TIOCIANATO Trabalho n.º 6
Doseamento do Tiocianato no plasma e na urina
CRITÉRIOS DE AVALIAÇÃO DE EXPOSIÇÃO AO TABACO
É normalmente aceite que os riscos para a saúde associados ao tabaco, aumentam com o número de cigarros fumados por dia. A avaliação da exposição ao tabaco através da utilização de questionários, pressupõe que o consumo diário de cigarros seja um índice de exposição adequado, em relação aos agentes tóxicos constituintes do fumo do tabaco. No entanto em estudos efectuados, verificou-se existirem indivíduos que fumam poucos cigarros por dia mas apresentam elevadas concentrações de monóxido de carbono no sangue e tiocianato no plasma, e outros, que fumam mais do que um maço de cigarros por dia e obtêm baixos valores para os mesmos parâmetros. Podemos assim observar que o número de cigarros consumidos é normalmente uma medida pouco correcta da dose. Isto sucede porque indivíduos que fumam o mesmo número de cigarros por dia não absorvem a mesma quantidade de fumo e portanto não estão expostos ao mesmo risco. A quantidade de fumo absorvida não é a mesma porque a absorção do fumo depende de vários factores, como: comprimento do cigarro, existência ou não de filtro, tipo de filtro (quando existe), profundidade da inalação, velocidade com que o cigarro é fumado, modo como cada individuo é capaz de metabolizar diferentes constituintes do fumo, idade do indivíduo e factores ambientais e nutricionais. Apesar das razões mencionadas, o número de cigarros fumados por dia é um factor a considerar na indicação do risco potencial a que um fumador está exposto, mas são na realidade os testes biológicos que mostram quais os fumadores que estão mais expostos ao fumo do tabaco devido a uma maior absorção do mesmo, e, por conseguinte, colocam a sua saúde em maior perigo. Reconhece-se portanto, a necessidade de utilizar testes biológicos para
avaliar o grau de exposição de cada indivíduo aos diferentes constituintes do fumo do tabaco.
Indicadores biológicos de exposição ao tabaco
Para podermos avaliar os níveis dos diferentes constituintes do fumo do tabaco que são absorvidos pelo organismo, podem ser executadas vários tipos de análises nos fluidos biológicos. As amostras biológicas normalmente utilizadas para fazer estas análises são: o sangue total, o plasma, a urina, a saliva e o ar expirado. É nestas amostras biológicas que podemos dosear determinadas substâncias tóxicas constituintes do fumo do tabaco, ou metabolitos delas derivados.
De entre estas substâncias tóxicas referimos o CO que pode ser determinado no ar expirado ou no sangue, o tiocianato cuja concentração pode ser determinada no plasma, urina ou saliva, a nicotina no plasma ou urina, e a cotinina, um metabolito da nicotina, no plasma.
Relativamente ao CO, verifica-se que o seu nível no sangue de fumadores são mais elevados do que em não-fumadores. Isto acontece, pois o CO é um dos constituintes do fumo do tabaco que é absorvido através das vias respiratórias e penetra no sangue onde se vai ligar à hemoglobina dos glóbulos vermelhos. Verificou-se haver um aumento progressivo de carboxihemoglobina no sangue relacionado com o aumento do consumo de cigarros. O nível médio de carboxihemoglobina no sangue de fumadores é cerca de 4-5%, chegando a atingir picos de 15%. Estes níveis em não-fumadores que vivem na cidade vão de 0,5% até ao máximo de 2%, variando portanto com as condições ambientais em que os indivíduos estão inseridos. A semi-vida do monóxido de carbono é de 4 h. Assim, a sua concentração no sangue permanece elevada durante um espaço de tempo relativamente curto depois de se fumar um cigarro.
Também relativamente ao tiocianato se verificou serem os níveis deste no plasma, urina e saliva, mais elevados em fumadores que em não-fumadores. A semi-vida do tiocianato no plasma é de 14 dias. Esta determinação se for comparada à da carboxihemoglobina é mais conveniente para identificar um fumador que tenha estado largas horas sem fumar. Alguns autores afirmaram
que para avaliar a exposição de um indivíduo ao fumo do tabaco, essa avaliação era mais correcta sempre que eram feitas juntamente no mesmo indivíduo a determinação da carboxihemoglobina no sangue e a do tiocianato no plasma. No entanto, o aumento dos níveis destes dois parâmetros nos fluidos biológicos, carboxihemoglobina e tiocianato, não é específico de indivíduos fumadores, há pois outros factores para além do fumo do tabaco, que vão afectar os níveis destes dois parâmetros. O monóxido de carbono, aparece aumentado no sangue sempre que se esteja em presença de uma combustão incompleta. É o que sucede por exemplo nas próprias habitações quando existem aquecedores ou esquentadores a gás, e nas ruas de grande tráfego, devido ao monóxido de carbono libertado, conjuntamente com os gases de escape dos veículos automóveis. Se excluirmos o tabaco, os factores que podem aumentar os níveis de tiocianato no organismo são, para além do tipo de alimentação do indivíduo, a exposição industrial a cianetos e ao acrilonitrilo.
Há ainda outros dois parâmetros que estão relacionados com o consumo de tabaco e que são susceptíveis de serem analisados nos fluidos biológicos. Trata-se da nicotina e de um seu metabolito, a cotinina. A nicotina, alcalóide constituinte do tabaco, pode ser encontrada na urina e sangue de fumadores, e de não-fumadores no caso de estes frequentarem ambientes em que se fuma. A nicotina depois de absorvida é metabolizada no organismo dando origem a vários metabolitos, sendo a cotinina o principal. Só cerca de 10% da dose absorvida de nicotina é excretada sem sofrer metabolização. A restante nicotina é rapidamente metabolizada, tendo uma semi-vida plasmática de menos de 30 minutos. Uma vez que a velocidade de biotransformação da nicotina é tão rápida, a determinação de um metabolito com uma semi-vida mais longa, tal como acontece com a cotinina, poderia ser mais vantajosa em estudos epidemiológicos do que a própria nicotina. Foi então desenvolvida uma técnica de radioimunoensaio para a nicotina e também para a cotinina, permitindo a análise destes parâmetros em extractos de tecidos e fluidos do organismo até níveis da ordem das picomoles. Em ensaios de rotina, a nicotina pode ser determinada por espectrofotometria no ultra-violeta. A nicotina e a cotinina também podem ser determinadas por cromatografia gasosa utilizando diversos tipos de detectores.
Ião tiocianato – indicador biológico de exposição ao tabaco
O ião tiocianato é um constituinte normal dos tecidos e fluidos dos mamíferos. Os níveis de tiocianato no organismo podem variar dependendo da quantidade do ião e seus ésteres existentes na dieta, e de outros compostos precursores tais como cianetos, nitrilos e isotiocianatos. Como exemplo de alimentos que vão originar um aumento nos níveis de tiocianato no organismo temos, nabo, rábano, alho, couve e amêndoas, entre outros. É por esta razão que os indivíduos vegetarianos apresentam níveis de tiocianato ligeiramente superiores aos não-vegetarianos, sendo no entanto este aumento inferior ao observado em fumadores.
Nos indivíduos fumadores, a concentração de tiocianato nos fluidos biológicos está mais elevada como consequência da existência de pequenas quantidades de cianeto de hidrogénio no fumo do tabaco.
Depois de absorvido pelo organismo, o cianeto vai sofrer uma biotransformação: cerca de 80% da dose absorvida vai ser destoxificada através da conversão a tiocianato, por intermédio da rodanase, uma enzima existente no fígado.
Visto o tiocianato ter menos de 1% da toxicidade do cianeto, a reacção catalisada pela rodanase, pode ser considerada uma verdadeira reacção de destoxificação. O tiocianato é por fim excretado pela urina. O restante cianeto segue outras vias menores, incluindo excreção pulmonar do próprio cianeto de hidrogénio. A semi-vida do cianeto de hidrogénio é de 44-66 horas.
Métodos de doseamento do ião tiocianato em fluidos
biológicos
Há diversos métodos que doseiam o ião tiocianato nos fluidos biológicos. Os métodos colorimétricos usados para a determinação do tiocianato baseiam-se em dois princípios diferentes: no “MÉTODO DE ALDRIDGE”, cianeto e tiocianato são convertidos em brometo de cianogénio pela adição de água de
bromo, obtendo-se depois um complexo corado entre o brometo de cianogénio e uma mistura de cloreto de piridina-benzidina.
No “MÉTODO DE BOWLER”, o tiocianato em filtrados de soro desproteinizado, reage com o nitrato férrico dando origem ao tiocianato férrico, que tem elevada absortividade. No “ MÉTODO DE WILLIAM BUTTS”é desenvolvida no Autoanalyer uma técnica baseada numa adaptação e melhoramento da reacção do nitrato férrico com o tiocianato. No “MÉTODO DE BRABANDER E VERBEKE” faz-se a determinação do tiocianato em tecidos e fluidos biológicos de animais por cromatografia gasosa. No “MÉTODO DE LUNDQUIST” faz-se o doseamento do tiocianato em fluidos biológicos, baseado na grande afinidade do ião tiocianato para uma resina aniónica francamente básica (Lewatit MP 7080). É através da resina que o tiocianato é separado dos outros constituintes da amostra biológica e doseado por intermédio de uma nova modificação à reacção de König, em que o hipoclorito de sódio é usado como halogenante e o ácido barbitúrico como agente ligante. Este método não é específico do tiocianato pois o cianeto e alguns antibióticos interferem. No entanto, se pretendermos a eliminação destes interferentes podem ser incluídos alguns passos adicionais, passos estes que não são normalmente utilizados em análises de rotina porque a concentração de cianeto no soro e urina é tão baixa que não justifica (Tabela seguinte). Uma vantagem desta técnica é que o soro não precisa de ser desproteinizado.
NÃO FUMADORES FUMADORES
Cianeto (µg/mL) Tiocianato (µg/mL) Cianeto (µg/mL) Tiocianato (µg/mL) Plasma 0,004 1-4 0,006 3-12 Urina 0,067 1-4 0,174 7-17
Níveis de cianeto e de tiocianato no plasma e urina de indivíduos fumadores e não-fumadores.
A técnica que os alunos irão executar na aula prática é uma modificação do método de ALDRIDGE e vai ser seguidamente apresentada.
Doseamento espectrofotométrico do tiocianato em fluidos
biológicos
Como foi referido anteriormente, há várias técnicas que doseiam o tiocianato no soro, urina e saliva, sendo algumas delas mais rápidas, sensíveis e precisas, mas exigindo outro tipo de aparelhagem. A técnica escolhida para ser executada na aula prática é uma técnica colorimétrica que necessita de um espectrofotómetro com registador e apresenta várias vantagens: é uma técnica rápida, pouco dispendiosa e aceitável para análise de rotina.
Metodologia a utilizar na aula prática
A técnica a ser utilizada na aula prática é uma técnica colorimétrica que utiliza uma modificação, que consiste na substituição da benzidina, uma amina carcinogénica, pela p-fenilenodiamina tal como foi sugerido por “Bark e Higson”. A natureza da reacção é tal que tanto o tiocianato como o cianeto reagem para dar origem à formação do complexo corado. O tiocianato, assim como no cianeto vão regir com o bromo, obtendo-se o brometo de cianogénio. Este reage com a piridina originando um aldeído glutacónico, que se vai posteriormente ligar à amina primária, a p-fenilenodiamina, formando um composto corado. A absorvência desta solução é depois medida espectrofotometricamente, uma vez que é proporcional à concentração de composto. O arsenito de sódio tem como função remover o excesso de bromo.
KSCN + 4 Br2 + 4H2O CNBr + 6HBr + H2SO4 + KBr
HCN + Br2 CNBr + HBr
CNBr + Mistura Piridina/p-fenilenodiamina Complexo Corado
As leituras no espectrofotómetro são medidas num comprimento de onda conhecido como sendo o ponto isosbéstico para esta reacção.
Fig.1 – Determinação do ponto isosbéstico, a partir de soluções padrão de tiocianato.
Este comprimento de onda é determinado por análise qualitativa da reacção corada no espectrofotómetro, registando os vários espectros de absorção com diferentes concentrações de soluções-padrão e a diferentes tempos.
A leitura das absorvências é depois feita no comprimento de onda previamente determinado, sendo necessário determiná-lo novamente sempre que forem feitos novos reagentes. Estas leituras devem ser feitas, entre o 5º e o 15º minuto após a adição do reagente.
Contribuição do cianeto existente no plasma e urina para a reacção
colorimétrica
Geralmente, a relação molar existente entre o tiocianato e o cianeto no plasma sanguíneo é de 50 de tiocianato para 1 de cianeto. Para além deste facto, quando o cianeto é adicionado ao plasma in vitro é pouco estável se
permanecer à temperatura ambiente. Assim sendo, a contribuição do cianeto para a intensidade de coloração desta reacção quando executada no plasma e em condições normais, deve ser insignificante, especialmente porque o processo envolve ainda uma diluição de 1 para 10.
Para reforçar o argumento de que é realmente muito pequena a quantidade de cianeto existente no plasma, basta referir que, nas várias técnicas descritas para dosear o cianeto no plasma, em todas elas encontramos um passo adicional comum e anterior à execução da técnica propriamente dita e que é uma concentração prévia do cianeto existente no plasma. No entanto em virtude da instabilidade comprovada do cianeto no plasma e devido a erros que se possam cometer durante o processo de concentração prévia, se a análise pretendida é realmente a determinação do cianeto, então há que actuar muito cuidadosamente aquando da realização dessa operação, ou então optar por fazer a análise no sangue inteiro em vez de plasma.
A excreção do cianeto pela urina é igualmente bastante baixa, e como a determinação do tiocianato na urina só é executada depois de feita uma diluição da amostra, pensa-se que devido a estas duas razões, o cianeto não contribui significativamente para a intensidade da coloração da reacção. Podemos então concluir que, só praticamente o tiocianato é calculado através desta técnica colorimétrica quando aplicada a amostras de sangue e urina.
