DISSERTAÇÃO_Estratégias para obtenção e identificação de duplo-haploides em milho tropical

Texto

(1)GUILHERME MENDES BATTISTELLI. ESTRATÉGIAS PARA OBTENÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE DUPLO-HAPLOIDES EM MILHO TROPICAL. LAVRAS - MG 2012.

(2) GUILHERME MENDES BATTISTELLI. ESTRATÉGIAS PARA OBTENÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE DUPLOHAPLOIDES EM MILHO TROPICAL. Dissertação apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de PósGraduação em Genética e Melhoramento de Plantas, área de concentração em Genética e Melhoramento de plantas, para a obtenção do título de Mestre.. Orientador Dr. Renzo Garcia Von Pinho. LAVRAS - MG 2012.

(3) Ficha Catalográfica Elaborada pela Divisão de Processos Técnicos da Biblioteca da UFLA Battistelli, Guilherme Mendes. Estratégias para obtenção e identificação de duplo-haploides em milho tropical / Guilherme Mendes Battistelli. – Lavras : UFLA, 2012. 61 p. : il. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Lavras, 2012. Orientador: Renzo Garcia Von Pinho. Bibliografia. 1. Milho híbrido. 2. Duplicação cromossômica. 3. Indutores de haploidia. 4. Citometria de fluxo. 5. Linhagens. I. Universidade Federal de Lavras. II. Título. CDD – 631.523.

(4) GUILHERME MENDES BATTISTELLI. ESTRATÉGIAS PARA OBTENÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE DUPLOHAPLOIDES EM MILHO TROPICAL. Dissertação apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de PósGraduação em Genética e Melhoramento de Plantas, área de concentração em Genética e Melhoramento de plantas, para a obtenção do título de Mestre. APROVADA em 29 de fevereiro de 2012. Dr. Adriano Teodoro Bruzi. UFLA. Dra. Lisete Chamma Davide. UFLA. Dr. Renzo Garcia Von Pinho Orientador. LAVRAS - MG 2012.

(5) AGRADECIMENTOS A Deus e a Nossa Senhora Aparecida, por me abençoar em todos os momentos da minha vida. A minha mãe, Denise; aos meus avós, Odilon e Aparecida; a minha irmã, Bianca; ao meu cunhado, Bruno; a minha madrinha, Ana e a todos meus familiares pelo amor, apoio, incentivo e compreensão em toda a minha vida. A minha esposa e companheira Ariana Justus, pelo amor e carinho em todo esse tempo que estamos juntos. À família da minha esposa, pelo apoio. Aos meus amigos e mentores, Marcos V. Faria e José Wilacildo de Matos, pelo incentivo para a realização deste mestrado. À Universidade Federal de Lavras (UFLA), ao Programa de PósGraduação em Genética e Melhoramento de plantas e ao Departamento de Biologia, pela oportunidade e a estrutura concedida para o desenvolvimento deste trabalho e a obtenção do título de mestre. À Empresa Geneze Sementes S.A., pela concessão da bolsa de estudos, e pelo apoio financeiro e na realização do projeto. Ao professor Renzo Garcia Von Pinho, pela orientação, oportunidade, conhecimento e apoio. Ao Heberte Silva e Livia Maria Chamma Davide, pela coorientação, apoio na elaboração e execução do trabalho e pelas valiosas sugestões que enriqueceram o projeto. Aos membros da banca, Lisete Chamma Davide e Adriano Teodoro Bruzi, pela atenção, sugestões e correções na redação da dissertação. Aos professores José Airton e Júlio, pela grande contribuição e ajuda nas análises estatísticas..

(6) Aos demais professores do Departamento de Biologia da UFLA, pelos ensinamentos transmitidos. Aos professores Lisete Chamma Davide, João Bosco dos Santos, Édila Vilela de Resende Von Pinho e Moacir Pasqual, por disponibilizarem os laboratórios para a realização deste projeto, a aos laboratoristas, pelo auxílio na execução das análises. Ao pessoal da Hortiagro, por disponibilizar a área de condução dos experimentos. À equipe de trabalho, Tallyta, Evellyn, Adriano, Ludmila, Leandro, Álvaro e os demais colegas do grupo do milho, pela contribuição na execução dos experimentos e análises laboratoriais. Aos colegas e amigos Breno, Edivaldo e Matheus, pela amizade, disposição em ajudar, ensinar, aprender junto e por estarem presentes nos momentos de alegrias e dificuldades. A todos que, de alguma forma, contribuíram para a concretização deste trabalho.. Muito Obrigado!.

(7) RESUMO A obtenção de linhagens duplo-haploides (DH) de milho é uma técnica utilizada pelas empresas privadas, entretanto, pouco difundida nas instituições públicas do país. Pesquisas sobre essa técnica são essenciais para desenvolver e aperfeiçoar a obtenção de linhagens DH em condições tropicais de cultivo. Dessa forma, este trabalho foi realizado com os objetivos de avaliar a capacidade de dois indutores com sistemas diferentes de indução de haploidia (androgenético e gimnogenético) em ambientes tropicais, testar a eficiência do marcador morfológico R-navajo e vigor de plântulas na seleção dos haploides, verificar se há interferência da geração dos híbridos doadores na indução de haploides, aferir a capacidade das técnicas de citometria de fluxo e marcadores moleculares SSR na confirmação de duplo-haploides e obter linhagens DH. Sementes dos indutores W23 e KEMS foram semeadas em Ponta Grossa, PR e Cravinhos, SP e as plantas cruzadas com seis híbridos e suas gerações F2. As sementes obtidas foram separadas conforme o marcador morfológico indicador de haploidia R-navajo (endosperma roxo e embrião branco) e germinadas em ambiente controlado, para uma segunda seleção de haploides baseada no vigor das plântulas. Nas plântulas selecionadas como haploides putativos, foi realizada a duplicação cromossômica, com posterior confirmação da ploidia e sucesso de duplicação pelo uso das técnicas de citometria de fluxo e marcadores moleculares SSR. Pode-se concluir que a produção de linhagens DH utilizando a linhagem indutora W23 (sistema androgenético) é inviabilizada pela baixa porcentagem de indução e produção de sementes. Porém, é possível obter linhagens DH a partir dos híbridos cruzados com o indutor KEMS. A geração de endogamia dos híbridos não interferiu na taxa de indução e na duplicação cromossômica de haploides. O uso da citometria de fluxo e marcadores moleculares SSR é eficiente na comprovação da duplicação cromossômica dos haploides. A utilização do marcador morfológico R-navajo e vigor das plântulas auxilia na identificação dos haploides. Palavras-chave: Indutores de haploidia. Duplicação cromossômica. Citometria de fluxo. Linhagens duplo-haploides. Milho híbrido..

(8) ABSTRACT The obtainment of double-haploid lines (DH) of maize is a technique used by private companies, however it is not so widely used by public institutions in Brazil. Researches on this technique are essential in order to develop and improve the obtainment of DH lines under tropical conditions of growth. Thus, this study aimed to evaluate the capacity of two inductors with different systems for induction of haploidy (androgenetic and gynogenetic) in tropical environments; to test the efficiency of the morphological marker RNavajo and vigor of seedling in haploid selection; to verify the presence of interference by generation of hybrid donors on haploid induction and to measure the ability of flow cytometry techniques and SSR molecular markers on confirming double haploid strains and obtaining DH. Seeds of the inductors W23 and KEMS were sown in Ponta Grossa-PR and Cravinhos-SP and plants were crossed with six hybrids and their F2 generations. The seeds obtained were separated according to the morphological marker that indicates R-Navajo haploidy (purple endosperm and white embryo) and germinated in a controlled environment in order to obtain a second selection of haploids based on the seedling vigor. In seedlings selected as putative haploids, we performed chromosome duplication with subsequent confirmation of ploidy and success of duplication through the use of flow cytometry techniques and SSR markers. We conclude that the generation DH lines using W23 as inductor (androgenetic system) becomes not viable because of the low percentage of induction and seed production, however it is possible to obtain DH lines through hybrids crossed with the inductor KEMS. The generation of inbreeding on hybrids did not affect the rate of induction and chromosome duplication of haploids. The use of flow cytometry and SSR markers is efficient on proving the chromosome duplication of haploids. The use of morphological marker R-Navajo and seedling vigor assist in the identification of haploids. Keywords: Haploidy Inductors. Chromosome duplication. Flow cytometry. SSR. Double haploid lines. Hybrid maize..

(9) SUMÁRIO 1 2 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 5. INTRODUÇÃO ...................................................................................... 9 REFERENCIAL TEÓRICO ............................................................... 11 Obtenção de linhagens ......................................................................... 11 Indutores de haploidia ......................................................................... 13 Identificação dos haploides.................................................................. 16 Comparação entre linhagens duplo-haploides e convencionais ....... 18 Duplicação cromossômica artificial .................................................... 19 Citometria de fluxo para análise de ploidia ....................................... 21 Marcadores moleculares SSR na identificação de haploides............ 23 MATERIAL E MÉTODOS................................................................. 25 Área experimental ................................................................................ 25 Genótipos avaliados.............................................................................. 25 Obtenção e identificação de haploides................................................ 26 Duplicação cromossômica.................................................................... 27 Avaliação da duplicação cromossômica por citometria de fluxo ..... 28 Avaliação da duplicação cromossômica pela fertilidade do pendão 29 Avaliação da duplicação cromossômica por marcadores microssatélites....................................................................................... 30 Análises estatísticas .............................................................................. 33 RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................... 35 Obtenção de haploides identificados pelo marcador morfológico R-navajo ................................................................................................ 35 Seleção de haploides pelo vigor das plântulas.................................... 40 Porcentagem de duplo-haploides identificados pela citometria de fluxo ....................................................................................................... 42 Porcentagens de plantas que produziram pólen................................ 49 Confirmação de duplo-haploides utilizando marcadores moleculares SSR ................................................................................... 52 CONCLUSÕES .................................................................................... 54 REFERÊNCIAS ................................................................................... 55.

(10) 9. 1 INTRODUÇÃO O Brasil é o terceiro maior país produtor de milho do mundo, com produção de, aproximadamente, 58 milhões de toneladas de grãos, no ano agrícola 2010/2011 (COMPANIA NACIONAL DE ABASTECIMENTO CONAB, 2011). A área cultivada com milho nesta safra foi de 13,84 milhões de hectares. Desse total, acima de 90% das sementes utilizadas para plantio são de milho híbrido. O mercado de sementes híbridas de milho é dominado por empresas multinacionais, que possuem acesso às recentes inovações tecnológicas, como os transgênicos e métodos para a obtenção de linhagens duplo-haploides (DH). Dessa forma, as informações sobre o desenvolvimento de linhagens DH no país são restritas a empresas privadas, dificultando o acesso de outras instituições públicas nacionais. O uso da técnica de produção de linhagens DH por meio de indutores de haploidia possibilita a produção de novos híbridos num menor tempo e com menor custo, em comparação aos métodos tradicionais. O método tradicional utilizado para a obtenção de linhagens necessita de, pelo menos, seis gerações de autofecundações, até alcançar a homozigose. Utilizando-se a tecnologia de DH, esse tempo pode ser abreviado em dezoito meses, o que aumenta consideravelmente a competitividade e a dinâmica do programa de melhoramento. Essa técnica também permite ao melhorista realizar o test-cross com linhagens em vez de progênies endogâmicas. Na implementação desse método é necessária a utilização de linhagens indutoras que podem gerar haploides paternos ou maternos, dependendo da linhagem empregada. Em geral, essas linhagens indutoras têm origem temperada, dificultando o manejo e o desenvolvimento destas em condições tropicais..

(11) 10. Normalmente, os genótipos que se encontram na geração F1 são cruzados com as linhagens indutoras para a obtenção de haploides, tornando o processo mais rápido para a obtenção das linhagens. Porém, Bernardo (2009) sugere a obtenção linhagens duplo-haploides a partir da geração F2, para que ocorra uma geração a mais de recombinação. Para um programa de melhoramento de milho que visa à produção de híbridos a partir de linhagens indutoras de haploidia é essencial identificar ambientes e épocas de semeadura, os quais propiciam um melhor desenvolvimento dessas linhagens. Também é importante identificar os possíveis haploides de maneira rápida e com baixo custo, além de estabelecer, de forma precisa, métodos de duplicação cromossômica e de obtenção das linhagens depois de realizada a duplicação. A técnica da citometria de fluxo está sendo amplamente utilizada, devido à facilidade e à rapidez na preparação das amostras e na obtenção dos resultados (LOUREIRO; SANTOS, 2004). Pelo fato de avaliar o conteúdo de DNA, essa técnica vem se mostrando uma ótima ferramenta para auxiliar na determinação da eficiência do método de indução de haploidia e o sucesso de duplicação cromossômica. Outra ferramenta utilizada na identificação de haploides são os marcadores. moleculares. microssatélites. (SSR),. por. serem. estáveis. e. codominantes, possibilitando a separação dos homozigotos dos heterozigotos (F1s) (BELICUAS et al., 2007). Dessa maneira, este trabalho foi realizado com os objetivos de avaliar a capacidade de dois indutores com sistemas diferentes de indução de haploidia (androgenético e gimnogenético) em ambientes tropicais, testar a eficiência do marcador morfológico R-navajo e o vigor de plântulas na seleção dos haploides, verificar se há interferência da geração dos híbridos doadores na indução de haploides, aferir a capacidade das técnicas de citometria de fluxo e marcadores moleculares SSR na confirmação de duplo-haploides e obter linhagens DH..

(12) 11. 2 REFERENCIAL TEÓRICO 2.1 Obtenção de linhagens O melhorista de milho tem como um de seus principais objetivos o aumento da produtividade de grãos. E nessa busca por híbridos de alta produtividade, uma das metodologias mais empregadas é o aproveitamento da heterose. A heterose, ou vigor híbrido, é oriunda do cruzamento entre duas ou mais linhagens homozigotas, preferencialmente contrastantes que, quando cruzadas, expressam o máximo vigor híbrido (PATERNIANI; CAMPOS, 1999). De acordo com Paterniani e Campos (1999), a produção de híbridos com alto desempenho necessita do cruzamento entre linhagens elites. O desenvolvimento dessas linhagens envolve a obtenção de linhagens e o cruzamento posterior com um testador, para identificar as que possuem maior capacidade de combinação. O processo tradicional utilizado para obter linhagens elites implica na autofecundação de várias plantas da população. Os descendentes S1 são semeados em linha e os melhores são selecionados e novamente autofecundados. O procedimento é repetido até que a maioria dos locos esteja em homozigose. Em geral, após seis a sete autofecundações, obtémse uma nova linhagem. Uma alternativa disponível na cultura do milho para acelerar a obtenção de linhagens consiste na produção de linhagens homozigotas instantâneas pelo uso de haploides duplicados, também conhecidos como duplo-haploides ou dihaploides (CHASE, 1952). Essa tecnologia tem se mostrado bastante vantajosa. Por exemplo, em um processo normal de autofecundação em espécies diploides, considerando apenas dois pares de locos independentes segregando entre os genitores (AAbb) e (aaBB), o genótipo recessivo aabb tem a probabilidade de ser encontrado na proporção de 1/16 em uma população F2..

(13) 12. Entretanto, na indução de haploidia, o mesmo genótipo terá a probabilidade de ocorrência de 1/4 na população. Isso ocorre devido à ausência dos heterozigotos, prevalecendo apenas quatro genótipos homozigotos (AABB, AAbb, aaBB e aabb) (PIERRE et al., 2011). Com a obtenção de linhas homozigotas, a variância aditiva é maximizada, os efeitos de dominância são neutralizados e as vantagens na seleção de características quantitativas podem ser superiores, uma vez que é realizada somente com base na aditividade, não havendo interferência dos efeitos de dominância e epistasia (BORDES et al., 2006). Outras vantagens no uso desta tecnologia são a garantia na qualidade das avaliações iniciais dos híbridos, uma vez que todas as plantas geradas de uma única semente haploide serão idênticas geneticamente (MILACH, 2007) e a possibilidade de que sejam herdados blocos gênicos inteiros, sem que tenha ocorrido recombinação (BERNARDO, 2009). No entanto, a maior vantagem desse processo está na redução significativa do tempo para a obtenção de linhagens. De acordo com a empresa Pioneer Sementes (2010), esse processo permite reduzir em, ao menos 18 meses, o tempo necessário para a obtenção de novas linhagens. A ocorrência de haploides naturais em milho já foi verificada, porém, em uma taxa extremamente baixa. Segundo Chase (1963), esta taxa é de uma em cada mil, ou seja, não suficiente para ser utilizada em programas de melhoramento de milho. Entretanto, têm sido utilizados dois processos para aumentar a frequência de produção de haploides. Um deles é realizado por meio da indução genética (in vivo) e o outro, por técnicas de cultura de tecido (in vitro). A indução in vivo tem sido preferida e baseia-se na utilização de linhagens indutoras de haploides, seguida por duplicação cromossômica (GEIGER; GORDILLO, 2009)..

(14) 13. 2.2 Indutores de haploidia Inicialmente, duas linhagens indutoras de haploidia se destacaram: Stock6 e W23. A primeira delas foi desenvolvida a partir de uma variedade denominada Stock6 (COE, 1959) que, quando autofecundada, produziu uma frequência de haploides em torno de 3,2%. A linhagem indutora Stock6 gera haploides de origem materna ou gimnogenéticos. Várias iniciativas foram realizadas no intuito de aumentar as frequências de indução de haploides com indutores melhorados. Em condições temperadas, a partir das linhagens Stock6 e W23, foram geradas inúmeras outras linhagens indutoras com maiores taxas de indução de haploidia. Lashermes e Beckert (1988) cruzaram a linhagem W23 com a linhagem Stock6 e obtiveram a linhagem indutora WS14, com taxa de indução de 3% a 5%. Sarkar et al. (1994) conseguiram uma taxa de indução de 6% nos cruzamentos realizados. As linhagens indutoras ZMS e KMS também foram derivadas da Stock6 e o cruzamento delas deu origem à linhagem MHI que induz, em média, 6,5% de haploides (CHALYK, 1999). A linhagem indutora RWS foi recentemente desenvolvida e caracterizada por Röber, Gordillo e Geiger (2005). Esta surgiu a partir do cruzamento entre as linhagens indutoras WS14 (LASHERMES; BECKERT, 1988) e KEMS (SHATSKAYA et al., 1994). Com a sua utilização, de 8% a10% dos descendentes são haploides derivados da planta mãe. De acordo com Geiger e Gordillo (2009), existem duas hipóteses dos mecanismos concebíveis que podem explicar a ocorrência de haploides de origem maternal. A primeira hipótese propõe que um dos dois núcleos reprodutivos do grão de pólen do indutor tenha uma alteração, mas ainda seja capaz de se fundir com a oosfera e, durante as divisões celulares subsequentes, os cromossomos do indutor se degeneram e são gradualmente eliminados das.

(15) 14. células primordiais. O outro núcleo reprodutivo se funde com os núcleos polares, formando o endosperma triploide. A segunda hipótese sugere que um dos núcleos reprodutivos do grão de pólen não é capaz de se fundir com a oosfera, mas pode provocar a embriogênese haploide, e o segundo núcleo reprodutivo se une com os núcleos polares, formando o endosperma, como na primeira hipótese. Os estudos de Wedzony, Röber e Geiger (2002) evidenciaram, experimentalmente, a primeira hipótese. Os autores fixaram os ovários de plantas autofecundadas do indutor RWS em intervalos regulares, durante os primeiros 20 dias após a polinização. De acordo com a taxa de indução do RWS, 18 dos 203 embriões continham os micronúcleos em todos os primórdios das células. Os micronúcleos variaram em número e diâmetro, exibindo características típicas de cromatinas metabolicamente inativas. Em algumas placas equatoriais, fragmentos de cromossomos também foram observados. A eliminação dos micronúcleos se inicia durante o estado globular da embriogênese. Essas observações são indiretamente encontradas nos resultados de Fischer (2004) e Li et al. (2009). Em todos os estudos, pequenas frações do genoma indutor foram detectadas nos indivíduos haploides por meio de técnicas de marcadores moleculares. No experimento de Fisher (2004), usando indutor RWS, foi detectado, em 1,4% dos haploides, o DNA paterno. Li et al. (2009), utilizando a linha indutora chinesa CAUHOI, identificou que, em média, 1,8% do genoma indutor foi transmitido. Geralmente, os segmentos transmitidos têm substituído os segmentos homólogos maternos. CAUHOI é um genótipo com alto teor de óleo. Dessa forma, a transmissão paterna também pode ser confirmada por um aumento da concentração de óleo em alguns haploides carregando segmentos cromossômicos do indutor..

(16) 15. Rotarenco, Adicu e Sarmaniuc (2009) polinizaram duas linhas puras doadoras com duas linhas de indutores e seus F1. Amostras representativas do campo cultivado com progênies haploides revelou diferenças significativas entre os indutores para altura de planta, comprimento da folha, largura da folha, comprimento da espiga e número de sementes, em 9 de 25 casos. Isso indica, novamente, a possibilidade de transmissão paterna e parece que é um fenômeno comum de alguns indutores. Até agora, nenhuma evidência experimental tem sido relatada em apoio à segunda hipótese. No entanto, é concebível que os indutores com anomalias reprodutivas, como microsporocitos aneuploides (CHALYK et al., 2003) ou aumento na taxa de heterofertilização (ROTARENCO; EDER, 2003), podem ser capazes de induzir a embriogênese haploide, devido a não penetração de um dos núcleos reprodutivos na oosfera. A outra linhagem, conhecida como Wisconsin 23 (W23), gera haploides androgenéticos a uma taxa que varia de 1% a 3% (KERMICLE, 1969, 1973). Segundo Kermicle (1973), os haploides são gerados por influência de uma mutação espontânea, devido ao alelo recessivo denominado gametófito indeterminado (ig), sendo de origem paterna, ou seja, androgenéticos. Este gene está localizado no braço longo do cromossomo 3 a 90 cM do loco lg2, o mais distal do braço curto (LASHERMES; BECKERT, 1988) e causa algumas alterações no desenvolvimento do saco embrionário. Assim, em uma megasporogênese normal, ocorrem três mitoses sucessivas, resultando em um saco embrionário com oito núcleos. Sob a ação do gene ig, algumas megasporogêneses sofrem quatro ou mais mitoses, resultando em um saco embrionário com 16 núcleos ou mais, em vez de oito núcleos normalmente observados (LIN, 1981). Como resultado dessas divisões mitóticas adicionais, o indivíduo mutante que apresenta o alelo ig1 exibe heterofertilização, poliembrionia e variação no nível de ploidia do endosperma depois da.

(17) 16. fertilização. Segundo Lin (1981), provavelmente, os sacos embrionários com oosfera degenerada favorecem o desenvolvimento de um núcleo reprodutivo de grão de pólen, sem a ocorrência de fertilização, dando origem a um embrião haploide. Kermicle (1969) observou que metade das sementes de uma espiga provenientes de plantas que contêm o alelo ig em homozigose recessiva é defeituosa e um quarto das sementes provenientes de plantas que contêm o alelo ig em heterozigose também são defeituosas. A linhagem W23 tem sido utilizada em pesquisas no Brasil (BELICUAS et al., 2007; RABEL, 2008). Segundo Belicuas et al. (2007), em condições tropicais de cultivo, a W23 é capaz de produzir haploides androgenéticos, mas é suscetível ao ataque de doenças e sensível ao calor e ao fotoperíodo.. 2.3 Identificação dos haploides O uso de haploides in vivo, em escala comercial, é possível devido a uma marcação morfológica nas sementes de milho, permitindo ao melhorista separar as sementes haploides e diploides obtidas do cruzamento do doador com o indutor. Chase e Nanda (1965) descreveram o sistema de marcador fenotípico baseado na pigmentação por antocianina determinado pelo gene R-navajo (R1nj). Este alelo promove a pigmentação com antocianina no endosperma e no embrião das sementes diploides, e as sementes haploides apresentam pigmentação somente no endosperma, ficando com o embrião branco. Como se sabe, o endosperma é formado por um tecido triploide, sendo um conjunto haploide do parental masculino e dois do parental feminino. Já o embrião é formado por um tecido diploide. Como o marcador morfológico R-navajo é dominante em um cruzamento, esse será expresso no endosperma. No caso de um embrião haploide, o marcador não será expresso, pois o embrião não contém.

(18) 17. o genoma da linhagem indutora que carrega o alelo marcador. A pigmentação pode variar em extensão e intensidade, dependendo do background genético do doador, em particular e do indutor (GEIGER; GORDILLO, 2009). De acordo com Rotarenco et al. (2009), existem, em conjunto com o gene R1-nj, os genes de cores adicionais (B1, PL1), que também condicionam a pigmentação do coleóptilo e da raiz das plântulas, favorecendo a separação de haploides e diploides. Após a germinação das sementes, as plântulas que apresentarem pigmentação no coleóptilo ou nas radículas são identificadas como diploides. Segundo Rabel (2008), o gene marcador R1-nj não se expressa em todos os genótipos, indicando que sua expressão é influenciada pelo background genético do parental masculino. O mesmo autor constatou que os marcadores morfológicos R-navajo e a coloração verde do coleóptilo não foram eficientes na identificação de indivíduos haploides. No trabalho de Rotarenco et al. (2009), algumas sementes também não expressaram a coloração arroxeada no endosperma, possivelmente devido ao fato de o indutor não ser homozigoto R1 ou o doador ser homozigoto Cl-1 do alelo dominante que inibe a expressão da antocianina no endosperma. Este gene ocorre frequentemente em materiais flint europeus ou tropicais (BELICUAS et al., 2007). Em alguns casos, quando o gene R1-nj é pouco expressado, a validação dos haploides putativos é possível precocemente nos estágios de plântula, havendo a ausência da coloração no coleóptilo e radículas que são expressos pelo gene Pl1 presente nos indutores. Lashermes e Beckert (1988) utilizaram outros marcadores fenotípicos para identificar haploides. Os autores utilizaram os genes da ausência de lígula e glossy (lg1, lg2 e gl1) e verificaram que a frequência de indução variava de 0,4% a 2,4%..

(19) 18. 2.4 Comparação entre linhagens duplo-haploides e convencionais Apesar das vantagens do novo método de obtenção de linhagens de milho, o uso de DH continuou restrito pela dificuldade de geração de linhagens a partir destes haploides. Resultados promissores utilizando linhagens indutoras foram obtidos somente após a década de 1980 (CHALYK, 1999; SARKAR et al., 1994; SHATSKAYA et al., 1994). O desenvolvimento da técnica de indução de gimnogenese in situ facilitou a produção em escala de indivíduos DH. Linhagens duplo-haploides obtidas por meio de culturas de anteras e linhagens convencionais obtidas de descendente de semente única (SSD) foram comparadas por Murigneux, Baud e Beckert (1993). Os autores observaram que a altura de espigas é maior em DHs. Chalyk (1994) avaliou plantas haploides obtidas por cruzamento com o indutor ZMK e verificou taxas de diploidização espontânea entre 3,3% e 3,6%. Na comparação com linhagens convencionais, observou-se que plantas duplohaploides são inferiores em algumas características, quando comparadas às linhagens convencionais, uma vez que não sofreram seleção natural e visual para a sua obtenção. Dentre as características para as quais os DH se mostram inferiores estão inserção de espiga, largura de folhas, número de nós, tamanho de pendão, diâmetro e número de espigas. Porém, estas apresentaram boa capacidade de combinação, sendo duas superiores às convencionais, seis com desempenho similar e duas com desempenho inferior. Bordes et al. (2006) avaliaram e compararam linhagens DH com progênies S1 e consideraram que, em teoria, num programa de seleção recorrente, o uso de DHs pode aumentar o ganho genético por unidade de tempo, devido ao aumento da variância genética entre unidades testadas que lidera o aumento da herdabilidade. Também observaram que a vantagem das DHs é a possibilidade de realizar o test-cross com linhagens terminadas e totalmente.

(20) 19. homozigotas. Login et al. (2007) compararam diferentes esquemas de melhoramento utilizando linhagens DH obtidas de plantas F1 ou F2 e levaram em consideração o número ótimo de famílias, o ganho de seleção, os componentes de variância, o orçamento e o tempo de produção. Concluíram que o melhor esquema está em realizar um test-cross com plantas F2 cruzadas com um testador e, simultaneamente, com as sementes remanescentes, cruzar com o indutor. As famílias selecionadas são duplicadas e as linhagens obtidas são novamente cruzadas com um testador. Barbosa (2009), comparando o desequilíbrio de ligação entre linhagens duplo-haploides e linhagens convencionais, observou que, em linhagens duplohaploides, o desequilíbrio de ligação foi maior que nas linhagens convencionais para uma mesma distância em todos os marcadores. Sugere, dessa forma, que, com a duplicação de indivíduos haploides, a segregação ocorre em blocos maiores, resultando em um maior número de genes. Assim, Bernardo (2009) sugere utilizar plantas F2 para a geração de linhagens DH, visto que a taxa de recombinação nessa geração é maior que em plantas F1. Este mesmo autor, objetivando identificar a influência da origem genética das populações na taxa de indução de haploides, constatou que, realmente, a origem genética das populações influencia a taxa de indução de haploides e também a sobrevivência em casa de vegetação, após o tratamento com colchicina.. 2.5 Duplicação cromossômica artificial A duplicação cromossômica costumava ser uma restrição na produção de linhagens DH em escala comercial, inicialmente devido ao fato de a duplicação espontânea ocorrer em baixa frequência e somente em poucos germoplasmas e, posteriormente, em função de os protocolos de duplicação artificial serem pouco eficientes. A duplicação cromossômica artificial em milho.

(21) 20. utiliza bloqueadores mitóticos, sendo a colchicina bastante empregada pelos pesquisadores, em concentrações que variam de 0,02% a 0,125%. A colchicina se liga à tubulina e inibe a polimerização dos microtubulos que compõem as fibras dos fusos, não havendo, assim, a migração dos cromossomos para os polos das células. Dessa forma, as células que anteriormente eram n (haploides) passam a ser 2n (BELICUAS et al., 2007). Gayen et al. (1994) inovaram a duplicação artificial em milho, cortando a ponta do coleóptilo das plântulas haploides (com 3-4 dias de germinação) e colocando-as imersas em uma solução de colchicina mais dimetil sulfóxido (DSMO), por 12 horas, a 18 °C. Anos mais tarde, Deimling, Röber e Geiger (1997) aumentaram ainda mais a eficácia do método, reduzindo as raízes de 2030 mm e colocando as plântulas imersas no escuro. Outro método utilizado para a duplicação foi desenvolvido por Zabirova et al. (1996), em que, no estádio de 3-4 folhas, a solução de colchicina é injetada cerca de 3-5 mm acima do ápice. Após a injeção, as plântulas são mantidas no escuro, por dois dias, a 18 ºC e, em seguida, plantadas em campo. Chalyk (2000), utilizando haploides maternais, comparou a eficiência dos métodos citados, avaliando a porcentagem de linhagens DH com pendão fértil. Além dos métodos conhecidos, os pesquisadores fizeram outros dois tratamentos com variações de temperatura e concentração de colchicina no método proposto por Deimling, Röber e Geiger (1997), para verificar se havia diferenças nos resultados. Os resultados demonstraram que os métodos desenvolvidos foram bastante eficientes, nas condições em que o trabalho foi realizado. O método de Deimling, Röber e Geiger (1997) permitiu a obtenção de 28,8% e 31,8% de haploides com pólen fértil, nas temperaturas de 18 °C e 26 °C, após o tratamento. O uso de injeção de colchicina, de acordo com o método de Zabirova et al. (1996), resultou em 27,5% de plantas haploides com pólen fértil. Essa porcentagem foi semelhante à obtida com o método usado por Deimling, Röber.

(22) 21. e Geiger (1997), e ao que foi relatado por Eder e Chalyk (2002). A tentativa de reduzir a concentração de colchicina não teve resultados positivos e nenhuma planta apresentou pólen fértil.. 2.6 Citometria de fluxo para análise de ploidia A técnica de citometria de fluxo foi desenvolvida, para a contagem e a análise de células sanguíneas, por volta da década de 1940 (DOLEZEL; GREILHUBER; SUDA, 2007). As duas áreas que impulsionaram o seu desenvolvimento foram a hematologia e a imunologia (CÔRTE-REAL et al., 2002). No entanto, com o avanço da técnica e o uso de novos marcadores fluorescentes, essa técnica generalizou-se para outras áreas, como a citogenética vegetal e microbiana (DOLEZEL; GREILHUBER; SUDA, 2007). A técnica de citometria de fluxo é baseada na análise de propriedades óticas, como dispersão da luz e fluorescência de partículas (núcleos, organelas, células e cromossomos) que fluem em uma suspensão líquida. As partículas em suspensão movem-se emergidas num fluido (tampão de extração) no interior de um capilar, dentro de um aparelho denominado citômetro de fluxo. Essas partículas intersectam uma a uma um feixe de laser, ocorrendo um processo de dispersão da luz e ou emissão de fluorescência. Dessa forma, podem-se verificar, simultaneamente, as distribuições dos valores da frequência e/ou densidade de cada parâmetro. Os sinais gerados pelas partículas são convertidos em valores digitais, armazenados e exibidos na forma de histogramas (DOLEZEL, 1997). Por meio de citometria de fluxo é possível mensurar o conteúdo de DNA de núcleos, permitindo avaliar o nível de ploidia, fazer comparações intra e interespecíficas do tamanho nuclear, avaliar o teor de DNA de cada cromossomo do complemento de uma espécie, realizar estudos do ciclo celular, análises de.

(23) 22. citogenotoxicidade. e. determinação. do. sexo. (HESLOP-HARRISON;. SCHWARZACHER, 2001). Nos eucariontes, o crescimento e a divisão celular são processos cíclicos. O tempo entre cada mitose encontra-se dividido em três fases: G1, S e G2. Durante a fase G1, período de crescimento celular, uma célula diploide apresenta um conteúdo 2C, possuindo, assim, duas cópias de cada cromossomo. Durante a fase S ocorre a duplicação do genoma nuclear e, na fase seguinte (fase G2), ocorre o segundo período de crescimento celular, durante o qual o conteúdo de DNA nuclear é mantido no nível 4C. Em seguida, ocorre à mitose (fase M), durante a qual a célula se divide, formando-se duas células filhas, cada uma com um conteúdo 2C de DNA. Numa população de células em crescimento, o número de núcleos na fase G1 é maior do que na fase G2. Dessa forma, nos histogramas obtidos pelos citômetros de fluxo em uma análise de ploidia observa-se o pico de maior intensidade referente à fase G1 do ciclo celular e a fase G2 apresenta um pico menor. A quantificação do nível de ploidia por citometria de fluxo é realizada pela análise da intensidade de fluorescência emitida pelos núcleos corados com fluorocromos específicos para DNA. A estimativa do nível de ploidia é feita comparando-se os picos G1 do histograma de uma amostra com o pico de uma planta padrão com ploidia conhecida (DOLEZEL, 1997). Portanto, a quantificação de DNA por citometria de fluxo é uma excelente alternativa, quando comparada aos métodos clássicos de contagem cromossômica. Apresenta como vantagens: fácil preparação da amostra; é mais rápida, podendo ser processadas várias amostras em um dia; não necessita de células em divisão; é um método não destrutivo e é capaz de detectar mixoploidia (LOUREIRO; SANTOS, 2004). O emprego da citometria de fluxo para a determinação do nível de ploidia em muitos acessos de espécies cultivadas foi bem sucedido. Por meio.

(24) 23. dessa técnica foi feita a caracterização do nível de ploidia de vários acessos do germoplasma de diversas espécies, como, por exemplo, Medicago sativa (BRUMMER; CAZCARRO; LUTH, 1999), Bromus ssp. (TUNA et al., 2001) e Dioscorea alata (EGESI, 2002). Em milho, a técnica de citometria de fluxo foi utilizada na identificação de haploides (BELICUAS, 2004; DANG et al., 2012; GEIGER; SCHÖNLEBEN, 2011; RABEL, 2008).. 2.7 Marcadores moleculares SSR na identificação de haploides Atualmente, os marcadores moleculares são considerados uma importante ferramenta para o melhoramento vegetal, fornecendo grande quantidade de polimorfismo não afetada pelos efeitos ambientais e estágios de desenvolvimento da planta. Seu emprego vem sendo realizado com diversas finalidades, tais como avaliação da diversidade genética, proteção de cultivares, pureza genética, seleção de genótipos em programas de melhoramento, construção de mapas genéticos e identificação de haploides (BELICUAS, 2004; LANZA; GUIMARÃES; SCHUSTER, 2000). Vários são os tipos de marcadores moleculares e, segundo Milach (1998), eles podem ser divididos em dois grupos, os de hibridação e os de amplificação. Os microssatélites, ou Simple Sequence Repeats (SSR), são do grupo de amplificação e utiliza a técnica denominada de polymerase chain reaction (PCR). Essa técnica envolve a síntese in vitro de um segmento específico de DNA na presença da enzima DNA polimerase. Esta enzima inicia a síntese de DNA a partir de um pequeno segmento chamado de primer. Os primers são pequenas moléculas de DNA de fita simples sintetizadas artificialmente, com sequências de nucleotídeos complementares às sequências específicas que flanqueiam a região alvo (BORÉM; CAIXETA, 2006)..

(25) 24. A preferência pelos marcadores SSR deve-se à agilidade da PCR. Além disso, são codominantes e estão espalhados ao acaso no genoma, com uma frequência relativamente alta (AKKAYA; BHAGWAT; CREGAN, 1992). Os SSR possuem de 1 a 6 nucleotídeos repetidos de 10 a 60 vezes em tandem, ao longo da molécula de DNA, amplamente distribuídas nos genomas eucariotos, que são flanqueadas por regiões conservadas entre indivíduos da mesma espécie (CAIXETA et al., 2006). A característica de codominância dos SSR possibilita a distinção entre o homozigoto e heterozigoto. Mesmo em genótipos de milho simples, detentores de base genética estreita, eles podem detectar alto número de alelos por loco. Devido a isso e à estabilidade da herança mendeliana dos locos SSR, permite que este seja uma alternativa interessante na diferenciação de indivíduos haploides dos F1 heterozigotos, quando utilizadas linhagens indutoras de haploidia para a obtenção de linhagens DH. Belicuas et al. (2007), utilizando marcadores SSR, fizeram a identificação de haploides em milho, com posterior confirmação destes por meio de outras técnicas, como contagem cromossômica e citometria de fluxo..

(26) 25. 3 MATERIAL E MÉTODOS. 3.1 Área experimental Os campos de cruzamentos foram conduzidos nos municípios de Cravinhos (situado a 650 m de altitude, nas coordenadas 21° 20′ 25″ de latitude Sul e a 47° 43′ 46″ de longitude Oeste, no estado de São Paulo) e Ponta Grossa (situado a 975 m de altitude, nas coordenadas 25° 5′ 42″ de latitude Sul e 50° 9′ 43″ de longitude Oeste, no estado do Paraná). As atividades laboratoriais e a aclimatação das plântulas foram realizadas no Departamento de Biologia da Universidade Federal de Lavras, no município de Lavras, situado a 918 m de altitude, nas coordenadas 21o14’30’’ de latitude Sul e a 45o00’10’’de longitude Oeste, no estado de Minas Gerais. Posteriormente, as plantas duplicadas foram conduzidas em Ijaci, MG (a 830m de altitude, nas coordenadas 21° 9′ 24″ Sul, 44° 55′ 34″ Oeste).. 3.2 Genótipos avaliados Foram utilizados seis híbridos F1 e suas gerações F2, de diferentes origens, os quais foram cruzados com dois indutores de haploidia (Tabela 1). A linhagem indutora de haploidia Wisconsin-23 (KERMICLE, 1969) (sistema androgenético), que carrega o alelo mutante ig e também alelos do sistema Rnavajo (R1-nj), foi utilizada como parental feminino e o outro indutor, KEMS (SHATSKAYA et al., 1994), que também carrega o alelo dominante R1-nj (sistema gimnogenético), como parental masculino. Em cada local, para favorecer a sincronia de florescimento, as sementes dos híbridos foram semeadas dez e quatorze dias antes da semeadura das linhagens indutoras, devido ao fato de estas possuírem origem temperada e serem mais precoces..

(27) 26. Tabela 1 Identificação dos híbridos cruzados com os indutores para a obtenção de haploides Híbridos Textura de grão Ciclo Origem P30F53 Semiduro Precoce Pionner DKB240 Dentado Superprecoce Monsanto L3/DENT Dentado Precoce UFLA 30/31 Duro Precoce Geneseeds 43/48 Dentado Precoce Geneseeds GNZ 2004 Dentado Precoce Geneze Sementes O campo de cruzamento em Ponta Grossa, PR, foi conduzido na safra 2010/11 e, em Cravinhos, SP, na safrinha 2011. Para cada local, os indutores foram semeados em 20 linhas de 5 m, a fim de garantir a quantidade mínima de plantas para a realização dos cruzamentos. As sementes dos híbridos (F1) e suas gerações F2 foram semeadas em duas linhas de 5 m. Duas sementes por cova foram distribuídas em linhas espaçadas de 80 cm, com 20 cm entre plantas. Aproximadamente 15 dias após a emergência das plantas, foi realizado o desbaste, deixando-se cinco plantas por metro linear. A adubação de semeadura foi de 500 Kg.ha-1 do formulado 10-30-10 e, em cobertura, foram aplicados 500 Kg.ha-1 de 20-0-20, após o desbaste. Os demais tratos culturais foram realizados conforme recomendação para a cultura do milho.. 3.3 Obtenção e identificação de haploides As sementes obtidas entre os cruzamentos citados anteriormente foram secas a 13% de umidade e separadas visualmente pela coloração do endosperma e embrião. Grãos com endosperma roxo e embrião branco foram considerados haploides e selecionados conforme descrito por Chase e Nanda (1965). As sementes selecionadas de acordo com o marcador morfológico Rnavajo foram colocadas para germinar, por 72 horas, em papel de germinação.

(28) 27. umedecido, no germinador de marca Mangelsdors, com temperatura controlada de 23 oC. Com a finalidade de eliminar os falsos haploides, antes da realização da duplicação cromossômica, depois de germinadas, as plântulas com baixo vigor apresentando radículas e coleóptilo menores foram selecionadas como haploides (Figura 1).. Figura 1 Classificação das plântulas pelo vigor, após a germinação das sementes identificadas como haploides, pelo marcador R-navajo 3.4 Duplicação cromossômica No Laboratório de Citogenética do Departamento de Biologia da UFLA, as plântulas de menor vigor identificadas como possíveis haploides foram submetidas ao tratamento de duplicação cromossômica com solução de 0,06% de colchicina e 0,5% de dimetil sufóxido, por 12 horas, de acordo com o protocolo proposto por Deimling, Röber e Geiger (1997). A única adaptação do protocolo foi de não cortar as pontas dos coleóptilos. Após o tratamento com colchicina, as plântulas foram lavadas, por 20 minutos, em água corrente e transferidas para bandejas de isopor com células de 1 cm3 em substrato vegetal. As plântulas foram aclimatadas na casa de vegetação do Departamento de Biologia da Universidade Federal de Lavras, e.

(29) 28. permaneceram em ambiente controlado por 20 dias. Nesse período, foi realizada a adubação foliar com monoamônio fosfato-MAP purificado, a 5% de concentração.. 3.5 Avaliação da duplicação cromossômica por citometria de fluxo No Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas, no Departamento de Agricultura da Universidade Federal de Lavras, foi feita a confirmação da duplicação dos cromossomos das plântulas haploides por meio da técnica de citometria de fluxo (GALBRAITH et al., 1983), realizada entre 15 e 20 dias após o tratamento com colchicina. Para a análise do conteúdo de DNA pela técnica de citometria de fluxo, foram utilizadas folhas jovens com 20-30 mg dos genitores (os seis híbridos e os dois indutores) e dos 918 descendentes obtidos desses cruzamentos, que sobreviveram à duplicação cromossômica. Juntamente com cada amostra, utilizaram-se, como padrão interno de referência, 20-30 mg de folhas jovens de Vicia faba (26,9 pg/2C). As amostras de cada plântula de milho e de Vicia faba foram coletadas e fragmentadas com bisturi em uma placa de Petri contendo 1 mL de tampão de extração LB01 gelado, para a obtenção da suspensão nuclear (DOLEZEL, 1997). A suspensão foi aspirada com pipeta plástica e gaze para evitar a passagem de fragmentos maiores dos tecidos vegetais e, posteriormente, filtrada em uma malha de náilon (50 μm), durante a transferência para um tubo de polietileno. Utilizaram-se 25 μL do tampão de extração contendo 1 mg/mL de iodeto de propídeo e 2,5 μL de RNase, os quais foram adicionados à suspensão em temperatura ambiente. Cada suspensão foi analisada no citômetro de fluxo (FacsCaliburBecton Dickinson). Os histogramas obtidos foram analisados pelos softwares Cell Quest e WinMDI 2.8 (2009). A estimativa do conteúdo de DNA nuclear.

(30) 29. (pg) de cada amostra foi realizada por meio da comparação da posição do seu pico G1 com o pico G1 do padrão interno de referência, com conteúdo de DNA conhecido. Para essa comparação, foi utilizada a seguinte expressão: Q = (E/S) x R. (1). em que Q é a quantidade de DNA da amostra (pg/2C); E é a posição do pico G1 da amostra; S é a posição do pico G1 do padrão de referência; R o conteúdo de DNA do padrão (26,9 pg/2C). As médias das quantidades de DNA foram calculadas para análise dos resultados. Assim, por meio da quantidade de DNA, foi possível fazer inferências a respeito do nível de ploidia do material avaliado.. 3.6 Avaliação da duplicação cromossômica pela fertilidade do pendão Após 20 dias da aplicação do protocolo para duplicação cromossômica, as plantas foram transplantadas para ambiente protegido com cobertura de lona plástica transparente nas dependências da empresa HortiAgro, localizada no município de Ijaci, MG. Todas as plantas foram identificadas para que houvesse o rastreamento e a possibilidade de confrontar os resultados de citometria com os dados de fertilidade do pendão. A adubação de semeadura foi de 450 kg do formulado 8-28-16, com espaçamento de 0,6 m entre linhas e 0,3 m entre plantas. A adubação de cobertura e os tratos culturais foram realizados conforme o recomendado para a cultura na região..

(31) 30. As espigas foram protegidas com sacos plásticos antes da emissão do estilo estigma das plantas, para que a autofecundação pudesse ser realizada posteriormente. As informações sobre a fertilidade do pendão foram coletadas de cada planta, após a emissão dos mesmos, sendo classificados em pendão fértil e estéril (Figura 2).. Figura 2 Plantas com diferentes fertilidades de pendões. (A) Pendão fértil e (B) pendão estéril As plantas que produziram pólen foram autofecundadas para a manutenção e a multiplicação de sementes.. 3.7 Avaliação da duplicação cromossômica por marcadores microssatélites No Laboratório de Genética Molecular do Departamento de Biologia extraiu-se o DNA do indutor KEMS dos 6 híbridos e de 65 plantas provenientes do cruzamento entre o indutor KEMS e os híbridos. A amostragem foi realizada procurando-se coletar DNA de plantas classificadas como haplóides, haploides/diploides, diploides e diploides/tetraploides pela citometria de fluxo, que produziram pólen e possuíam folhas verdes. O procedimento de extração foi realizado conforme Pereira et al. (2007). Foram coletadas 3 g de folhas de cada planta. Em seguida, foram trituradas com 10 ml de tampão de extração e 20 μl.

(32) 31. de β-mercaptoetanol, em um almofariz com nitrogênio líquido. O tampão de extração foi constituído por 2% de CTAB, 100 mM de TRIS (pH 8,0), 1,4 M de NaCl e 1% de polivinilpirrolidona (PVP). O material triturado foi colocado em tubos de centrífuga e incubado, em banho-maria, a 65 ºC, por 30 minutos. Durante a incubação em banho-maria, os tubos foram agitados levemente e, depois de centrifugados, o sobrenadante contendo os ácidos nucleicos foi coletado. Em seguida, os ácidos nucleicos foram extraídos com 10 ml da mistura clorofórmio:álcool isoamil (24:1). Estes foram precipitados pela adição de 30 ml da mistura de etanol 95% e acetato de amônio 7,5M (6:1), os quais foram mantidos em freezer, a -20 ºC, por, aproximadamente, 12 horas. Após a precipitação, os ácidos nucleicos foram transferidos para microtubos centrifugados e secos. Posteriormente, foram reidratados em tampão TE (1 mM de TRIS e 0,1 mM de EDTA). Logo após a segunda extração com clorofórmio: álcool isoamil (24:1), o sobrenadante foi precipitado pela adição de, pelo menos, três volumes de uma mistura de acetato de sódio 3M:etanol 95% (1:20). Os ácidos nucleicos precipitados foram reidratados em tampão TE. Uma terceira extração foi realizada com clorofórmio-alcool-isoamil, com igual volume de TE. Coletou-se o sobrenadante e o DNA foi precipitado (durante, aproximadamente, 12 horas, no freezer) com álcool acetato de sódio, até completar o tubo (1,5 μl). Centrifugou-se por 10 minutos, a 10.000 rpm e os ácidos nucleicos foram reidratados com tampão de TE. Alíquotas de DNA obtidas de cada indivíduo foram quantificadas em gel de agarose 1%, ao lado de um padrão de concentração de DNA, construído a partir de DNA de fago λ, nas concentrações de 100, 200 e 300 ng/μl. Mediante comparação visual da intensidade das bandas do DNA das amostras e dos padrões, a concentração de cada amostra foi estimada e, posteriormente, diluída para a concentração de 10 ng/μl, utilizada nas reações..

(33) 32. Cada reação continha volume total de 11,06 μL. Esta foi preparada pela mistura dos seguintes reagentes com as respectivas concentrações (PEREIRA et al., 2007): 2,25 μL de DNA genômico, 1μL de uma solução contendo os ácidos desoxirribonucleotídeos (dATP, dGTP, dCTP e dTTP), 0,6 μL da enzima Taq DNA polimerase, 0,8 μl do par de primer, 1,00 μL de tampão de reação (50 mM tris pH 8,3; 2,0 mM MgCl2; 20 mM de KCl; 10 μg de BSA; 0,25% de ficol 400; 10 mM de tartrazine) e 4,45 μL água bidestilada até totalizar o volume final. As amplificações foram realizadas em tubos de 0,2 ml, em termociclador modelo Mastercycler Eppendorf. A programação do equipamento foi de cinco minutos, a 95 ºC, para desnaturação do DNA, oito ciclos, em que foram usados 20 segundos, à temperatura de 94 ºC para desnaturação, 20 segundos para anelamento do primer, cuja temperatura foi de 55 ºC e 60 ºC, dependendo do primer testado, 1 minuto a 72 ºC, para extensão de DNA, 24 ciclos que diferiram dos primeiros apenas na temperatura de anelamento de 52 ºC a 65 ºC e uma extensão final, por quatro minutos, a 72 ºC. As reações amplificadas foram submetidas à eletroforese vertical por uma hora e quarenta minutos, a 130 V, em gel de poliacrilamida 6%. Logo depois, corou-se o gel em solução de nitrato de prata, durante 10 minutos, seguido de enxague em água corrente e, então, foi imerso em solução reveladora, até o aparecimento das bandas. O gel foi avaliado em luz fluorescente e fotografado com câmera digital. Utilizara-se 25 primers indicados para a cultura do milho, de acordo com Veiga (2011), em estudo de QTLs associados à resistência à cercosporiose e produção de grãos de milho. Dentre os 25 primers utilizados, cinco deles (BNLG1175, BMC 1714, BNLG 1520, BNLG 1233 e BNLG 1258) foram considerados polimórficos entre os genitores, cujas bandas apresentaram, boa definição no gel. Estes foram usados nas progênies para analisar e comprovar a paternidade dos haploides..

(34) 33. 3.8 Análises estatísticas As análises foram realizadas utilizando-se locais como repetições e as proporções observadas foram avaliadas usando-se a abordagem de modelos lineares generalizados mistos (MLGM), de forma análoga ao proposto por Nunes, Moraes e Bueno Filho (2004), uma vez que foi detectada superdispersão. Neste caso, foi empregado o MLGM binomial com a função de ligação logit, conforme descrito a seguir:. (2). (3). em que Rijk/pijk: proporção observada na parcela que recebeu o híbrido j na geração k e no local i, admitida condicionalmente, independente ao efeito aleatório de parcela; µ: intercepto; li: efeito fixo do local i; hj: efeito fixo do híbrido j; gk: efeito fixo da geração k; hgjk: efeito fixo da interação do híbrido j com a geração k; Pijk: efeito aleatório da parcela ijk, sendo pijk ~ N (0, σp2)..

(35) 34. Os MLGMs foram ajustados com estimação dos efeitos fixos e aleatórios, bem como dos componentes de variância, via maximização da função de verossimilhança restrita (REML). Para isso, utilizou-se o pacote lme4 do programa R (versão 2.14) (BATES; MAECHLER; BOLKER, 2011). A significância dos efeitos do modelo foi verificada via análise de “deviance”, com aplicação do teste estatístico de χ2 (qui-quadrado), a 5% de probabilidade (CORDEIRO; DEMÉTRIO, 2007). Evidenciada a significância, especialmente para híbridos e interação híbridos x gerações, procedeu-se ao agrupamento, com base na distância de Mahalanobis, pelo método do vizinho mais próximo e estabelecido o ponto de corte usando o método de reamostragem bootstrap (MOURÃO JÚNIOR, 2001)..

(36) 35. 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Obtenção de haploides identificados pelo marcador morfológico Rnavajo Em ambos os locais, as linhagens indutoras foram muito precoces e ocorreu maior coincidência no florescimento com os genótipos doadores, quando estes foram semeados 14 dias antes das linhagens indutoras. Rabel (2008) observou resultado similar quando conduziu cruzamentos com a linhagem indutora W23, no Brasil. Este autor encontrou maior coincidência de florescimento com os genótipos doadores de pólen quando estes foram semeados 16 dias antes da linhagem indutora. A precocidade é justificada pelo fato de linhagens indutoras de haploidia possuírem origem temperada. Belicuas (2004) e Rabel (2008) descreveram a suscetibilidade da linhagem W23 a doenças de final de ciclo e baixa adaptação às condições tropicais de cultivo. Neste trabalho, esses fatores foram bastante evidentes, de modo que, com a mesma quantidade de plantas e com os mesmos cruzamentos realizados entre os dois indutores com os genótipos doadores, a linhagem W23 apresentou um número menor de sementes de possíveis haploides, quando comparada com o indutor KEMS (Tabela 2). A maior quantidade de sementes obtidas pelos cruzamentos realizados com o indutor KEMS já era esperada, uma vez que este é utilizado como parental masculino, sendo que as sementes colhidas dos genótipos doadores vieram a partir de plantas adaptadas às condições tropicais de cultivo, além de este indutor possuir maior taxa de indução (SHATSKAYA et al., 1994)..

(37) 36. Tabela 2 Número de sementes totais e classificadas como haploides, identificadas pelo marcador morfológico R-navajo, obtidas dos cruzamentos com os indutores KEMS e W23 em Ponta Grossa, PR (safra 2010/11) e Cravinhos, SP (safra 2011) Indutor. Híbrido. KEMS KEMS KEMS KEMS KEMS KEMS KEMS KEMS KEMS KEMS KEMS KEMS W23 W23 W23 W23 W23 W23. 30F53 30F53 DKB240 DKB240 L3/DENT L3/DENT 30/31 30/31 43/48 43/48 GNZ 2004 GNZ 2004 30F53 30F53 DKB240 DKB240 L3/DENT L3/DENT. Ponta Grossa-PR Gerações Total Haplóides Indução de haplóides (%) F1 1781 118 6,6 F2 974 72 7,4 F1 330 106 32,1 F2 1792 73 4,1 F1 1207 152 12,6 F2 403 58 14,4 F1 1574 207 13,2 F2 537 76 14,2 F1 1668 113 6,8 F2 1306 110 8,4 F1 2067 383 18,5 F2 1191 378 31,7 F1 532 23 4,3 F2 404 11 2,7 F1 751 39 5,2 F2 409 36 8,8 F1 438 44 10,0 F2 139 13 9,4. Total 1389 662 3745 569 1100 548 1831 135 2855 1192 2090 2452 1440 821 713 587 407 255. Cravinhos-SP Haplóides Indução de haplóides (%) 113 8,1 26 3,9 106 2,8 19 3,3 107 9,7 72 13,1 228 12,5 13 9,6 176 6,2 23 1,9 193 9,2 241 9,8 63 4,4 7 0,9 13 1,8 2 0,3 3 0,7 0 0,0. Mesmo sendo suscetível às doenças e pouco adaptado, este indutor apresentou quantidade satisfatória de pólen, favorecendo a produção de sementes. Entretanto, Prigge et al. (2011), utilizando indutores derivados do indutor KEMS em condições tropicais de cultivo, observaram que, além de apresentarem baixa performance para as características agronômicas, a quantidade produzida de pólen sob condições de altas temperaturas dificultou a produção de sementes dos cruzamentos com algumas fontes de germoplasma, como também ocorreram dificuldades na produção de sementes do indutor. Estes autores salientam a necessidade de desenvolvimento de indutores tropicalizados..

(38) 37. Para alguns cruzamentos com a linhagem indutora W23 não foi possível obter sementes devido a fatores ambientais e à falta de coincidência de florescimento. Dessa forma, foram utilizados os dados dos cruzamentos balanceados, ou seja, quando se obtiveram sementes dos híbridos com as duas gerações e nos dois locais (Tabela 2). Portanto, o número de híbridos avaliados com o indutor KEMS foi maior do que os obtidos pelo cruzamento com a linhagem indutora W23. Pelo teste da razão de verossimilhança, com probabilidade de 5%, houve diferença significativa entre os indutores na taxa de indução de haploides. O indutor de haploides maternos KEMS teve uma porcentagem média de indução de 7,1% (Tabela 2). Este valor é semelhante ao encontrado por Shatskaya et al. (1994), que obtiveram porcentagem de indução variando de 6,3% a 8%. A taxa de indução de haploides da linhagem W23 caracterizados pelo Rnavajo variou de 0 a 10% (Tabela 2). Kermicle (1969) relatou que a porcentagem de indução de haploides com esse indutor varia de 1% a 3%. Belicuas (2004) e Rabel (2008) também encontraram porcentagens de indução elevadas, com base na observação da expressão do marcador morfológico Rnavajo. No entanto, quando utilizaram métodos mais precisos para a confirmação da haploidia, constataram a alta frequência de falsos haploides. Belicuas (2004) utilizou 425 sementes identificadas como haploides pelo marcador R-navajo e obteve, a partir destas, somente quatro plantas haploides induzidas pela W23. Ciente deste fato, e como as quantidades das sementes de possíveis haploides por genótipos obtidas nesta pesquisa foram pequenas, o restante das análises para identificar efeitos de híbridos, gerações e locais foi realizado considerando apenas os dados dos híbridos cruzados com o indutor KEMS que produziu sementes. Na Tabela 3 apresenta-se o resumo da análise de “deviance” da proporção de haploides (identificados por meio do marcador R-navajo) pelo total.

(39) 38. de sementes obtidas do cruzamento de seis híbridos e suas gerações F2 com o indutor KEMS. Diferenças significativas foram observadas para os efeitos de locais e híbridos. Tabela 3 Resumo da análise de “deviance” para taxa de indução de haploides identificados pelo marcador R-navajo dos seis híbridos cruzados com o indutor KEMS FV GL DEVIANCE Locais 1 12,58* Híbridos 5 15,56* Gerações 1 1,29 Híb x Ger 5 7,42 * Diferenças significativas, pelo teste χ2, com probabilidade de 0,05. O efeito não significativo para gerações demonstra que, mesmo com uma geração de endogamia, esta não interfere na taxa de indução de haploides dos híbridos, não havendo diferença significativa na taxa de indução de haploides entre uma geração e outra. As médias ajustadas obtidas pela análise de “deviance” da taxa de indução em Ponta Grossa foram de 16,9% e, em Cravinhos, de 9,2%. As porcentagens médias de indução dos locais ficaram acima do normalmente relatado nos cruzamentos com esse indutor (SHATSKAYA et al., 1994). Röber, Gordillo e Geiger (2005) utilizaram vários indutores, entre eles o indutor KEMS, e encontraram diferenças significativas entre os ambientes. Esses autores enfatizaram que o ambiente pode influenciar, de várias formas, a taxa de indução. Entretanto, Eder e Chalyk (2002), quando utilizaram o indutor MHI para a indução de haploides em ambiente controlado e em campo, não encontraram diferença significativa na taxa de indução entre os ambientes. De acordo com Rotarenco, Kirtoca e Jacota (2007), um fator que pode influenciar a taxa de indução de haploides é a época da polinização. Segundo o autor, a melhor fase para a polinização visando uma maior indução de haploidia.

(40) 39. é no terceiro dia após o aparecimento do estilo estigma. A partir disso há um decréscimo na indução de haploides. A porcentagem de indução avaliada pelo marcador R-navajo variou significativamente entre os híbridos. Os híbridos GNZ 2004, L3/DENT e 30/31 foram os que apresentaram as maiores taxas de indução de haploides (Tabela 4). Tabela 4 Médias ajustadas das taxas de indução de haploides identificados pelo marcador morfológico R-navajo, oriundos dos cruzamentos dos seis híbridos com o indutor KEMS Híbridos Taxa de indução (%) 30F53 4,5 b DKB240 4,5 b L3/DENT 9,0 a 30/31 8,9 a 43/48 3,7 b GNZ 2004 11,6 a *Porcentagens médias seguidas da mesma letra pertencem ao mesmo agrupamento, com base na distância de Mahalanobis, com ponto de corte a 5% de probabilidade.. Ao avaliar diversos germoplasmas aliados a diferentes texturas de grãos, Barbosa (2009), Eder e Chalyk (2002) e Röber, Gordillo e Geiger (2005) encontraram diferenças entre genótipos na taxa de indução de haploides. Prigge et al. (2011) também relataram diferenças significativas entre diferentes germoplasmas. Segundo os autores, há maior facilidade em identificar haploides pelo marcador morfológico R-navajo em híbridos, comparado à utilização de populações segregantes. Dessa forma, outros métodos (vigor das plântulas, coloração do coleóptilo, quantidade de óleo no embrião e características fenotípicas das plantas durante seu desenvolvimento) para a identificação de haploides devem ser utilizados para eliminar os indivíduos falsos haploides, classificados pelo marcador R-navajo..

(41) 40. 4.2 Seleção de haploides pelo vigor das plântulas A seleção de haploides pelo vigor das plântulas precedeu a duplicação cromossômica, a fim de identificar possíveis falsos haploides selecionados pelo marcador morfológico R-navajo. Dessa forma, daquelas sementes classificadas pelo marcador morfológico como haploides, selecionaram-se as plântulas com menor vigor, sendo estas consideradas como haploides. Rotarenco, Adicu e Sarmaniuc (2009), trabalhando com indutores de haploides maternos, verificaram que, mesmo na presença do gene inibidor de antocianina Cl-1, é possível selecionar os haploides pelo baixo vigor e/ou coloração púrpura das radículas. Os mesmos autores salientam que é possível identificar haploides nas sementes pelo marcador R-navajo, pelo vigor de plântulas e em plantas adultas. Durante a avaliação de plântulas, foi identificada alta taxa de falsos haploides que anteriormente foram selecionados com relação ao marcador morfológico R-navajo. Isso permitiu a redução significativa da quantidade de plântulas que foram tratadas com colchicina. Na Tabela 5 apresenta-se o resumo da análise de “deviance” da proporção de haploides identificados pelo vigor em relação aos identificados pelo marcador R-navajo. Os resultados demonstram que houve diferença significativa entre híbridos e na interação híbridos x gerações. Tabela 5 Resumo da análise de “deviance” da proporção de haploides classificados pelo vigor, em relação aos identificados pelo marcador R-navajo FV. GL. DEVIANCE. Locais. 1. 4,47. Híbridos. 5. 17,52*. Gerações. 1. 0,4. 5. 17,24*. Híb x Ger 2. * Diferenças significativas, pelo teste χ , com probabilidade de 0,05.