade, obtidas através da fusão de um linfócito B (de um animal previamente imunizado com o antígeno de interesse) com uma célula de mieloma
Anticorpos Monoclonais
• Células Mieloma: X63-Ag-8.653, SP2 • Não secretoras • Hipoxantina-fosforil transferase deficienteTipos de Testes Imunológicos
Herceptin (AcMo) liga a HER-2, receptor para fator de crescimento de algumas células tumorais (câncer de mama e linfomas).
ANTICORPOS MONOCLONAIS
Porque produzir?
ANTICORPOS MONOCLONAIS (AcMo) ANTICORPOS POLICLONAISEspecificidade
Y
Y
Y
Y
YY
ANTICORPOS MONOCLONAIS
Tipos de Técnicas:
•
Fusão Celular
•
Biologia Molecular
Ambas necessitam de Imunização
IMUNIZAÇÃO DOS ANIMAIS (fonte de Linfócito B = será imortalizado)
MIELOMAS
(Vida eterna + congelar + sobreviver em cultura)
Etapas de produção
1.Imunização: insere-se o antígeno de interesse juntamente com fatores que auxiliam na ativação do SI (adjuvantes) na corrente sanguínea do animal (camundongo, coelho, cabra) semanalmente por cerca de 10 semanas, diminuindo a dose progressivamente;
2.Preparo das células do mieloma: células de mieloma são cultivados em meio contendo 8-azaguanina que garantirá sensibilidade ao meio utilizado após a fusão celular
Etapas de produção
3. Fusão: linfócitos B presentes no baço/linfonodos do animal imunizado são retirados e fundidos separadamente com um mieloma, formando o hibridoma que crescerá e se multiplicará indefinidamente em um meio de cultura contendo principalmente albumina de soro bovino (BSA) e fatores de crescimento;
4. Sobrenadante: com o tempo, a quantidade de anticorpos secretados por esses clones do hibridoma no sobrenadante da cultura vai aumentando;
5. Separação [hibridoma x sobrenadante]: por centrifugação separa-se as células do separa-seu sobrenadante
Etapas de produção
6.
Separação [IgG monoclonal x outras moléculas do sobrenadante]: •sob agitação magnética constante e à temperatura de 4°C •adicionam-se, aos poucos, 50% em massa de sulfato de amônio: precipitando principalmente o IgG e algumas proteínas •Centrifugação a 9500rpm por 30min e a 5°C: separação das proteínas (precipitado) das outras substâncias como água, sal e açúcares (sobrenadante)•Adiciona-se 5% em volume de tampão fosfato (PBS) somente sobre o precipitado, ressuspendendo-o
•Faz-se uma diálise, sob agitação magnética e a 4°C em 3L de tampão PBS, onde a primeira troca é feita após 2 horas decorridas, seguindo over night.
Etapas de produção
7.
Coluna de afinidade: purificação refinada com a resina Protein ASepharose 4 Fast Flow;
•Coluna de 10mL com filtro
•0,5mL da resina é suficiente (1 mL de resina liga 35mg de IgG) •primeiramente a solução de Anticorpo é submetida à agitação vertical por cerca de 4h, e cada 10mL passam pela resina
•para eluir a IgG da coluna, adicionam-se 10ml da solução de citrato de sódio com pH 3
•obtêm-se finalmente alíquotas de 1ml com gradiente decrescente de concentração e corrigido o pH com 10% (vol) tampão Tris 1M pH 6,8.
Etapas de produção
8.
Caracterização do AcMoA) Teste da reação entre o antígeno de interesse com os IgGs monoclonais de cada cultura de hibridoma:
ELISA indireto;
Imunofluorescência indireta; Western Blot;
B) Teste para verificação do grau de pureza da solução final purificada:
Eletroforese em gel (poliacrilamida).
PRODUÇÃO
IMUNIZAÇÃO DOS ANIMAIS
(fonte de Linfócito B = será imortalizado)
O Ag utilizado na imunização?
- Proteína = melhor antígeno
- Polissacarídeos = menor imunogenicidade
- Lipídeos, peptídeos sintéticos, ac nucléicos = baixa
imunogenicidade (tratados com carreadores)
Qual o protocolo utilizado de fusão celular?
- Fusão com baço ou linfonodo
PRODUÇÃO
IMUNIZAÇÃO DOS ANIMAIS
Qual via de imunização?
- IP (melhor via) para fusão com baço
- IM (difícil p/ camundongo)
- SC (Volume limitado)
- EV (recomendada na última dose e sem adjuvante)
- diretamente no órgão (perigosa e sem adjuvante)
Qual a quantidade de Ag?
PRODUÇÃO
IMUNIZAÇÃO DOS ANIMAIS
Como preparar o Ag ?
- Com adjuvante (Completo/incompleto de Freund)
ACF (óleo + BCG) = recomendado na 1a. dose
AIF (apenas óleo) = doses subsequentes
- Alguns Ag ou via de administração podem requerer
outro adjuvante (Ag particulado, lipossomos, alúumen,
etc.)
1a. dose
3a. dose (se necessário)
2a. dose
última dose (
±15d/EV/salina)
±15d
±15d
Coleta: Máximo 15% do vol. total ou 1% do peso corporal
Esquema de imunização:
- Volume (
µL) = 50-500 (IP), 50-200 (SC e EV), 50-100
(baço/linfonodo), 50-100 (subplantar)
ANIMAIS DE PEQUENO PORTE
ACOMPANHAMENTO DA RESPOSTA
Dia 1a: Coleta = 1a imunização
Dia das demais coletas e demais doses
MONITORAR
ELISA
FUSÃO CELULAR
Em cultura por 1 semana
VIAS DE SÍNTEASE DE DNA Duas vias: 1 - Via DENOVO: 5-amino-imidazole-4carboxy-ribonucleotide aminopterina 2 - Via de Salvamento: GUANINE ou HIPOXANTYINE HPRT DNA DEOXYTHIMIDINEGUANINA Tk
↓
DNA TK: timidina kinaseHPRT: hipoxantina fosforibosil transferase
POSITIVO
EXPANDE EM CULTURA/ASCITE
PURIFICAÇÃOISOTIPAGEM
PRODUÇÃO EM LARGA ESCALA
EXPANSÃO EM CULTURA
EXPANSÃO EM ASCITE
PURIFICAÇÃO
CROMATOGRAFIA
Ascite ou meio=
“Immunoblotting”
CARACTERIZAÇÃO/ESPECIFICIDADE
AcMoIMUNIZAÇÃO COM PROTEÍNA RECOMBINANTE
Giviziez et al., 2004
EX: Giviziez et al., 2004 AcMo em fagomídeos contra vírus de bronquite em galinha
Produtos
São produzidos anticorpos monoclonais contra:
- Antígeno de superfície do vírus da Hepatite b, visando o estudo da sua caracterização estrutural e funcional para a revisão da especificidade de seus subtipos e o desenvolvimento de conjuntos para o diagnóstico sorológico.
- Antígeno purificado GP51/25 do Trypanossoma cruzi, visando o desenvolvimento de reativo para diagnóstico para doença de Chagas.
- Antígeno b-galactosidase + peptídeo extraído do citosol de T. cruzy. - Duplete proteico de 28-30KDa do Mycobacterium bovis BCG. - Imunoglobulinas humanas G e M.
- Proteínas de membrana externa (OMPs), polissacarídeo e lipooligossacarídeo de Neisseria
meningitidis, visando o desenvolvimento da vacina contra meningite b.
- Antígenos de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni. - Proteínas de Salmonella typhi TO-S.2154. - Proteínas do vírus da Hepatite C. - Proteínas do vírus da Hepatite A. - Desenvolvimento de AcsMns para Citrinina. - Proteínas do vírus vacinal da Febre Amarela (17DD). - Proteínas do vírus vacinal do Sarampo (CAM 70). - Antígenos do Mycoplasma mycoides caprino. - Proteína NS1 do vírus da Dengue, tipo2, expressa em E. coli.
TCD4
TCD8
IMUNOFENOTIPAGEM
MARCADOR TUMORAL
Diagnóstico por imagem
Tumores da tireóide:
•A cintilografia por captação de iodo não é capaz de diferenciar
tumores benignos e malignos;
•A diferenciação é
importante pois os tumores benignos
normalmente não precisam ser removidos;
•O uso de anticorpos monoclonais baseia-se na expressão de
galectina-3 por células tireiodeanas neoplásicas enquanto nos
tumores benignos não há expressão dessa molécula.
Diagnóstico por imagem
Fragmentos bivalentes de anticorpos monoclonais:
•Rápida penetração em tecidos;
•Maior retenção no órgão-alvo;
•Rápida depuração plasmática;
Intacto
Dímero
Diagnóstico por imagem
Antígeno carcinoembriônico (CEA):
•Relacionado com câncer colorretal;
•Dímero anti-CEA marcado com
18F para imagens por PET scan;
Diagnóstico por imagem
Partículas de ferro oxidada conjugadas com anticorpo contra
receptor HER2/neu no diagnostico de câncer de mama:
•Alta sensibilidade;
•Detecção de tumores de até 50 mg;
•Possibilidade de monitorização do tratamento;
•Pode-se associar outro anti-neoplásico na particula
Diagnóstico por imagem
Antes injeção Após injeção 1 hora após injeção 12 hora após injeção
Tratamento
Por que Anticorpos Monoclonais são tão efetivos?
•Bloquear receptores ou fatores de crescimento essenciais à célula;
•Induzir apoptose;
•Ligar-se a alvos celulares
•Recrutar funções como citotoxidade celular anticorpo-dependente
(ADCC) ou citotoxidade complemento-dependente (CDC), ou
distribuir partículas citotóxicas como os radioisótopos.
TERAPIA
anticorpos imunomoduladores como o anti-CD3 e
o anti-CD154 com aplicação na fase aguda da
rejeição, para terapêutica do câncer, como
marcadores tumorais ou em kit para diagnóstico.
Há fusão das cadeias variáveis leve e pesada do anticorpo de camundongo (em verde escuro), com as cadeias constantes humanas (em laranja), formando moléculas quimeras. Estas moléculas eram ainda imunogênicas, assim os protocolos mais modernos de humanização preconizam o transplante das CDR murinas (linhas verdes) para cadeias variáveis humanas (em amarelo). Esta molécula teria ainda as cadeias constantes de imunoglobulinas humanas como na quimera e se apresenta de forma suficientemente invisível para o sistema imune
Tratamento
Esquematização de processos de humanização de imunoglobulinas.
Tratamento
Anticorpos monoclonais no tratamento do câncer2 abordagens:
• Ação direta do anticorpo sobre algum receptor celular de forma a
promover a morte celular ou inibir o crescimento tumoral.
• Uso de anticorpos monoclonais como agentes direcionadores da
terapia ligados à toxinas ou radioisótopos antitumorais.
Tratamento
Anticorpos monoclonais aprovados como antineoplásico no Brasil.
Anticorpo Nome Comercial Tipo Indicações
Rituximabe Mabthera (Roche) Quimérico Linfoma não-Hodkin Transtuzumabe Herceptin (Roche) Humanizado Câncer de mama
Bevacizumabe Avastin (Roche) Humanizado Carcinoma metastático de câncer de cólon e
reto
Cetuximabe Erbitux (MSD) Quimérico Câncer de cabeça, pescoço e colón. Gentuzumab
ozogamicina
Mylotarg (Wyeth) Humanizado Leucemia mielóide aguda Alentuzumabe Campath (Bayer) Humanizado Leucemia linf.crônica
Tratamento
Anticorpos monoclonais aprovados como antineoplásico no Brasil.
Tratamento
Anticorpos monoclonais utilizados como imunossupressores
Anticorpo Nome Comercial Tipo Indicações
Adalimumabe Humira (Abbott) Humanizado D.de Crohn, psoríase, artrite
reumatóide Daclizumabe Zenapax (Roche) Humanizado Transplante renal
Infliximabe Remicade (Schering-Plough) Quimérico D. de Crohn, psoríase, Artrite reumatóide, colite ulcerativa
Basilizimabe Simulect (Novartis) Quimérico Transplante renal e hepático Efalizumabe Efalizumab*
(Genentech)
Humanizado Psoríase
Tratamento
Tratamento
Outras aplicações de anticorpos monoclonais na terapia
Anticorpo Nome Comercial Tipo Indicações
Abiciximabe Reopro (Eli Lilly) Quimérico Infarto agudo do miocárdio, isquemia
miocárdica. Natalizumabe Tysabri (Biogen) Humanizado Doença de Crohn,
Esclerose Múltipla
Tocilizumabe Actemra (Roche) Humanizado Castleman's disease, artrite reumatóide
Tratamento
Outras aplicações de anticorpos monoclonais na terapia
Tratamento
Novas aplicações de anticorpos monoclonais na terapia
Tratamento da dor
• Bloqueio de neurotrofinas no SNC, pertencentes a família do fator de crescimento dos neurônios (NGF). • Uma das ações do NGF é mediada pela ligação ao trkA.
• A ligação promove a sobrevivência e desenvolvimento neuronal durante o desenvolvimento embrionário e também medeia as ações que provocam a dor.
Bibliografia
1) ANVISA. Consulta de produtos. Capturado em: 17/04/2009.
2) Baradaran, B. et al. Large Scale Production and Characterization of Anti-Human IgG Monoclonal Antibody in Peritoneum of Balb/c mice. American Journal of Biochemistry and Biotechnology, 1 (4): 189-192, 2005.
3) Committe on Methods of Producing Monoclonal Antibodies Institute for Laboratory Animal Researche National Council. Monoclonal Antibody Production, 1999.
4) Drewe, E., Powdel, R.J. Clinically useful monoclonal antibodies in treatment. J. Clin. Pathol, 55: 81-85, 2002.
5) Hefti, F.F. et al. Novel class of pain drugs based on antagonism of NGF. Trends in pharmacological science, 27 (2): 85-91, 2006.
6) MICROMEDEX Healthcare. Alentuzumab Drugdex evaluations. Capturado em: 17/04/2009. 7) Mousa, S. A. et al. Nerve growth factor governs the enhanced ability of opioids to suppress