http://tede.mackenzie.br/jspui/bitstream/tede/3524/5/Tha%C3%ADs%20Terpins%20Ravache

Texto

(1)UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE Centro de Ciências Biológicas e da Saúde Programa de Pós-Graduação em Distúrbios do Desenvolvimento. Thaís Terpins Ravache. PAPEL DO ENRIQUECIMENTO AMBIENTAL NA RECUPERAÇÃO DOS PREJUÍZOS DA MEMÓRIA EM CAMUNDONGOS ARβ3KO. São Paulo 2018.

(2) Thaís Terpins Ravache. PAPEL DO ENRIQUECIMENTO AMBIENTAL NA RECUPERAÇÃO DOS PREJUÍZOS DA MEMÓRIA EM CAMUNDONGOS ARβ3KO. Exame de defesa de Doutorado apresentado ao programa de pósgraduação em Distúrbios do Desenvolvimento da Universidade Presbiteriana Mackenzie, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor.. Orientadora: Prof. Dra. Miriam Oliveira Ribeiro. São Paulo 2018.

(3) R252p. Ravache, Thaís Terpins. Papel do enriquecimento ambiental na recuperação dos prejuízos da memória em camundongos ARβ3KO / Thaís Terpins Ravache. 70 f. : il. ; 30 cm. Tese (Doutorado em Distúrbios do Desenvolvimento) – Universidade Presbiteriana Mackenzie, São Paulo, 2018. Orientadora: Miriam Oliveira Ribeiro. Bibliografia: f. 51-69.. 1. Memória. 2. Receptor adrenérgico β3. 3. Comportamento animal. 4. Enriquecimento ambiental. I. Ribeiro, Miriam Oliveira, orientadora. II. Título. CDD 153.12 Bibliotecária Responsável: Eliana Barboza de Oliveira Silva - CRB 8/8925.

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(5) AGRADECIMENTOS Agradeço à Universidade Presbiteriana Mackenzie e ao Centro de Ciências Biológicas e da Saúde por todo suporte cedido. A todos os professionais do programa de Distúrbios do Desenvolvimento pelas aulas e contribuições feitas para a construção da minha carreira e a CAPES pelo suporte financeiro. À minha orientadora Miriam Oliveira Ribeiro, por todos os momentos de ensinamentos, de elogios, de críticas e de dedicação. Aos meus amigos e colegas do Laboratório de Neurobiologia e Metabolismo Energético que foram grandes companheiros neste processo e me ajudaram na realização deste trabalho. Em especial agradeço a Fernanda Lorena e a Bruna Pascarelli por compartilharem tantos conhecimentos e pelo acolhimento e amizade. Também agradeço a Gabriela Gonçalves por me ajudar na realização deste projeto além de ter me ensinado a crescer profissionalmente. Aos companheiros do prédio 28 que em uma rotina laboratorial estressante adicionaram intervalos com café e risadas. Aos funcionários do biotério central e do prédio 28 por todo o apoio técnico e convivência. Agradeço aos meus pais Celia e Ricardo por todo o apoio dado e por nunca me deixarem desistir dos meus sonhos. Às minhas irmãs Paula e Andréa por permanecerem ao meu lado com um sorriso no rosto mesmo nos meus momentos mais difíceis. Também agradeço a todos os meus amigos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste projeto..

(6) RESUMO O processo de formação da memória é caracterizado por apresentar três estágios:. aprendizado,. consolidação. e. evocação.. Pode. também. ser. classificada de acordo com a sua duração: memória de curto e de longo prazo, e pelo seu conteúdo: explícita ou implícita. O hipocampo e a amígdala são estruturas fundamentais para o processamento da memória. A noradrenalina é um neurotransmissor que possui importante participação no processo de formação da memória, através dos receptores adrenérgicos do tipo α e β. São conhecidas três isoformas dos receptores do tipo β: β1, β2 e β3, que são expressos tanto no hipocampo como na amígdala e participam no processo de formação da memória. Estudos em mamíferos demonstram papel importante dos receptores β para consolidação de memória por meio de abordagens farmacológicas, modelos que apresentam críticas, pois fármacos apresentam especificidade limitada. O método de enriquecimento ambiental (EA) é muito utilizado como estratégia de melhora de habilidades cognitivas. No presente estudo, foi avaliada a influência do enriquecimento ambiental na memória em camundongos nocautes para o receptor adrenérgico β3 (ARβ3KO). Para tanto, padronizamos um protocolo de EA de 8 semanas de duração e avaliamos seu efeito sobre a formação de memória declarativa de curto e longo prazo, assim como também a ansiedade e capacidade locomotora por meio de testes comportamentais, tanto em animais jovens quando em animais adultos. Os resultados obtidos mostraram que o receptor adrenérgico β3 (ARβ3) tem importante participação no processo de formação da memória e o EA utilizado nos animais jovens reverte os déficits de memória dos ARβ3KO. Já nos animais adultos observamos uma piora na memória tanto de curto como de longo prazo dos animais ARβ3KO não submetidos ao EA, indicando que o envelhecimento e a falta do ARβ3 agravam os déficits de memória. Além disso, o protocolo de EA não foi eficiente para reverter os prejuízos na memória exibidos pelos ARβ3KO quando aplicado na idade adulta. Palavras-chaves: Memória, receptor adrenérgico β3, comportamento animal, enriquecimento ambiental..

(7) ABSTRACT Memory formation is divided in three moments: learning, consolidation and evocation and can be classified by its duration: short-term and long-term memory and its nature: explicit or implicit. The hippocampus and the amygdala are fundamental for memory formation. Noradrenaline is a neurotransmitter with important role in the memory formation that exert its effect through adrenergic receptors, α and β. There are three isoforms of β-adrenergic receptors: β1, β2 and β3, all expressed in the amygdala and hippocampus and they are involved in memory formation. Previous studies performed in mammal demonstrated important participation of β-adrenergic receptors in memory formation through pharmacological approaches, method that presents limitation due to poor agonists and antagonists specificity. The method of environmental enrichment (EE) can be used as a strategy to improve cognitive abilities. In the present study was evaluated the influence of environmental enrichment on memory of β3-adrenergic receptor knockout mice (ARβ3KO). Therefore, was standardized an 8-week EE protocol and through behavioral tests was evaluated short and long term declarative memory, as well as neuromotor dysfunction and anxious behavior, comparing ARβ3KO with FVB male mice at a young age and adulthood. The results showed that β3 adrenergic receptor (ARβ3) plays an important role in memory formation and the EE protocol used in this study in can reverse the memory deficits of ARβ3KO young mice. The ARβ3KO adult mice showed a worsening memory, both short and long-term memory, which indicates that aging and the absence of ARβ3 aggravate the memory deficits. Furthermore, the EE protocol was not effective to reverse memory impairments of ARβ3KO when applied in adulthood mice. Key-words: Memory, adrenergic receptor β3, animal behavior, environmental enrichment..

(8) LISTA DE ABREVIAÇÕES ACTH - hormônios adrenocorticotrópicos (do inglês Adrenocorticotropic hormone) AMPA - α-amino-3-hidroxi-5 metil-4 isoxazol propionato AMPc - adenosina monofosfato cíclico AR - receptor adrenérgico ATP - adenosina tri-fosfato CAMKII - Proteína Quinase Dependente de Cálcio-Calmodulina II (do inglês Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II) CRF - Fatores Liberadores de Corticotropina (do inglês Corticotropin-releasing Factor) CRH - hormônio liberador de corticotrofina (do inglês Corticotropin-releasing hormone) EA - enriquecimento ambiental GR - Receptor de Glicocorticóides (do inglês Glucocorticoid Receptor) iGluRs - Receptores Glutamatérgicos Ionotrópicos (do inglês Ionotropic Glutamate Receptor) KA - Cainato (do inglês kainate) LC - locus coerulus LTP - Potenciação de Longa Duração (do inglês Long-term Potentiation) mGluRs - Receptores Glutamatérgicos Metabotrópicos (do inglês Metabotropic Glutamate Receptor) MR - Receptor de Mineralocorticóides (do inglês Mineralocorticoid Receptor) NE - noradrenalina NMDA - N-metil-D-aspartato PKC - proteína quinase C (do inglês Protein Kinase C) P43 - Proteína 43 SNC - Sistema Nervoso Central.

(9) SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 1.1. Formação e consolidação da memória...................................................10 1.2. Papel da Noradrenalina e dos Receptores β-Adrenérgicos na Formação da Memória.....................................................................................15 1.3. Modelo Animal e Testes Comportamentais...........................................20 1.4. Enriquecimento Ambiental......................................................................22 2. JUSTIFICATIVA............................................................................................25 3. OBJETIVO 3.1. Objetivo Geral...........................................................................................26 3.2. Objetivos Específicos...............................................................................26 4. MÉTODOS 4.1. Animais e Enriquecimento Ambiental....................................................27 4.2. Delineamento Experimental 4.2.1. Estudo 1 - Efeito do EA em Camundongos Jovens...........................29 4.2.2. Estudo 2 - Efeito do EA em Camundongos Adultos..........................30 4.3. Testes Comportamentais.........................................................................30 4.3.1. Campo Aberto........................................................................................31 4.3.2. Labirinto em Cruz Elevado....................................................................32 4.3.3. Reconhecimento de Objetos................................................................33 4.3.4. Preferência Social..................................................................................34 4.3.5. Análise Estatística.................................................................................35.

(10) 5. RESULTADOS 5.1. Estudo 1 - Efeito do EA em Camundongos Jovens 5.1.1. Campo Aberto........................................................................................36 5.1.2. Labirinto em Cruz Elevado....................................................................37 5.1.3. Reconhecimento de Objetos................................................................37 5.1.4. Preferência Social..................................................................................39 5.2. Estudo 2 - Efeito do EA em Camundongos Adultos 5.2.1. Campo Aberto........................................................................................40 5.2.2. Labirinto em Cruz Elevado....................................................................42 5.2.3. Reconhecimento de Objetos................................................................43 5.2.4. Preferência Social..................................................................................44 6. DISCUSSÃO..................................................................................................45 7. CONCLUSÕES..............................................................................................50 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................51 ANEXO I............................................................................................................70.

(11) 1. INTRODUÇÃO 1.1. Formação e consolidação da memória A memória é um processo dependente da aprendizagem, já que no processo de aprendizado ocorre a aquisição de novas informações, enquanto que o armazenamento e evocação dos conhecimentos compõem a memória (IZQUIERDO et al., 2002). Desta forma o processo da memória pode ser dividido em 3 etapas: 1) Aprendizado/Aquisição que é o estágio em que a informação chega ao Sistema Nervoso Central (SNC) através da via sensorial por meio de estímulos tais como o olfato, a visão, a audição e o tato. Nesta etapa a informação está instável e pode sofrer interferências de outras memórias, drogas ou outros tratamentos (MCGAUGH, 1966; IZQUIERDO, 1989; MCGAUGH, 2000; IZQUIERDO, 2002); 2) Armazenamento/Consolidação na qual ocorre a formação da memória final após as interferências submetidas na aquisição; 3) Evocação, processo de recuperação da memória após a sua consolidação (JAMES, 1890; IZQUIERDO, 2002). Usualmente a memória é classificada pelo seu conteúdo e seu tempo de duração. A memória classificada pelo seu conteúdo pode ser do tipo declarativa ou explícita, que pode ser episódica quando envolve experiências pessoais ou semântica quando se dá a partir de fatos aprendidos. A memória também pode ser do tipo procedural ou implícita, que envolve procedimentos motores. A memória de trabalho decorre da manipulação da informação previamente consolidada, ou também da manutenção de alguma informação enquanto o indivíduo recebe e processa outros estímulos (KANDEL et al., 2000). Quanto ao tempo de duração, a memória pode ser classificada como de curto ou de longo prazo. A memória de curto prazo tem duração de no máximo 6 horas, tempo suficiente para que ocorra a sua evocação, e depois é descartada. Já a memória de longo prazo tem média de 6 horas para ser consolidada e pode ser preservada durante anos ou até mesmo toda a vida do indivíduo (IZQUIERDO, 2002; MAMMARELLA et al., 2012; MA, HUSAIN e BAYS, 2014).. 10.

(12) A consolidação da memória de longo prazo não depende da memória de curto prazo, estudos demonstram que é possível prejudicar um tipo de memória mantendo intacta a outra (IZQUIERDO et al., 1998a; IZQUIERDO et al., 1988b). A consolidação da memória em longo prazo implica em modificações na expressão gênica e na síntese protéica modificando sinapses e resultando na consolidação da memória, enquanto que na memória de curto prazo essas modificações não ocorrem (AGRANOFF et al., 1965; FREY et al., 1995; IZQUIERDO, 2002; MAMMARELLA et al., 2012; MA, HUSAIN e BAYS, 2014). Portanto, os mecanismos entre as memórias de curto e longo prazo são distintos e os processos são separados. Donald Hebb, em 1949, foi o primeiro a propor que a memória formada em mamíferos seria armazenada por sinapses mais eficientes entre neurônios ativados na fase de aprendizado, ou seja, quando dois neurônios pré e póssinápticos estão ativos, há um reforço no axônio do neurônio pós-sináptico. Esse processo resulta em modificações nas sinapses que é denominada de plasticidade sináptica. A partir desta hipótese, em 1973, foi descrita a primeira evidência para a possível base para a formação de memória de longo prazo, que foi denominada de Potenciação de Longa Duração (LTP, do inglês Longterm Potentiation) (Bliss e Lomo,1973). Neste trabalho os autores demonstram que um estímulo induz uma mudança eletrofisiológica que tem duração igual à de uma memória (BLISS e COLLINGRIDGE, 1993). O LTP foi observado através de um estímulo elétrico repetitivo no córtex entorrinal em um feixe de fibras que inerva o hipocampo, a via perforante. Após o estímulo repetido observou-se um aumento do potencial excitatório pós-sináptico com uma duração prolongada. Este experimento somado ao modelo proposto por Hebb fortalece a hipótese de que o aumento na atividade celular está implícito na formação da memória e aprendizado (BLISS e LOMO, 1973; TEYLER e DISCENNA, 1986; WIGSTRÖM et al., 1986; SQUIRE, 1992). O glutamato é o neurotransmissor que está intimamente ligado ao LTP. Duas famílias de receptores glutamatérgicos já foram caracterizadas; os ionotrópicos (iGluRs) e metabotrópicos (mGluRs). Quando o glutamato é liberado na fenda sináptica de neurônios que estão sendo estimulados liga-se a três iGluRs expressos na membrana do neurônio pós-sináptico: o AMPA (α11.

(13) amino-3-hidroxi-5 metil-4 isoxazol propionato), o NMDA (N-metil-D-aspartato) e o KA (cainato). O AMPA e o NMDA promovem a entrada de Na+ e de Ca++ e a saída de K+ no neurônio pós-sináptico, enquanto que o KA só é permeável a Na+ e a K+. Ainda hoje o papel do KA é pouco conhecido, pois as características entre o KA e o AMPA são muito parecidas, o que dificulta a separação de suas atividades em estudos com fármacos (IZQUIERDO et al.,1997; BEVILAQUA et al., 2005; IZQUIERDO et al., 2006; ALBERINI, 2008; HALL e GOOSH, 2008). O glutamato ao se ligar ao AMPA provoca uma despolarização da membrana do neurônio pós-sináptico pela entrada de Na+ e de Ca++ Logo após essa despolarização inicial ocorre o desbloqueio do NMDA através da dissociação do íon de Mg++, possibilitando que o glutamato se ligue ao seu sítio, ativando-o e assim permitindo também a entrada de Na+ e de Ca++ no citoplasma do neurônio pós-sináptico (CAMMAROTA et al., 1996; IZQUIERDO e MEDINA,1997; CAMMAROTA et al., 1998; IZQUIERDO, 2002) (Figura1). Com o aumento de Ca++ no neurônio pós-sináptico ocorre a ativação da cascata da proteína quinase dependente de cálcio-calmodulina II (CAMKII), que medeia a fosforilação dos receptores AMPA, aumentando a sua sensibilidade ao glutamato e também insere mais receptores AMPA na membrana do neurônio pós-sináptico. Com o aumento de ligações de glutamato nos receptores do tipo AMPA há a manutenção do LTP e com isso a consolidação da memória. Estudos demonstram que este aumento da atividade dos receptores AMPA pode durar horas, possibilitando a consolidação da memória de longo prazo (CAMMAROTA et al., 1998; CAMMAROTA et al., 2002; IZQUIERDO et al., 2006; IZQUIERDO et al., 2008). A proteína quinase C (PKC) também tem participação nesta fase, pois com o aumento de cálcio intracelular há a ativação da PKC que irá fosforilar o substrato pré-sináptico associado à proteína 43 (P43). A P43 está envolvida com a mobilização das vesículas de glutamato junto da membrana do neurônio pré-sináptico. Estudos demonstram que a inativação das enzimas CAMKII e PKC leva a um bloqueio na indução do LTP, indicando que essas enzimas auxiliam na regulação do LTP e por tanto na consolidação da memória 12.

(14) (MALINOW et al., 1989; MALENKA et al., 1989; O’DELL et al., 1991; CAMMAROTA et al., 1996; IZQUIERDO e MEDINA, 1997; CAMMAROTA et al., 1998; CAMMAROTA et al., 2002; BONINI et al., 2005; IZQUIERDO et al., 2006).. Figura 1: Ativação dos receptores glutamatérgicos ianotrópicos AMPA e NMDA, responsáveis pela indução do LTP (adaptado de MALENKA e NICOLL, 1999).. Nesta fase também ocorre a ativação de receptores mGluRs nas membranas pré e pós-sinápticas que regulam a atividade dos iGluRs. Os mGluRs ativam uma cascata enzimática nos neurônios pré e pós-sináptico que irá inativar os canais de cálcio dependentes de voltagem. Com a diminuição da entrada de cálcio nos neurônios, há também a interrupção na liberação de neurotransmissores glutamatérgicos e, por consequência, uma diminuição na excitabilidade neuronal. Desta forma, os mGluRs possuem papel oposto aos iGluRs e sua ação regula localmente a LTP e, portanto, a consolidação da memória (IZQUIERDO e MEDINA, 1997). Apesar da primeira descrição do LTP ter sido observada no giro denteado, estudos recentes observam o LTP em outras regiões, como CA1 no hipocampo e nas áreas basolateral e pré-frontal da amígdala. No entanto, 13.

(15) esses estudos ainda não são conclusivos e indicam que, apesar da existência de LTP nestas áreas, os seus mecanismos são distintos em cada região cerebral e não estão esclarecidos (HUANG e KANDEL, 1995; HUANG e KANDEL, 1996; BEVILAQUA et al., 1997; IZQUIERDO et al., 2006; MAROUN, 2006; HUANG e KANDEL, 2007). O hipocampo, o núcleo caudato e a amígdala estão envolvidos em diferentes aspectos na consolidação da memória. Como alternativa de métodos lesionando áreas cerebrais, muitas pesquisas utilizam anfetamina e lidocaína em diferentes áreas para uma melhor compreensão da consolidação da memória em cada área. Os efeitos da anfetamina decorrem da sua atividade estimulatória. liberando. principalmente. noradrenalina. e. dopamina. nas. terminações nervosas, e também diminui a recaptação de noradrenalina no neurônio, prolongando a sua ação e melhorando a consolidação da memória. Estudos mostram que a aplicação de anfetamina no núcleo caudato melhora a formação de memória no labirinto de água com as pistas visuais, enquanto que no hipocampo a anfetamina melhora a memória espacial. Já na amígdala há melhora tanto na memória espacial como no experimento com as pistas visuais (PACKARD e MCGAUGH, 1992; MCDONALD e WHITE, 1993; PACKARD et al., 1994; PACKARD e TEATHER, 1998; PACKARD e CAHILL, 2001). Por outro lado, a aplicação de lidocaína, um bloqueador de canais de Na+, no hipocampo bloqueia a formação de memória no labirinto com pistas visuais, mas não bloqueia a formação de memória visuo-espacial quando aplicada na amígdala. Desta forma, esses estudos indicam que a amígdala modula a consolidação da memória no núcleo caudato e hipocampo, mas não é uma área crítica na formação destes tipos de memória (PACKARD e MCGAUGH, 1996; PACKARD e TEATHER, 1998; PACKARD e CAHILL, 2001). Estudos indicam que o hipocampo está envolvido com a recuperação da informação. espacial e. contextual. (HIRSCH,. 1974;. SQUIRE,. CLARK,. KNOWLTON, 2001). A inativação do hipocampo de ratos através de antagonistas. do. receptor. glutamatérgico. AMPA/cainato. ou. agonistas. GABAérgicos, prejudica na evocação da memória espacial no labirinto de água e em tarefas contextuais de medo condicionado (HOLT e MAREN, 1999; 14.

(16) RIEDEL et al., 1999). E com a utilização de agonistas de receptores de glicocorticóides no hipocampo em tarefa de retenção, há um prejuízo na evocação da memória espacial dos ratos (ROOZENDAAL et al., 2003; ROOZENDAAL et al., 2004).. 1.2. Papel da Noradrenalina e dos Receptores β-Adrenérgicos na Formação da Memória Outros. neurotransmissores. apresentam. papel. no. processo. de. consolidação da memória, tais como a adrenalina e noradrenalina (NE) (MCDONALD e WHITE, 1993; IZQUIERDO e MEDINA, 1997; CAHILL e MCGAUGH, 1998; MCGAUGH, 2004; LU, PANG e WOO, 2005). No SNC a NE é sintetizada pelo locus coerulus (LC), que é considerado um dos principais centros noradrenérgicos do SNC, pois emite projeções axonais que atingem desde o bulbo olfatório até a medula espinhal (Figura 2) (MAEDA, 2000). A NE é formada a partir da dopamina através da ação da enzima β-hidroxilase nas vesículas sinápticas dos neurônios noradrenérgicos e é secretada pelo LC. A secreção de NE. é baixa durante o sono e, ao acordar, sua liberação é. aumentada e se mantém alta ao longo do dia, participando do processo de aquisição e consolidação da memória. A NE também tem participação na facilitação de formação da memória a partir de estímulos com valência emocional, como em situações de aumento do estado de atenção, quando a liberação de NE atinge seus níveis mais altos (LIDDELL et al., 2005; SAMUELS e SZABADI, 2008; BERRIDGE, SCHMEICHEL e ESPAÑA, 2012; SARA e BOURET, 2012). Os receptores adrenérgicos (AR) estão presentes em todos os mamíferos e são encontrados em diversos tecidos, como tecido adiposo, brônquios, vasos no músculo liso, coração e encéfalo. Apesar desses receptores serem reconhecidos pelo seu importante papel em certos processos fisiológicos, tais como o metabolismo energético, funcionamento cardíaco e contrações da musculatura lisa, estudos mais recentes indicam que os AR apresentam participação no processo de consolidação da memória.. 15.

(17) Os receptores adrenérgicos são classificados em tipo α1, α2, β1, β2 e β3. Os receptores α1 são pós-sinápticos e são positivamente acoplados à proteína G ativando fosfolipase C. Já os α2 são pré e pós-sináptico e é um dos principais inibidores da adenilciclase. Os receptores adrenérgicos do tipo β (ARβ) também são positivamente acoplados a proteína G e a enzima adenilciclase catalisa a conversão da adenosina tri-fosfato (ATP) em adenosina monofosfato cíclico (AMPc). O AMPc irá ativar proteínas quinases dependentes de AMPc, que são responsáveis por fosforilação, possibilitando a amplificação dos sinais e geração de respostas farmacológicas (KRAUSE et al., 1996; VATNER et al., 2000).. Figura 2: Via noradrenérgica no córtex (adaptado de BREEDLOVE et al, 6ª ed.).. Diversos estudos mostram que os três tipos de ARβ são encontrados na amígdala e no hipocampo, sendo o ARβ1 encontrado nas regiões hipocampais CA1 e CA3 e em pouca quantidade no giro denteado. Os ARβ2 e ARβ3 são encontrados em quase todas as regiões do hipocampo e também na amígdala; sendo o ARβ3 também presente no córtex entorrinal (SUMMERS et al., 1995; HILLMAN et al., 2005; COX et al., 2008). A expressão destes receptores no hipocampo e na amígdala sugerem que eles podem estar envolvidos nos processos de memória e aprendizado. 16.

(18) Estudos mostram que o isoproterenol, agonista para os ARβ1 e ARβ2, no hipocampo in vivo aumenta a plasticidade neural nas regiões CA1, CA3 e no giro denteado, enquanto que o propranolol, antagonista dos ARβ1 e ARβ2, bloqueia a LTP no CA1 e no giro denteado (STRAUBE et al., 2003; KEMP e MANAHAN-VAUGHAN, 2008; HAGENA e MANAHAN-VAUGHAN, 2012; GOH e MANAHAN-VAUGHAN, 2013; HANSEN e MANAHAN-VAUGHAN, 2015). Os ARβ também atuam na região CA1 do hipocampo e o córtex entorrinal, utilizando experiências emocionais para a formação de memória de longo prazo. Desta forma, podemos imaginar que os ARβ possuem papel importante na consolidação da memória de longo prazo no hipocampo, mediando vias sinalizadoras e cascatas intracelulares que alteram a plasticidade e excitabilidade neuronal durante o processo de formação da memória (MCGAUGH, 1989; IZQUIERDO et al., 1998a; HATFIELD, SPANIS e MCGAUGH, 1999; IZQUIERDO, 2002; MCGAUGH, 2004; CAMMAROTA et al., 2008). Na amígdala, os ARβ influenciam positivamente na memória emocional de longo prazo. Em estudos que utilizam agonistas destes receptores em ratos, há melhora na formação da memória; enquanto que com o uso de antagonistas como o propranolol, há um efeito impeditivo da consolidação da memória (LIANG, 1986; IZQUIERDO, 1992; FERRY e MCGAUGH, 1999). Outros estudos sugerem que a via β-adrenérgica também possui papel modulando vias que diminuem a atividade neuronal ou aumentam os sistemas inibitórios, como as vias GABAérgica e peptidérgica opióide. O bloqueio da formação da memória pelo uso do agonista do GABA, o muscimol, é prevenido pelo tratamento concomitante com o clenbuterol, um agonista do ARβ2 (INTROINI-COLLISON et al., 1995; HATFIELD, SPANIS e MCGAUGH, 1999). Um estudo feito com cultura de astrócitos de galinha e agonistas dos ARβ2 e ARβ3 sugere que os ARβ aumentam a captação de glicose nos neurônios e assim melhoram a consolidação da memória. Neste estudo eles observaram que ao estimular os ARβ2 com zinterol ocorre captação de glicose pelos neurônios após 2 horas da estimulação, enquanto que a ativação dos ARβ3 pelo CL 316243 leva ao aumento da captação de glicose 5 minutos após a estimulação e tem efeito mais duradouro. Em conjunto esses dados sugerem 17.

(19) que as duas isoformas aumentam a disponibilidade de glicose através de mecanismos distintos (GIBBS, HUTCHINSON e SUMMERS, 2008). A liberação da NE pelo LC também é modulada pela sinalização periférica pela glândula adrenal. A liberação da NE dependente da sinalização periférica e ocorre em situações de stress em que há primeiramente ativação do hipotálamo ativa o sistema nervoso autônomo levando à liberação adrenalina (80%) e noradrenalina (20%). A NE e a adrenalina liberadas irão ativar os receptores adrenérgicos que se encontram nas projeções do nervo vago para o núcleo do trato solitário que, por sua vez possui projeções diretas para a amígdala e também para o LC (HERMAN e CULLINAN, 1997; NINAN, 1999). Apesar do stress moderado participar na melhora da consolidação da memória, estudos mostram que em situações em que o stress é agudo pode ocorrer um bloqueio na consolidação da memória. Por exemplo, em teste de memória espacial ao longo de 3 dias, roedores submetidos ao contato com predadores antes do início e ao final do teste erraram mais nas tarefas de aprendizado e não consolidaram a memória espacial de curto e de longo prazo. Assim estudos que utilizam situações de stress agudo mostram que há prejuízo na formação da memória de curto e longo prazo e também no processo de aprendizagem (KIRSCHBAUM et al., 1996; PARK et al., 2008). O papel dos ARα1 e ARα2 na consolidação da memória foi demonstrado pela estimulação do receptor α1 e com o antagonismo do receptor α2. Nesta situação há um estímulo na consolidação da memória de longo prazo (FERRY et al., 1999; CAMMAROTA et al., 2008; SARA, 2009). Segundo McGaugh (2004) o efeito dos receptores tipo α1 provavelmente dependem da interação com os receptores do tipo β na formação da memória, pois já foi demonstrado que o antagonismo do ARα1 juntamente com o agonismo do ARβ2 foi prejudicam a consolidação da memória (GIBBS, HUTCHINSON e SUMMERS 2008). Os ARα2 apresentam respostas distintas dependentes da sua localização. Nos neurônios pós-sinápticos o ARα2 é excitatório atuando 18.

(20) positivamente na memória de trabalho no córtex pré-frontal (CARLSON e GANN, 1992; ARNSTEN et al., 1997). Já a ação do ARα2 do neurônio présináptico é inibitória, pois tem efeito antagônico aos receptores β-excitatórios, ou seja, os ARα2 inibem a produção de adenilciclase que por consequência não formará o AMPc e, portanto, o PKA. Os ARα2 inibem a liberação de noradrenalina através de sua ligação a este receptor no neurônio pré-sináptico, sendo um mecanismo de retroalimentação auto-inibitório (STARKE et al., 1989; BYLUND e RAY-PRENGER, 1989). Outra situação em que se observa a importância dos AR é na doença de Alzheimer em que ocorre perda seletiva de neurônios e, entre eles, os neurônios noradrenérgicos do LC. Nos estágios iniciais da doença de Alzheimer observa-se mudanças nestes neurônios, tais como o acúmulo da proteína tau hiperfosforilada que se degrada liberando fragmentos insolúveis que se enovelam e depositam-se dentro das células hipocampais e do córtex, dificultando a comunicação entre eles. Além disso, com a progressão da doença há perda dos neurônios noradrenérgicos e por consequência mudanças anatômicas das redes de comunicação dos mesmos e na expressão dos AR como possível mecanismo compensatório (HENEKA et al., 2006; GRUDZIEN et al., 2007; BRAAK e DEL TREDICINI, 2012). Apesar de estudos relacionarem a perda de neurônios do LC e a consequente redução na sinalização noradrenérgica com a perda de memória e ansiedade, o seu papel ainda não está claro ao longo do curso da doença de Alzheimer. , No entanto, estudos em pacientes humanos e em modelos animais, sugerem que a perda dos neurônios noradrenérgicos agrava o avanço da doença de Alzheimer (HENEKA et al., 2006; GRUDZIEN et al., 2007; KALININ et al., 2007; GANNON et al., 2015). Em um estudo feito em humanos com doença de Alzheimer foi mensurada a quantidade de noradrenalina no plasma quando os indivíduos estavam vivos, e no encéfalo após a morte durante a autópsia. Embora os níveis plasmáticos de noradrenalina estivessem normais, havia déficit no tecido cerebral (RASKIND et al., 1984). Outros estudos in vitro com tecido cerebral de camundongos com doença de Alzheimer indicam que a NE age também como agente anti-inflamatório reduzindo a toxicidade neural da amilóide e regulando 19.

(21) negativamente os genes de inflamação nos astrócitos e micróglia (FEINSTEIN et al., 2002; HENEKA et al., 2010). Estudos utilizando agonistas e antagonistas dos AR indicam que a ativação dos ARα2 inibe o crescimento da placa β-amilóide, enquanto que a ativação dos ARβ2 aumenta o crescimento da placa. Além disso, a terbutalina, um agonista para ARβ2, corrige a inibição da LTP induzida pela presença da placa β-amilóide. A utilização do CL316243, um agonista do ARβ3, em galinhas resgata as memórias que foram perdidas devido à formação da placa βamilóide (WANG et al., 2009; GIBBS et al., 2010). Os diversos estudos que mostram a importância da via β-adrenérgica foram feitos utilizando agonistas e antagonistas específicos para os Arβs, que reduz a precisão dos resultados obtidos já que agentes farmacológicos não apresentam alta especificidade (MERSMANN, 1998; JIMENEZ et al., 2002). Desta forma, apesar do conhecimento acumulado sobre a influência das vias noradrenérgicas na aquisição e consolidação da memória, seu papel na cognição ainda não está totalmente elucidado.. 1.3. Modelo Animal e Testes Comportamentais O uso de modelos animais em estudos na área da saúde proporciona uma investigação mais rápida e elaborada ao compararmos com estudos em seres humanos (LYNETTE, 1998; FAGUNDES e TAHA, 2004; KAC, 2002). William Harvey (1616) foi um dos pesquisadores pioneiros no uso de animais como modelo em seus estudos de reprodução animal e circulação sanguínea depois dele muitos outros estudiosos passaram a utilizar modelos animais, como Edward Jenner (1765) que utilizou gado para testar as suas hipóteses de vacinação; Antoine Lavoisier (1772) que usou camundongos para estudar a fisiologia da respiração; e Louis Pasteur (1886) que utilizou macerado de cérebro de cachorro raivoso para testar a imunização da raiva. Um animal para se tornar modelo de estudo necessita ter características suficientes para. 20.

(22) ser semelhante ao objeto imitado e ter a capacidade de ser manipulado sem as limitações do mesmo objeto (SALÉN, 1995; FAGUNDES e TAHA, 2004). Os roedores são o modelo animal mais utilizado na pesquisa ultimamente, dentre eles os camundongos participam em mais de 90% destes estudos em todo o mundo. O camundongo possui desenvolvimento, fisiologia, comportamento e doenças semelhantes aos seres humanos. Possui também cerca de 99% dos genes homólogos aos dos seres humanos, com aproximadamente. 342. regiões. conservadas. entre. eles.. Levando. em. consideração estes fatos, os camundongos são definidos como uma primeira via para definir e estudar funções fisiológicas e genéticas em mamíferos (O’BRIEN e WOYCHICK, 2002; AUSTIN et al., 2004; CHAMPY et al., 2008). As primeiras técnicas de transgenia animal desenvolvidas para nocautear um gene, foram feitas na década de 80 pelo cientista Martin Evans e, atualmente, ratos e camundongos nocautes são muito utilizados na pesquisa científica para obter uma melhor compreensão do papel fisiológico de um determinado gene no organismo (GOLDSTEIN, 2001; PESQUERO et al., 2002). Os primeiros indícios de estudos de comportamento animal datam de mais de 2000 anos atrás, e visavam a compreensão da anatomia, reprodução e origem desses animais. Charles Darwin, no século XIX, descrevia em seus trabalhos a importância do estudo do comportamento animal para uma melhor compreensão do comportamento humano (VIEIRA, 2005; ZUANON, 2007). A definição de comportamento segundo Kandel (1976) é a resposta do organismo estimulada por fatores externos, ou seja, a partir do momento em que há uma mudança ambiental, o cérebro irá processar este estímulo gerando uma atividade motora. Porém, sabe-se hoje que, nem todas as respostas a um estímulo são relacionadas com movimentos, desta forma podemos definir o comportamento como uma resposta motora ou de secreção induzida por estímulos no ambiente externo e interno do organismo (COSTA, 2002). O comportamento varia entre as espécies, ou seja, para cada estímulo há uma. 21.

(23) reação diferente, distinguindo as atividades endócrinas e neuronais em resposta a um mesmo estímulo (KANDEL et al., 1995; KANDEL et al., 2000).. 1.4. Enriquecimento Ambiental O Enriquecimento Ambiental (EA) é uma técnica que visa o bem-estar psicológico e fisiológico do animal e tem como objetivo principal oferecer ao animal em cativeiro condições que estimulem o seu comportamento natural (SHEPHERDSON et al., 1998). Esta técnica foi primeiramente reconhecida por Yerkes (1925) e posteriormente por Hediger (1950) que reconheceram a importância física e social de um ambiente e o seu impacto no bem-estar de um animal em cativeiro, sendo hoje muito utilizada em zoológicos e aquários, e atestada por diminuir comportamentos estereotipados, aumentar a motivação do animal e tornar o comportamento do animal mais próximo ao natural, visando às necessidades da sua espécie (SHEPHERDSON et al., 1998; MELLEN e MACPHEE, 2001). As técnicas de EA podem ser divididas em 5: 1) Enriquecimento físico, em que há a introdução de materiais no recinto que estimulam atividades em seu ambiente natural, como a introdução de tocas e túneis; 2) Enriquecimento Sensorial, que consiste na estimulação dos sentidos do animal, ou seja, introdução de ervas para estimular o olfato e apresentação de objetos com diferentes texturas para estimular o tato; 3) Enriquecimento Cognitivo, atividades em que o animal necessita solucionar um problema, por exemplo pendurar uma banana através de um barbante no teto da gaiola irá exigir certa manipulação do animal para solucionar o desafio e então chegar ao prêmio; 4) Enriquecimento Social, os animais podem ser submetidos a interagir com outras espécies ou somente o aumento do número de animais da mesma espécie em um mesmo recinto irá aumentar a colônia e consequentemente influenciará na hierarquia social estabelecida; 5) Enriquecimento Alimentar, que consiste em alterações na própria dieta do animal, como também na frequência, no tempo e o tipo de manipulação que o alimento pode ser. 22.

(24) oferecido (VAN PRAAG et al., 2000; MELLEN e MACPHEE, 2001; ZIMMERMANN et al., 2001). Apesar do uso do EA delinear o bem-estar animal e diminuir o stress em ambientes de cativeiro, otimizando as condições ambientais e de vivência do animal, hoje muitos estudos tem utilizado o EA como estratégia de investigação de habilidades cognitivas. Em estudos em que animais são submetidos ao EA têm demonstrado benefícios cognitivos tanto em animais saudáveis quanto em animais enfermos, sendo estes jovens e/ou idosos. No início dos estudos de EA, na década de 60, foi observado maior peso cerebral e maior espessura do córtex em animais tratados com EA, e em estudos mais recentes esses animais apresentam mudanças moleculares e morfológicas cerebrais, tais como neurogênese, aumento da densidade sináptica e liberação de fatores neurotrópicos, e essas alterações resultam na melhora do aprendizado e memória (DIAMOND, 2001; WURBEL et al., 2001; LEGGIO et al., 2005; AMARAL et al., 2008; SEGOVIA et al., 2009). O EA tem sido muito utilizado para análise do desenvolvimento cerebral em roedores, e hoje muitos estudos, utilizando ratos e camundongos, observaram um aumento da neurogênese, crescimento e ramificações dendríticas, do mRNA do NGF e do LTP no hipocampo (GREEN et al., 1983; TORASDOTTER et al., 1996; KEMPERMANN et al., 1997; TORASDOTTER et al., 1998; NILSSON et al., 1999; RAMPON, 2000; DUFFY et al., 2001). Estes resultados indicam uma melhora no aprendizado e na consolidação da memória. Muitos estudos com modelo animal para a doença de Alzheimer utilizam o EA para uma melhor compreensão deste quadro. Wolf e colaboradores (2006) utilizaram um modelo de camundongo transgênico para a doença de Alzheimer e mostraram melhora na consolidação da memória e aprendizado devido ao melhor desempenho destes animais em testes comportamentais. Neste estudo também foi observado no hipocampo um aumento de novos neurônios imaturos no giro denteado e na produção de fatores neurotróficos, como o BDNF, de camundongos jovens quando comparados ao grupo controle do mesmo modelo sem EA. Outros estudos, também utilizando modelos de 23.

(25) camundongos para a doença de Alzheimer, mostram um aumento no número de neurônios maduros e imaturos no hipocampo em animais com EA comparados ao grupo do mesmo modelo em condições padrão (MIROCHNIC et al., 2009; HERRING et al., 2009).. 24.

(26) 2. JUSTIFICATIVA Sabemos que a via noradrenérgica é de fundamental participação no processo de formação da memória. No entanto, estudos anteriores se utilizaram de fármacos para investigar esta via, o que pode levar à resultados não muito precisos pela especificidade relativa dos agonistas e antagonistas. E o enriquecimento ambiental tem sido foco de estudos por representar processo de intervenção para melhorar os prejuízos na memória observada em indivíduos com demência e doença de Alzheimer. Assim, a fim de melhor compreender os mecanismos envolvidos nesse processo, utilizaremos o enriquecimento ambiental em animais nocautes para ARβ3 para melhorar o déficit na formação da memória observada nesses animais, já que em estudos anteriores em nosso laboratório observamos que animais nocautes para o ARβ3 possuem prejuízos na consolidação da memória. .. 25.

(27) 3. OBJETIVO 3.1. Objetivo Geral O objetivo do nosso estudo foi avaliar se o enriquecimento ambiental seria capaz de corrigir o prejuízo na consolidação da memória observada em camundongos com nocaute para os receptores adrenérgicos do tipo β3.. 3.2. Objetivos Específicos  Avaliar a capacidade de o enriquecimento ambiental corrigir o prejuízo na consolidação da memória de camundongos nocautes para o receptor adrenérgico do tipo β3 quando aplicado em animais jovens.  Avaliar a capacidade de o enriquecimento ambiental corrigir o prejuízo na consolidação da memória de camundongos nocautes para o receptor adrenérgico do tipo β3 quando aplicado em animais adultos.. 26.

(28) 4. MÉTODOS 4.1. Animais e Enriquecimento Ambiental No presente estudo foram utilizados camundongos machos nocautes para o receptor β-adrenérgico do tipo 3 (ARβ3KO) e camundongos selvagens da linhagem FVB como grupo controle. Os camundongos ARβ3KO e FVB são procedentes de colônia já estabelecida do Biotério Central da UPM. Os animais ARβ3KO e FVB foram divididos em grupos submetidos ao EA e grupos controle sem EA. Os animais não submetidos ao EA foram mantidos no Biotério Central da UPM, em gaiolas padrão forradas com maravalha, com no máximo 5 animais, em estante ventilada (23±2ºC), ciclo de luz claro/escuro de 12h (7h-19h) e comida e água ad libitum (Figura 3A). Os animais submetidos ao EA ficaram em gaiolas de dois andares (57x31x41cm), forradas com maravalha, em estante ventilada, com ciclo de luz de 12 horas e temperatura de 23±2°C. Cada gaiola teve no máximo 8 animais, com comida e água ad libitum e casa para refúgio em ambos os andares (Figura 3B).. Figura 3: Gaiola padrão (A) e gaiola utilizada no protocolo de enriquecimento ambiental (B).. O protocolo de EA foi padronizado em nosso laboratório (adaptado de SIMPSON e KELLY, 2011; HÜTTENRAUCH, SALINAS e WIRTHS, 2016) e constituiu em intervenções duas vezes por semana durante 8 semanas, com 27.

(29) atividades estimulatórias sensorial, cognitiva, e alimentar e de mudanças físicas no ambiente (Tabela 1). Estas atividades ocorreram na mesma estante ventilada em que permaneceram e com duração em média de 1 hora. O cronograma de atividades foi igual e de mesma ordem para todos os grupos. Após as 8 semanas de EA iniciamos os testes comportamentais. Os animais permaneceram nas gaiolas de enriquecimento ambiental, porém não houve intervenções com atividades estimulatórias. Tabela 1: Cronograma do Enriquecimento Ambiental Semanas. Enriquecimento Enriquecimento 1 2. Primeira. Ambientação com o novo recinto.. Segunda. Colocar algodão de diferentes tamanhos em um andar do recinto. Duração: 4-5 horas. Terceira. Gelo em pote com e sem água. Duração: 1 hora. Quarta. Quinta. Sexta. Sétima. Oitava. Cenoura em diferentes tamanhos. Duração: 4-5 horas Trilha com tempero (orégano, erva cidreira ou camomila) no andar inferior. Duração: 2 horas Colocar 2 novas tocas feitas de rolo de papelão, posicionadas uma por andar. Colocar espelho em um dos andares. Duração: 15 minutos em cada andar Colocar maravalha suja de rato em pontos de foco no andar inferior da gaiola. Duração: 1 hora. Salada de frutas (banana, maçã, uva). Duração: 5-6 horas Esconder fruta de preferência em caixa com maravalha. Duração: 4-5 horas Colocar folhas de jornal em um andar do recinto. Duração: 5-6 horas Bolinhas plásticas em caixa com maravalha. Duração: 3-4 horas Arroz integral cozido. Duração: 3-4 horas. Pendurar bananamaçã com barbante no teto da gaiola. Duração: 2-3 horas Gelatina incolor com uvas-passas em cantos opostos no andar inferior. Duração: 3 horas Potes com água fria e natural com cenoura, milho e ervilha congelados. Duração: 2-3 horas. 28.

(30) Este projeto foi dividido em dois estudos para compreender a influência do EA conforme os diferentes períodos de vida do camundongo com relação a idade humana. Todos os procedimentos foram apresentados e aprovados pelo Comitê de Ética da UPM (processo CEUA/UPM Nº 156/02/2017) (Anexo I).. 4.2. Delineamento Experimental 4.2.1. Estudo 1 - Efeito do EA em Camundongos Jovens Neste estudo os animais foram transferidos para a gaiola de EA logo após o desmame, aos 21 dias de idade e os testes comportamentais tiveram início aos 85 dias de idade (Figura 4). Desta forma a idade equivalente para o ser humano neste estudo seria de 4,5 meses de idade para o início do EA e de 24,29 anos de idade para o início dos testes comportamentais (DUTTA e SENGUPTA, 2016). Os animais estudados foram divididos nos seguintes grupos:  Grupo 1 Controle sem EA (n=7) animais selvagens FVB;  Grupo 2 ARβ3KO sem EA (n=7) animais nocautes para o ARβ3;  Grupo 3 Controle com EA (n=9) animais selvagens FVB com início ao EA logo após o desmame;  Grupo 4 ARβ3KO com EA (n=9) animais nocautes para o ARβ3, com início do EA logo após o desmame.. Figura 4: Diagrama dos animais jovens submetidos ao Enriquecimento Ambiental do Estudo 1.. 29.

(31) 4.2.2. Estudo 2 - Efeito do EA em Camundongos Adultos Neste estudo os animais foram mantidos em gaiolas padrão coletivas até os 120 dias de idade, quando então foram transferidos para a gaiola de EA para o início do protocolo e os testes comportamentais tiveram início aos 180 dias de idade (Figura 5). Desta forma a idade equivalente para o ser humano neste estudo seria de 34,29 anos de idade para o início do EA e de 51,43 anos de idade para o início dos testes comportamentais (DUTTA e SENGUPTA, 2016). Os animais neste estudo foram divididos nos seguintes grupos:  Grupo 1 Controle (n=6) animais selvagens FVB;  Grupo 2 ARβ3KO (n=9) animais nocautes para o ARβ3;  Grupo 3 ARβ3KO EA (n=7) animais nocautes para o ARβ3 submetidos ao EA aos 120 dias de idade. No Estudo 2 não foi possível a análise do grupo FVB com EA pois não houve quantidade suficiente de animais para a comparação com os outros grupos devido a eventualidades.. Figura 5: Diagrama dos animais adultos submetidos ao Enriquecimento Ambiental do Estudo 2.. 4.3. Testes Comportamentais Os testes ocorreram na sala de testes comportamentais localizada no Biotério Central da UPM. Antes da entrada dos animais, a sala foi limpa com álcool 70% e as janelas e luminárias foram cobertas com papel pardo para ficar com. iluminação. de. penumbra.. Anteriormente. ao. início. dos. testes. comportamentais, os animais tiveram 1 hora de ambientação na sala de teste.. 30.

(32) A higienização do aparato ocorreu antes da entrada de cada animal e foi feito com o uso de álcool 5%. Todos os testes foram gravados para posterior análise. Houve participação na análise de um pesquisador cego para o experimento, para a confirmação dos dados.. 4.3.1. Campo Aberto Este teste tem como objetivo avaliar a atividade locomotora e o comportamento. exploratório. do. animal,. podendo. também. indicar. comportamento ansioso e hiperatividade (EILAM, 2003). O aparato utilizado consiste em uma arena circular de 30 cm de diâmetro, com o assoalho branco demarcado em linhas pretas, dividindo a arena em 8 quadrantes periféricos e 4 quadrantes centrais. Esta arena é envolta por uma parede também circular revestida em papel pardo, para o animal não ter visão e não ser influenciado pelo ambiente externo a arena (Figura 6).. Figura 6: Aparato para o teste de campo aberto. Fonte: http://www.scienlabor.com.br. O teste teve duração total de 10 minutos e foi realizado durante 3 dias seguidos com um intervalo de 24 horas entre os testes. Os parâmetros avaliados foram:. 31.

(33)  Quantidade de cruzamentos nas zonas periférica, central e entre zonas;  Tempo em segundos de permanência nas zonas periférica e central;  Frequência e tempo de duração em segundos de levantamento;  Frequência e tempo de duração em segundos de self-grooming;  Quantidade de bolos fecais.. 4.3.2. Labirinto em Cruz Elevado Este teste tem como objetivo avaliar processos neurobiológicos associados à ansiedade (HANDLEY e MITHANI, 1984). O aparato tem formato de cruz e consiste em dois braços opostos sem paredes laterais, ou seja, abertos, e dois braços fechados, com paredes laterais. Este labirinto possui uma altura de 30cm do chão, possui paredes e piso da cor cinza, cada braço têm 34cm de comprimento e 6cm de largura (Figura 7).. Figura 7: Aparato utilizado no teste de labirinto em cruz elevado. Fonte: http://www.scienlabor.com.br. O teste inicia com o animal no centro do labirinto com a cabeça direcionada ao braço fechado e tem duração de 5 minutos. Os parâmetros observados foram:  Quantidade de entradas e tempo de permanência em segundos nos braços abertos e fechados do labirinto;  Frequência e tempo em segundos de levantamento; 32.

(34)  Frequência e tempo em segundos de self-grooming;  Frequência e tempo em segundos de mergulho (head-dipping);  Quantidade de bolos fecais. Para a representação do tempo de permanência nos diferentes braços do labirinto em cruz elevado, a medida obtida em segundos foi transformada em porcentagem para melhor elucidação dos dados, através de regra de três simples onde 100% equivale a 300 segundos.. 4.3.3. Reconhecimento de Objetos Este teste tem como objetivo avaliar a memória declarativa de curto e longo prazo, baseando-se na preferência dos roedores por objetos novos á objetos familiares (CLARKE et al., 2010). O teste ocorreu no mesmo aparato do Campo Aberto, logo após as 3 sessões do teste, pois os animais já estavam ambientados com a arena. Foram selecionados 4 objetos para a realização do teste, estes objetos são de igual tamanho e composição, mas de forma e coloração diferentes, com exceção dos objetos A e B, que são idênticos. O teste foi divido em 3 fases distintas, sendo a primeira fase de familiarização, em que o animal ficou por 10 minutos com os objetos A e B na arena. O teste ocorreu após 3 horas, onde os animais ficaram em contato com o objeto A e C durante 3 minutos. E após 24 horas do treino foi feito o reteste, em que os animais tiveram contato com os objetos A e D durante 3 minutos. Foram avaliados os seguintes parâmetros:  Frequência e tempo de contato em segundos com cada objeto;  Frequência e tempo de self-grooming. Para a representação do tempo de contato do animal com cada objeto, a medida obtida em segundos foi transformada em porcentagem para melhor elucidação dos dados, através de regra de três simples onde 100% equivale a. 33.

(35) somatória do tempo de contato com os dois objetos em cada fase do teste de reconhecimento de objetos.. 4.3.4. Preferência Social O objetivo deste teste é avaliar o funcionamento da amígdala na consolidação da memória social de curto prazo. O teste foi realizado em um aparato de acrílico (20x40x22cm) divido em 3 compartimentos separados por uma porta que era retirada durante o teste, permitindo a passagem do animal pelos 3 compartimentos (Figura 8).. Figura 8: Aparato utilizado no teste de preferência social.. Anteriormente ao início do teste, o animal ficou no compartimento central do aparato (as portas permaneciam fechadas), durante 10 minutos, nos outros dois compartimentos continham duas gaiolas de arame vazias. Após este período, as portas foram retiradas e o animal pôde andar livremente entre os três compartimentos. Esta 1ª fase teve duração de 10 minutos. Na 2ª fase foi colocado um camundongo desconhecido em uma das gaiolas, enquanto a outra permaneceu vazia. Esta fase também teve duração de 10 minutos.. 34.

(36) Na 3ª fase foi colocado um camundongo desconhecido na gaiola anteriormente vazia, durante 10 minutos. Nesta fase é possível analisar o contato e interesse social do animal avaliado entre um camundongo já conhecido e um desconhecido (RICCERI et al., 2007). Para o início de cada fase, as portas eram fechadas e o camundongo avaliado era recolocado no compartimento central. E os parâmetros avaliados em nas 3 fases foram:  Número de entradas e tempo de permanência em cada compartimento;  Frequência e tempo de contato em cada gaiola. Para a representação do tempo de contato em cada gaiola, a medida obtida em segundos foi transformada em porcentagem para melhor elucidação dos dados, através de regra de três simples onde 100% equivale a somatória do tempo de contato do animal com cada gaiola em cada fase do teste de preferência social.. 4.3.5. Análise Estatística Os dados obtidos foram submetidos para a análise estatística para levantamento de sua relevância. Os dados foram expressos como média + erro padrão. As diferenças entre os grupos foram analisadas por ANOVA mista de 2 vias seguida pelo pós-teste de Bonferroni através do programa Graphpad Prism, e por ANOVA de 3 vias através do software SPSS pelo modelo de medidas repetidas e a significância considerada foi de p≤0,05.. 35.

(37) 5. RESULTADOS 5.1. Estudo 1 – Efeito do EA em Camundongos Jovens 5.1.1. Campo Aberto Para verificar se a falta do receptor adrenérgico β3 e a técnica de EA alteram a atividade locomotora dos animais, aplicamos o teste de campo aberto e foi observado que nos 4 grupos não houve alterações na capacidade locomotora dos animais, tanto na quantidade de cruzamentos na zona periférica (F(1,28) = 0,282; n.s.) como na zona central (F(1,28) = 0,630; n.s.). Ao avaliarmos a frequência total dos cruzamentos em cada sessão do teste de campo aberto também é possível observar que não há diferença entre os grupos e nem interferência do EA (F(1,28) = 0,053; n.s.) nos três dias de. B. 400. 150. 300 200 100 0 1. 2. 100. 50. 3. 1. 2. Cruzamentos. 300 200 100 0. 0. 1. 3. 2. 3. 2. 3. Sessões. F. Zona Central. Total. 600. 100. 50. 0 2. Sessões. 200. 3. Cruzamentos. E 150. 1. 400. Sessões. 400. 0. AR3KO. 0 0. Sessões. Grupo com EA Zona Periférica D. FVB. Total. 600. 0 0. Cruzamentos. C. Zona Central. Cruzamentos. Grupo sem EA Zona Periférica A Cruzamentos. Cruzamentos. teste (Figura 9 C e F).. 400. 200. 0 0. 1. 2. Sessões. 3. 0. 1. Sessões. Figura 9: Frequência de cruzamentos em cada zona do aparato e frequência total de cruzamentos nas três sessões do teste de Campo Aberto, dos grupos sem EA (A, B e C) e com EA (D, E e F). Estão apresentadas as médias de cada sessão com o seu respectivo erro padrão. Análise por ANOVA de três vias, considerando p≤0,05. Grupo FVB sem EA n=7, grupo ARβ3KO sem EA n=7, grupo FVB com EA n=9, grupo ARβ3KO com EA n=9.. Quando avaliamos os demais parâmetros como levantar, quantidade de bolos fecais e limpeza, não observamos diferenças entre os grupos (dados não mostrados). 36.

(38) 5.1.2. Labirinto em Cruz Elevado Apesar dos resultados obtidos no teste de campo aberto não sugerirem um comportamento ansioso em nenhum dos grupos avaliados, aplicamos o teste de labirinto em cruz elevado para avaliarmos este comportamento. Como podemos observar na Figura 10, o EA interferiu no tempo de permanência nos braços do labirinto, aumentando o tempo de permanência no braço aberto (F(1,28) = 7,638; p=0,01) e diminuindo o tempo de permanência no braço fechado (F(1,28) = 4,229; p=0,04), sugerindo que o EA reduz o comportamento ansioso tanto nos animais selvagens como nos animais nocautes para o ARβ3.. Braço Aberto 60. *. *. *. 60. Tempo (%). Tempo (%). 80. Braço Fechado. 40. Sem EA Com EA. *. 40. 20. 20 0 FVB. AR 3KO. 0 FVB. AR 3KO. Figura 10: Tempo de permanência em porcentagem nos braços aberto e fechado do Labirinto em Cruz Elevado dos grupos sem EA e com EA. Estão apresentadas as médias de cada grupo com o seu respectivo erro padrão. Análise por ANOVA de duas vias, seguida pelo pós-teste de Bonferroni, considerando p≤0,05. Grupo FVB sem EA n=7, grupo ARβ3KO sem EA n=7, grupo FVB com EA n=9, grupo ARβ3KO com EA n=9.. Os parâmetros de limpeza, mergulhar, levantar e quantidade de bolos fecais não foi observada diferença em nenhum dos grupos (dados não mostrados).. 5.1.3. Reconhecimento de Objetos Para avaliar o efeito do EA na memória declarativa de curto (3 horas) e de longo prazo (24 horas), submetemos os animais ao teste de reconhecimento de objetos. Observamos que todos os animais permaneceram por tempo igual entre os objetos A e B idênticos durante o período de familiarização, mostrando que não há preferência por nenhuma região do aparato (Figura 11 A e D). 37.

(39) Quando submetidos ao objeto novo 3 horas após o período de familiarização, observamos que grupo FVB sem EA permaneceu mais tempo em contato com o objeto C, distinguindo o objeto novo, formando a memória declarativa de curto prazo. O EA não alterou a formação de memória nos animais FVB (F(1,29)=43,998; p≤0,0001) (Figura 11 B e E). Já os animais ARβ3KO sem EA não fazem distinção entre os objetos conhecido e novo, como esperado. No entanto, o EA corrigiu inteiramente o prejuízo na formação de memória declarativa de curto prazo causado pela ausência do receptor ARβ3 (F (1,29)= 6,198; p=0,019) (Figura 11 B e E). Efeito idêntico foi observado no que diz respeito à formação da memória declarativa de longo prazo (F(1,29)=40,974; p≤0,0001) (Figura 11 C e F).. Grupo sem EA A. FVB. B. Familiarização. 80. 80. 60. 60. C. Teste (após 3 horas). Reteste (após 24 horas). 80. ***. Tempo (%). Tempo (%). Tempo (%). ***. 40. 40. 20. 20. 0 ObjB. ObjA. ObjB. 60 40 20. 0 ObjA. AR3KO. 0 ObjA. ObjC. ObjA. ObjC. ObjA. ObjD. ObjA. ObjD. Grupo com EA 80. 60. 60. 40 20. F. Teste (após 3 horas) *. ***. 40. ObjB. ObjA. ObjB. ***. 40. 0. 0. ObjA. ***. 60. 20. 20. 0. Reteste (após 24 horas). 80. Tempo (%). E. Familiarização. 80. Tempo (%). Tempo (%). D. ObjA. ObjC. ObjA. ObjC. ObjA. ObjD. ObjA. ObjD. Figura 11: Porcentagem do tempo de contato com cada objeto nas três fases do teste de Reconhecimento de Objetos dos grupos sem EA (A, B e C) e com EA (D, E e F). Estão apresentadas as médias de cada grupo em cada fase, com o seu respectivo erro padrão. Análise por ANOVA de duas vias, seguida pelo pós-teste de Bonferroni. Grupo FVB sem EA n=7, grupo ARβ3KO sem EA n=7, grupo FVB com EA n=10, grupo ARβ3KO com EA n=9. *p=0,019 e ***p≤0,0001. 38.

(40) 5.1.4. Preferência Social Para avaliarmos o efeito do EA sobre a memória de reconhecimento social dos animais utilizamos o teste de preferência social.. Na fase de. familiarização ao aparato observamos que os animais de todos os grupos permaneceram em contato com as duas gaiolas vazias por tempo similar, não mostrando preferência entre elas (Figura 12A). Na fase seguinte os animais permaneceram mais tempo em contato com a gaiola que continha o camundongo do que com a gaiola vazia, indicando que os animais analisados não possuem problemas de socialização (Figura 12B). Quando os animais foram expostos ao camundongo conhecido e um camundongo novo, observamos que todos os animais dos 4 grupos estudados permanecem por mais tempo com o camundongo novo (F(1,28) = 81,723; p≤0,0001), indicando que a ausência do receptor ARβ3 não impede a formação de memória social de curto prazo (Figura 12C).. 100. 100. 80. 80. 60 40 20 0 a1 a2 a1 a2 a1 a2 a1 a2 iol aiol aiol aiol aiol aiol aiol aiol a G G G G G G G G. Camundongo X Vazia ***. ***. C ***. 80. 60 40 20. ***. ***. *** ***. 60 40 20. 0 o nd mu Ca. FVB FVB EA AR3KO AR3KO EA. Conhecido X Novidade. 100. *** Tempo (%). B. Familiarização. Tempo (%). Tempo (%). A. o o o o ia ia ia ia ng Vaz ong Vaz ong Vaz ong Vaz nd nd nd mu mu mu a a a C C C. 0 n Co. o o o o o o o o cid Nov ecid Nov ecid Nov ecid Nov he nh nh nh Co Co Co. Figura 12: Porcentagem do tempo de contato em cada gaiola nas três fases do teste de Preferência Social dos grupos sem EA e com EA. Estão apresentadas as médias de cada grupo em cada fase, com o seu respectivo erro padrão. Análise por ANOVA de duas vias, seguida pelo pós-teste de Bonferroni. Grupo FVB sem EA n=7, grupo FVB com EA n=9, grupo ARβ3KO sem EA n=7, grupo ARβ3KO com EA n=9. ***p≤0,001.. 39.

(41) 5.2. Estudo 2 – Efeito do EA em Camundongos Adultos 5.2.1. Campo Aberto Ao avaliarmos a atividade locomotora nos grupos adultos por meio do teste de campo aberto observamos que o envelhecimento não altera a capacidade locomotora dos animais ARβ3KO quando comparados aos animais FVB, ao analisarmos a quantidade de cruzamentos, não houve diferença entre os grupos FVB e ARβ3KO nos cruzamentos na zona periférica (F(1, 26)=0,01016; n.s.) e na zona central (F(1, 26)=0,3300; n.s.) (Figura 8 C e D). No entanto, o EA induziu ao aumento na atividade exploratória dos animais do grupo ARβ3KO EA, pois quando comparamos os grupos ARβ3KO e ARβ3KOEA há diferença nos cruzamentos na zona central (F(1, 28)=5,139; p=0,0398) porém não há diferença nos cruzamentos na zona periférica (F(1, 28)=2,387; n.s.) (Figura 13 C e D). A análise estatística mostrou que não há diferença entre os grupos FVB e ARβ3KO no tempo de permanência na zona periférica (F(1, 26)=2,850; n.s.) e na zona central (F(1, 26)=2,848; n.s.). Há diferença entre os grupos ARβ3KO e ARβ3KO-EA no tempo de permanência na periferia (F(1, 28)=15,82; p=0,0014) e no centro (F(1, 28)=15,81; p=0,0014) (Figura 13 A e B). Desta forma os resultados sugerem que o EA reduziu o comportamento ansioso. Ao compararmos os cruzamentos totais não houve diferença entre os grupos FVB e ARβ3KO (F(1, 26)=0,1139; n.s.) como também entre os grupos ARβ3KO e ARβ3KO-EA (F(1, 28)=4,118; n.s.) (Figura 13 E).. 40.

(42) A. B. Zona Central. Zona Periférica. 550. Tempo (segundos). Tempo (segundos). 300. 200. 100. 0. 500. FVB. 450. AR3KO AR3KO EA. 400 350 300. 0. 1. 2. 3. 0. 1. Sessões. D. Zona Central. 250 200. Cruzamentos. Cruzamentos. 3. 150 100 50. E. Zona Periférica. 400. 1000. 300. 800. Cruzamentos. C. 2. Sessões. 200 100. Total. 600 400 200. 0. 0 0. 1. 2. 3. 0. 1. Sessões. 2. 0. 3. 0. 1. Sessões. 2. 3. Sessões. Figura 13: Tempo de permanência (A e B) e frequência de cruzamentos (C e D) em cada zona do aparato e somatória dos cruzamentos nas três sessões do teste de Campo Aberto. Estão apresentadas as médias de cada sessão com o seu respectivo erro padrão. Análise por ANOVA de duas vias, seguida pelo pós-teste de Bonferroni. Grupo FVB sem EA n=6, grupo ARβ3KO sem EA n=9, grupo ARβ3KO com EA n=7.. O grupo ARβ3KO levanta significativamente por mais tempo do que os animais FVB nos 3 dias de teste. É interessante que EA corrige este comportamento embora induza ao aumento da deambulação (Figura 14). Nos parâmetros de frequência de levantar, quantidade de bolos fecais e frequência e tempo de limpeza não foi observada diferença entre os grupos (dados não mostrados). Dia 1. Dia 2. Dia 3. 200. *. 150 100 50 0. 200. **. Tempo (segundos). Tempo (segundos). Tempo (segundos). 200. 150 100 50 0. FVB. AR3KO. AR3KO EA. **. 150 100 50 0. FVB. AR3KO. AR3KO EA. FVB. AR3KO. AR3KO EA. Figura 14: Tempo em segundos de levantar em cada dia do teste de Campo Aberto. Estão apresentadas as médias de cada grupo com o seu respectivo erro padrão. Análise por ANOVA de duas vias, seguida pelo pós-teste de Bonferroni. Grupo FVB sem EA n=6, grupo ARβ3KO sem EA n=9, grupo ARβ3KO com EA n=7. * p≤0,05 e **p≤0,01. 41.

(43) 5.2.2. Labirinto em Cruz Elevado Para avaliarmos o comportamento ansioso dos animais adultos utilizamos o labirinto em cruz elevado e observamos que não houve diferença entre os grupos na frequência de entradas no braço aberto (p=0,1684) como no braço fechado (p=0,7286) (Figura 15 A e B). Já ao analisarmos o tempo de permanência, observamos que o grupo ARβ3KO permaneceu mais tempo no braço aberto e menos tempo no braço fechado (p=0,0165) do que os grupos FVB e ARβ3KO EA, sugerindo um comportamento menos ansioso do grupo ARβ3KO, e portanto sugere que o EA reduz o tempo de permanência no braço aberto (Figura 15 C e D). Nos demais parâmetros analisados não foi observada diferença entre os grupos (dados não mostrados).. Braço Aberto. 25. 25. 20. 20. 15 10 5. 15 10 5. 0 FVB. AR 3KO. 0. AR 3KO EA. FVB. Braço Aberto. C. AR 3KO. AR 3KO EA. Braço Fechado. D. 80. 80. *. 60. Tempo (%). Tempo (%). Braço Fechado. B. Frequência. Frequência. A. 40 20. 60. * 40 20. 0 FVB. AR 3KO. AR 3KO EA. 0 FVB. AR 3KO. AR 3KO EA. Figura 15: Frequência de entradas (A e B) e tempo de permanência em porcentagem (C e D) nos braços aberto e fechado no Labirinto em Cruz Elevado. Estão apresentadas as médias de cada grupo com o seu respectivo erro padrão. Análise por ANOVA de duas vias, seguida pelo pós-teste de Bonferroni, considerando p≤0,05. Grupo FVB sem EA n=6, grupo ARβ3KO sem EA n=9, grupo ARβ3KO com EA n=7.. 42.