DANIELE BUSSIOLI ALVES CORRÊA
“CARACTERIZAÇÃO DE NOVAS ESPÉCIES DE Streptomyces
ASSOCIADAS À SARNA DA BATATA NO BRASIL”
CAMPINAS 2015
ii
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DANIELE BUSSIOLI ALVES CORRÊA
“CARACTERIZAÇÃO DE NOVAS ESPÉCIES DE Streptomyces
ASSOCIADAS À SARNA DA BATATA NO BRASIL”
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de doutora do programa de Genética e Biologia Molecular, na área de Genética de Microorganismos.
v
RESUMO
A sarna da batata é uma doença de ocorrência generalizada nas regiões produtoras do Brasil, tornando-se um fator limitante no cultivo dessa cultura. Essa doença afeta a qualidade da batata por lesões na superfície do tubérculo, que diminuem seu valor comercial ou impedem a comercialização. Diferentes espécies do gênero Streptomyces são causadoras dessa doença e o levantamento das espécies patogênicas presentes em regiões produtoras do Brasil é um fator primordial para a realização de medidas de manejo. O presente trabalho teve por objetivo a caracterização de 57 linhagens de Streptomyces, consideradas possíveis novas espécies associadas à sarna da batata no Brasil, por meio de taxonomia polifásica. Foi realizada a caracterização morfológica, bioquímica, patogênica (genes nec1, tomA e txtAB e testes de patogenicidade in vitro em rabanete e batata) e molecular (primers específicos para S.
acidiscabies, S. scabiei e S. turgidiscabies, PCR-RFLP do gene atpD, análises de multilocus -
genes atpD, gyrB, recA, rpoB, trpB e do gene 16S RNAr) das linhagens. Utilizando-se as técnicas de PCR-RFLP do gene atpD e análise de sequências dos genes atpD e rpoB as linhagens foram, inicialmente, separadas em 20 grupos genéticos (G1 a G20). Esses grupos apresentaram alta heterogeneidade com relação à morfologia da cadeia de esporos, à produção de pigmentos e ao aspecto e coloração das colônias e dos esporos, bem como na utilização de diferentes fontes de carbono. Das 57 linhagens analisadas, 24 (35,3%) apresentaram amplificação dos três genes de patogenicidade avaliados, seis (8,8%) não apresentaram nenhum dos genes e 38 (55,9%) apresentaram diferentes combinações com ausência de um ou mais genes. Todas as linhagens mostraram-se patogênicas ao rabanete causando sintomas de necrose, inchaço radial e/ou nanismo da parte aérea e raiz, no entanto, apresentaram diferenças no grau de virulência. As linhagens mais virulentas também foram avaliadas em testes de patogenicidade em fatias de batata e a agressividade das mesmas, determinada pela extensão e profundidade da necrose, foi dependente da cultivar testada, sendo que todas as variedades avaliadas foram suscetíveis. A relação filogenética das linhagens foi estabelecida junto às principais espécies de Streptomyces fitopatogênicas e a maioria dos grupos genéticos ficou alocada em ramos distintos e/ou com baixos valores de similaridade de sequências. O grupo G11 ficou filogeneticamente próximo de
S. scabiei e suas genomoespécies e o G7 próximo de S. turgidiscabies/S. reticuliscabiei, porém,
vi características morfológicas diferentes. Os dados moleculares, associados às características morfológicas, bioquímicas e patogênicas das linhagens, permitiram a confirmação de que os grupos genéticos representam pelo menos 34 novas espécies de Streptomyces fitopatogênicas no Brasil. Os polimorfismos nas sequências do gene atpD permitiram o desenvolvimento de primers específicos para as espécies S. caviscabies/S. setonii (Cavis1F/Cavis4R) e S. scabiei (ScADF2/ScADR1). A especificidade desses primers foi confirmada em experimentos de amplificação utilizando-se DNAs de outras espécies de Streptomyces causadoras da sarna da batata. O nível de sensibilidade da técnica de PCR utilizando-se os primers Cavis1F/Cavis4R foi de 0,1 pg. Ainda, nas análises de AFLP, a combinação de primers E21/M16 foi selecionada como marcador molecular para estudos taxonômicos dentro do grupo de espécies de Streptomyces fitopatogênicas.
vii
ABSTRACT
Potato scab is a widespread disease in growing areas in Brazil, becoming a limiting factor in potato production. This disease affects potato quality due to injuries on the tuber surface decreasing its market value or precluding its commercialization. Several species of the genus
Streptomyces causing potato scab are known and the survey of pathogenic species present in the
Brazilian producing areas is the most important factor for performing management measures. This study aimed to characterize 57 strains of Streptomyces, considered possible new species associated with potato scab in Brazil, through polyphasic taxonomy. The morphological, biochemical, pathogenic (nec1, tomA and txtAB genes and in vitro pathogenicity tests on radishes and potatoes) and molecular characterization (species-specific primers for S. acidiscabies, S.
scabiei and S. turgidiscabies, PCR-RFLP of atpD gene, multilocus sequence analysis of atpD, gyrB, recA, rpoB and trpB genes and 16S rRNA gene sequence analysis) of the strains were
performed. Using PCR-RFLP of atpD gene technique and sequence analysis of atpD and rpoB genes, the strains were initially separated into 20 genetic groups (G1 to G20). These groups showed high heterogeneity in their spore chains morphology, pigment production and the appearance and color of the colonies and spores, as well as the utilization of different carbon sources. From a total of 57 strains evaluated, 24 (35.3%) showed presence of the three pathogenicity genes, six (8.8%) showed no amplification of the genes and 38 (55.9%) showed absence of one or more genes. All strains were pathogenic on radish causing symptoms of necrosis, radial swelling and/or stunting of shoot and roots, however, they showed differences in virulence level. The most virulent strains were evaluated in pathogenicity test on potato tubers slices and the aggressiveness of the strains, determined by the extent and depth of necrosis, was dependent on the cultivar of potato used, and all evaluated varieties were susceptible. The phylogenetic relationship of the strains has been established with respect to the main species of plant pathogenic Streptomyces and most groups were allocated in different branches and/or with low sequence similarity values. G11 group was closely related to S. scabiei and its genomospecies and G7 was allocated with S. turgidiscabies/S. reticuliscabiei, but they showed no amplification in experiments using species-specific primers and different morphological features were observed. The molecular data, associated with morphological, biochemical and pathogenic characteristics of the strains, allowed confirmation that these genetic groups represent at least 34
viii new species of phytopathogenic Streptomyces in Brazil. The polymorphisms in the atpD gene sequences allowed the development of species-specific primers for S. caviscabies/S. setonii (Cavis1F/Cavis4R) and S. scabiei (ScADF2/ScADR1). The specificity of these primers was confirmed by amplification experiments using DNA from other Streptomyces species causing potato scab. Sensitivity level of the PCR technique using the Cavis1F/Cavis4R primers was 0.1 pg. Further, in AFLP analyzes, E21/M16 primers set was selected as molecular marker for taxonomic studies within the group of plant pathogenic species of Streptomyces.
ix
SUMÁRIO
RESUMO ... v
ABSTRACT ... vii
LISTA DE FIGURAS ... xvii
LISTA DE TABELAS E QUADROS ... xx
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ... xxii
1. INTRODUÇÃO ... 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 3
2.1. A cultura da batata e problemas fitossanitários ... 3
2.2. Sarna da batata ... 4
2.3. O gênero Streptomyces e espécies causadoras da sarna da batata ... 6
2.4. Patogenicidade de Streptomyces ... 9
2.5. Ciclo da doença e estratégias de manejo ... 13
2.5.1. Uso de cultivares resistentes ... 15
2.5.2. Uso de batata semente certificada ... 17
2.5.3. Tratamento dos tubérculos ... 18
2.5.4. Manutenção da umidade do solo ... 18
2.5.5. Acidificação do solo ... 19
2.5.6. Rotação de culturas ... 19
2.5.7. Controle químico ... 20
2.5.8. Controle biológico ... 20
2.5.9. Interferência na síntese de taxtomina ... 22
2.5.10. Identificação das espécies patogênicas ... 22
2.6. Taxonomia e caracterização ... 23
2.7. Sarna da batata no Brasil ... 27
3. OBJETIVOS ... 29 3.1. Objetivo geral ... 29 3.2. Objetivos específicos ... 29 4. MATERIAL E MÉTODOS ... 30 4.1. Linhagens ... 30 4.2. Caracterização morfológica ... 33
x
4.3. Caracterização bioquímica ... 33
4.4. Caracterização patogênica ... 35
4.4.1. Teste de patogenicidade (in vitro) em mudas de rabanete ... 35
4.4.2. Teste de patogenicidade (in vitro) em tubérculos de batata ... 36
4.4.3. Teste de patogenicidade (in vivo) em tubérculos de batata ... 37
4.5. Caracterização molecular ... 39
4.5.1. Extração de DNA cromossômico ... 39
4.5.2. Amplificação dos diferentes genes por PCR ... 40
4.5.3. Análises de PCR-RFLP do gene atpD ... 44
4.5.4. Sequenciamento ... 44
4.5.5. Análises das sequências ... 45
4.6. Desenvolvimento de primers espécie-específicos ... 46
4.6.1. Desenvolvimento de primers para as espécies S. caviscabies/S. setonii e S. scabiei ... 46
4.6.2. Nível de sensibilidade da técnica de PCR utilizando-se os primers desenvolvidos ... 46
4.6.3. Confirmação da especificidade dos primers desenvolvidos ... 47
4.7. Seleção de marcadores de AFLP para Streptomyces fitopatogênicas ... 47
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 49
5.1. Caracterização de novas espécies de Streptomyces associadas à sarna ... 49
5.1.1 Análises de PCR-RFLP do gene atpD ... 49
5.1.2. Caracterização morfológica ... 56
5.1.3. Caracterização bioquímica ... 63
5.1.4. Caracterização patogênica ... 67
5.1.4.1. Amplificação dos genes nec1, tomA e operon txtAB ... 67
5.1.4.2. Teste de patogenicidade em mudas de rabanete ... 71
5.1.4.3. Teste de patogenicidade em tubérculos de batata (in vitro) ... 77
5.1.4.4. Padronização de teste de patogenicidade em tubérculos de batata (in vivo) ... 81
5.1.5. Caracterização molecular ... 85
5.1.5.1. Análise filogenética do gene 16S RNAr ... 85
5.1.5.2. Análise de MLSA ... 88
5.1.5.2.1. Análise de MLSA dos genes atpD, gyrB, recA, rpoB e trpB ... 88
xi
5.1.5.3. Análise de regiões polimórficas de sequências do gene 16S RNA ribossomal ... 97
5.1.5.4. Amplificação com primers espécie-específicos ... 103
5.2 Distribuição de espécies e grupos genéticos de Streptomyces associadas à sarna da batata no Brasil ... 106
5.3.Desenvolvimento de primers espécie-específicos ... 110
5.3.1. Desenvolvimento de primers específicos para S. caviscabies/S. setonii... 110
5.3.2. Desenvolvimento de primers específicos para S. scabiei ... 113
5.3.3 Desenvolvimento de primers específicos para S. europaeiscabiei ... 116
5.4.Seleção de marcador para técnica de AFLP ... 116
6. CONCLUSÕES ... 120 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 122 Apêndice 1 ... 138 Apêndice 2 ... 140 Apêndice 3 ... 142 Apêndice 4 ... 145 Apêndice 5 ... 147 Apêndice 6 ... 148 Anexo 1 ... 150 Anexo 2 ... 151
xii
“É que tem mais chão nos meus olhos que
cansaço nas minhas pernas, mais esperança nos
meus passos do que tristeza nos meus ombros,
mais estrada no meu coração do que medo na
minha cabeça”
Cora Coralina
“A satisfação está no esforço e não apenas na
realização final”
xiii
Aos meus pais Angélica e Jorge
por serem minha fonte de inspiração e porto
seguro, por toda dedicação e amor.
Aos meus irmãos Ju e Rafa
por serem sempre presentes e estarem ao meu
lado em todos os momentos, pelo incentivo e
por todos os valiosos conselhos.
xiv
AGRADECIMENTOS
À Deus, pela saúde e por meu caminho abençoado, sempre me proporcionando força para superar as dificuldades e colocando pessoas de muita luz na minha vida.
À Profa. Dra. Suzete Aparecida Lanza Destéfano, Susi, pelo trabalho lado a lado nesses últimos dez anos e por toda dedicação e incentivo. Obrigada por todos ensinamentos, por estar sempre comigo compartilhando as vitórias e dificuldades diárias, por todas cobranças e elogios, que ajudaram no meu crescimento pessoal e profissional. Agradeço também pela amizade, por ser tão motivadora e doce nos momentos difíceis, sempre preocupada com meu bem estar e por todo carinho. O resultado dessa pesquisa é fruto de uma parceria desenvolvida com muita confiança e respeito, bem como do amor e dedicação na realização desse trabalho.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (Processo: 2011/02994-8) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (Processo: 141249/2011-0) pela concessão da bolsa de Doutorado.
À Associação Brasileira da Batata (ABBA) pelo financiamento inicial do projeto e fornecimento das amostras de batata utilizadas no estudo e em especial ao engenheiro agrônomo Natalino Yassushi Shimoyama, por toda disponibilidade e envolvimento nessa pesquisa.
Ao Dr. Márcio José da Silva, pesquisador do Laboratório de Biologia Molecular de Plantas - CBMEG/UNICAMP, pelo sequenciamento das amostras.
Ao Dr. Fabrício José Jaciani, do Fundo de Defesa da Citricultura, pela disponibilidade e treinamento para a realização dos experimentos de AFLP e à Dra. Cláudia Beatriz Afonso de Menezes, do CPQBA/DRM – Unicamp, pelo grande auxílio na construção dos dendrogramas.
Ao engenheiro agrônomo Pedro Hayashi, pelas orientações para o plantio dos tubérculos nos testes de patogenicidade em casa de vegetação.
Aos membros da banca de qualificação, pré-banca e banca de tese: Profa. Dra. Alessandra Alves de Souza (Centro Apta Citros Sylvio Moreira - IAC), Profa. Dra. Fabiana Fantinatti-Garboggini (CPQBA/DRM – Unicamp), Prof. Dr. Ivan Paulo Bedendo (Departamento de Fitopatologia – Esalq/USP), Prof. Dr. Ricardo Harakava (Lab. Bioquímica Fitopatológica - Instituto Biológico), Profa. Dra. Valéria Maia de Oliveira (CPQBA/DRM – Unicamp) e Prof. Dr.
xv Welington Luiz de Araújo (Departamento de Microbiologia – USP), por suas observações e sugestões valiosas que enriqueceram o trabalho.
Aos companheiros de trabalho mais intimamente envolvidos com essa pesquisa: Alex, Gabriela, Marina, Renata e Suzana pela contribuição no desenvolvimento dos primers e nos testes de patogenicidade; Mariana Appy pela parceria e grande ajuda na execução dos testes bioquímicos; e à Denise Salomão pela padronização de algumas metodologias utilizadas. Agradeço pelo trabalho conjunto e auxílio nos experimentos.
Aos amigos do Laboratório de Bacteriologia Vegetal, por todos os momentos vividos dia a dia, pela amizade e troca de experiências pessoais e profissionais. Agradeço aos antigos e atuais companheiros de trabalho Mari Mari, Dê, Marcela (Manola), Rafa (Rafibis), Jaque, Thais, Suzana, Alex, Bárbara, Celeste, Gabriela, Karen, Lu, Lucas, Mari Appy, Marina, Mariana Torreão, Marcel, Marcelo, Pedro, Rê, Soninha e Talitha. Obrigada por todo companheirismo, pelos bons momentos e pela ajuda nas dificuldades, essa conquista tem a contribuição especial de cada um de vocês.
Às minhas queridas amigas Denise, Mari Mari, Rafa, Marcela, Jaque, Thaís e Suzana. A convivência diária trouxe muitos momentos alegres e inesquecíveis. Agradeço também pela amizade, companheirismo, pelo crescimento e por todos momentos que compartilhamos, vocês são pessoas muito especiais para mim, levo comigo sempre boas lembranças e sinto muitas saudades. Um agradecimento especial à Mari Mari por todos os ensinamentos, ideias e grande auxílio nos experimentos. Obrigada por tudo que me ensinou, por ser minha inspiração como profissional, mãe e amiga. Dê, obrigada por todo seu apoio, conselhos e por essa energia incrível, você é uma grande amiga que eu quero sempre ao meu lado.
Aos pesquisadores do Laboratório de Bacteriologia Vegetal: Irene, Beriam, Júlio e Susi por todos ensinamentos e auxílio ao longo desses anos, pela confiança no meu trabalho, pela amizade e acolhimento no laboratório.
Aos amigos e amigas que não participaram diretamente do desenvolvimento desse trabalho mas que são pessoas essenciais na minha vida. Obrigada por todos momentos, das conversas mais simples aos assuntos sérios, enfim, momentos diários que compartilhamos com pessoas especiais. Agradeço a paciência, carinho, ouvidos e puxões de orelha, levo comigo o aprendizado
xvi proporcionado por cada um de vocês e sinto que vocês me tornam uma pessoa melhor. Agradeço de forma especial: às minhas amigas de faculdade, as gildas Má e Li, tão queridas e presentes na vida profissional e pessoal, tenho por vocês um carinho especial, uma amizade intensa e muito verdadeira; aos companheiros de sábado Cida, Keilla, Luelc e Bruce e às condicionadas, Mandinha, Fa e Renatinha, pela convivência diária e por tornarem meus dias mais leves e alegres; às maravilhosas Manola, Bruna, Cissa e Jaque, por momentos de muita risada e troca de boas energias; às amigas de muito tempo, Thai e Cris, por fazerem parte da minha vida e de muito do que sou; e aos grandes amigos Gláucia, Mara e João pelos quais sinto um carinho enorme e que foram tão presentes sempre me apoiando, principalmente nesse momento da minha vida.
À minha família pela compreensão nos meus momentos ausentes, incentivo e pelos bons momentos juntos. Aos tios, tias e principalmente aos primos e às minhas primas, amigas e irmãs, Dessa, Didy e Jé. Aos meus queridos avôs que lembro com muito carinho e minhas avós por terem participado sempre de perto da minha educação e por dividir cada uma das minhas conquistas com muito orgulho. Sou eternamente grata por ter uma família tão abençoada e presente, agradeço muito por todo amor, carinho e paciência.
Aos meus irmãos, Ju e Rafa, por serem aqueles que me dão sermões, conselhos e me ajudam a ser uma pessoa melhor, seja pela convivência ou inspiração. Que sejamos sempre unidos e que eu possa comemorar cada vitória com vocês. Obrigada pelo sobrinho que me traz tantos momentos de felicidade e deixa minha vida mais leve, o sorriso do Nic acalma e aquela risada gostosa já foi muitas vezes minha força para continuar. Ansiosa pela vinda de mais uma sobrinha para alegrar meus dias. Amo muito vocês!
Aos meus pais, sinto que nossa união se fortalece cada dia mais e tenho uma eterna gratidão por serem tão maravilhosos comigo. Sempre presentes em todos momentos, em cada conquista, me ajudando a ter forças e nunca desistir. Obrigada por serem pais batalhadores e por construir essa família tão unida, com amor, respeito, cuidado e carinho. Vocês são grandes responsáveis por todas minhas conquistas, e minha dedicação, determinação e valores foram inspirados na maneira de ser de vocês. Agradeço por todos os mimos, atenção, compreensão e por todo amor, sou muito feliz por ter nascido em uma família tão abençoada. Amo muito vocês!
xvii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Gráfico de área colhida (ha), produção (t) e rendimento médio (kg/ha) da cultura da
batata de 2000 a 2014 no Brasil. ... 3
Figura 2. Diferentes tipos de sintomas de sarna comum da batata. ... 5
Figura 3. Sintomas de sarna reticulada (A) e sarna avermelhada (B) ... 6
Figura 4. Ciclo de vida de Streptomyces ... 8
Figura 5. O patogenoma de Streptomyces ... 13
Figura 6. Ciclo da sarna da batata ... 14
Figura 7. Distribuição do inóculo em placa de Petri para avaliação da utilização de carboidratos. ... 35
Figura 8. Esquema da avaliação do teste de patogenicidade de linhagens de Streptomyces... 37
Figura 9. Escala diagramática para avaliação de percentual de área do tubérculo coberta pelas lesões de sarna ... 39
Figura 10. Perfis de restrição de parte do gene atpD das linhagens Tipo de Streptomyces digerido com a enzima Hae III ... 50
Figura 11. Perfis de restrição de parte do gene atpD das linhagens Tipo de Streptomyces digerido com a enzima Cfo I.. ... 50
Figura 12. Perfis de restrição de parte do gene atpD das linhagens de Streptomyces spp. digerido com a enzima Hae III. ... 52
Figura 13. Perfis de restrição de parte do gene atpD das linhagens de Streptomyces spp. digerido com a enzima Cfo I. ... 52
Figura 14. Características morfológicas da linhagem IBSBF 2968 (Grupo 9) em meio de cultivo YME ... 56
Figura 15. Micromorfologia das hifas de linhagens de Streptomyces spp. em meio AA... 57
Figura 16. Similaridade de morfologia das colônias e coloração de esporos de linhagens do G7. ... 58
Figura 17. Variações na morfologia das colônias e coloração de esporos de linhagens do G9 ... 58
Figura 18. Utilização diferencial de ramnose entre linhagens do G17... 66
Figura 19. Produtos de amplificação do gene nec1.. ... 68
Figura 20. Produtos de amplificação do operon da txtAB ... 68
Figura 21. Produtos de amplificação do gene da tomA ... 68
Figura 22. Sintomas observados em mudas de rabanete inoculadas com linhagens de Streptomyces spp.. ... 72
xviii Figura 23. Comparação do efeito de diferentes culturas de Streptomyces spp. crescidas em meio OMB na média do comprimento (cm) da parte aérea e da raiz de mudas de rabanete crescendo em
meio AA. ... 73
Figura 24. Sintomas de nanismo, inchaço radial e necrose em mudas de rabanete causadas por linhagens de Streptomyces dos grupos genéticos: G11, (A) IBSBF 2863, (B) IBSBF 2823, (C) IBSBF 2867 e (D) IBSBF (2942); G13, (E) IBSBF 2941. ... 73
Figura 25. Necrose em fatias de tubérculos de batata das variedades (A) Ágata, (B) Asterix, (C) Atlantic, (D) Cupido e (E) Mondial, após teste de patogenicidade ... 78
Figura 26. Necrose causada pela linhagem IBSBF 2867 (G11) em fatias de batata das cultivares (A) Ágata, (B) Asterix, (C) Cupido e (D) Markies. ... 80
Figura 27. Tubérculos de batata da cultivar Ágata em solo (A) não inoculado e (B) inoculado com Streptomyces scabiei (IBSBF 2308) causando sintomas típicos de sarna comum. ... 83
Figura 28. Sintomas de sarna comum causados por Streptomyces scabiei (IBSBF 2308) ... 83
Figura 29. Árvore filogenética construída a partir de sequências do gene 16S RNAr das linhagens de Streptomyces spp., causadoras da sarna da batata. ... 87
Figura 30. Árvore filogenética construída a partir de sequências concatenadas dos genes atpD, gyrB, recA, rpoB e trpB das linhagens de Streptomyces spp., causadoras da sarna da batata... 90
Figura 31. Árvore filogenética construída a partir de sequências concatenadas dos genes atpD, gyrB, recA, rpoB, trpB e 16S RNAr das linhagens de Streptomyces spp., causadoras da sarna da batata. ... 93
Figura 32. (A) Localização das regiões variáveis (δ, γ, α e β) no gene 16S RNAr (Modificado de Kreuze et al., 1999); (B) Alinhamentos de sequências das regiões variáveis do gene 16S RNAr das linhagens dos grupos genéticos G5, G7, G11 e G20 e de linhagens Tipo de espécies de Streptomyces estreitamente relacionadas filogeneticamente a esses grupos.. ... 102
Figura 33. Produtos de amplificação das linhagens de Streptomyces sp. com o par de primers Aci1/Aci2. ... 106
Figura 34. Distribuição de espécies e grupos genéticos de Streptomyces causadores da sarna da batata em regiões produtoras de diferentes estados ... 107
Figura 35. Produtos de amplificação utilizando-se o par de primers Cavis1F/Cavis4R. ... 111
Figura 36. Produtos de amplificação utilizando-se o par de primers Cavis1F/Cavis4R. ... 112
Figura 37. Produtos de amplificação utilizando-se o par de primers Cavis1F/Cavis4R com diferentes quantidades de DNA da espécie S. caviscabies (IBSBF 2051T). ... 112
Figura 38. Produtos de amplificação com o par de primers ScADF1/ScADR1 ... 114
Figura 39. Produtos de amplificação com o par de primers ScRAF1/ScRAR1 ... 115
Figura 40. Produtos de amplificação com o par de primers ScRAF2/ScRAR1 ... 115
xix Figura 42. Dendrograma de similaridade (UPGMA - coeficiente Dice) das linhagens Tipo de
Streptomyces associadas à sarna da batata, analisados com marcadores AFLP EcoRI/MseI – primers E21/M16. ... 118
Figura 43. Dendrograma de similaridade (UPGMA - coeficiente Dice) das linhagens Tipo de
Streptomyces associadas à sarna da batata, analisados com marcadores AFLP EcoRI/MseI – primers E02/M02. ... 118
Figura 44. Dendrograma de similaridade (UPGMA - coeficiente Dice) das linhagens Tipo de
Streptomyces associadas à sarna da batata, analisados com marcadores AFLP EcoRI/MseI – primers E21/M02. ... 119
Figura 45. Árvore filogenética construída a partir das sequências concatenadas dos genes atpD,
xx
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Tabela 1. Linhagens de Streptomyces sp. utilizadas nesse estudo. ... 30 Tabela 2. Linhagens Tipo de Streptomyces spp. associadas à sarna da batata. ... 32 Tabela 3. Linhagens de Streptomyces spp. utilizadas no desenvolvimento de primers espécie-específicos e teste de patogenicidade (in vivo) em batata. ... 32 Quadro 1. Determinação de valores de virulência de acordo com a porcentagem de crescimento da parte aérea e da raiz das plantas inoculadas comparadas às plantas controle. ... 36 Tabela 4. Sequência dos primers utilizados nas amplificações por PCR e no seqüenciamento dos diferentes genes. ... 41 Tabela 5. Pares de primers, regiões amplificadas, tamanhos dos produtos, concentrações de reagentes e programas de amplificação utilizados nos experimentos de PCR. ... 43 Tabela 6. Perfil de restrição enzimática de parte do gene atpD com as enzimas Hae III e Cfo I das linhagens de Streptomyces spp. e métodos utilizados para a separação das mesmas em grupos genéticos (G1 a G20). ... 53 Tabela 7. Dados de procedência, cultivar de batata e características morfológicas das linhagens de Streptomyces spp. associadas à sarna da batata avaliadas nesse estudo. ... 59 Tabela 8. Avaliação da utilização de carboidratos pelas linhagens de Streptomyces spp. ... 64 Tabela 9. Caracterização da patogenicidade das linhagens de Streptomyces sp. por avaliação da presença dos três genes marcadores da patogenicidade (nec1, tomA e txtAB), testes de patogenicidade in vitro em batata (cultivar Ágata) e em mudas de rabanete. ... 74 Tabela 10. Caracterização da agressividade das linhagens de Streptomyces sp. por teste de patogenicidade in vitro em diferentes cultivares de batata utilizados para plantio no Brasil. ... 79 Tabela 11. Quantidade de tubérculos obtidos em cada vaso e avaliação da virulência in vivo da linhagem de Streptomyces scabiei (IBSBF 2308) em diferentes cultivares de batata... 82 Tabela 12. Dados de agrupamento e valores de similaridade de sequências a partir da árvore filogenética e matriz de similaridade do gene 16s RNAr das linhagens de Streptomyces spp. ... 88 Tabela 13. Valores de similaridade de sequências a partir da árvore filogenética e matriz de similaridade dos genes atpD, gyrB, recA, rpoB e trpB das linhagens Tipo de Streptomyces spp. associadas à sarna da batata. ... 91 Tabela 14. Dados de agrupamento e valores de similaridade de sequências a partir da árvore filogenética e matriz de similaridade dos genes atpD, gyrB, recA, rpoB e trpB das linhagens de
Streptomyces spp. ... 91
Tabela 15. Dados de agrupamento e valores de similaridade de sequências a partir da árvore filogenética e matriz de similaridade dos genes atpD, gyrB, recA, rpoB, trpB e 16S RNAr das linhagens de Streptomyces spp. ... 94 Tabela 16. Resumo dos resultados das análises filogenéticas das linhagens de Streptomyces spp. ... 95
xxi Tabela 17. Diferentes perfis de regiões variáveis δ, γ, α, β do gene 16S RNAr de Streptomyces spp., combinação dessas sequências para as linhagens utilizadas nesse estudo e valores de similaridade de sequências do gene 16S RNAr para as linhagens que apresentaram a mesma combinação. ... 99 Tabela 18. Resultado da amplificação por PCR das linhagens de Streptomyces, utilizando-se
primers específicos para as espécies S. acidiscabies (Aci1/Aci2), S. scabiei (ScabI/ScabII) e S. turgidiscabies (TurgI/TurgII). ... 104
Tabela 19. Distribuição das espécies e dos grupos genéticos de Streptomyces por Estado produtor de batata no Brasil ... 108 Tabela 20. Distribuição mundial das espécies de Streptomyces associadas à sarna. ... 109
xxii
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
16S RNA ribossomal em procariotos
16S-23S região espaçadora entre os RNAs ribossomais 16S e 23S α região variável alfa do gene 16S RNA ribossomal β região variável beta do gene 16S RNA ribossomal γ região variável gama do gene 16S RNA ribossomal δ região variável sigma do gene 16S RNA ribossomal
AA ágar-água
ABBA Associação Brasileira da Batata
AFN Área Final de Necrose
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism atpD gene codificante da cadeia β da ATP sintase
BSA albumina sérica bovina
ºC graus Celsius
CBMEG Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética CFBP Collection Française de Bactéries Phytopathogène
CFD Classificação Final da Doença
CR Colonization Region
cm centímetro
DNA ácido desoxirribonucléico
DNAr ácido desoxirribonucléico ribossomal dNTP desoxirribonucleotídeo trifosfatado
DSMZ Deutsche Sammlung von Mikrooganismen und Zellkulturen
EDTA ácido etilenodiamino tetracético
FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations
FUNDECITRUS Fundo de Defesa da Citricultura
g gramas
G grupo genético
xxiii
h hora
ha hectare
HCl ácido clorídrico
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IBSBF Coleção de Culturas de Fitobactérias do Instituto Biológico
ISP International Streptomyces Project
Kb Kilobases
Kg Kilograma
L litro
LiCl cloreto de lítio
LMG Laboratorium voor Microbiologie
M molar
MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
Mb Megabase
MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis
mg miligrama
MgCl2 cloreto de magnésio
min minuto
mL mililitro
MLSA Multilocus Sequence Analysis
MLST Multilocus Sequence Typing
mm milimetro mM milimolar g micrograma μL microlitro M micromolar n° número
NaCl cloreto de sódio
NaOCl hipoclorito de sódio
nec1 gene que codifica proteína necrogênica Nec1
xxiv
ND Não Determinada
OMB Oatmeal Broth
PAI pathogenicity
pb pares de base
PCR Polymerase Chain Reaction
pH potencial hidrogeniônico
ppm partes por milhão
pg picograma
qsp quantidade suficiente para
recA gene codificante da recombinase A
rep repetitive elements
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
RNA ácido ribonucléico
RNase ribonuclease
RNAr ácido ribonucléico ribossomal
rpm rotações por minuto
rpoB gene codificante da subunidade da RNA polimerase
s segundo
SDS dodecil sulfato de sódio
syn synonym
T
linhagem Tipo
t tonelada
TAE Tris - Acetato - EDTA
Taq Thermus aquaticus (enzima DNA polimerase)
TE Tris - EDTA
tomA gene que codifica a tomatinase
TR Toxicogenic Region
Tris Tris(hidroximetil)aminometano
trpB gene codificante da subunidade B da triptofano sintase
txtAB operon com os genes txtA e txtB que codificam sintetases da taxtomina A
xxv
UFV Universidade Federal de Viçosa
UNICAMP Universidade Estadual de Campinas
UPGMA Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic mean
1
1. INTRODUÇÃO
A batata (Solanum tuberosum L.) é originária da região dos Andes e foi difundida para diversos países, sendo considerada, atualmente, a quarta principal cultura alimentar no mundo após o arroz, milho e trigo (FIERS et al., 2012). Devido às suas características nutricionais e participação na dieta alimentar de vários países, é considerada uma cultura importante para programas de erradicação da fome no mundo (FAO, 2008).
A produção mundial de batata está em crescente aumento, principalmente na Ásia. O Brasil, é considerado o segundo maior produtor da América Latina, após o Peru, sendo responsável por 1% da produção mundial (FAO, 2015). No entanto, há diversos fatores que podem limitar o sistema de produção da batata, sendo que, dentre eles, os problemas fitossanitários são de grande importância causando perdas significativas diretas e elevação nos custos de produção (ZAMBOLIM et al., 2009). A batata é suscetível à diversas doenças causadas por bactérias, fungos e vírus; e pragas, como nematóides e insetos, que podem causar danos em todas as partes da planta (FIERS et al., 2012).
A sarna da batata é uma doença bacteriana de ocorrência generalizada nas regiões produtoras do Brasil e os principais sintomas se caracterizam por lesões na superfície do tubérculo, que diminuem seu valor comercial ou impedem a sua comercialização. Essa doença pode ser causada por um grupo polifilético de espécies do gênero Streptomyces que apresentam diferenças na morfologia, fisiologia e características moleculares. Essas espécies foram relatadas em diferentes países causando sintomas de sarna da batata, no entanto, a ocorrência e a distribuição dessas fitobactérias pode variar dependendo da região produtora avaliada. A incidência da sarna vem aumentando consideravelmente no Brasil, tornando-se um fator limitante no cultivo de batata e o conhecimento das espécies patogênicas presentes no país é um fator primordial para a realização de medidas de manejo da doença (CORRÊA, 2011).
Estudos recentes de levantamento e caracterização de linhagens de Streptomyces sp. associadas à sarna da batata provenientes de diferentes regiões produtoras do Brasil revelaram a ocorrência das espécies S. scabiei, S. caviscabies/S. setonii, S. europaeiscabiei e S. sampsonii, já descritas em outros países. Entretanto, nesse estudo, das 178 linhagens nacionais analisadas, 57 apresentaram características genéticas distintas das 12 espécies Tipo de Streptomyces associadas à sarna da batata (CORRÊA, 2011).
2 O presente trabalho teve por objetivo a caracterização de 57 linhagens de
Streptomyces, que podem representar possíveis novas espécies e/ou subespécies de Streptomyces associadas à sarna da batata no Brasil, por meio de taxonomia polifásica.
3 Figura 1. Gráfico de área colhida (ha), produção (t) e rendimento médio (kg/ha) da cultura da batata de 2000 a 2014 no Brasil. Fonte dos dados: IBGE (2015).
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. A cultura da batata e problemas fitossanitários
A batata (Solanum tuberosum L.) é originária da região dos Andes e foi difundida para diversos países, sendo considerada, atualmente, a quarta principal cultura alimentar no mundo após o arroz, milho e trigo (FIERS et al., 2012). Devido às suas características nutricionais (rica em carboidratos, proteínas e sais minerais), participação na dieta alimentar de vários países, fácil cultivo e alto rendimento por área plantada, a batata é considerada uma das maiores fontes de nutrientes para a humanidade, podendo ser utilizada para programas de erradicação da fome no mundo (FAO, 2008).
A produção mundial de batata está em crescente aumento, principalmente na Ásia. Segundo dados da FAO, em 2013, a produção mundial de batata foi cerca de 376 milhões de toneladas, sendo que os maiores produtores foram a China, Índia, Rússia e Ucrânia. O Brasil, considerado o segundo maior produtor da América Latina, após o Peru, foi responsável por 1% da produção mundial (FAO, 2015).
Em 2014, a produção brasileira foi de 3,7 milhões de toneladas (t) de batata no ano, em uma área de 131,5 mil hectares (ha), com rendimento de 28,4 t/ha (IBGE, 2015). Analisando os dados da produção dessa cultura de 2000 a 2014 houve aumento da produção e rendimento da batata apesar da redução da área plantada, devido principalmente aos avanços tecnológicos, profissionalização dos produtores e melhorias nas condições de cultivo (nutrição e irrigação) e qualidade da batata-semente (JADOSKI et al., 2009) (Figura 1).
4 No Brasil, as regiões Sudeste e Sul concentram os principais estados produtores representados por Minas Gerais, Paraná, Rio Grande do Sul, Santa Catarina e São Paulo. Os Estados da Bahia e Goiás contribuem, de forma minoritária, com cerca de 12,2% da produção brasileira de batata (IBGE, 2015).
A produção de batata atende ao mercado interno e muito pouco do produto é destinado à exportação, principalmente sob a forma de batata processada (FAO, 2008). Os tubérculos são destinados para mercado fresco, indústria de batata processada (pré-fritas congeladas, chips e palha) e batata semente. As cultivares mais plantadas e comercializadas no país são Ágata, Asterix, Cupido, Mondial e Markies, para mercado fresco e pré-fritas congeladas; e Atlantic, destinada à indústria de batata chips (SHIMOYAMA, 2014).
Diferentes fatores podem ser limitantes no sistema de produção da batata sendo que os principais desafios são as melhorias no sistema de irrigação, a preservação e uso racional da água, os ajustes na nutrição das plantas, o controle da erosão, a rotação de culturas, a racionalização do emprego de defensivos, bem como um maior controle na qualidade do material propagativo (ZAMBOLIM et al., 2009). Ainda, os problemas fitossanitários são de grande importância, causando perdas significativas diretas e elevação nos custos de produção, já que esta cultura é suscetível a mais de 40 pragas e doenças causadas por insetos, nematóides, vírus, fungos e bactérias. Esses patógenos são da parte aérea e/ou solo e podem causar danos em todas as partes da planta (FIERS et al., 2012). Estimativas realizadas pela ABBA indicam que as perdas por descarte e problemas fitossanitários correspondem a cerca de 10% da produção (SHIMOYAMA, 2014).
A cultura da batata pode ser acometida por bacterioses durante praticamente todo o ciclo. Na safra das águas, destacam-se a murcha bacteriana (Ralstonia solanacearum) e canela preta (Pectobacterium spp.). Já na safra da seca e de inverno destaca-se a sarna comum (Streptomyces scabiei), que afeta principalmente os tubérculos (ZAMBOLIM et al., 2009).
2.2. Sarna da batata
A sarna da batata é uma doença causada por bactérias do gênero Streptomyces, presentes no solo, que afetam as partes subterrâneas da planta, principalmente os tubérculos. Os sintomas externos causados nos tubérculos afetam a qualidade da batata acarretando grandes perdas no valor comercial e rejeição do produto tanto para o consumo
5
in natura e produção de tubérculos-semente quanto para o processamento (DEES;
WANNER,2012).
A sarna da batata é uma doença bacteriana complexa com diversidade de sintomas e de agentes causais. A severidade da sarna da batata e a ocorrência dos sintomas podem variar de acordo com o ambiente, suscetibilidade da cultivar e virulência do patógeno (LORANG et al., 1995; TOTH et al., 2001). O ambiente determina as condições favoráveis ou desfavoráveis ao desenvolvimento do patógeno. A cultivar tem influência no desenvolvimento da doença de acordo com sua resistência/suscetibilidade à infecção pelo patógeno. No caso da ocorrência da infecção as principais variações nos sintomas e na severidade da doença são determinadas pelo patógeno causador e seu grau de virulência. A variação nos sintomas permite a classificação em diferentes tipos de sarna, como sarna comum, reticulada ou avermelhada (CORRÊA, 2011).
A sarna comum á caracterizada por lesões tipicamente arredondadas com uma textura áspera e corticosa e variam em profundidade (superficial, elevada e profunda) e coloração, de pardo-clara a pardo-escura. A profundidade da lesão está associada à virulência do patógeno, sendo que quanto mais superficiais, menos virulento o patógeno. Lesões elevadas e profundas caracterizam maior virulência do patógeno (LORIA et al., 1997) (Figura 2).
A sarna reticulada e avermelhada são causadas por espécies diferentes daquelas que causam a sarna comum. Esses dois tipos de sarna apresentam sintomas semelhantes, caracterizados por lesões superficiais de coloração marrom e com aspecto de rede nos tubérculos de batata. Na sarna avermelhada, adicionalmente ao aspecto reticulado, as lesões apresentam coloração avermelhada (HARRISON, 1962; BANG, 1979; SCHOLTE; LABRUYÈRE, 1985) (Figura 3). As lesões são necróticas e ásperas, mas nunca elevadas Figura 2. Diferentes tipos de sintomas de sarna comum da batata. (A) Lesão superficial; (B) Lesão erumpente; (C) Lesão profunda. Fonte: Corrêa (2011).
C B
6 ou profundas como na sarna comum. Nessas doenças a infecção da raiz parece ser um evento importante no seu desenvolvimento. Os patógenos afetam todas as partes enterradas da planta e poucas cultivares de batata (LORIA; KERS; JOSHI, 2006).
A sarna da batata já foi relatada em todos os continentes do mundo, sendo considerada a quarta doença mais importante da batata na América do Norte (SLACK, 1991). No Canadá, segundo dados de 2002, estimou-se perdas econômicas de 15% decorrentes dessa doença (HILL; LAZAROVITS, 2005). Ainda os custos associados à sarna comum na Tasmania, Austrália foram estimados em cerca de 4% do valor industrial (DEES; WANNER, 2012). As perdas econômicas causadas por essa doença afetam diversos setores, não só o mercado de produto fresco, mas também a produção de batata semente e batata processada (batata frita e chips), sendo que nesse último setor a aceitação do produto é ainda mais rigorosa (WANNER; KIRK, 2015).
No Brasil, a sarna da batata é uma das doenças mais importantes economicamente e está amplamente distribuída nas regiões produtoras da cultura, tornando-se um fator limitante no cultivo (CORRÊA, 2011).
2.3. O gênero Streptomyces e espécies causadoras da sarna da batata
O gênero Streptomyces é composto por 668 espécies(EUZÉBY, 2013) e a maior parte delas é saprófita que vive no solo, produzindo enzimas hidrolíticas responsáveis pela degradação de polímeros derivados de plantas e/ou animais, como celulose, lignina e quitina, realizando um papel importante no ciclo de carbono (LORIA; KERS; JOSHI, 2006). As espécies desse gênero são conhecidas também por sua habilidade em produzir metabólitos secundários biologicamente ativos de interesse biotecnológico, como
Figura 3. Sintomas de sarna reticulada (A) e sarna avermelhada (B). Fonte: Corrêa (2011).
7 antibióticos, antifúngicos e agentes antitumorais. Ainda, podem ser utilizadas em programas de controle biológico na inibição de crescimento de fungos e bactérias fitopatogênicas do gênero Streptomyces, sendo uma alternativa ao uso de pesticidas químicos (COMPARONI, 2015; EVANGELISTA-MARTINEZ, 2014; HILTUNEN; VALKUNEN, 2011; LIU; ANDERSON; KINKEL, 1995; SILVA et al., 2013; WANNER; KIRK; QU, 2014).
As bactérias do gênero Streptomyces são Gram positivas com alta proporção de citosina e guanina no DNA (66 a 78%) e, em sua maioria, possuem um único cromossomo linear com longas sequencias terminais repetidas invertidas (long terminal inverted repeats), que protegem o DNA da degradação por nucleases do solo (LIN et al., 1993; WANNER; KIRK, 2015). O genoma de Streptomyces possui de 8 a 12 Mb, no qual a região de 4,5 a 6 Mb contém os genes housekeeping necessários para o crescimento e metabolismo, enquanto que os cassetes de genes ou operons que codificam a ampla variedade de metabólitos secundários estão, em sua maioria, nos 2 a 3 Mb finais de cada extremidade do cromossomo. Os cassetes que codificam metabólitos secundários são demarcados em ambos os lados por sequências com pequenas repetições invertidas, sequências de inserções ou sítios de integração de fagos, sugerindo que eles devem ser transferidos dentro e entre os genomas de Streptomyces (CHATER et al., 2010; WANNER; KIRK, 2015). Essas bactérias são caracterizadas também pela estrutura filamentosa e formação de esporos. A rede de filamentos secreta enzimas catabólicas que degradam o substrato orgânico quebrando-o em nutrientes assimiláveis que promovem, assim, o crescimento da colônia. A privação de nutrientes e outros fatores ambientais ativam o desenvolvimento de hifas aéreas, que se fragmentam formando as cadeias de esporos. Os esporos são resistentes à dessecação e podem ser carregados pela água ou por animais presentes no solo. Esses esporos germinam independentemente de nutrientes e formam micélios ramificados multinucleados, completando o ciclo de vida da bactéria (LORIA; KERS; JOSHI, 2006). A senescência do micélio vegetativo é a fase na qual há grande produção e secreção de metabólitos secundários incluindo compostos antimicrobianos (HORINOUCHI, 2002) (Figura 4).
8 Entre os membros do gênero Streptomyces conhecidos por serem saprófitas do solo, com ciclo de vida complexo e produção de metabólitos secundários, a habilidade em infectar tecidos de plantas é uma característica rara. Das espécies de Streptomyces descritas até o momento, poucas são consideradas patogênicas às plantas (BIGNELL et al., 2010).
A sarna da batata pode ser causada por um grupo polifilético de espécies do gênero
Streptomyces que apresentam diferenças na morfologia, fisiologia e características
moleculares. Essas espécies foram bem caracterizadas e vêm sendo encontradas em diferentes países causando uma diversidade de sintomas caracterizando a sarna comum, sarna reticulada ou avermelhada (CORRÊA, 2011).
A principal espécie causadora da sarna comum é Streptomyces scabiei, encontrada em solos secos, neutros a alcalinos e amplamente distribuída no mundo (LAMBERT; LORIA, 1989a). No entanto, outras espécies também já foram descritas causando esses sintomas: S. acidiscabies causadora da sarna em solos ácidos, com pH abaixo de 5,2 (LAMBERT; LORIA, 1989b); S. caviscabies/S. setonii (syn. S. griseus) causadoras de
Figura 4. Ciclo de vida de Streptomyces. Fonte: http://streptomyces.openwetware.org, modificado por Corrêa (2011).
Crescimento vegetativo Produção de metabólitos secundários Esporulação Nova geração Germinação Crescimento vegetativo
9 lesões profundas (deep-pitted scab) (GOYER;FAUCHER;BEAULIEU, 1996; LIU et al., 2005; MILLARD; BURR, 1926); S. turgidiscabies, causando lesões erumpentes e descrita no Japão (MIYAJIMA et al., 1998); S. europaeiscabiei e S. stelliscabiei, consideradas duas genomoespécies dentro da espécie S. scabiei (BOUCHEK-MECHICHE et al., 2000); e S.
luridiscabiei, S. puniciscabiei e S. niveiscabiei, causando lesões erumpentes em solos
ácidos na Coréia (PARK et al., 2003a). Mais recentemente foram relatadas duas novas linhagens na América do Norte, Streptomyces sp. IdahoX e Streptomyces sp. DS3024 (HAO et al., 2009; WANNER, 2007a).
Além disso, são citadas as espécies S. reticuliscabiei, causadora da sarna reticulada (netted scab) e descrita na França (BOUCHEK-MECHICHE et al., 2000), S. aureofaciens e
S. griseus causadoras da sarna avermelhada (FAUCHER et al., 1993), S. sampsonii,
considerada saprófita, mas que já foi isolada de lesões de sarna (LAMBERT; LORIA, 1989a) e S. ipomoeae que causa a sarna em batata-doce (LABEDA; LYONS, 1992; PERSON; MARTIN, 1940; WAKSMAN; HENRICI, 1948).
As diferentes espécies de Streptomyces causadoras da sarna não são hospedeiro-específicas e podem causar doenças em outras culturas como batata-doce, beterraba, cenoura, couve-nabo, pastinaca (cherivia), nabo e rabanete, resultando também em perdas econômicas consideráveis (LAMBERT, 1991; GOYER; BEAULIEU, 1997; LORIA; KERS; JOSHI, 2006).
Nos últimos anos, a disponibilidade de genomas de Streptomyces patogênicos (S.
scabies 87-22, S. turgidiscabies Car8 e S. ipomoeae 91-03) e não patogênicos (S. coelicolor
A3 (2), S. avermitilis MA-4680, S. clavuligerus ATCC 27064, S. sviceus ATCC 29083, S.
pristinaespiralis ATCC 25486, Streptomyces sp. Mg1 e Streptomyces sp. SPB74) em base
de dados públicas possibilitou uma análise comparativa que permitiu a identificação de genes nas espécies de Streptomyces patogênicas e que estão ausentes nas não patogênicas, referenciados como o patogenoma de Streptomyces. Esses genes possibilitam a colonização dos tecidos, adaptação e sobrevivência nesse nicho ecológico (BIGNELL et al., 2010).
2.4. Patogenicidade de Streptomyces
Apesar da grande diversidade de características morfológicas, fisiológicas e genéticas, os genes responsáveis pela patogenicidade e virulência são compartilhados por
10 algumas espécies causadoras da sarna comum, em uma região do cromossomo denominada ilha de patogenicidade PAI (pathogenicity island) (WANNER, 2006). A PAI possui duas áreas distintas, designadas como região de colonização CR (colonization region) e região toxicogênica TR (toxicogenic region). A região CR contém genes que estão relacionados à virulência, mas que não são determinantes da formação dos sintomas da sarna, tais como
tomA e nec1, que codificam as proteínas tomatinase e Nec1, respectivamente. Outros genes
dessa região são similares a transposases e esterases, estas últimas enzimas podem degradar a suberina que geralmente atua contra a invasão microbiana. Já a região TR inclui os genes
txtAB, txtC, txtE, txtR e nos relacionados à síntese da fitotoxina taxtomina A, responsável
pela patogenicidade das linhagens (AITTAMAA et al., 2010; LERAT; SIMAO-BEAUNOIR; BEAULIEU, 2009).
A patogenicidade de Streptomyces é considerada altamente evoluída e requer a ligação ao hospedeiro, penetração, colonização e evasão do sistema de defesa da planta. Diferentes fatores de patogenicidade estão envolvidos em cada um desses eventos: a fitotoxina taxtomina atua principalmente na ligação, penetração, colonização e inibe a biossíntese de celulose, que compromete a integridade da parede celular, causando a hipertrofia e morte da célula; já a proteína Nec1 e a tomatinase auxiliam na evasão da defesa do hospedeiro (LORIA;KERS;JOSHI, 2006). Assim, a patogenicidade de linhagens de Streptomyces requer a produção coordenada de uma variedade de produtos, incluindo múltiplos metabólitos secundários e secreção de proteínas (LORIA et al., 2008).
A taxtomina A é considerada o metabólito chave para a patogenicidade de linhagens de Streptomyces spp., sendo responsável pelos sintomas característicos da sarna comum (AITTAMAA et al,, 2010; DEES; WANNER, 2012; LORIA et al., 2008; LORIA; KERS; JOSHI, 2006). Essa toxina induz uma variedade de mudanças fenotípicas no hospedeiro incluindo a hipertrofia celular, nanismo da raiz e parte aérea e necrose do tecido. Atua inibindo a síntese e deposição de celulose, que causa hipertrofia celular nos tecidos em expansão, estimula o influxo de íons cálcio e induz a morte celular programada (BIGNELL et al., 2010; LORIA; KERS; JOSHI, 2006). A biossíntese dessa toxina é induzida pela presença de polissacarídeos derivados de plantas, como a celobiose, celotriose e suberina (DEES; WANNER, 2012; LORIA et al., 2008).
11 O gene nec1 codifica a proteína necrogênica Nec1, que é secretada e representa um importante fator de virulência independente associado à colonização e supressão da resposta de defesa da planta (BUKHALID; CHUNG; LORIA, 1998; JOSHI et al., 2007). Esse gene é conservado entre a maioria de Streptomyces spp. causadoras da sarna e está ausente em formas não patogênicas. As enzimas tomatinases, codificadas pelo gene tomA, hidrolizam a alfa-tomatinase e o produto dessa hidrólise reprime a resposta de defesa induzida da planta, interferindo em processos de transdução de sinal que são essenciais para a resistência à doença (LORIA; KERS; JOSHI, 2006).
A ilha de patogenicidade pode ser transmitida para outras linhagens durante o processo de conjugação e inserir-se em sítios específicos no cromossomo linear de espécies receptoras levando ao surgimento de novas linhagens ou espécies patogênicas em sistemas agrícolas. Essa transmissão de genes de patogenicidade explica a natureza polifilética de espécies causadoras da sarna, conferindo o fenótipo patogênico em espécies até então não patogênicas (KERS et al., 2005; LORIA; KERS; JOSHI, 2006). Estudos indicam que as espécies S. turgidiscabies e S. acidiscabies receberam a ilha de patogenicidade de S.
scabiei, primeira espécie de Streptomyces patogênica a batata descrita (WANNER, 2006).
Apesar das diferentes espécies causadoras da sarna comum compartilharem os genes das ilhas de patogenicidade, foi detectada uma grande variabilidade genética nessa região, até mesmo entre linhagens de uma mesma espécie, como descrito para S. turgidiscabies. Nessa espécie foram relatadas quatro tipos diferentes de PAI, caracterizadas por microarranjo, com diferenças genéticas nas regiões CR e TR. Somente uma dessas formas de PAI foi adquirida da espécie S. scabiei, sendo que as demais formas de ilhas de patogenicidade foram adquiridas em outros eventos independentes. Essa alta variabilidade levou os autores a concluir que os genes relacionados à virulência e patogenicidade possuem múltiplas origens e que as ilhas de patogenicidade sejam um mosaico de regiões que podem sofrer evolução independente. Ainda as análises das ilhas de patogenicidade de
Streptomyces sugerem que a região de colonização (CR) inclui muitos genes ainda não
caracterizados e que podem estar envolvidos na patogenicidade e virulência (AITTAMAA et al., 2010).
Diferentes estudos demonstraram a correlação entre a patogenicidade de
12 patogenicidade, já que espécies não patogênicas não apresentam esses genes (BUKHALID; CHUNG; LORIA, 1998; WANNER, 2006). Ainda, todas as linhagens que contém os genes
txtAB são patogênicas à batata e rabanete. No entanto, os genes nec1 e tomA não são
detectados em diferentes espécies de Streptomyces causadoras da sarna, sendo considerados portanto dispensáveis para o processo de patogenicidade (FLORES-GONZÁLEZ; VELASCO; MONTES, 2008; KREUZE et al., 1999; WANNER, 2009).
Algumas espécies de Streptomyces patogênicas e causadoras dos sintomas de sarna não produzem taxtomina, nem a proteína Nec1, sendo que estas provavelmente utilizam outras vias ainda não estudadas. Em uma dessas linhagens, GK18, a produção do antibiótico borrelidina induziu sintomas de sarna profunda nos tubérculos de batata, revelando que há outros mecanismos de patogenicidade que utilizam alvos celulares diferentes das taxtominas (AITTAMAA et al., 2010; CAO et al., 2012; LORIA; KERS; JOSHI, 2006).
O genoma de S. scabiei 87-22 foi comparado com outros genomas de patógenos microbianos e de Streptomyces não patogênicas. As análises revelaram a presença de genes adicionais, sugerindo que múltiplos determinantes genéticos podem estar associados à patogenicidade dessas espécies, além dos fatores já conhecidos, taxtomina A e fator de virulência Nec1 (BIGNELL et al., 2011). A maior parte dos genes identificados (81%) codificam proteínas, algumas são possivelmente proteínas secretadas, reguladores transcricionais, transportadores de membrana e enzimas para a biossíntese de metabólitos secundários que podem potencialmente contribuir para a patogenicidade desses organismos. A avaliação comparativa de genomas de diferentes espécies patogênicas evidenciou que cada espécie possui um conjunto de genes únicos que contribui para a patogenicidade, juntamente com os genes que são compartilhados pelas espécies, tais como, tomA, nec1 e os relacionados à síntese de taxtomina A (txtC e txtE) (BIGNELL et al., 2010) (Figura 5).
13
2.5. Ciclo da doença e estratégias de manejo
As espécies de Streptomyces sobrevivem saprofiticamente no solo ou em tecidos de plantas infectados, sob a forma vegetativa micelial ou de esporos. Estas estruturas permanecem no solo em aglomerados próximos a restos de cultura e produzem hifas que se desenvolvem radialmente, o que facilita sua dispersão. Os esporos podem sobreviver em solos secos por longos períodos e podem ser disseminados por chuva, vento, vetores (artrópodes e nematóides) ou até mesmo por tubérculos infectados (MANZER; STORCH; SEWELL, 1984; MAYFIELD et al., 1972).
Ao encontrar um tubérculo no início de seu desenvolvimento, os esporos de
Streptomyces penetram através de estruturas como as lenticelas, estômatos ou ferimentos
(AGRIOS, 1997) (Figura 6). No entanto, a entrada no tubérculo e na raiz pode ocorrer por hifas secundárias, que não requerem aberturas naturais (TARKOWSKI; VEREECKE, 2014). Na fase de tuberização ocorre a maior suscetibilidade do tubérculo à infecção por
Streptomyces, uma vez que as lenticelas jovens não estão totalmente suberizadas. Por outro
lado, com a maturação, os tubérculos se tornam mais resistentes à infecção (ADAMS; LAPWOOD, 1978).
Após a penetração, o patógeno coloniza inicialmente os espaços intercelulares e, logo após, os intracelulares (ADAMS; LAPWOOD, 1978). A bactéria cresce entre as camadas da periderme e produz fitotoxinas, como taxtominas, que causam a morte celular e induzem
Figura 5. O patogenoma de Streptomyces. Diagrama de Venn representando os genes que estão ausentes em espécies de
Streptomyces não patogênicas e presentes
nos fitopatógenos (S. scabiei 87-22, S.
turgidiscabies Car8 e S. ipomoeae 91-03).
Os números indicam a quantidade de genes possivelmente associados a patogenicidade exclusivos ou compartilhados pelas espécies. Exemplos de determinantes de virulência conhecidos estão indicados. Modificado de Bignell et al. (2010).
14 a produção de suberina nas células adjacentes levando à formação de uma camada corticosa ao redor do tecido infectado. A camada corticosa forma uma barreira, no entanto, a bactéria é capaz de crescer nessa camada, nutrindo-se do tecido morto (AGRIOS, 1997). O crescimento da camada corticosa empurra a periderme infectada para o exterior tornando a superfície áspera e suberificada (sintomas de sarna) (BABCOCK; ECKWALL; SCHOTTEL, 1993) (Figura 6). Este ciclo ocorre muitas vezes durante o crescimento do tubérculo, aumentando o tamanho da lesão. Assim, quanto mais cedo o tubérculo for infectado, maior será a extensão da lesão (RODRIGUES NETO; DESTÉFANO; SHIMOYAMA, 2008).
15 O aumento da incidência da sarna nos campos de produção depende de diversos fatores como a adaptação ou predominância de espécies de Streptomyces mais agressivas, o aumento da área plantada com variedades de batata suscetíveis, a dispersão de espécies patogênicas por meio de batata semente contaminada, plantio contínuo em solos infestados e práticas culturais que promovam condições favoráveis à sarna, como a compactação e a alteração da microbiota do solo devido ao uso indiscriminado de defensivos agrícolas (RODRIGUES NETO; DESTÉFANO; SHIMOYAMA, 2008).
Considerando as diferentes etapas do desenvolvimento da cultura da batata e os fatores favoráveis ao desenvolvimento da doença, diferentes estratégias de controle podem ser adotadas a fim de se reduzir a incidência e severidade da sarna. Dentre elas, podemos citar o uso de cultivares resistentes à doença, a certificação da batata-semente e o tratamento dos tubérculos antes do plantio. Ainda, a manutenção de umidade, principalmente na fase de tuberização aumenta a população de bactérias antagonistas presentes na lenticela. Outras medidas como a acidificação do solo, rotação com culturas não hospedeiras, controle biológico e o controle químico podem ser utilizadas para a redução da quantidade de
Streptomyces patogênicas no solo (CORRÊA, 2011; RODRIGUES NETO; DESTÉFANO;
SHIMOYAMA, 2008).
2.5.1. Uso de cultivares resistentes
O uso de cultivares resistentes representa uma das principais formas de controle de doenças de plantas, pois evita ou reduz o uso de defensivos, diminuindo com isso o impacto ambiental e os custos de produção (CAMARGO; BERGAMIN FILHO, 1995).
O desenvolvimento de cultivares de batata resistentes à sarna seria o melhor e mais confiável método de manejo, mas nenhuma cultivar comercialmente disponível tem se mostrado completamente resistente à doença (DEES; SLETTEN; HERMANSEN, 2013). As cultivares de batata mais utilizadas para plantio em regiões produtoras do Brasil são suscetíveis ou apresentam somente resistência parcial à sarna. Em estudo realizado por Garcia (2008), as cultivares Monalisa, Cupido, Ágata e Asterix foram consideradas suscetíveis, sendo que Atlantic e Mondial foram indicadas como as mais apropriadas para plantio em regiões com histórico de sarna, uma vez que mostraram maior resistência às linhagens de Streptomyces avaliadas no estudo.
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Os principais fatores que limitam o desenvolvimento de cultivares resistentes à sarna comum são: a necessidade de estudos fisiológicos com foco na resposta da planta à
Streptomyces ou taxtomina, principalmente, se a planta produz moléculas que induzem a
produção da fitotoxina pela bactéria; mapeamento de genes de resistência ou suscetibilidade para uso em programas de melhoramento; identificação de melhores fontes de resistência utilizando germoplasma, principalmente espécies selvagens (WANNER; KIRK, 2015).
Os mecanismos e a base genética envolvidos na tolerância à sarna ainda não são conhecidos. Alguns estudos genéticos indicam que múltiplos genes podem estar envolvidos na resistência/suscetibilidade das cultivares. A resistência das plantas à sarna comum não parece seguir o típico modelo de resistência, com um gene de resistência da planta que responde ao patógeno sendo responsável por desencadear um mecanismo de defesa. Não há nenhuma evidência de resposta da planta de batata à Streptomyces ou à taxtomina, nem mesmo da expressão de genes relacionados a defesa em tubérculos com sintomas de sarna comum (DEES; WANNER, 2012; FLINN et al. 2005).
Em testes de patogenicidade em casa de vegetação com condições controladas, tanto ambientais quanto do inóculo de Streptomyces, ocorrem variações de sintomas de sarna comum de nulo a severo nos tubérculos de uma mesma planta, em um mesmo vaso. Essa variação e não ocorrência de um fenótipo de batata resistente à doença dificulta as análises dos dados e o entendimento dos mecanismos genéticos envolvidos na resistência (DEES; WANNER, 2012).
O conteúdo de açúcares redutores (glicose e frutose) na pele do tubérculo está positivamente correlacionado com a severidade da sarna comum e a capacidade de glicosilação da taxtomina, inativando-a parcialmente, tem sido proposta como um mecanismo de resistência entre as cultivares (GOTO, 1981; ACUÑA et al., 2001). Alguns estudos tem se mostrado promissores e utilizam a taxtomina A como agente seletivo para eliminação de progênie sensível à sarna comum em população de melhoramento genético de batata (HILTUNEN et al., 2011) e na seleção de células somáticas para isolar variantes de batata da cultivar Russet Burbank com extrema resistência à sarna (WILSON et al. 2010). Ainda, o banco de germoplasma com espécies selvagens tem potencial de fornecer
