FILMES DE NANOPARTÍCULAS LUMINESCENTES EM
DISPOSITIVO MICROFLUÍDICOS VISANDO O
DESENVOLVIMENTO EM MÉTODOS ANALÍTICOS PARA A
DETERMINAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS DE INTERESSE CLÍNICO
BIOLÓGICO
Alunos: Julia Jorge Davidovic Orientador: Omar Pandoli
O crescente interesse pelo desenvolvimento de sondas analíticas luminescentes é atribuído às características intrínsecas deste fenômeno que facilita a detecção seletiva e sensível de espécies químicas de interesse clinico-biológico, ambientais, entre outras. Ressalta-se nesse panorama a multiplicidade de modos de detectar alterações no sinal da sonda (deslocamentos de comprimento de onda, alteração da intensidade de radiação ou das características de polarização). As sondas luminescentes constituídas por nanopartículas, em especial aquelas incluídas na categoria de “quantum dots” (QDs) ou pontos quânticos, vêm encontrando espaço em novas abordagens espectroanalíticas. [1]
Nano partículas luminescentes possuem propriedades diferenciadas dos outros materiais luminescentes (por exemplo, os corantes orgânicos), pois sua luminescência tem perfil estreito (pequeno valor de FWHM) com comprimento de onda máximo ajustável pelo controle do tamanho da partícula que, por sua vez, é controlado no momento da síntese. [2] Essa característica de variação de comprimento de onda em função do tamanho do material é previsto no modelo quântico da partícula na caixa (confinamento quântico).
Os QDs são formados por elementos dos grupos IIB-VIA ou IIIA-VA como CdS, CdSe, CdTe, GaN, ZnS e InP. A nanopartícula pode ser revestida com ligantes orgânicos para evitar a oxidação e a agregação da nanoestrutura e ainda facilitar a sua dispersão uniforme em meio líquido (dispersão coloidal). Estes ligantes modificam a superfície dos QDs através de ligações covalentes, interações de Van-der-Walls ou adsorção. Esses revestimentos também conferem características diferenciadas aos QDs como, por exemplo, seletividade nas interações e consequentemente nas determinações analíticas. Por outro lado é extremamente importante revestir as nanopartículas para reduzir sua toxicidade, em especial, as que possuem cadmio na sua composição, por este ser tóxico.
Os sensores formados por QDs são baseadas na resposta luminescente das nanopartículas na presença de uma determinada substância. A adição de concentrações crescentes dessa substância num meio que contém a nanopartícula produz quenching (supressão de fluorescência) ou amplificação da fluorescência, de preferência do modo seletivo, do QD indicando grandes possibilidades do ponto de vista analítico com essa nova abordagem. Essa seletividade seria também útil se for característica de classes de substâncias. Aplicações mais específicas com o uso de QDs serão exploradas para classes de substâncias de interesse clínico-biológico.
2. Objetivo
O presente trabalho objetiva a imobilização de ácido tioglicólico (TGA) quantum dots (QDs) de CdTe na superfície de vidro funcionalizado, para posterior estudo e avaliação do potencial uso deste film luminescentes para a detecção de moléculas biológicas ativas, como, por exemplo, a histamina.
3. Métodos procedimentais e resultados.
Desenvolvimento de filme de QDs-CdTe através a funcionalização do vidro com grupo funcional amino (–NH2).
Para o desenvolvimento do filme de QDs-CdTe, dois métodos de limpeza e hidroxilação da superfície do vidro foram testados. A primeira utilizando a técnica do plasma etching e a segunda utilizando solução piranha para cumprir o objetivo de hidroxilação da lâmina. Depois desse processo, o vidro é funcionalizado com 3-aminopropiltrimetoxisilano (APTS) de acordo com as técnicas testadas no laboratório, objetivando criar uma ligação do grupo hidroxila (-OH) com esta substância, deixando disponível seu grupo amino (-NH2) e possibilitando a ligaçao deste com os QDs. A imobilizaçao dos QDs-CdTe na superfície do vidro foram testadas também por duas técnicas. A primeira objetivando uma ligação eletrostática entre o grupo amino do vidro e carboxílico presente no TGA ligado aos QDs, na qual o vidro é mergulhado em solução de QDs e mantido nesse meio durante uma noite. A segunda é criando uma ligação covalente entre os dois grupos citados, utilizando 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) e N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) como catalisadores da reação.
Limpeza do vidro Método 1:
Lavaram-se as amostras de vidro com água destilada e detergente com a ajuda de um pano. Colocou-se os vidros imersos em água MiliQ em uma cuba de teflon e deixou-se no ultrassom por 10 minutos. Repetiu-se esse processo. Secaram-se os vidros com N2 e colocou-os em outra cuba de téflon com tricloroetileno durante 10 minutcolocou-os no ultrassom. Repete-se esse processo, em seguida, utilizando acetona e duas vezes etanol. As lâminas são posteriormente secas e postas durante 10 minutos na estufa a temperatura de 100oC.
As lâminas de vidro, em seguidas são postas no plasma cleaner para receber o tratamento com plasma durante 3 minutos, gerando anteriormente na câmara 2 minutos de vácuo. Este processo possibilita hidroxilarasuperfície da lâmina de vidro, o que é essencial para o sucesso da posterior sinalização. Um estudo do melhor tempo para se deixar a lâmina no plasma cleaner foi executado, medindo-se após o tratamento, sempre em duplicata, o ângulo de contato de uma gota de água na superfície do vidro. Os resultados são apresentados na tabela 1.
Tempo em plasma Ângulo de contato (graus)
0 min 9.9
1 min 5.7
3 min 5.4
4 min 10
Tabela 1: vidro em Plasma Cleaner tempo x ângulo de contato
Os dados obtidos apontam que o tempo mais adequado para a exposição em plasma é de 3 minutos, já que neste tempo obteve-se o menor ângulo de contato, indicando que, pela sua altahidrofilicidade, a superfície foi hidroxilada com maior sucesso.
Método 2:
Lavaram-se as amostras de vidro com água destilada e detergente com a ajuda de um pano. Colocou-se os vidros imersos em água MiliQ em uma cuba de teflon e deixou-se no ultrassom por 10 minutos. Repetiu-se esse processo. Colocou-se os vidros em outra cuba de téflon com solução piranha (3:1 H2SO4:H2O2) a 70oC durante 45 minutos. Após esse
Repete-se quatro vezes essa etapa. Em seguida os vidros são enxaguados abundantemente com água miliQ, secos com N2 e postos na estufa a 100oC durante 5 minutos. Testes utilizando o goniômetro comprovaram que, assim como o método anterior, a superfície se torna hidrofílica, comprovando a hidroxilação.
Sinalização do vidro:
Um estudo visando buscar a melhor concentração de 3-mercaptopropiltrimetoxisilano (MPTS) em tolueno e tempo de imersão do vidro em solução para cumprir o objetivo de sinalização foi feito. Foram testadas as concentrações de 2,5% e 5% e os tempos de 2 horas e 4 horas.
Teste 1:
Filme de TGA QDs-CdTe sob o vidro:
Espectros de fluorescência da solução de TGA QDs-CdTe:
Em fluorímetro, foi analisado o espectro da solução de TGA QDs-CdTe (diluída em água 1:9). A solução foi diluída para 200 uL e avolumada para 2,8mL no momento em que as medições foram executadas. Os resultados são apresentados na tabela 2.
Excitação Emissão Intensidade
330 535,84 176,58 320 535,83 231,90 310 535,80 240,23 300 535,84 279,04 290 535,81 292,17 280 535,41 317,00
Tabela 2: Espectros de fluorescência da solução de TGA QDs-CdTe
Imobilização via ligação eletrostática:
Os vidros previamente funcionalizados com APTS foram imersos em tubos fálcons em soluções aquosas de QDs-CdTe (pH=10), variando o tempo e a concentração para criar um filme de QDs com a maior intensidade de fluorescência possível. Medidas AFM foram feitas com um microscópio multimode-8 equipado com um scanner JV (125 x 125 x 5 µm) e o modo não-contato do AFM foi utilizado para obter a imagem topográfica (2 µm x 2 µm) durante 10 minutos. A imagem da lâmina foi reproduzida antes e após a criação de filme de TGA QDs-CdTe. A imagem AFM indicou a presença de QDs de vários tamanhos (entre 20 nm e 40 nm) sobre a superfície de vidro (figura 1).
Figura 1: Imagem AFM de lâmina de vidro antes e após criação de film de TGA QDsCdTe.
Imobilização via ligação covalente:
Neste processo, em um tubo fálcon, 1 mL da solução aquosa de TGA QDs-CdTe foi adicionada a 0.5 mL de tampão fosfato-salino (PBS). Sob agitação, foi adicionado 1mL de EDC e mais 0,5mL de PBS, com tempo de reação de 20 minutos. Adicionou-se então1mL de NHS, aguardou-se mais 10 minutos e então o vidro funcionalizado foi mergulhado no tubo. A reação está representada na figura 2. O vidro foi mantido no meio durante 6 horas e 19 horas. O vidro retirado após 6 horas de reação apresentou, a olho nu, fluorescência fraca. O vidro retirado após 19 horas apresentou coloração preta, indicando oxidação dos QDs. Estudos sobre o tempo de reação ideal ainda devem ser executados, almejando-se aperfeiçoar o processo e criar um film com fluorescênciaconsiderável e uniforme para posteriores testes de sensibilidade com as moléculas de interesse clinico-biológico e ambiental.
Figura 2:Representação da reação de TGA QDs-CdTe e da superfície de vidro. Interação do filme de QDs-CdTe sob o vidro com a Histamina.
A lâmina de vidro, após funcionalização e formação do filme por ligação eletrostática foi analisada no fluorímetro sob três condições: em condição ambiente, submerso em
que quando a lamina foi posta em água ocorreu um pequeno quenching da luminescência, porem quando posto na solução de histamina foi produzido um quenching maior ainda, com deslocamento do λmax de 533nm para 528 nm, indicando a sensibilidade do filme com essa amina biogênica. O filme de QDs se manteve estável durante uma semana, se tornando gradualmente menos luminescente até a perda total desta característica.
Figura 3:Espectro de fluorescência do filme de QDs seco, em água e em Histamina
10-4mol.L-1.
4. Conclusão:
O estudo comprovou o potencial do uso de filmes de TGA-CdTeQDs como sonda luminescente sensível para histamina. O uso do filme é vantajoso devido a reduzir a quantidade CdTe- QDs necessário, uma vez que é imobilizado e pode ser usado para analisar um maior número de amostras, em vez da substituição necessária de dispersão aquosa de TGA-QDs cada vez que uma amostra for analisada.
Durante o projeto surgiram algumas dificuldades como a reprodutibilidade de amostras de filme criadas por ligação eletrostática, o que levou a busca por novos caminhos como a criação de filme por ligação covalente.
Como ambições futuras do projeto estão aperfeiçoar o processo de imobilização de TGA-QDs em vidro e testar a interação do filme com outras moléculas clinico biológicas.
5. Referencias bibliográficas:
[1] S.M. Zhao, S.Q. J. Han, Chin. Chem. Soc., 57, (2010), 1353-1360.
[2] H.Y. Acar, R. Kas, E. Yurtsever, C. Ozen, I. Lieberwirth, J. Phys. Chem., 113, (2009), 10005–10012.
