Anais 2016: 18ª Semana de Pesquisa da Universidade Tiradentes. “A prática interdisciplinar
Efeito Neuroprotetor da Própolis Vermelha Após Lesão da Via
Nigroestriatal em Modelo Experimental da Doença De Parkinson
Ana Maria Gomes dos Santos (PROBIC-Unit), e-mail:
anna_bem_maria@hotmail.com
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Sheilla da Silva Barroso (Doutoranda), e-mail:
sheillassb@hotmail.com
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Camila Gomes Dantas (Doutoranda), e-mail:
ftacamila@gmail.com
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Dayse Rosângela Santos Marques (Mestre), e-mail:
day-ro@hotmail.com
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Juliana Cordeiro Cardoso (Co-orientador), e-mail:
juaracaju@yahoo.com.br
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Margarete Zanardo Gomes (Orientador), e-mail:
guetezanardo@yahoo.com.br
Universidade Tiradentes/Fisioterapia/Aracaju, SE.
Área do conhecimento: 2.07.00.00-8 - Fisiologia. Subárea do conhecimento:
2.07.02.00-0 - Fisiologia de Órgãos e Sistemas
Pesquisa executada com recursos do edital PPP 04/2011, FAPITEC/SE.
RESUMO: A doença de Parkinson (DP) é uma enfermidade neurodegenerativa que afeta neurônios dopaminérgicos presentes na substância negra compacta (SNc). Dentre os tratamentos utilizados, a levodopa ou L-DOPA (3,4-diidroxifenilalamina), reduz os sintomas característicos da doença. Na tentativa de buscar novas alternativas de tratamento, visando minimizar a ocorrência de efeitos colaterais, visto que a L-DOPA, após uso contínuo, induz o aparecimento de discinesias e flutuações motoras, os produtos naturais têm apresentado ação neuroprotetora sobre a fisiopatologia da DP. A própolis vermelha (origem botânica Dalbergia ecastophyllum) tem apresentado efeitos antioxidante e anti-inflamatório, que podem diminuir a morte de neurônios dopaminérgicos. Assim, o presente trabalho tem como objetivo avaliar o efeito neuroprotetor do extrato hidroetanólico de própolis vermelha (EHPV) após lesão da via nigroestriatal - modelo experimental da doença de Parkinson. Para tanto, 28 dias após indução da lesão por aplicação de 6hidroxidopamina (6-OHDA) no núcleo estriado, os cortes histológicos encefálicos foram submetidos à imunohistoquímica para tirosina hidroxilase (TH). Foi realizada análise de variância de uma via (ANOVA), seguida do pós-teste de Tukey, para o fator tratamento. Valores de p ≤ 0,05 foram considerados significantes. Os resultados mostraram que o tratamento com EHPV a 10 mg/kg aumentou o número de neurônios dopaminérgicos remanescentes após a lesão, sugerindo um efeito protetor do EHPV sobre a morte neuronal dopaminérgica.
Palavras-chaves: própolis, doença de Parkinson, 6-hidroxidopamina.
INTRODUÇÃO
A doença de Parkinson (DP) é a segunda desordem neurodegenerativa caracterizada pela perda progressiva de neurônios dopaminérgicos (DA) na SNc (BATASSINI et al., 2015). Tem-se observado que a causa da morte celular da DP é multifatorial. A apoptose, o estresse oxidativo, disfunção mitocondrial e a neuroinflamação tem sido comumente associados às doenças neurodegenerativas (KURNIK, 2015). A morte neuronal pode ser resultante da produção de neurotoxinas pelos astrócitos, aumento da transmissão glutamatérgica e produção espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (BATASSINI et al., 2015). Também se observa a ocorrência de agragados proteicos chamados corpos de Lewy e da α-sinucleína (BU, et al., 2015).
O tratamento sintomático da DP é à base do precursor dopaminérgico L-DOPA, que atua diminuindo os efeitos motores da doença (GARBAYO et al., 2013). Porém, após uso contínuo e prolongado, a L-DOPA induz o aparecimento de movimentos involuntários (OBESO et al., 2000). Desta forma, a busca por novas estratégias terapêuticas se faz necessária.
A própolis vermelha é um produto de origem natural, que possui uma composição rica em isoflavanóides, pterocarpanos, chalconas benzofenonas, flavonóides, benzofenonas preniladas e terpenos (LOPES et al., 2014), com atividades antimicrobiana, antioxidante, antiinflamatória (CAVENDISH et al., 2015) e neuroprotetora (CHINTA et al., 2013).
Dentre os tipos de própolis vermelha, a própolis sergipana mostrou maior teor de compostos fenólicos e de flavonóides com maior atividade
Anais 2016: 18ª Semana de Pesquisa da Universidade Tiradentes. “A prática interdisciplinar antioxidante (MACHADO et al., 2016). Assim,
objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito neuroprotetor do EHPV após lesão da via nigroestriatal por 6-OHDA - modelo experimental da doença de Parkinson. MATERIAL E MÉTODOS Grupos experimentais
Os animais que receberam aplicação intracerebral de 6-OHDA foram distribuídos em grupos experimentais de acordo com os seguintes tratamentos administrados por via oral (p.o., 1 mL): veículo (Tween 80 a 2% em água destilada); EHPV 10 mg/Kg e EHPV 50 mg/Kg. Adicionalmente, o grupo controle (que recebeu aplicação intraestriatal de solução salina contendo ácido ascórbico) foi tratado com veículo (Tween 80 a 2% em água destilada, p.o.). Ao final desta distribuição, os quatro grupos foram denominados: grupo 6-OHDA/veículo, grupo 6OHDA/EHPV 10, grupo 6-OHDA/EHPV 50 e grupo salina/veículo, referindo-se, respectivamente, à administração intracerebral e oral (FRANCARDO
et al., 2011). Ao final do experimento, os grupos
foram constituídos por 6 a 8 animais.
Imunohistoquímica para Tirosina Hidroxilase
As lâminas com cortes encefálicos passaram pelo processo de desparafinização, desidratação, recuperação antigênica. Em seguida foi realizado o bloqueio da peroxidase endógena (H2O2 0,3%),
bloqueio em Soro Albumina-Bovina 2%, (Sigma-Aldrich, Sigma Chemical Co., St Louis, USA) e incubação com anticorpo primário dirigido contra os antígenos de interesse (1:100, Santa Cruz Biotecnology, Inc. Alle Rechte Vorbehalten) por 2 horas. Em seguida foi realizada a incubação com anticorpo secundário marcado com Biotina (1:250,
Vectastain, Vector Laboratories®) por 90 minutos; incubação com o complexo Avidina-BiotinaPeroxidase (solução A e B, Kit ABC, Vectastain, Vector Laboratories®) por 90 min e incubação com tetracloreto de 3’3’-diaminobenzidina (DAB) (kit DAB, Vector Laboratories). As lâminas foram desidratadas, diafinizadas e preparadas para análise (BOIX et al., 2015).
Análise de Imagens
As imagens foram analisadas pelo software “Image J” do National Institute of Health Image, (W. Rasband, domínio público National Institute of
Mental Health). As imagens da SNc e do estriado
foram capturadas das lâminas usando câmera de
vídeo Olympus C-7070, acoplada a microscópio Olympus CX31 no aumento de 40X. A SNc foi identificada e fotografada de forma a excluir a área tegmentar ventral e a substância negra reticulada. Ao menos três secções representativas de cada plano rostrocaudal da SNc (-5,0; -5,6 e -6,0 mm em relação ao Bregma) foram examinadas (ZARE et al., 2015).
Para quantificação da densidade de fibras positivas para TH no estriado foi realizada leitura da densidade óptica (DO), medida em níveis de cinza. Uma escala arbitrária pré-fixada com valores inteiros graduados de 0 a 10 para tons de cinza variando de branco a preto, respectivamente, foi estabelecida para secção bilateralmente. A DO foi medida em 2 a 3 secções ao nível dos planos 1.3, 0.2 e –1.3 mm em relação ao Bregma (PAXINOS, WATSON, 2013).
Análise Estatística
Foi realizada análise de variância de uma via (one-way ANOVA) seguida do pós-teste de Tukey, para comparações entre os
tratamentos. Valores de P < 0,05 foram considerados significantes. Os graus de liberdade foram designados por F. Foi utilizado o programa
Graph Pad Prism 5.0 para análise dos dados.
RESULTADOSEDISCUSSÃO
No ensaio biológico, foi observada diminuição da porcentagem de neurônios TH+ na SNc no grupo 6-OHDA/veículo em relação ao grupo salina/veículo (p < 0,01). Não foi observada diferença significativa entre os grupos lesionados tratados com veículo e EHPV na dose de 50 mg/kg (p > 0,05). Já o tratamento com EHPV na dose de 10 mg/kg promoveu aumento significativo da porcentagem de neurônios TH+ remanescentes (p < 0,001) em comparação com o grupo 6-OHDA/veículo e ambas as doses de EHPV apresentaram valores estatisticamente semelhantes aos do grupo salina/veículo. Não foi observada diferença significativa com relação ao efeito entre as doses testadas (F 3-31 = 5,50, p = 0,0042, ANOVA de uma
via seguida do pós-teste de Tukey, Figuras 1 e 2). A análise da DO no CPu evidenciou diminuição da porcentagem de fibras TH+ nos grupos lesionados tratados com veículo (p < 0,0001) e EHPV 50 mg/kg (p > 0,05) em relação ao grupo salina/veículo. Já o tratamento com EHPV 10 mg/kg em roedores lesionados promoveu aumento significativo da marcação para TH (p < 0,05) em relação ao grupo lesionado tratado com veículo, atingindo médias estatisticamente semelhantes às
Anais 2016: 18ª Semana de Pesquisa da Universidade Tiradentes. “A prática interdisciplinar do grupo salina/veículo. Não foram observadas
diferenças significantes quanto às doses de EHPV (F 3-54 = 6,84, p = 0,0006, ANOVA de uma via
seguida do
(TH+) na substância negra compacta e no núcleo estriado, respectivamente, em relação ao lado contralateral à lesão. Os roedores foram eutanasiados 28 dias após a microinjeção de solução salina ou 6-hidroxidopamina (6-OHDA). O extrato hidroetanólico de própolis vermelha foi administrado a cada três dias nas doses de 10 (EHPV 10) e 50 (EHPV 50) mg/kg durante duas semanas. Letras diferentes indicam valores estatisticamente distintos. AS colunas representam as médias e as barras representam o EPM.
Figura 2: Fotomicrografias mostrando neurônios positivamente
marcados para a enzima tirosina-hidroxilase na substância negra compacta de ratos dos grupos salina/veículo (A), 6-OHDA/veículo (B), 6-OHDA/EHPV 10 (C) e 6-OHDA/EHPV 50 (D), do lado da lesão, 28 dias após as cirurgias. Aumento de 100X.
Figura 3: Fotomicrografias mostrando fibras positivamente
marcadas para a enzima tirosina-hidroxilase no núcleo estriado de ratos dos grupos salina/veículo (A), 6OHDA/veículo (B), 6-OHDA/EHPV 10 (C) e 6-6-OHDA/EHPV 50 (D), do lado da lesão, 28 dias após as cirurgias. Aumento de 40X.
No presente estudo foi observada ação neuroprotetora do EHPV (10 mg/kg) após lesão encefálica, evidenciada através da preservação da marcação imunohistoquímica para a enzima de síntese de neurônios dopaminérgicos, a TH (NAKASHIMA et al., 2013). A aplicação da toxina 6-OHDA resultou em diminuição de neurônios e fibras marcados, confirmando a efetividade da lesão em produzir o quadro tecidual semelhante ao observado na DP (BATASSINI et al., 2015). O tratamento com EHPV promoveu recuperação significativa da quantidade de neurônios e fibras remanescentes após lesão da via nigroestriatal em ratos, respectivamente, na SNc, núcleo onde são encontrados os corpos celulares de neurônios dopaminérgicos, e no estriado, o núcleo de projeção.
Em estudos prévios, o EHPV administrado na dose de 10 mg/kg também atenuou os déficits motores induzidos por 6OHDA (BARROSO, 2012) e mostrou ação neuroprotetora frente à lesão nervosa periférica em ratos (BARBOSA et al., 2015). Por outro lado, o tratamento com a maior dose de EHPV (50 mg/kg) não produziu modificações significativas em relação aos demais grupos lesionados. Este achado pode ter relação com o perfil toxicológico descrito para o EHPV, onde doses crescentes administradas diariamente induziram modificações comportamentais e histopatológicas (DA SILVA et al., 2015). Em adição, compostos com potente ação antioxidante, como o suco de romã, mostraram poder de exacerbar o estresse oxidativo em modelo animal para estudo da DP (TAPIAS et al., 2014), o que sugere cautela na indicação da dose.
O efeito neuroprotetor do EHPV neste modelo utilizado para estudo da DP pode ser atribuído, em grande parte, aos marcadores bioativos identificados na composição do EHPV que apresentam
ação neuroprotetora. A daidzeina, por pós - teste de Tukey, Figuras 1 e 3 ).
Figura 1: Porcentagem média de neurônios (A) e fibras (B)
Anais 2016: 18ª Semana de Pesquisa da Universidade Tiradentes. “A prática interdisciplinar exemplo, aplicada em cultivo de células microgliais
murinas expostas a lipopolissacarídeos (que induzem a liberação de mediadores inflamatórios), suprimiu a produção de óxido nítrico e de IL-6, diminuiu a produção de espécies reativas de oxigênio, a fosforilação de quinase de proteína ativada por mitogênio (p38 MAPK) e a ativação do fator de Kappa B (NF- κB).
Em adição, o mesmo meio de cultivo condicionado (obtido de células microgliais ativadas) foi utilizado em neurônios dopaminérgicos e, em presença de daidzeina, a neurotoxicidade foi reduzida (CHINTA et al., 2013). Considerando-se as atividades biológicas descritas para os marcadores químicos e a fisiopatologia da DP, sugere-se que o efeito neuroprotetor do EHPV esteja associado a ações de combate à formação de mediadores inflamatórios, de espécies reativas de oxigênio, da excitotoxicidade glutamatérgica e de apoptose, que podem ser moduladas por receptores estrogênicos tipo β, além de um possível efeito neurotrófico.
CONCLUSÕES
Concluiu-se que o tratamento com EHPV a 10 mg/kg protegeu neurônios dopaminérgicos da neurodegeneração da via nigroestriatal em ratos.
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